מאמר שיטה

אימות מערכת לחץ היפרברי עם הרדמה קסנון עבור דרוזופילה מלנגסטר

DOI:

10.3791/69671

⸱

20 בפברואר 2026

 , 
1Clore Laboratory, University of Buckingham

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גזים שנראים לא מזיקים בלחץ אטמוספרי יכולים לגרום להתנהגויות כמו נרקוזה בתנאי לחץ גבוה. תאי לחץ היפרבריים קונבנציונליים יקרים ודורשים עבודה אינטנסיבית. מחקר זה מציג שיטה פשוטה וזולה לבחינת השפעות הזנון על Drosophila melanogaster בלחצים בינוניים מתחת ל-4 אטמוספירה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתנאים היפרבריים, ריכוזים גבוהים של הגזים הסביבתיים עשויים לעורר מגוון תגובות התנהגותיות אצל בעלי חיים שונים. חלק משמעותי מההתנהגויות הללו מייצג שינויים במצבים קוגניטיביים שעדיין אינם מובנים היטב. דוגמה בולטת היא הרדמה כללית. ההשפעה ההתנהגותית של מספר גזים בתנאים היפרבריים בהרדמה כללית, או נרקוזיס, הייתה מחקר מדעי ארוך טווח, למרות השימוש התדיר בתרופות ברפואה. קסנון, המסווג כגז אצילי וסוכן הרדמה, נחשב לאחת האפשרויות הבטוחות ביותר להרדמה כללית בבני אדם. עם זאת, היא אינה מרדימה זבובים בתנאים נורמובאריים. כאן קבענו מערכת ניסוי פשוטה שמגבירה את הלחץ הסביבתי עד ~3 אטמוספירה ומאפשרת חקר הרדמה של קסנון באחד האורגניזמים המודמיים הפופולריים ביותר, Drosophila melanogaster. מערך ניסויי זה מקל עוד יותר על חקר גזים אחרים והשפעתם בתנאי לחץ גבוה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני הקצוות הקיצוניים של השפעות התנהגותיות שנצפו בבעלי חיים בתנאי לחץ יתר הם עוויתות על ידי חמצן ונרקוזה על ידי חנקן 1,2. באופן מעניין, דווחו ליקויים קוגניטיביים כמו הזיות ופגיעה בזיכרון עם חנקן ומימן בערכי לחץ לפני רמת ההכרה 3,4. הרדמה שנגרמה על ידי קסנון, קריפטון וחמצן חנקן בתנאים היפרבריים דווחה לפני 5,6.

הרדמה כללית היא גם אבן יסוד ברפואה וגם תופעה בעלת עניין מדעי רב. למרות השימוש הארוך והנפוץ בו, הבנתנו לגבי האופן המדויק של כימיקלים מסוימים גורמים להיעדר זמני של תנועה, זיכרון, כאב ותודעהמוגבלת. קסנון, בהיותו גז אצילי, יכול להיות החבר המוזר ביותר בין סוכני ההרדמה. הוא נחשב לאופציה בטוחה להרדמה, ומציע השראה והחלמה מהירה, הפרעה פיזיולוגית מינימלית, ותופעות לוואי קלות בלבד כמו בחילות לאחר הניתוח 8,9.

בהתחשב בחשיבות הרפואית של ההרדמה ובתכונות הכימיות הייחודיות של קסנון, מחקר זה שואף לחקור הרדמה מושרה על ידי קסנון באמצעות מודל פשוט של בעלי חיים בשם דרוזופילה מלנגסטר. מגוון מחקרים נערכו באמצעות זבובי פירות לחקר הרדמה כללית, עם הצעות רבות של מערכות ושימוש בחומרי הרדמה נדיפיםשונים 10,11,12,13. עם זאת, לא דווח על הרדמה של קסנון בדרוזופילה. בתנאים נורמובאריים, קסנון אינו גורם להרדמה בדרוזופילה מלנגסטר, הידועה גם כזבובי פירות. כדי להתמודד עם מגבלה זו, מחקר זה מציע מערכת היפרברית המאפשרת מניפולציה מבוקרת של לחץ הסביבה בין 1 אטמוספירה לכ-4 אטמוספירה. נערכו מספר מחקרים שהשתמשו בתאי לחץ כדי לענות על סקרנות דומה14,15. עם זאת, רוב התאים ההיפרבריים המסחריים נהנים מחומרים עמידים ועמידים לדליפות, אך הם בעלי נפח גבוה (~3 ליטר) והם מורכבים שיטתית לתפעול ויקרים. במקום זאת, השיטה המתוארת במאמר זה פשוטה וזולה, ומאפשרת חקר השפעות של גזים שונים ושילוביהם. הוא מספק מערכת המתאימה למודלים של בעלי חיים קטנים כמו D. melanogaster ו-C. elegans.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דרוזופילה מלנגסטר

  1. אסוף 20 נקבות ו-20 זבובים זכרים בגילאי 1-3 ימים לכל ניסוי באמצעות CO2.
  2. נחו את הזבובים הנבחרים בבקבוקון עם מזון לפחות 24 שעות לפני הניסוי בטמפרטורה של ~22 מעלות צלזיוס.

2. מתן הרדמה

  1. העבר את הגזים ממיכלי הגז שלהם לשקיות הגז העמידות לדליפות לשימוש ניסיוני. להעברה ישירה של גז מהמיכל אל השקיות, השתמש בצינורות סיליקון.
  2. חבר צינור סיליקון בקוטר 25 מ"מ (3.4 מ"מ) למזרק הפוליפרופילן. לאחר מכן מחברים את מזרק הפוליפרופילן לשקיות הגז ולברז התלת-כיווני. למען הבהירות, מזרק הפוליפרופילן ייקרא מזרק #1 בשאר הטקסט.

3. הרכבת מערכת ההיפרברית (איור 1)

  1. מקם את שולחן תאורה LED בכיוון נוף על השולחן (קצה ארוך אופקי לפני השולחן).
  2. הניחו את משאבת ההזרקה סמוך לאחד הצדדים הקצרים של שולחן תאורה LED, כדי להבטיח שכיוון המשאבה מאפשר למזרק הניסיוני להימשך מעל התאורה האחורית.
  3. מקם את המצלמה מעל המערכת כדי לכסות את האזור שבו נמצא המזרק הניסיוני.
  4. חתוך צינור סיליקון באורך 75 מ"מ (קוטר 3.4 מ"מ). חבר את הברז התלת-כיווני למנומטר באמצעות צינור הסיליקון מהפיה המרכזית.
  5. השתמשו במהדקי קפיצי צינור על הפיה מהצד של המנומטר ובברז התלת-כיווני כדי להבטיח שהצינור מהודק.
  6. באמצעות הכפתור המסומן בחץ כפול ביחידת הבקרה של משאבת ההזרקה, הגדר את המהירות ל-80 מ"מ/מ' ואת משך הזמן ל-38 שניות לדחיסה או דה-קומפרסיה אוטומטית של הבוכנה.

4. הליך להרדמת קסנון

  1. הגבל את האור הסביבתי בחדר הניסויים והדליק את שולחן התאורה של ה-LED וקבע את הבהירות לרמה 3. זה עוזר להגדיל את הניגודיות בסרטון.
  2. הסר את הבוכנה של מזרק הפוליקרבונט. הכנס כמות קטנה של כותנה לפטמה של המזרק כדי למנוע מהזבובים לברוח. לשם בהירות, מזרק הפוליקרבונט ייקרא מזרק #2 בשאר הטקסט.
  3. כדי להעביר 40 זבובים מהבקבוקון למזרק #2, קודם כל מוציאים את מכסה הבקבוקון ומניחים את קנה המזרק אנכית מעל הבקבוקון. שפת הקנה צריכה להתמזג עם החלק העליון של הבקבוקון כדי לאפשר לזבובים להיכנס לקנה המזרק. סובב את המבנה 180° ותקשה. זה ימקם את הזבובים בתחתית קנה המזרק. תחזיר את הבוכנה פנימה. שים את המזרק עם הזבובים בתוך משאבת ההזרקה.
  4. כוון את סימני הקנה של המזרק בצד כדי לראות טוב יותר את הזבובים מנקודת מבט המצלמה.
  5. אבטח את המזרק מהקנה ומראש הבוכנה למשאבת ההזרקה באמצעות ברגים מתכווננים.
  6. הסר את הכותנה מקצה המזרק #2 וחבר אותו עם הברז התלת-כיווני.
  7. תתחיל את הקלטת הווידאו. תדליק את המנומטר. סובב את העצירה כדי לחבר את המנומטר למזרק #2 ולאשר לחץ של 0 קילופסקל במזרק באמצעות המנומטר.
  8. סובב את הברז התלת-כיווני למצב הצידי כדי לאפשר חילופי אוויר עם המזרק לפני הניסוי.
  9. העבר את הבוכנה מ-20 ל-2 מ"ל באמצעות אפשרות הבקרה הידנית של משאבת ההזרקה, שנועדה לאפשר את האפשרות המהירה ביותר.
  10. שאפו 18 מ"ל של גז ההרדמה משקית הגז למזרק #1. חבר את מזרק #1 עם החיבור התלת-כיווני מפתח נעילת הלואר הצידית. כדי להעריך את הנפח הנכון, 18 מ"ל גז הרדמה בכמות כוללת של תערובת של 20 מ"ל תיתן 90% מאחוז הגז. ניתן לשנות זאת בהתאם לאחוז הגז הסופי הרצוי.
  11. העבר את הבוכנה חזרה לקו ה-20 מ"ל באמצעות אפשרות ידנית של משאבת ההזרקה.
  12. סובב את העצירה כדי לחבר את המינומטר עם מזרק #2. בדרך כלל, המנומטר מראה לחץ ~-3 קילופסקל לאחר מילוי ההרדמה.
  13. הזז את הבוכנה אוטומטית, עם הגדרות מהירות וזמן ל-80 מ"מ/ש ו-38 שניות. המשאבה צפויה להגיע ל-5 מ"ל בר של הקנה תוך 38 שניות. כאשר הבוכנה עוצרת, הלחץ המקסימלי חייב להיות ~200 קילופסקל.
  14. השאירו את הבוכנה במצב של 5 מ"ל למשך 20 שניות. שים לב ללחץ השיא.
  15. הקישו במזרק כדי להוציא זבובים שנאחזים בבומפה, מה שגורם להם לשקוע ללא תנועה בתחתית.
  16. התחל את הדקומפרסיה האוטומטית בסוף 20 שניות. סיים את הניסוי כשהבוכנה חוזרת למוט של 20 מ"ל. שים לב ללחץ הסופי של בקרת הדליפות.

5. ניתוח נתונים

הערה: בניסוי זה, הופעת חומרי הרדמה שימשה כנקודת סיום. תנועות הזבובים נמדדו מזמן תחילת דקומפרסיה של הבוכנה. פותחו שתי שיטות ניתוח שונות: ניתוח פיקסלים ומעקב זבובים. לכל שיטת ניתוח היו חסרונות, המועברים בדיון.

  1. ניתוח פיקסלים
    1. השתמש ב-ScreenFlow כדי לערוך את הסרטונים. חתוך כל וידאו לפי אזור העניין (ROI), כלומר 5 מ"ל ראשונים של קנה המזרק.
    2. קצץ את הווידאו ל-20 השניות הראשונות אחרי שריקת הדחיסה במזרק. ייצא את הסרטונים הערוכים כ-GIFים. שכפל את ה-GIF.
    3. באמצעות Fiji, הסר את הפריים הראשון מכפיל אחד והסר את הפריים האחרון מהעותק השני. כדי להשיג זאת, בחר עריכת תמונה > וידאו > מחיקת פריימים.
    4. הפוך כל קובץ בינארי GIF בפיג'י כך שהזבובים יופיעו בלבן על רקע שחור. כדי להשיג זאת, בחר בתהליך > בינארי > להפוך בינארי.
    5. פתח את שני ה-GIFים בפיג'י. חשב את הפרש הפיקסלים בין ה-GIFים. כדי להשיג זאת, בחרו ב-Process > Image Calculator. הפעולה הזו תיצור GIF של הפרש פיקסלים.
    6. שמור את ה-GIF של ההבדל בפיקסלים. נתח את החלקיק ב-GIFים השונים. לשם כך, בחרו בניתוח > ניתוח חלקיקים בפיג'י. כוון את ספי גודל הפיקסלים כדי להגדיל את יחס האות לרעש.
    7. לאחר ניתוח חלקיקים, פיג'י מפיקה CSV עם הבדלי פיקסלים לכל פריים. שמור את קובץ ה-CSV. ניתן להשתמש בנתוני CSV כדי לתאר את התנועה לכל פריים. השתמשו בתנועה מצטברת דרך פריימים כדי להקצות הבדלים סטטיסטיים בין הניסויים.
  2. מעקב זבוב
    הערה: בשיטת מעקב הזבובים, נעשה שימוש בטכנולוגיית בינה מלאכותית לזיהוי ומעקב אחר מרכז המסה של כל זבוב בסרטוני הניסוי. שני מודלים שולבו לכך: YOLO (אתה מסתכל רק פעם אחת) לזיהוי ו-MASA (התאמת כל דבר על ידי סגמנטציה של כל דבר) למעקב. הדגמים בוצעו על Google Colab באמצעות כרטיס מסך Tesla T4.
    1. התקן את ספריית ה-YOLO של Ultralytics ב-Colab, ואז טען את מודל yolo11n.pt. השתמש ב-CVAT (כלי סימון ראיית מחשב) כדי להוסיף הערות לזבובים בפריימים שהופקו מהסרטונים, ואז לייצא את מערך הנתונים בפורמט YOLO לצורך אימון. נהלי התקנה והדרכה מפורטים מתוארים במאגר המקוון.
    2. התקן את מאגר MASA ב-Google Colab ושלב פילטר קלמן לביצוע מעקב אחר אובייקטים בין פריימים עוקבים. שלבו את מודל זיהוי YOLO המיומן עם מסגרת המעקב של MASA.
    3. השתמש ב-FixTrack כדי לבדוק ידנית את הטראקלטים שנוצרים על ידי צינור MASA+YOLO המשולב. זהה וממזג מסלולים מפורקים בצורה שגויה או תקן אי-התאמות זהות כדי לקבל מסלולים רציפים עבור זבובים בודדים. נהלי התקנה והדרכה מפורטים מתוארים במאגר FixTrack.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת במאמר זה מאפשרת ניטור הן של תזמון והן של היקף הפעילות המוטורית בזבובים בתנאי היפרבריק. תצורה זו מאפשרת לגזים כמו קסנון וחמצן חנקן, שאין להם תכונות הרדמה בתנאים רגילים, לייצר הרדמה בדרוזופילה מלנוגסטר. כדי להדגים זאת, ניסינו ריכוזים שונים של קסנון ואוויר. התחלנו להקים את התהליך עם 90% קסנון ו-10% אוויר. לאחר מכן הראינו את רגישות המתודולוגיה על ידי השוואת ההבדלים שנמדדו כאשר כמות גז ההרדמה הוגדלה וירדה ב-5%. איור 1 מציג את פרוטוקול ההרדמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת פשוטה וזולה זו הופכת את הבדיקות ההתנהגותיות ההיפרבריות בדרוזופילה לנגישות באופן רחב, ומאפשרת ניסויים מהירים וניתנים לשחזור ללא כלי לחץ מיוחדים. עם זאת, יש לו כמה מגבלות. אחד הפשרות החשובות שלו הוא הלחץ המרבי הנמוך יותר ביחס למערכות הקיימות. הלחץ הגבוה ביותר שניתן לגרום עם ההגדרה הזו הוא ~4 אטמוספירה, בעוד שכלי לחץ המשמשים לדרוזופילה מדווחים ככשהם מגיעים לככפול מזה, ומערכות לעכברים יכולות להגיע עד 100 אטמוספירה.<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך כלכלית על ידי קרן TBD (Tiny Blue Dot). אנו מודים לג'ניפר סאן וטינג ליו מ-Google DeepMind על עזרתן והכוונה במעקב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקיות גז אטומות לאוויר (0.5 ליטר)טכנסטרו7440440
מצלמהאפלאייפון 15
מהדקי צינור עם קפיץ כפול עם חוט כפולמפת מקורותA24120200ux2109
תערובת מזון דרוזופילהחמושת מתקדמתDM900
דרוזופילה מלנגסטרדרווין ביולוגיהLZ-210
צינור הזרקהאייטוסרלאהB09M8G5BQ8
שולחן נורות LEDלייריM1-3878368
מנומטרדווייראומגה477AV-8
אום דחיסה תלת-כיווני ממתכת בצורת עצירה סיגמא אלדריץ'  Z182184
מזרק פוליקרבונט (20 מ"ל)DMC MedicalFD-1031NS
מזרק פוליפרופילן (20 מ"ל)BD301031
צינורות סיליקון
גז קסנוןגזים תעשייתיים בצ'נגדו טאיו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bert, P. Barometric Pressure: Researches in Experimental Physiology. , College Book Company. Columbus, Ohio. (1943).
  2. Grover, C. A., Grover, D. H. Albert Behnke: nitrogen narcosis. J Emerg Med. 46, 225-227 (2014).
  3. Rostain, J. C., Lavoute, C., Risso, J. J., Vallée, N., Weiss, M. A review of recent neurochemical data on inert gas narcosis. Undersea Hyperb Med. 38, 49-59 (2011).
  4. Clark, J. E. Moving in extreme environments: inert gas narcosis and underwater activities. Extrem Physiol Med. 4, 1(2015).
  5. Lawrence, J. H., Loomis, W. F., Tobias, C. A., Turpin, F. H. Preliminary observations on the narcotic effect of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils. J Physiol. 105, 197-204 (1946).
  6. Miller, K. W., Paton, W. D., Smith, E. B., Smith, R. A. Physicochemical approaches to the mode of action of general anesthetics. Anesthesiology. 36, 339-351 (1972).
  7. Mashour, G. A., Forman, S. A., Campagna, J. A. Mechanisms of general anesthesia: from molecules to mind. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 19, 349-364 (2005).
  8. Sanders, R. D., Franks, N. P., Maze, M. Xenon: no stranger to anaesthesia. Br J Anaesth. 91, 709-717 (2003).
  9. Law, L. S. C., Lo, E. A. G., Gan, T. J. Xenon anesthesia: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Anesth Analg. 122, 678-697 (2016).
  10. Krishnan, K. S., Nash, H. A. A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila melanogaster altered in sensitivity to halothane. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (21), 8632-8636 (1990).
  11. Zalucki, O., Day, R., Kottler, B., Karunanithi, S., van Swinderen, B. Behavioral and electrophysiological analysis of general anesthesia in 3 background strains of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 9, 7-15 (2015).
  12. Daplan, E., Turin, L., Skoulakis, E. M. C. Measuring the anesthetic response to chloroform and isoflurane in general anesthesia mutants in Drosophila melanogaster. Anesthesia Res. 2, 12(2025).
  13. Rodriguez, E., Peng, B., Lane, N. Anaesthetics disrupt complex I-linked respiration and reverse the ATP synthase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1866, 149511(2025).
  14. Wlodarczyk, A., McMillan, P. F., Greenfield, S. A. High pressure effects in anaesthesia and narcosis. Chem Soc Rev. 35, 890-898 (2006).
  15. Koblin, D. D., et al. Minimum alveolar concentrations of noble gases, nitrogen, and sulfur hexafluoride in rats: helium and neon as nonimmobilizers (nonanesthetics). Anesth Analg. 87, 419-424 (1998).
  16. Thomas, J. J., Baxter, R. C., Fenn, W. O. Interactions of oxygen at high pressure and radiation in Drosophila. J Gen Physiol. 49, 537-549 (1966).
  17. Kent, D. W., Halsey, M. J., Eger, E. I. 2nd, Kent, B. Isoflurane anesthesia and pressure antagonism in mice. Anesth Analg. 56, 97-101 (1977).
  18. Gunning, C. FixtrackV2 at SingleVid. , Github. (2025).
  19. Allada, R., Nash, H. A. Drosophila melanogaster as a model for study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes. Anesth Analg. 77, 19-26 (1993).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Hyperbaric PressureXenon AnesthesiaDrosophila MelanogasterAnesthetic GasesBehavioral ResponsePressure ChamberVideo AnalysisPixel DifferenceFly MovementModel Organisms

מאמרים קשורים