הערכת תפקוד רב-מודלי של תאי T של קולטני אנטיגן כימריים ברזולוציה תא יחיד באמצעות ניתוח אופטופלודיקה

Summary

טיפול אימוץ בתאי T באמצעות תאי CAR-T מראה פוטנציאל בטיפול בסרטן הדם, אם כי התגובות המתמשכות אינן עקביות. תאי T פוליפונקציונליים קשורים לעמידות בהפוגה, אך בדיקות סטנדרטיות מסתירות תת-אוכלוסיות מרכזיות. אנו מציגים זרימת עבודה חד-תאית באמצעות פלטפורמת אופטופלואידיקה לזיהוי ובידוד תאי CAR-T פונקציונליים במיוחד למחקרים נוספים.

Abstract

טיפול מאמץ בתאי T הוא פרדיגמה טיפולית חדשנית שבה תאי T אוטולוגיים עוברים שינוי גנטי כדי לבטא קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לגידול לפני התרחבות ה-ex vivo והזרמה מחדש למטופל. למרות הדגמות מרשימות של עוצמה אנטי-גידולית אצל מטופלים עם ממאירות המטולוגית מתקדמת, תגובות ארוכות טווח אינן מתבטאות בחלק משמעותי מהמקרים. למרות שמספר גורמים ייחודיים עשויים לתרום לשונות בתוצאות הקליניות, ישנן עדויות גוברות לכך שאחוז תאי T פוליפונקציונליים במוצר תאי CAR-T לפני ההזלפה קשור מאוד לעמידות ההפוגה בסרטן. למרבה הצער, הערכות סטנדרטיות של מוצרי תאי CAR-T מסתמכות כיום על מדידות אוכלוסייה נרחבות או בדיקות סופיות, מה שמגביל את היכולת לבודד ולחקור תת-אוכלוסיות עם תכונות פונקציונליות מוגברות. כאן, אנו מדגימה תהליך המשתמש בפלטפורמת אופטופלואידיקה להערכת פרופיל הפרשת הציטוקינים וההפעלה באמצעות ביטוי CD137 של תאי CAR-T בודדים, שניתן לשלב באופן אופציונלי עם הערכת פעילות ציטוטוקסית. תאים המפגינים את רמת הפונקציונליות הרב-מודלית הגבוהה ביותר יכולים להיות מבודדים לניתוחים נוספים שינחו את עיצוב טיפולי תאי CAR-T מהדור הבא.

Introduction

תאי T המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הפגינו עוצמה אנטי-גידולית מרשימה אצל מטופלים עם ממאירות המטולוגית מתקדמת ^1,2. עם זאת, חלקים משמעותיים מהחולים המטופלים בסופו של דבר חוזרים למחלה, מה שמדגיש את הצורך לפתח מוצרי תאי CAR-T בעלי עמידות פונקציונלית גבוהה^יותר 3,4,5,6. למרות שגורמים ייחודיים רבים עשויים לתרום לשונות בתוצאות הקליניות, ישנן עדויות גוברות לכך שאחוז תאי ה-T הפוליפונקציונליים במוצר תאי CAR-T לפני ההזלפה קשור מאוד לעמידות ההפוגה בסרטן. לכן, אסטרטגיות להעשיר או להנדסה של תאי CAR-T עם פוליפונקציונליות גבוהה יותר יכולות להניב מוצרים טיפוליים עם פוטנציאל מוגבר לתגובות קליניות ארוכות טווח ^6,7,8. למרבה הצער, השיטות הנוכחיות לאפיון תפקודי תאי CAR-T מתבססות בעיקר על מדידות אוכלוסייה נרחבת או בדיקות טרמינליות. אלה מגבילים את היכולת לבודד ולחקור תת-אוכלוסיות ספציפיות עם תכונות רב-תכליתיות מוגברות. לדוגמה, הפרשת ציטוקינים נבדקת בדרך כלל באמצעות סופרנטנטים בכמויות גדולות או באמצעות צביעה תוך-תאית. האחרון דורש קיבוע תאים בתמורה למידע ברמת^{תא יחיד 9}. באופן דומה, פוטנציאל ציטוטוקסי מוערך בדרך כלל עבור אוכלוסיות תאי CAR-T בכמויות גדולות על ידי כימות אובדן החיוניות של תאי המטרה לאחר קו-קולטורציה של תאי T/תאי מטרה¹⁰. היכולת להעריך את הפרשת הציטוקינים, ההפעלה והפעילות הציטוליטית של תאי CAR-T ברי קיימא ברזולוציה של תא יחיד עשויה לעודד פיתוח מוצרים טיפוליים בעלי יעילות אנטי-גידולית עמידה יותר.

כאן, אנו מציגים שיטה לפרופיל בו-זמנית של תאי CAR-T בודדים לתפקוד רב-מודלי באמצעות פלטפורמת תא יחיד של אופטופלואידיקה (איור 1). המערכת עושה שימוש במיקום אופטו-חשמלי (OEP) כדי להזיז חרוזי לכידת ציטוקינים ותאים בודדים לעטים מופרדים מרחבית, ומאפשרים הערכות פונקציונליות של תאי CAR-T בודדים (איור 2A). בפרוטוקול זה, אנו מדגימים תהליך ליצירת תאי CAR-T באמצעות העברת גנים לא-ויראלית ומעריך את הפרשת והפעלת הציטוקינים דרך CD137 של תאי CAR-T בודדים במהלך קו-קולטורציה עם תאי מטרה מבטאים אנטיגנים ושליליים לאנטיגן (איור 3 ואיור 4)¹¹. הפוטנציאל להבחין בין פרופילי ציטוקינים ופרופילי הפעלה בין מוצרי תאים מותאמים מתבטא בהשוואה בין תאי CAR-T סטנדרטיים לתאי c-Jun שמביעים הבעה יתר על המידה⁶. פעילות ציטוטוקסית נגד תאים חד-מטרה ניתנת גם להערכה באמצעות קריאות מבוססות קספאז או פלואורסצנציה על פלטפורמת אופטופלואידיקה (איור 2B). עם זאת, נדרש ניתוח טיים-לאפס כדי לקבוע את קינטיקת האינטראקציה, שיכולה להשתנות באופן משמעותי עבור כל מבנה וניסוי של CAR. באופן דומה, בדיקות הרג חוזרות שמחקות גירוי כרוני דורשות זרימת עבודה חלופית. לכן, במאמר זה אנו מתארים את ההליך הבסיסי להערכת ציטוטוקסיות אך איננו דנים ביישומים המפורטים שלו.

בהתבסס על ההערכה והמאפיינים הנבחרים, ניתן לפרוק תאי CAR-T חיים המציגים את רמת הפונקציונליות הרב-מודלית הגבוהה ביותר מהמכשיר ולהעביר לבארות בודדות בלוחות של 96 בארות להמשך מחקר (איור 2C).

Protocol

הערה: הבופר וההכנה למדיה מופיעים בטבלה 1.

1. בידוד תאי T של CD8 מקונוס מערכת הפחתת לויקוציטים

הערה: בצע את כל השלבים בטכניקה סטרילית ואספטית בארון ביוסייטי לתרביות רקמה. כל המדיה לדילול, שטיפות והשעיה מחדש צריכה להישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך.

1. הוסף 15 מ"ל של מדיום הפרדה לתאים (צפיפות 1.077 גרם למ"ל) לכל אחד משני צינורות חרוטיים בקוטר 50 מ"ל (צינור הפרדה).
2. החזק חרוט מערכת הפחתת לויקוציטים (LRS) (צד חרוטי כלפי מטה) מעל צינור חרוטי בקוטר 50 מ"ל ללא כיסוי. בעזרת מספריים סטריליסטיים, חתכו את צינור הפלסטיק שמתחת לקונוס ה-LRS. מניחים את חרוט ה-LRS מעל צינור הקונוס הפתוח של 50 מ"ל וחתוך את צינור הפלסטיק מעל. אסוף כ-8-10 מ"ל דם בצינור הקוני של 50 מ"ל.
3. מלאו את צינור הקונוס של 50 מ"ל עד 50 מ"ל ב-PBS + EDTA (כפי שמצוין ברשימת המדיה והבופרים) ופיפטה לערבוב הדם המדולל. חלק את הדם המדולל שווה בשווה בין שני צינורות ההפרדה.
4. צנטריפוגה את צינורות ההפרדה עם דם מדולל בעוצמה של 750 x g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), עם 9 דקות כהאצה ו-2 כהאטה.
5. באמצעות פיפטה סרולוגית בנפח 10 מ"ל, אספו בזהירות והעבירו את שכבת הבופי מכל צינור הפרדה לצינור קוני חדש של 50 מ"ל.
6. מלאו כל צינור קוני בנפח 50 מ"ל עד 40 מ"ל ב-PBS + EDTA ומרחפים מחדש כדי לקבל תליות חד-תאיות. צנטריפוגה את המתלים החד-תאיים ב-300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
7. תשתה מחדש ומשלב את כדורי התאים ב-40 מ"ל של PBS + EDTA. צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב-300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט.
8. החזירו את כדור התא ל-PBS + EDTA וקבעו את צפיפות התאים הקיימת של תלות תאי הדם המונוגראלי ההיקפי (PBMC) באמצעות צביעת Trypan Blue.
   הערה: Trypan Blue הוא צבע חדיר של תאים חיים שמכתים DNA. לכן, גם PBMCs חיים וגם תאים לא גרעיניים (כלומר, תאי דם אדומים) יישארו ללא צבע. חשוב להוציא תאים קטנים (למשל, תאי דם אדומים) בעת קביעת צפיפות ה-PBMC הקיימת.
9. העבר את מספר ה-PBMCs הרצוי לצינור קוני חדש בנפח 50 מ"ל להעשרת תאי T מגנטית של CD8⁺ . העריך פי 10 את מספר תאי ה-CD8⁺ T הרצויים ככמות ההתחלה של תאי PBMC הנדרשים להעשרה מגנטית. שמור על החומרים קרים במהלך ההליך.
10. צנטריפוגה את מתלה תאי PBMC ב-300 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא ל-40 מיקרוליטר של MACS Buffer (כפי שמצוין ברשימת המדיה והבופרים)^{לכל 1 על} 10 7 תאים.
11. הוסיפו 10 מיקרוליטר של קוקטייל ביוטין-AB של תאי CD8⁺ לכל 1 על^{10 תאים} . מערבבים על ידי פיפטינג ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
12. הוסף 30 מיקרוליטר של MACS Buffer לכל תא 1 x 10⁷ . הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי תאי T מסוג CD8⁺ לכל 1 על^{10 7} תאים. מערבבים על ידי פיפטינג ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
13. הניחו עמודות LS מקוררות מראש על מגנט. הניחו צינור קונוסי בקוטר 15 מ"ל מתחתיו כדי לאסוף את זרימת הנוזלים. איזון כל עמודת LS עם 3 מ"ל של MACS Buffer.
14. באמצעות אותו צינור קוני של 15 מ"ל כמו צינור האיסוף, יש להחיל את תליית התא על עמודת ה-LS המאוזנת. שטוף את העמודה 3 פעמים עם 1 מ"ל של MACS Buffer. תן לכל שטיפה של 1 מ"ל לעבור לגמרי דרך עמודת ה-LS לפני שמיישמים את השטיפה הבאה.
15. החזירו בזהירות את התאים שנאספו וקבעו את צפיפות התאים הקיימת של תליית תאי ה-CD8⁺ העשירה באמצעות צביעת Trypan Blue.

2. הפעלה מבוססת חרוזים של תאי T מסוג CD8⁺

1. חשב את מספר חרוזי CD3/CD28 האנושיים הנדרשים ליחס 1:1 של תאי T לחרוזים. מלאי חרוזי ההפעלה מכיל 1 x 10,⁶ חרוזים ל-25 מיקרוליטר.
2. מערבול עדין את חרוזי ההפעלה למשך לפחות 30 שניות לפני העברת נפח ההשעיה המחושב לצינור קוני של 15 מ"ל. הוסיפו נפח שווה של מדיום כדי לשטוף את החרוזים והמערבולת למשך לפחות 5 שניות.
3. הניחו את צינור הקונוס בקוטר 15 מ"ל בתוך המגנט המתאים למשך דקה אחת כדי לאסוף את החרוזים בצדדי הצינור. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
4. חשב את נפח המדיום הנדרש לריכוז סופי של תאי T של 1 x 10⁶ תאי T למ"ל. הסר את צינור החרוט של 15 מ"ל מהמגנט ותשהה מחדש בנפח המחושב של מדיום התרבות. הוסף את IL-2 האנושי הרקומביננטי לריכוז סופי של 50 U/mL.
5. העבר את התווך המלא לצינור המכיל את תאי ה-T והשהיה מחדש. זורעים את תליית התא לפורמט תרבית תאים מתאים (למשל, 1 מ"ל בלוחות 48 בארות, 2 מ"ל בלוחות 24 בארים) ודגירה למשך 40 שעות.

3. יצירת תאי CAR-T באמצעות העברת גנים לא-ויראלית באמצעות נוקלאופקציה

הערה: חימום מוקדם של מדיום (37 מעלות צלזיוס), חומרים (RT) וצנטריפוגה (RT) הוא קריטי לספק יעילות העברת גנים גבוהה.

1. הכינו ותייגו לוח עם 48 בארות עם 1 מ"ל מדיום תרבית תאים לכל מצב גרעין. דגרו את הצלחת לפחות 30 דקות כדי לספק מדיום חם ומותאם_ל-CO2 עם pH פיזיולוגי.
2. הפעל את הנוקלאופקטור ובחר את המיקומים שיש להטמיע בתוך רצועת 16 הבארות. בחר את התוכנית המתאימה (למשל, FI-115 שתעדיף יעילות גבוהה או EO-115 ליעילות גבוהה יותר).
3. הוצא את לוח תרבית התאים עם תאי T מהאינקובטור והשתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את המראה הוויזואלי של התאים, כדי לקבל רושם ראשוני אם ההפעלה הצליחה. תאי T שמופעלים בהצלחה אמורים להראות התקבצות אחידה וצורת תא מוגדלת. צבע בינוני שונה ממדיום טרי לגוון כתום קל מצביע על כך שההפעלה הובילה למצב מטבולי פעיל יותר ונחשב לסימן טוב. בשלב זה, ניתוח זרימה-ציטומטרי של סמני הפעלה מוקדמים CD25 ו-CD69 יכול לאמת את ההפעלה.
4. להשהה, לקצור ולספור תאי T מופעלים. חשב את מספר תאי T הנדרש על ידי התחשבות בין 1.2 ל-2 x 10⁶ תאי T לכל תנאי. העבר את הנפח המחושב לצינור קוני חדש של 15 מ"ל וצנטריפוגה בצנטריפוגה בעוצמה של 200 x g למשך 10 דקות ב-RT.
5. שואף והשליך סופרנטנט ושוטף תאי T עם 10 מ"ל של PBS חם. צנטריפוגה בעוצמה של 200 x גרם למשך 10 דקות ב-RT. נצלו את זמן הצנטריפוגה כדי להפשיר את הפלסמידים המקודדים על ידי CAR, בדרך כלל בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר DNA. הרכבת פלסמיד קידוד טרנספוזאז (SB100x) (1.0 מיקרוגרם) או מיניסירקל (0.5 מיקרוגרם) יחד עם פלסמיד מקודד CAR (1.0 מיקרוגרם) או מיניסירקל (0.6 מיקרוגרם) בצינור מיקרוצנטריפוגציה 1.5 מ"ל ללא DNA בתנאי נוקלופקציה.
6. הכינו כמות מספקת של תמיסת נוקליאופקטור P3 עם תוספת תוספת (לפי תנאי: 16.4 מיקרוליטר תמיסת נוקליאופקטור + 3.6 מיקרוליטר של תוסף).
7. הוציאו את צינור הקונוס של 15 מ"ל המכיל את תאי ה-T מהצנטריפוגה, שאפו סופרנאנט וצנטריפוגה למשך דקה אחת בעוצמה של 200 x גרם כדי לאסוף נוזל שאריתי בתחתית. קח פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בזהירות כמה שיותר בופר מבלי לגעת בכדור התא.
8. יש להמשיך מיד עם ההשעיה מחדש של כדור תא T ב-20 מיקרוליטר של בופר P3 (כפי שמצוין ברשימת החומרים) לכל תנאי. העבר 20 מיקרוליטר של תליית תא בבופר P3 לצינור מיקרוצנטריפוגציה בנפח 1.5 מ"ל המכיל את המבנים המתאימים, ערבב בעדינות ללא הכנסת אוויר, והעבר את תליית התא לרצועת הגרעין של 16 הבארות. טפחו בעדינות כדי להוציא אוויר מהתחתית של הבאר.
9. הניחו את רצועת 16 הבארים במערכת הנוקלאופקטור 4-ממדית והתחילו בהליך הנוקליאופקציה. לאחר נוקליופקציה מוצלחת, צלב ירוק אמור להיות גלוי על המסך עבור כל באר שנבחרה.
10. מיד הוסיפו 100 מיקרולטר של מדיום מחומם מראש מהצלחת המוכנה עם 48 בארות לפני דגירה של רצועת 16 בארות למשך 10 דקות באינקובטור.
11. תלה בזהירות 2x עד 3x, העבר את מתלה התא ללוח 48 בארות שהוכן, והחזר אותו לאינקובטור.
12. לאחר 4-5 שעות, הסר בזהירות 500 מיקרוליטר מכל באר ומוסיפים בזהירות 500 מיקרוליטר מדיום תרבית טרי ומחומם מראש בתוספת 50 U/mL IL-2 רקומביננטי אנושי.
13. בצע החלפות מדיה סדירות כל יומיים כדי להרחיב את התאים, תוך שמירה על צפיפות תאים בין 0.5 ל-2 x 10⁶ T תאים/מ"ל.
14. ביום השישי, הסר את חרוזי ההפעלה של CD3/CD28. קצור תאי T על ידי השעיה עדינה של 10x והעברת תליית התא לצינור קוני של 15 מ"ל. הנח את צינור הקונוס של 15 מ"ל בתוך המגנט המתאים למשך דקה.
15. שואף את תליית התא, מעביר ללוח תרבית טרי, והזין תאים עם מדיום תרבית תאים טרי בתוספת IL-2 לריכוז סופי של 50 U/mL. החרוזים צריכים להישאר גלויים בדפנות הצדדים של צינור הקונוס בקוטר 15 מ"ל שנותר במגנט.
16. נתח את יעילות העברת הגנים ביום השביעי באמצעות ניתוח זרימה-ציטומטרי של ביטוי CAR או סמן מחליף לפני המשך למיון מגנטי של תאי CAR חיוביים לטרנסגנים ביום השמיני (אסטרטגיית שער באיור משלים 1).

4. העשרה מגנטית של תאי T חיוביים לטרנסגנים

הערה: בצע את כל השלבים בטכניקה סטרילית ואספטית בארון ביוסייטי לתרביות רקמה. כל המדיה לדילול, שטיפות והשעיה מחדש צריכה להישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך.

1. קציר תאי T על ידי השעיה עדינה והעברה לצינורות חרוטיים בגודל 15 מ"ל. סופרים תאי T, קחו את מספר התאים להעשרה מגנטית וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב-300 x g.
2. שאפו וזרקו סופרנטנט ושטפו על ידי השעיה מחדש של 10 מ"ל של בופר MACS. צנטריפוגה ל-10 דקות ב-300 x g. שאיפה והשלכת סופרנטנט.
3. חשב את כמות הנוגדן הביוטינילאטיבי המכוון נגד הסמן המחליף (למשל, tEGFR) הנדרש. בדרך כלל, יש להטות את רמת הנוגדן ל-1 מיקרוליטר ל-1 על^{10 תאים} .
4. החזירו תאי T בצפיפות של 1 × 10⁷ תאים למ"ל והוספו את כמות הנוגדן הביוטינילטי שמחושבת. דגרו במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C.
5. שטוף על ידי הוספת 10 מ"ל של בופר MACS וצנטריפוגה 10 דקות ב-300 x גרם. שאיפה והשלכת סופרנטנט.
6. החזירו תאי T ל-1 על^{10 7} תאים לכל 80 מיקרוליטר של בופר MACS. הוסיפו מיקרו-חרוזי אנטיביוטין בנפח של 20 מיקרוליטר ל-1 על^{10 7} תאים. ערבבו היטב ודגרו 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. שטוף על ידי הוספת 10 מ"ל של בופר MACS וצנטריפוגה 10 דקות ב-300 x גרם. שאיפה והשלכת סופרנטנט. החזירו תאים ל-500 מיקרוליטר של בופר MACS.
8. הניחו עמודות LS מקוררות מראש על מגנט. הניחו צינור קונוסי בקוטר 15 מ"ל מתחתיו כדי לאסוף את זרימת הנוזלים.
9. איזון כל עמודת LS עם 3 מ"ל של MACS Buffer. באמצעות אותו צינור קוני של 15 מ"ל כמו צינור האיסוף, יש להחיל את תליית התא על עמודת ה-LS המאוזנת.
10. שטוף את העמודה 3 פעמים עם 1 מ"ל של MACS Buffer. תן לכל שטיפה של 1 מ"ל לעבור לגמרי דרך עמודת ה-LS לפני שמיישמים את השטיפה הבאה.
11. כדי לאסוף תאים חיוביים לטרנסגנים, קחו את עמודת ה-LS מהמגנט והכניסו אותה לצינור קוני חדש בנפח 15 מ"ל. הוסיפו 5 מ"ל של בופר MACS ודחפו בעדינות את הנוזל החוצה מהעמודה.
12. ספרו את התאים והצנטריפוגה המבודדים במשך 10 דקות ב-300 x g. החזר את התאים החיוביים לגן טרנסגני בנפח מתאים של מדיום עם תוספת IL-2 ודוגר עד לביצוע הערכות פונקציונליות ו/או פנוטיפיות. בצע בדיקת טוהר לפני תחילת תהליכי העבודה על ידי צביעה עבור סמן CAR או סמן הטרנסדוקציה תחליף (איור משלים 2).

5. הכנת מערכת

1. הפעל את המכשיר ופתח את תוכנת Cell Analysis Suite (CAS). ודאו שמיכל איסוף הפסולת ריק. ודאו שיש מים בעמודת מכשיר האדים.
2. נווט לפאנל תהליכי עבודה. פתח את תהליך העבודה Full Clean (נטען מראש במהלך התקנת המערכת).
   הערה: מומלץ להריץ את תהליך Full Clean בתוך 72 שעות מתחילת ניסוי על הכלי.
3. בצע את כל הבדיקות והמשך על ידי לחיצה על התחל. כאשר מתבקשים, החליפו את הצינורות הקוניים ובקבוקי התגובה בכל אחד מחריצי תא החומרים במיכלים טריים עם תמיסת ניקוי BLI. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
4. כאשר מתבקשים, החליפו את הצינורות הקוניים ובקבוקי התגובה בכל אחד מחריצי תא החומרים במיכלים טריים עם מים סטריליים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
5. פתח את תהליך העבודה של בדיקת קדם-טיסה (נטען מראש במהלך התקנת המערכת). בצע את כל הבדיקות והמשך על ידי לחיצה על התחל.
6. הכינו צינור קוני של 50 מ"ל עם 2 מ"ל תמיסת רטבה. הכינו צינור קוני נפרד בנפח 50 מ"ל עם 39.6 מ"ל של 1x DPBS ו-400 מיקרוליטר של תוסף רטבה.
7. כאשר מתבקשים, החלף את שבב ה-Flush בשבב אופטופלואידיקס. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך. נקה בזהירות את פני השטח של שבב האופטופלואידיקה ואת הפרולים של הקן עם 70% אתנול לפני סגירת הקנים.
8. כאשר מתבקשים, החליפו את הצינורות הקוניים ובקבוקי התגובה בכל חריץ בתא המגיב במיכלים טריים עם התמיסות המתאימות.

6. יצירת זרימת עבודה בבדיקות

1. נווט לפאנל תהליכי עבודה. בחר ליצור זרימת עבודה חדשה (+), לבחור פרופיל תא Opto T, ואז לבחור MCA ו-Cytotoxicity Assay מהתפריט הנפתח ב-MCA.
2. לחץ כפול על Cytokine Bead Load כדי להרחיב את רשימת הטעינה של החרוזים. אם אתה בודק פחות מ-3 מטרות ציטוקינים, לחץ על ה-X כדי למחוק חרוזים ציטוקינים מרשימת טעינת החרוזים.
3. עדכן כל שדה עם סוג החרוז המתאים, יעד הציטוקינים ומיקום הייבוא.
   הערה: תוכנת CAS טוענת אוטומטית כל חרוז לכידת ציטוקינים לפי סדר הירידה בבהירות Cy5, ללא קשר לאופן שבו ערכי הטעינה של החרוזים מסודרים.
4. לחצו פעמיים על Prioritized APC Load עם Control כדי להרחיב את רשימת העומס לתאי היעד. אם בודקים יותר מתא יעד אחד של תאי ביקורת וקו תאי מטרה אחד של דגימה, הוסף שלבי טעינה נוספים של תאים.
5. עדכן כל שדה עם שם קו תא המטרה הרצוי, שדה הראייה (FOVs) הרצוי לעין, וקריטריוני בחירת APC (על ידי ציון קובץ תבנית בחירת עט היעד (TPS).
6. בחר ב-T Cell Load Configuration ובחר מספר קווי תאים. לחצו פעמיים על Priority T Cell Load כדי להרחיב את רשימת העומס של T-cell.
7. עדכן כל שדה עם שם קו תא ה-T הרצוי, שדה הראייה הרצוי לכתיבה, וקריטריוני בחירת תאי T (על ידי ציון קובץ תבנית ה-TPS).
8. לחצו פעמיים על בדיקת ציטוטוקסיות כדי להרחיב את הגדרות בדיקת הציטוטוקסיות. עדכן את שדות הגדרות ההדמיה הספציפיים לזרימת העבודה עם משך הבדיקה הרצוי (h).
9. בדיקות פנוטיפ וציטוקינים בלחיצה כפולה להרחבת פרוטוקול הצביעה של בדיקת הפרשת הציטוקינים.
10. עדכן את שדות On Chip Staining עם מיקום הייבוא המתאים לכתמים הראשיים והמשניים.
11. לחצו פעמיים על T Cell Unload כדי להרחיב את רשימת הפריקה. עדכן את שדה # הייצוא לכל שבב (כולל ריקים) למספר הייצוא הרצוי. שמור ופתח את זרימת העבודה החדשה.

7. עומס חרוזי לכידת ציטוקינים

1. סוניקט ו/או מערבולת לכל בקבוקון חרוזים כדי להחזיר את חרוזי הלכידה לחלוטין. קבעו את ריכוז החרוזים באמצעות מד תאים.
2. כוונו את צפיפות החרוזים ל-4.5 x 10⁶ חרוזים למ"ל (חרוזים מסוג A) או 4 x 10⁶ חרוזים למ"ל (חרוזים מסוג B) ב-30 מיקרוליטר של בופר דילול חרוזים.
3. אחסן את מתלי החרוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמתבקשים להעמיס לתא הטעינה של הדגימה. בצע את כל הבדיקות והמשך על ידי לחיצה על התחל.
4. כאשר מתבקשים, מערבבים את מתלה החרוזים של הציטוקינים עם פיפטה של 20 מיקרוליטר וטענו את מתלה החרוזים למיקום הייבוא המתאים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
5. כאשר מתבקשים, יש לבדוק ויזואלית מספר שדה ראייה (FOVs) כדי לוודא שחרוזי הלכידה נטענו בהתפלגות אחידה בין תעלות הנוזל בצפיפות מתאימה. אם התפלגות הטעינה ו/או הצפיפות היו לא אופטימליות, בחר ב-Flush ו-Import כדי לנסות שוב את טעינת החרוזים. אם התפלגות העומס והצפיפות היו מספקות, בחרו ב-Proceed כדי להתחיל ביצירת חרוזים.
6. חזור על שלב 7.3 עבור כל חרוז לכידת ציטוקינים.

8. עומס תאי מטרה

1. קבעו את צפיפות התאים החיים של כל קו תא יעד באמצעות צביעת Trypan Blue.
   הערה: תהליך עבודה זה מניח שתאי היעד מגיעים מתרביות פעילות. אם רוצים להשתמש בתאים מוקפאים במקום זאת, ודא שהתאים תורבדו לפחות למעבר אחד לאחר ההפשרה והם לפחות 90% חיוניים.
2. קצור 1 על^{10 תאי מטרה של 6} לתוך צינור מיקרופוג' בנפח 1.7 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאיפת את הסופרנטנט.
3. החזירו כל כדור תא מטרה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת Annexin V. דגרו 30 דקות ב-RT, מוגנים מאור.
4. הוסיפו 400 מיקרוליטר של בופר קישור 1x Annexin V והשלים מחדש באמצעות פיפטינג. צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאיפת את הסופרנטנט.
5. החזירו כל כדור תא מטרה ב-250 מיקרוליטר של מדיה טעינה + CaCl₂. אחסן את מתלי תא המטרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיבקשו להעמיס את תא הטעינה של הדגימות.
6. כאשר מתבקשים, החזירו את תאי המטרה עם פיפטה של 200 מיקרוליטר וטענו את תאי המטרה למיקום הייבוא המתאים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
7. כאשר מתבקשים, יש לבדוק ויזואלית מספר שדה ראייה כדי לוודא שתאי המטרה טעונו בהתפלגות אחידה על פני תעלות הנוזל בצפיפות מתאימה. אם התפלגות העומס ו/או הצפיפות היו פחות אופטימליות, בחרו ב-Flush ו-Import כדי לנסות שוב טעינה של תאי יעד. אם התפלגות העומס והצפיפות היו מספקות, בחר ב-Proceed כדי להתחיל ב-TPS gating.
8. כאשר מתבקשים, עבור ל-Manual Operations, ואז לחץ על TPS וטען את תבנית ה-TPS המבוקשת.
9. ציין את המסנן(ים) האופטיים ואת ה-FOVs שיש לצלם להגדרת שערי TPS, ואז לחץ על Capture Only כדי להתחיל ברכישת תמונה.
10. פתח את עורך הגדרות השער, לחץ על תיבת הסימון של Annexin, ובחר את הערוץ המתאים לצביעה של Annexin V עבור פרמטר X. מהתפריט הנפתח בחר לLog (Delta Median Brightness). בחר OEP עבור פרמטר Y. מהתפריט הנפתח בחר 'השכן הקרוב ביותר'.
11. גרור את הפינות של השער שנוצר כדי להוציא את Annexin V^hi ותאי^{Nearest Neighbor low} , ואז שמור את תבנית ה-TPS בלי לשנות את שם הקובץ.
12. חזור ל-Workflows ולחץ על המשך כדי להמשיך בכתיבה. חזור על שלבים 8.7-8.11 עבור כל קו תא יעד.

9. עומס תא T

1. קבעו את צפיפות התאים החיים של כל קו תאי T באמצעות צביעת Trypan Blue.
   הערה: תהליך עבודה זה מניח שתאי ה-T מגיעים מתרביות פעילות. אם רוצים להשתמש בתאים מוקפאים במקום זאת, ודא שהתאים תורבתו במהלך הלילה לאחר ההפשרה והם לפחות 90% חיוניים.
2. אספו 1 על 10 תאי T עם⁶ תאי T לתוך צינור מיקרופוגה בנפח 1.7 מ"ל. צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאיפת את הסופרנטנט.
3. החזירו כל כדור תא מטרה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת Annexin V. דגרו 30 דקות ב-RT, מוגנים מאור.
4. הוסיפו 400 מיקרוליטר של בופר קישור 1x Annexin V והשלים מחדש באמצעות פיפטינג. צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאיפת את הסופרנטנט.
5. החזירו כל כדור תא T ל-250 מיקרוליטר של חומר טעינה + CaCl₂. אחסן את מתלי תא ה-T בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיתבקשו להעמיס לתא הטעינה של הדגימות.
6. כאשר מתבקשים, החזירו את תאי היעד עם פיפטה של 200 מיקרוליטר וטענו את מתלה תא ה-T למיקום הייבוא המתאים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
7. כאשר מתבקשים, יש לבדוק ויזואלית מספר שדה ראייה (FOVs) כדי לוודא שתאי ה-T טעונו בהתפלגות אחידה על פני הערוצים הנוזליים בצפיפות מתאימה. אם התפלגות העומס ו/או הצפיפות היו מתחת לאופטימליות, בחרו ב-Flush ו-Import כדי לנסות שוב טעינת T-cell. אם התפלגות העומס והצפיפות היו מספקות, בחר ב-Proceed כדי להתחיל ב-TPS gating.
8. כאשר מתבקשים, עבור ל-Manual Operations, ואז לחץ על TPS וטען את תבנית ה-TPS המבוקשת.
9. ציין את המסנן(ים) האופטיים ואת ה-FOVs שיש לצלם להגדרת שערי TPS, ואז לחץ על Capture Only כדי להתחיל ברכישת תמונה.
10. פתח את עורך הגדרות השער, לחץ על תיבת הסימון של Annexin, ובחר את הערוץ המתאים לצביעה של Annexin V עבור פרמטר X. מהתפריט הנפתח בחר לLog (Delta Median Brightness). בחר OEP עבור פרמטר Y. מהתפריט הנפתח בחר 'השכן הקרוב ביותר'.
11. גרור את הפינות של השער שנוצר כדי להוציא את Annexin V^hi ותאי^{Nearest Neighbor low} , ואז שמור את תבנית ה-TPS בלי לשנות את שם הקובץ.
12. חזור ל-Workflows ולחץ על המשך כדי להמשיך בכתיבה. חזור על שלבים 9.7-9.11 עבור כל קו תאי T.

10. בדיקת ציטוטוקסיות

1. הכינו מדיום פרפוזיה בצינור קונוסי בנפח 50 מ"ל על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תגובת NucView 530 Caspase-3 מופשרת מראש ל-20 מ"ל מדיום T (ריכוז מלאי 1 מ"מ, ריכוז סופי 5 מיקרומון).
2. כאשר מתבקשים, החלף את הצינור הקוני המתאים בחריצי תא התגובה עם הצינור הקוני המוכן המכיל את חומר הפרפוזיה. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
   הערה: 20 מ"ל של מדיום פרפוזיה מספיקים לפרפיוז שבב אופטופלואידיקה יחיד למשך 24 שעות. הכינו מדיום פרפוזיה נוסף אם בדיקת הציטוטוקסיות אמורה להימשך יותר מ-24 שעות.
3. אם תרצו, סיימו כל שלבי הדמיה שנותרו של בדיקת ציטוטוקסיות בכל שלב לאחר שעברו 14 שעות על ידי לחיצה על דלג על שאר ההדמיה של TPS והמשיכו בתהליך העבודה.

11. בדיקת פנוטיפ וציטוקינים

1. הכינו את תמיסת הצביעה הראשונית בצינור מיקרופוג' בנפח 1.7 מ"ל על ידי ערבוב 76 מיקרולטר של נוגדנים לזיהוי פאנלים CD8/NK אנושי מולטיפלקס ו-4 מיקרוליטר של אנטי-CD137_BV421.
2. ערבבו על ידי פיפטינג ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמתבקשים לטעינה. כאשר מתבקשים, ערבב את תמיסת הצביעה הראשית עם פיפטה של 20 מיקרוליטר וטען למקום הייבוא המתאים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
3. הכינו את תמיסת הצביעה המשנית בצינור מיקרופוג' נפרד בנפח 1.7 מ"ל על ידי ערבוב 72 מיקרוליטר של 1x DPBS עם 8 מיקרוליטר של ערכת המולטיפלקס SA-PE.
   הערה: יש להכין את תמיסת הצביעה המשנית מראש, כך שתהיה מוכנה לטעינה מיד עם סיום הצביעה הראשית.
4. ערבבו על ידי פיפטינג ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמתבקשים לטעינה. כאשר מתבקשים, מערבבים את תמיסת הצביעה המשנית עם פיפטה של 20 מיקרוליטר וטענו למקום הייבוא המתאים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.

12. ניתוח בדיקה

1. נווט לשולחן העבודה ופתח את תוכנת Assay Analyzer . בחר ב-Assay Analyzer, בחר Workflows, ואז בחר את סוג תהליך העבודה שיש לנתח.
2. השתמש בכל קריטריון רצוי כדי להגדיר עטים שמעניינים לפריקה. צור את רשימת ה-unload לפי הקריטריונים הרצויים, ואז חזור לתוכנת CAS ובחר ב-Continue workflow select.
3. אמת את תיבת הסימון של רשימת יצירת ייצוא עם Assay Analyzer עבור: [Optofluidics Chip ID] מסומן.

13. פרק

1. הכינו לוח תחתית עגול עם 96 בארות עם 50 מיקרוליטר מדיה של תאי T לכל באר. לחץ על המשך כדי להמשיך בפריקת התא.
2. כאשר מתבקשים, פתח את תא הטעינה של השבב, פתח את מכסה הקן, והסר את שבב האופטופלואידיקה. הניחו את השבב בצלחת פטרי סטרילית, כאשר הקצה העליון של שבב האופטופלואידיקה מורם ב->1° כדי למנוע תאים להתגלגל החוצה מהעטים. אחסן באינקובטור תרבית רקמה סטרילי במהלך שלב השטיפה הבא.
3. הניחו שבב סטרילי ב-Flush בקן הריק, סגרו את מכסה הקן, ואז סגרו את מפרץ הצ'יפס. לחץ על 'בוצע' ואז 'המשך'.
4. כשמתבקשים, פתח את תא הטעינה של השבב, פתח את מכסה הקן, והסר את שבב השטיפה. החלף את שבב האופטופלואידיקה לתוך הקן הריק, סגור את מכסה הקן, ואז סגור את תא השבבים. לחץ על סמל הריצה כדי להמשיך.
5. כאשר מתבקשים, בחר Open כדי להציג את תפריט Load/Unload Plate Plate . לחץ על 'Unload' כדי להסיר את הלוחית הקודמת. עדכן מזהה לוחית באר וסוג פלטת באר, בחר טעינה, ואז בחר בוצע.
6. לחץ על המשך כדי להמשיך בפריקת התא. לאחר שכל העטים הרצויים פורקו, עברו ל-Manual Operations ופתחו את תא השבבים כדי לאסוף את הפלטה המכילה את התאים הרלוונטיים.

Results

באמצעות הפרוטוקול שתיאר, אתגרנו תאי T מדומים, תאי CAR, ובעלי ביטוי יתר של c-Jun, עם תאי גידול שליליים לאנטיגן או חיוביים לאנטיגן ( איור 3 K562), או השארנו אותם ללא גירוי (רק תאי T). תאי המטרה הוערכו מבחינת ביטוי הומוגני של האנטיגן כתנאי מוקדם לתוצאות ניתנות לשחזור (איור משלים 3). בזכות הבידוד שלהם בננו-עטים בודדים, הצלחנו לאפיין את פרופילי הביטוי של הציטוקינים של תאים אלו כמפיקים יחידים, כפולים או משולשים, בהתאם למצב שנבדק (איור 3). תוצאות אלו אומתו באמצעות ELISA כשיטה מבוססת לזיהוי ציטוקינים (איור משלים 4).

כצפוי, רוב תאי ה-T המדומים-גרעינים נשארו שליליים לכל שלושת הציטוקינים שנמדדו (TNF-α, IFN-γ ו-IL-2). בקרב תאי CAR T סטנדרטיים, יצרני ציטוקינים IFN-γ כפולים, משולשים ויחידיים, וכן חלקים קטנים של תאים מפרישים TNF-α ו-IL-2, זוהו באתגר אנטיגן, בעוד שחשיפה לתאי גידול שליליים לאנטיגן לא גרמה להפרשת ציטוקינים רב-תאיים. מעניין לציין כי ביטוי יתר של c-Jun הגדיל את שיעור יצרני הציטוקינים הכפולים והמשולשים, וכן התאים המפרישים ציטוקין יחיד, במפגש עם המטרה, ובכך הפחית את החלק הכולל של תאים שליליים לציטוקין בהשוואה לתאי CAR T סטנדרטיים. תוצאות אלו תואמות לדיווחים קודמים שתיארו את המודולציה הפנוטיפית של תאי CAR T על ידי ביטוי כפוי^{של פקטור} השעתוק 6 הזה. ראוי לציין כי ראינו אחוז גדול יותר של תאים חיוביים ל-IFN-γ בקבוצת תאי T בלבד מאשר בקבוצת תאי הגידול השליליים לאנטיגן, מה שעשוי לנבוע ממספר התאים הקטן יותר שנותחו במצב זה.

כדי לחקור עוד את הפעלת תאי T, הערכנו את ביטוי CD137 בתאי CAR מדומים, CAR, ותאי CAR בעלי ביטוי יתר של c-Jun וטופלו כפי שתואר לעיל (איור 4 וטבלה משלימה 1). האתגר של תאי T של CAR עם תאי מטרה K562 המבטאים אנטיגן גרם לעלייה בביטוי CD137 בהשוואה לתאי מדומה-גרעין. יתרה מזאת, ראינו מגמה של שיעור מעט גבוה יותר של תאים חיוביים ל-CD137 בקרב תאי CAR T שמביעים יתר על המידה c-Jun בהשוואה למוצר CAR הסטנדרטי.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר אפשר הערכת הפרשת והפעלת ציטוקינים של תאי CAR T ברמת התא היחיד, מה שאפשר זיהוי יצרני ציטוקינים חד-תאיים ורב-תאיים ולחזור מגמות פנוטיפיות שתוארו קודם לכן ברמת⁶.

איור 1: זרימת עבודה סכמטית לפרופילינג מולטימודלי באמצעות פלטפורמת אופטופלואידיקס. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

איור 2: תמונות מייצגות של תכונות שונות של פלטפורמות אופטופלואידיקה. (א) ייבוא רצף החלקיקים הבודדים לעטים בודדים באמצעות OEP. העטים בחלק השמאלי של התמונות נטענו ברצף הקודם. (ב) אירועי הרג בשלושה עטים בודדים לאורך זמן, המראים תאי גידול המבטאים GFP ומבטאים אנטיגן. (ג) ייצוא של תא בודד מעט אחד באמצעות OEP. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: ניתוח מייצג של פרופילי הפרשת ציטוקינים ברמת התא היחיד. תאי T בודדים עם גרעין מדומה או תאי CAR-T גודלו בנוכחות או בהיעדר תאי גידול שליליים לאנטיגן או חיוביים לאנטיגן K562 בתוך ננו-עטים המכילים חרוזי לכידת ציטוקינים עבור TNF-α, IL-2 ו-IFN-γ. תרשימי עוגה מציגים את הפרופורציות של תאי CAR-T שנכתבו בנפרד עם פרופיל הפרשת הציטוקינים לאחר 24 שעות של קו-קולטורציה (ניתוח נקודת קצה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: ניתוח מייצג של ביטוי CD137 ברמת התא היחיד. תאי T בודדים עם מוק-נוקלאופקט או תאי CAR-T צוברו לצורך ביטוי פני השטח של CD137 על שבב האופטופלואידיקס, 24 שעות לאחר התרבית, בנוכחות או בהיעדר תאי גידול שליליים לאנטיגן או חיוביים לאנטיגן ב-K562. גרפים של כינור מציגים את עוצמת הפלואורסצנציה של ביטוי CD137 על תאי T מדומים-גרעיניים ותאי CAR-T לאחר 24 שעות של תרבית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

רכיבי מדיום תאי T (סינון סטרילי באמצעות יחידות סינון ואקום 0.22μM)	נפח (ריכוז סופי)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	5 מ"ל (90 U/mL)
β-מרקפטואנול (50 מ"מ)	0.5 מ"ל (45 מיקרומטר)
סרום אנושי (מושבת חום)	50 מ"ל (9%)
תוסף GlutaMAX (100x)	5 מ"ל (0.9x)
רכיבי מדיום תאי הגידול	נפח (ריכוז סופי)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 מ"ל
פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	5 מ"ל (90 U/mL)
סרום עגל עוברי (מושבתת חום)	50 מ"ל (9%)
רכיבי מאגר MACS	נפח (ריכוז סופי)
DPBS (Mg 2+-חופשי, Ca+-חופשי)	500 מ"ל
סרום עגל עוברי (מושבתת חום)	2.5 מ"ל (0.5%)
EDTA (0.5 מ')	2 מ"ל (2 מ"מ)
רכיבי מאגר PBS/EDTA	נפח (ריכוז סופי)
DPBS	500 מ"ל
EDTA (0.5 מ')	2 מ"ל (2 מ"מ)
רכיבי מדיה בטעינה	נפח (ריכוז סופי)
מדיום תא T	18 מ"ל
תגובת טעינה	2 מ"ל
טעינת רכיבי מדיה+CaCl2	נפח (ריכוז סופי)
מדיית טעינה	499 מיקרוליטר
CaCl2	1.25 מיקרוליטר
מדיום פרפוזיה + מצע קספזה	נפח (ריכוז סופי)
מדיום תא T	20 מ"ל
מצע NucView 530 Caspase-3 (1 mM ב-DMSO)	100 מיקרוליטר
רכיבי בופר דילול חרוזים	נפח (ריכוז סופי)
DPBS	800 מיקרוליטר
BSA (2% ללא הפסקה)	100 מיקרוליטר (0.2% w/v)
טווין-20 (10% ללא ויל)	10 מיקרוליטר (0.1% w/v)

טבלה 1: הכנת מדיה ובופר.

איור משלים 1. אסטרטגיית גייטינג לדוגמה להערכת יעילות העברת גנים לפני העשרה מגנטית. גרפים של קווי מתאר והיסטוגרמה לדוגמה מציגים את אסטרטגיית השער לזיהוי תאי CAR T הביטוי ב-CAR (tEGFR חיובי) לאחר ביצוע העברת גן. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2. בקרת טוהר לאחר מיון. גרפים קונטור לדוגמה מציגים חלק מתאי CAR T הביטוי ב-CAR (tEGFR חיובי) לאחר ביצוע מיון מגנטי. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3. ביטוי אנטיגן על תאי גידול יעדיים. גרפים היסטוגרמיים מייצגים תאי גידול WT K562 או מהונדסים לביטוי ROR1 עם נוגדן איזוטיפ או ROR1 באמצעות ציטומטריית זרימה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4. זיהוי ציטוקינים באמצעות ELISA סטנדרטי. ריכוזי IL-2 ו-IFN-γ בסופרנטנט לאחר 24 שעות של קו-קולטורציה עם תאי גידול^{K562 ROR1} ב-E:T של 4:1 כפי שנמדד באמצעות ELISA עבור תאי CAR לעומת תאי T מסוג CAR+cJ. מובהקות סטטיסטית כפי שנקבעה על ידי מבחן t לא מזווג עם *P≤ 0.05, **P≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 1: תאים שנבדקו. הטבלה מציינת את מספר התאים הבודדים שנותחו בכל מצב. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

תהליך העבודה המודגם מאפשר הערכה של הפרשת הציטוקינים ופרופיל ההפעלה של תאי CAR-T בודדים במהלך גידול משותף עם תאי מטרה חיוביים לאנטיגן ואנטיגן שליליים, שניתן לשלב אותם אופציונלית עם הערכת פעילות ציטוליטית. בעוד שהיכולת ללכוד נתונים פונקציונליים רב-מודליים ברזולוציה של תא יחיד מציעה דרך לנתח את ביצועי תאי ה-T של CAR בדיוק חסר תקדים, הכימות של המדידות תלויה מאוד בדיוק טכנולוגיית OEP בטעינת אותו מספר של חרוזי לכידת ציטוקינים, תאי מטרה ותאי CAR-T בכל עט. לכן, חשוב לוודא שצפיפות העומס וקריטריוני ה-TPS של כל מגיב או דגימת תא מותאמים כך שיאפשרו עומס חד-חרוזי ו/או תא יחיד בכל עט. בעוד שהתאמת ריכוז המתלה של החרוז או התא בערוצי הנוזלים מאפשרת טעינה מספקת בעט, אפשרויות השטיפה והייבוא של הפלטפורמה משמשות כאסטרטגיה נוספת לניסיון חוזר של תהליך הטעינה.

מאפיין יתרון אחד בעיצוב שבב האופטופלואידיקה הוא ההפרדה של פריסת העט ל-22 שדה ראייה מובחן. על ידי טעינת תאי T שהונדסו עם מבני CAR שונים ל-FOVs שונים בתוך שבב האופטופלואידייקה, הצלחנו גם להעריך האם מבנה חלופי שאוכפ ביטוי יתר של c-Jun יכול לשפר את יצירת תאי CAR-T עם פונקציונליות רב-מודלית, בהשוואה למבנה CAR סטנדרטי (איור 3 ואיור 4). בדרך זו, פלטפורמת אופטופלואידיקה מספקת אמצעים לזיהוי מהיר של מבני CAR מועמדים שעשויים להעלות פוטנציאל לשפר את עמידות ההפוגה בסרטן הנגרמת על ידי תאי CAR-T. ראוי לציין כי ניתוח האינטראקציה בין תאי המטרה לתאי האפקטור ברמת התא היחיד דורש שליטה קריטית על פרמטרים מרכזיים, למשל, ההטרוגניות של ביטוי אנטיגן המטרה בתאי הגידול וטוהר אוכלוסיית תאי CAR-T (איור משלים 2 ואיור משלים 3).

למרות שהתמקדנו בהערכת הפרשות IL-2, TNF-α ו-IFN-γ, המגוון הרחב של אנליטים מסיסים שניתן לזהות באמצעות לוחות לכידת ציטוקינים מולטיפלקס מסחריים מאפשר התאמה אישית משמעותית של תהליך העבודה. התפתחויות אחרונות מדגישות שהתחום מתקדם גם בכיוון של ציטומטריית זרימה מממד גבוה, ופותח אפשרויות חדשות לסינרגיה עם פרופיל פונקציונלי של סוגי תאי חיסון שונים^12,13. לדוגמה, יישומים עתידיים עשויים לכלול קמפיינים של סינון לזיהוי תאי T רגולטוריים (Tregs) רב-פונקציונליים המבטאים CAR. אלה מפרישים ציטוקינים אנטי-דלקתיים מרובים כגון TGF-β ו-IL-10¹⁴. לכן, הגמישות של מערכת אופטופלואידיקה עשויה לסלול את הדרך לתובנות קריטיות כאשר אימונותרפיות תאיות מתרחבות לתחומים חדשים בטיפול במחלות שאינן ממאירות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
גרעין 4-D	לונזה
מיקרו-חרוזי אנטי-ביוטין	מילטני ביוטק	130-090-485
CD3/CD28 דיינאבידס	תרמו פישר	11131D
ערכת בידוד תאי T ל-CD8+	מילטני ביוטק	130-096-495
צינורות חרוטיים של CELLSTAR בגודל 15 מ"ל (PP)	גריינר ביו-וואן	188271-N
צינורות חרוטיים של CELLSTAR בגודל 50 מ"ל (PP)	גריינר ביו-וואן	227261
קורנינג 75 ס"מ ומעלה; בקבוק תרבית תאי צוואר בצורת U עם פקק אטם	קורנינג	430720U
Costar 24-well Clear Clear Plate מספר בארות מטופלות ב-TC, עטופות בנפרד, סטריליות	קורנינג	3526
קוסטאר 48-באר שקופה, טופל ב-TC, מספר לוחות באר מרובים, עטופים בנפרד, סטריליים	קורנינג	3548
DPBS, בלי סידן, בלי מגנזיום	תרמו פישר	14190169
מגנט DynaMag-15	תרמו פישר	12301D
EGFR (ארביטוקס, קטוקסימאב)	אלי לילי	NDC 66733-948-23	להטיה פנימית (ביוטין)
נוגדן EGFR (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
סרום בקר עוברי, ערך	תרמו פישר	A5256801
תוסף GlutaMAX (100x)	תרמו פישר	35050038
Human IL-2 IS, דרגת פרימיום	מילטני ביוטק	130-097-748
סרום אנושי	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ הצלב האדום הגרמני (GRC)	לא זמין
עמודת הפרדת תאים ב-MACS, LS	מילטני ביוטק	130-042-401
MACS MultiStand	מילטני ביוטק	130-042-303
ערכת P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X	לונזה	V4XP-3032
פנקול אדם, צפיפות: 1.077 גרם למ"ל	פאןביוטק	P04-60500
ערכת זיהוי אפופטוזיס PE Annexin V I	BD ביוסיינסס	559763
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)	תרמו פישר	15140122
ערכת ביוטינילציה ובידוד פני שטח של תאי פירס	תרמו פישר	A44390
ערכת התחלה של QuadroMACS (LS)	מילטני ביוטק	130-091-051
RPMI 1640 Medium, תוסף גלוטמקס, HEPES	תרמו פישר	72400054
פיפטות סרולוגיות 2, 5, 10, 25 ו-50 מ"ל	גריינר ביו-וואן	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Trypan Blue Stain (0.4%)	תרמו פישר	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8.0	תרמו פישר	15575020
β-מרקפטואנול (50mM)	תרמו פישר	31350010
מגני משואות
לוח עגול-תחתית עם 96 בארות	קורנינג	3799
שבב Beacon Plastic Flush		500-00030
תמיסת ניקוי BLI, נתרן היוקלויט, 0.825%	ברוקר	520-08000
אלבומין סרום בקר (BSA)	סיגמא-אלדריץ'	A4161
נוגדן אנטי-אנושי Brilliant Violet 421 CD137 (4-1BB)	ביולג'נד	309820
כלוריד סידן (CaCl2)	סיגמא-אלדריץ'	C5670
LEGENDplex Human IFN-& Gamma; חרוזי לכידה B3, 13X	ביולג'נד	740545
LEGENDplex Human IL-2 Capture Bead A5, 13X	ביולג'נד	740934
נוגדנים לזיהוי פאנל אנושי V02 של LEGENDplex	ביולג'נד	741041
LEGENDplex Human TNF-α חרוז לכידת B7, 13X	ביולג'נד	740711
LEGENDplex SA-PE	ביולג'נד	740452
מצע NucView 530 Caspase-3, 1 מ"מ ב-DMSO	Hö איזל	B-10406
שבב OptoSelect 3500	ברוקר	500-12001
אזיד נתרן	סיגמא-אלדריץ'	S2002
גיל 20	סיגמא-אלדריץ'	P1379
מאגר יצוא טבעוני	ברוקר	520-00040
בקבוקי מדיה של VWR, ריבוע, PETG, 125 מ"ל	VWR	216-2265
בקבוקי מדיה של VWR, מרובע, PETG, 500 מ"ל	VWR	216-2267
תוסף הרטבה	ברוקר	520-08016
תמיסת הרטבה	ברוקר	520-00009