ניתוח DNA מיקרוביאלי בשטח באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית ויחידת qPCR שדה

Summary

צורות אמינות ומדויקות של ניתוח DNA שניתן לפרוס בשטח הן קריטיות לתעשיות רבות. מאמר זה מציע שתי שיטות לניתוח מיקרוביאלי סביבתי בשטח: 1) בידוד DNA מיקרוביאלי מדגימות סביבתיות באמצעות ערכת שדה חילוץ ביולוגית, ו-2) ניתוח DNA באמצעות יחידת qPCR בשטח.

Abstract

ככל ש-PCR כמותי (qPCR) מאומץ באופן רחב יותר בתעשיות, היכולת לחלץ ולנתח DNA בסביבות מרוחקות ללא מכשולים לוגיסטיים הופכת לחיונית. דוגמה ברורה לכך היא הצורך בכלים פשוטים לכימות חיידקים המפרקים מזהמים באתרים מרוחקים שנפגעו מהתמוטטויות רכבות או שחרור נפט, המאפשרים הערכה מהירה של הסיכון וההשפעה הסביבתית. כדי להשיג זאת באופן אמין, התהליכים חייבים להיות ניידים וקלים, ידידותיים למשתמש עבור לא-מדענים, עמידים לזיהום, ויכולים לספק תוצאות מהירות תוך שמירה על בקרת איכות קפדנית. למרות שקיימות כבר שנים אפשרויות להפקת חומצות גרעין וניתוח qPCR מחוץ למעבדה, רק לאחרונה התקדמות טכנולוגית אפשרה פיתוח מערכות פריסה בשטח המסוגלות לביצועים אמינים ומדויקים. במחקר זה, אנו מדגימים שימוש בערכת חילוץ DNA שדה בשילוב עם מכשירי qPCR ניידים בתנאי סביבה ריאליסטיים. ניסויים בשטח שנערכו בטמפרטורות חיצוניות סביבתיות של כ-30 מעלות צלזיוס הראו תפוקות DNA ויעילות הגברה דומות לאלו שהושגו במעבדות מבוקרות. חשוב לציין כי תוצאות שהושגו בשטח הוכיחו רגישות ושחזור שוות ערך, ואישרו שזרימות עבודה ניידות יכולות לספק נתונים איכותיים ללא צורך בתשתיות מעבדה קונבנציונליות. ממצאים אלו מדגישים את הפוטנציאל לניתוחים מולקולריים מבוזרים שמרחיב את טווח ה-qPCR לסביבות מרוחקות ומוגבלות במשאבים, תוך שמירה על הדיוק והאמינות הנדרשים לקבלת החלטות.

Introduction

כאשר בוחנים ניתוחים ביולוגיים מולקולריים, כמו qPCR, קיימות מספר מגבלות בניהול דגימות. דוגמה ברורה לכך היא הביקוש לכלים פשוטים ואמינים לכימות חיידקים מפחיתי מזהמים באתרים מרוחקים שנפגעו מסטיות רכבת או פליטות נפט, התומך בהערכה מהירה של סיכון והשפעה סביבתית 1,2,3,4,5. המגבלה העיקרית היא שלא משנה כמה קרים תשמור על הדגימה, קהילות מיקרוביאליות יכולות (וישתנו) עם הזמן ^6,7. כדי להבטיח שהנתונים משקפים במדויק את הסביבה המקורית ממנה נאספו הדגימות, מומלץ להפיק את ה-DNA מהדגימות הללו בתוך 24 שעות^ו-8 דקות. למהנדס שאוסף דגימות מיקרוביאליות על פלטפורמת נפט ימית, או למדען עמוק בתוך יער גשם, ציר זמן זה אינו אפשרי. להעביר דגימת מים או אדמה מאחד מהאזורים המרוחקים הללו לחברת שילוח באותו יום ואז לשלוח לילה למעבדה (וכל זאת תוך שמירה על קירור), שם ניתן להפיק את ה-DNA לפני הניתוח, זה פשוט בלתי אפשרי.

לאחר שה-DNA מופק, השעון נעצר, וכל המידע הגנטי של הדגימה נשמר ללא הגבלת זמן באמצעות טכניקות אחסון נכונות⁹. זה הופך את ה-DNA המופק לייחודי מאוד בהשוואה לרוב הדגימות הכימיות, המתלורגיות והביולוגיות – שרובן מוגבלות לחיי מדף מוגבלים. ניתן לאסוף DNA מאוחסן שנים או עשורים לאחר מכן ולנתח מטרות חדשות בפלטפורמות חדשות. מסיבה זו, חשוב שה-DNA המופרז ייצג באמת את קהילת המיקרואורגניזמים המקורית, ולא את זו שהושפעה מהעברה מאוחרת.

בנוסף, הצורך במעבדה לחילוץ וניתוח הדגימות מגביל מאוד את הגמישות והעקביות בתוכניות הדגימה. עלות הלוגיסטיקה לבדה עלולה להיות בלתי אפשרית עבור פרויקטים מסוימים¹⁰. היכולת לנתח דגימות ולכמת במדויק מטרות גנטיות מעניינות תוך שעות או אפילו דקות מהדגימה, פותחת דלתות רבות לפרויקטים סביבתיים ברחבי העולם.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות ערכת Bio-Extract (ערכת שדה חילוץ ביולוגית) ו-FieldQuant qPCR (qPCR מבוסס שדה).

1. דגימת ביומסה ממי תהום ופרוטוקול בידוד DNA באמצעות מסנן עטוף וערכת שדה חילוץ ביולוגית

1. לבש כפפות ומשקפי בטיחות בכל שלב בשלב 1.
2. הכינו את המשאבה והצינורות הפריסטלטיים וטיהרו את הבאר באמצעות ניקוי נפח סטנדרטי, בהתאם להנחיות דגימות מי תהום של סוכנות הגנת הסביבה (EPA)¹¹.
3. הסר את המסנן, המתאם, הקלפס והפקקים מצינור הצנטריפוגה המסופק (איור 1).
4. העבר את הצינור (בקוטר פנימי 1/4-5/16 אינץ' [תעודת זהות]) דרך הקלמפ שסופק והדק את הקלימפ כדי לקבע את הצינור למתאם הנעילה (איור 2).
5. חבר את פתח הכניסה של המסנן למתאם Luer-Lock שהותקן בשלב הקודם.
6. הניחו את המסנן בתוך מיכל קבלה כדי שניתן יהיה למדוד במדויק את כמות המים המסוננת.
7. סנן עד 1 ליטר מים עם קצב זרימה נמוך (<0.5 ליטר לדקה). כמות המים המסוננת משתנה בהתאם לעכירות המים.
   1. אם המסנן נסתם לפני סינון 1 ליטר, עצרו והמשיכו לשלב הבא.
      הערה: ניתוח DNA רגיש וניתן לבצע אותו בכמות של 10 מ"ל בלבד, בהתאם לביומסת המערכת.
8. תעד ידנית את הנפח שעבר דרך המסנן במיליליטרים (mL). זרוק את המים המסוננים.
9. סגור את המסנן בשני הקצוות. ודא שהקצה הדק סגור עם הפקק האדום והקצה העבה יותר סגור עם פלאג Luer-Lock לבן.
10. החזר את המסנן לצינור הפלסטיק שסופק.
11. הדביקו את התווית לצינור הצנטריפוגה ורשמו את כמות המים שעברה דרך המסנן, את המיקום, תאריך הדגימה ואת הניתוחים הנדרשים. אחסן בטמפרטורה של 1-4 מעלות צלזיוס עד להפקה.
    הערה: יש להפיק מסננים בתוך 24 שעות מהדגימה.
12. באמצעות מגבוני הכנת האלכוהול המצורפים, נקה משטח שטוח שניתן להשתמש בו לשלב את ההוצאה (למשל, לוח עץ, דלת תא מטען של משאית וכו').
13. כדי לחלץ את ה-DNA, יש לפרוס את כל רכיבי ערכת שדה החילוץ הביולוגית על פני השטח השטוח והנקי (איור 3).
    1. פתח את שני קצות המסנן והניח את הפקקים בצד לשימוש מאוחר יותר. מצא ופתח אחד מ-3 מ"ל המזרקים הכלולים בערכה. משוך אוויר לתוך המזרק של 3 מ"ל וחבר אותו למסנן דרך חיבור ה-Luer הנעול.
    2. דחוף את האוויר מהמזרק כדי להוציא את שאר המים מהפילטר. נתק את המזרק ושאב עוד אוויר לפני שתחזור על הפעולה.
    3. חזור על זה מספר פעמים, כדי לוודא שכמה שיותר מים נדחפים החוצה מהפילטר. תחזור על פקק השקע האדום.
14. הפוך את מזרק התמיסה A הסגור מספר פעמים כדי לוודא שהוא מעורבב היטב. הסר את פקק המזרק עם נעילת הלואר.
15. חבר את מזרק התמיסה A לכניסת המסנן הסגורה של 0.2 מיקרון דרך קצה נעילת הלואר ולהוסיף בהדרגה את כל תמיסה A על ידי לחיצה על הבוכנה. דחיפה מהירה מדי עלולה לגרום ללחץ אחורי להיווצרות, לכן חשוב להוריד את הבוכנה לאט. אם סתימת המסנן מונעת הוספת פתרון A, הסר את מכסה השקע האדום של המסנן ונסה שוב. תחזור על המסנן.
16. נער בחוזקה את המסנן הסגור בחוזקה במשך 5 דקות.
    הערה: כדי למנוע עייפות, ניתן להכין מספר דגימות לשלב זה, וכולן ניתנות ללחיצת יד בו זמנית. אם זמין, ניתן להשתמש במיקסר וורטקס נטען לביצוע שלב זה במקום לחיצת יד.
17. הפוך את מזרק תמיסה B הסגור מספר פעמים כדי לוודא שהוא מעורבב היטב. הסר את פקק נעילת הלואר מהמזרק.
18. הסר את מכסה כניסת הפילטר המכוסה בכיסוי. חבר את מזרק תמיסה B לכניסת המסנן המכוסה דרך קצה נעילת הלואר והוסף לאט לאט את כל תמיסה B על ידי לחיצה על הבוכנה. דחיפה מהירה מדי עלולה לגרום ללחץ אחורי להיווצרות, לכן חשוב להוריד את הבוכנה לאט. תחזיר את מכסה כניסת המסנן.
19. נער בחוזקה את המסנן הסגור בחוזקה במשך 5 דקות.
    הערה: כדי למנוע עייפות, ניתן להכין מספר דגימות לשלב זה ולנענע את כולן ביד בו זמנית. אם זמין, ניתן להשתמש במיקסר וורטקס נטען לביצוע שלב זה במקום לחיצת יד.
20. הסר את מכסה הכניסה.
21. כאשר המסנן הפוך, דחוף 1 מ"ל אוויר לתוך המסנן באמצעות מזרק של 3 מ"ל המחובר ליחידת המסנן המכוסה ואז משוך את הבוכנה לאחור כדי להסיר כמה שיותר מהליזאט (הנוזל).
    הערה: אם הליזאט צמיגי במיוחד, ייתכן שיהיה צורך לדחוף ולמשוך את הבוכנה מספר פעמים כדי להסיר את התמיסה מהפילטר.
22. הוסף את הליזאט לצינור חרוזים בנפח 5 מ"ל. סגור את הצינור ואטום אותו עם פאראפילם למעלה.
23. נער את הצינור ביד בחוזקה במשך 5 דקות. הנח את הצינור זקוף תוך כדי המשך השלבים.
    הערה: כדי למנוע עייפות, ניתן להכין מספר דגימות לשלב זה, וכולן ניתנות ללחיצת יד בו זמנית. אם זמין, ניתן להשתמש במיקסר וורטקס נטען לביצוע שלב זה במקום לחיצת יד.
24. תוך הימנעות מזיהום בחלק העליון של הנייר כסף, הנח את מחסנית ההכנה לדגימה על משטח שטוח.
25. הוציאו את המזרק בנפח 1 מ"ל מהאריזה והבריגו את עמודת הנעילה עם לואר לקצה המזרק. השתמשו בקצה המחודד של העמוד כדי לחדור שני חורים בחלק הראשון של מחסנית ההכנה לדגימה.
    אזהרה: חלקים מסוימים של המחסנית מכילים מלחים כאוטרופיים ו/או אתנול. לבש כפפות ומשקפי בטיחות.
26. באמצעות פיפטה פלסטית נפחית, העבר 1 מ"ל ליזאט (נוזלי בלבד, הימנע מהעברת חרוזים ככל האפשר) מצינור החרוזים אל החור החדש של מחסנית ההכנה הראשונה. לתוצאות הטובות ביותר, הוסיפו לאט את הליזאט בזווית קלה בעת פיפסת פיפסט לתוך החור בנייר הכסף.
27. הכנס את עמודת המזרק חזרה לחלק האדום של המחסנית. משוך את הנוזל לגמרי לתוך המזרק ואז דוחף אותו החוצה. בצע את פעולת המשאבה הזו 10 פעמים.
28. דחוף את כל הנוזל מהמזרק וחזר לחלק האדום של המקלטת לפני שתעבור לשלב הבא. אין להעביר נוזל מחלק אחד לאחר - זה חל על כל שלב שנותר בפרוטוקול בידוד ה-DNA של הדגימה.
29. מקם את קצה עמוד המזרק המחודד מעל החלק האדום-כתום וחורר שני חורים במחסום האלומיניום. השתמש בפומפה כדי למשוך את כל נפח המזרק, הנוזל עד למעלה במזרק, ולשאוב החוצה עד הסוף. חזור על השלב הזה פעם אחת לסך הכל 2 משאבות, ודוחף את כל הנוזל החוצה. אל תעביר נוזלים לשלב הבא.
30. מקם את קצה עמוד המזרק המחודד מעל החלק הכתום וחורר שני חורים דרך מחסום הנייר כסף. השתמש בפומפה כדי למשוך את כל נפח הנוזל של המזרק לתוך המזרק ולשאוב החוצה עד הסוף. אל תעביר נוזלים לשלב הבא.
31. מקם את קצה עמוד המזרק המחודד מעל החלק הצהוב ודקב פעמיים דרך מחסום האלומיניום. השתמש בפומפה כדי למשוך את כל נפח הנוזל של המזרק לתוך המזרק ולשאוב החוצה עד הסוף. אל תעביר נוזלים לשלב הבא.
32. מקם את קצה עמוד המזרקים המחודד מעל החלק הכחול של ייבוש באוויר ודקב את מחסום האלומיניום פעם אחת בלבד. השתמש בפומפה כדי למשוך את כל נפח האוויר של המזרקה לתוך המזרק ולשאוב במהירות החוצה. חזור במהירות על פעולת השאיבה הזו לפחות 20 פעמים עד שהעמודה נראית יבשה.
33. מקם את קצה עמוד המזרקים המחודד מעל החלק הירוק הסופי וחורר פעמיים דרך מחסום האלומיניום. השתמש בפומפה כדי למשוך את כל נפח הנוזל של המזרק לתוך המזרק ולשאוב החוצה עד הסוף. חזור על השלב הזה לסך הכל 5 משאבות.
34. באמצעות מזרק 1 מ"ל ועמודת הכנת דגימה, העבר את כל התמיסה מהחלק הירוק למיקרוצינור מתויג היטב בנפח 1 מ"ל - זהו דגימת ה-DNA שהופקה בשטח. יש לאחסן בטמפרטורה של 1-10 מעלות צלזיוס (למשל, במקרר עם שקיות קרח/קרח, או במקרר וכו') למשך עד שבוע, או עד השימוש.
    הערה: לאחסון ארוך טווח, ניתן לאחסן דגימות DNA בטמפרטורה של -20°C ללא הגבלת זמן.

2. פרוטוקול ניתוח qPCR מבוסס שדה באמצעות יחידת qPCR שדה

הערה: מכשיר qPCR מבוסס שדה והטלפון ששולט במכשיר מסתמכים על סוללות נטענות. ודאו ששניהם טעונים במלואם לפני שאתם מגיעים לשטח.

1. הניחו עד שלוש דגימות DNA שהופקו מהשדה בחריצי הדגימה הטהורים של המגש. ודא שיש דגימה אחת בכל חלק: דגימה אחת בחריצים 1, 2 או 3, דגימה אחת בחריצים 4, 5 או 6, ודגימה אחת בחריצים 7, 8 או 9.
2. הנח את רצועות הבדיקה לכל דגימה בחריצי רצועות A, B או C המתאימים על המגש. יישר את הבאר הראשונה על הרצועה עם החריץ הראשון במגש.
3. פתח את הטלפון ופתח את האפליקציה שנקראת על שם מכשיר qPCR המסחרי. הטלפון ויחידת ה-qPCR בשטח מתחברים דרך אלחוט משולב לטווח קצר. כשהאפליקציה נפתחת, הקש על כפתור Start Run .
   הערה: האפליקציה נטענת מראש בטלפון המצורף ולא ניתן להוריד אותה במקום אחר.
4. במסך הבא, הקש על כפתור יצירת מזהים .
5. המסך הבא הוא המקום בו מוזן מידע הדגימה עבור כל מדגם; הקש תחת מזהה דגימה והקלד שם לדוגמה.
   1. הקישו יחידות דגימה ובחרו את יחידת הנפח המתאימה לסוג הדגימה ששימשה בהוצאה (גרמים [גרם], מיליליטרים [מ"ל], או מטוש).
   2. לאחר מכן להקיש מתחת לכמות הדגימה ולהקליד את נפח הדגימה ששימש בחילוץ השדה למעלה (למשל, מיליליטרים של מים מסוננים). חזור על התהליך הזה עבור שתי הדגימות הנותרות.
   3. כאשר הזנת מידע הדגימה של כל הדגימות, הקש על כפתור ההמשך .
      הערה: אם משתמשים בפחות מ-3 דגימות, השאירו את מזהה הדגימה כברירת מחדל, בחרו כל יחידה והקלדו 1 בשורת כמות הדגימה כדי שכל המדגם שלא נוצל יוכל להמשיך.
6. במסך הבא, הקש על התיקייה. עבר למסך הבא ולחץ על שמירה לתיקייה הנוכחית.
7. במסך הבא, הקלד שם ריצה והקש על אישור.
8. הפעל את הכלי על ידי לחיצה והחזקה על כפתור ההפעלה , הממוקם בפינה השמאלית העליונה של הכלי, עד שכל האורות בחזית הכלי נדלקו (~5 שניות). לאחר מכן, הקש על אישור באפליקציה כדי להמשיך.
9. במסך הבא, הקש על חיבור דרך אלחוטי משולב לטווח קצר. לחצו על כפתור האלחוטי המשולב לטווח קצר (סמל מוכר לסימן מסחרי) מעל הכלי עד שהאור הכחול מתחיל להבהב. הקש על אישור והמתין עד שהאפליקציה והכלי יתסנכרנו יחד. לאחר שהן מסונכרנות, הקש על שם הכלי באפליקציה כדי לבחור אותו, ואז לחץ על כפתור החיבור כדי לטעון את רצועות הבדיקה.
   הערה: אם הכלי והאפליקציה לא מסונכרנים בפעם הראשונה, ודאו שהאור האלחוטי המשולב לטווח קצר בכלי עדיין מהבהב ולחץ שוב על סריקה.
10. לפני הסרת פקקי רצועות הבדיקה, בדוק שהכדורים הליופילים אינם נמצאים בחלק העליון של אף אחד מבארות רצועת הבדיקה. אם כן, טפח בעדינות את תחתית הבאר כדי לגרום לכדור ליפול נמוך יותר לתוך הבאר.
11. הסר את הפקקים מצינורות הגו סטריפ לדגימה הראשונה. הוסיפו 18 מיקרוליטר מים סטריליים לבאר הראשונה של רצועת הבדיקה והפינו בעדינות פיפטות למעלה ולמטה כדי להמיס את הכדור. חזור על זה לשני הבארות הנותרות.
12. הוסיפו 2 מיקרולטר של הדגימה לכל באר ואוטמו את הצינורות על ידי הכנסת סט של פקקי רצועות גומי לתוך הצינורות, כאשר החריצים בין הפקקים פונים אל גב המגש. חזרו על שלבים 2.10-2.12 עבור הדגימות הנותרות במידת הצורך. לאחר שכל רצועות הבדיקה מולאו ונאטמו עם פקקי רצועות, הקש על אישור באפליקציה.
13. הסר כל רצועת בדיקה אחת אחת ובדוק אם יש בועות בתחתית הבארות. אם יש בועות בתחתית אחת מהבארות, הניעו בעדינות את הרצועה קדימה ואחורה עד שהבועות עולות כלפי מעלה לכיוון ראש הבאר. לאחר שכל הבארות נבדקו, הקש על אישור באפליקציה והמשיך לטעון את הרצועות במכשיר.
14. פתח את מכסה המכשיר ומניח את רצועות הבדיקה בתוך מכשיר qPCR השדה באותו סדר וכיוון שבו הם על המגש, כך שצירי הבאר והחריצים בין הפקקים פונים לגב הכלי. לאחר שכל הרצועות הוספו, דחפו בעדינות את המכסה למטה עד שהוא ננעל במקום ולחצו על אישור.
15. הקש על כפתור התחלת הריצה באפליקציה.
    הערה: הריצה תתחיל ותסתיים ~45 דקות בהתאם לתנאי ריצה מוגדרים מראש. תנאים אלו אינם ניתנים לעריכה.
16. כשהריצה מסתיימת, הקש על תוצאות באימייל. כאשר הטלפון מחובר ל-Wifi, התוצאות יישלחו לניתוח ודיווח; עד אז, התוצאות נשמרות על הכלי.
    1. לאחר החיבור ל-Wifi, המשתמש יצטרך ללחוץ שוב על כפתור השליחה כדי לשלוח את התוצאות.
17. נקה את המגש בין הרצפות כדי למנוע זיהום בין הדגימות.
    הערה: הפלט הוא קובץ אקסל המכיל ערכי סף מחזור (Ct) עבור כל באר. תוצאות אלו נשלחות למעבדה, שבודקת את איכות ההגברה וממירה את ערכי ה-Ct לשפע באמצעות עקומות סטנדרטיות מאומתות הספציפיות לכל יעד qPCR ועל בסיס הנפח והמטריצה של הדגימה המקורית. תוצאות אלו נשלחות למשתמש כתוצר אלקטרוני וכן כקובץ PDF.

Results

חילוץ DNA מדגימות סביבתיות מייצגות בוצע הן באמצעות ערכת שדה החילוץ הביולוגית והן באמצעות שיטה מבוססת מעבדה מאומתת מאוד שתוארה קודם⁴. כפי שמוצג באיור 4, השלמת בידוד DNA מוצלחת באמצעות ערכת השדה אושרה כאשר השוו תוצאות qPCR לשיטת חילוץ מעבדה מאומתת מאוד. עקביות זו מאשרת שהשיטה שמרה על שלמות ה-DNA של דגימות סביבתיות בשטח.

רכיבי ערכת qPCR השדה מוצגים באיור 5. ניתוח של דילול תרבית סטנדרטי של דהלוקוקואידים (DHC) באמצעות יחידת qPCR שדה בוצע הן בטמפרטורות פנימיות (21 מעלות צלזיוס) והן בטמפרטורות חיצוניות (30 מעלות צלזיוס) כדי להמחיש את עמידות המכשיר בתנאי שדה אמיתיים. התוצאות, הנראות באיור 6, מדגישות את הסטייה הנמוכה עבור 10 חזרות שונות של כל אחד. להקשר מלא, DHC הוא אורגניזם המסוגל לפרק ממסים כלוריים והוא נפוץ לכימות באמצעות qPCR^{בתעשיית} השיקום הסביבתי.

כדי לאמת את דיוק המכשירים, DHC נותח בשלושה ריכוזים שונים באמצעות עשרה מכשירי qPCR בשדה שבוצעו בשכפולים (איור 7). גם בשפע נמוך, סטיית התקן היחסית נותרה נמוכה (מתחת ל-5%) בכל הריצות האלה. יש לשים לב כי, בהשוואה לסטיית תקן, סטיית תקן יחסית חשובה לנתונים לוגריתמיים שכן היא מנרמלת את התוצאות באמצעות המשוואה הבאה:

כאשר RSD הוא סטיית תקן יחסית, σ הוא סטיית התקן של מאגר הנתונים, ו-μ הוא הממוצע של מאגר הנתונים.

יחד, שתי השיטות במאמר זה מספקות תוצאות שחזוריות על פני חילוצי שדה משוכפלים ובדיקות qPCR. ההסכמה בין חילוץ שטח ומעבדתי לניתוח qPCR מראה שניתן לקבל נתונים אמינים ואיכותיים ללא תלות בתשתית מעבדה, מה שמאפשר ניתוח מיקרוביאלי בסביבות מרוחקות או מוגבלות במשאבים.

איור 1: רכיבי ערכת פילטר מכוסה. המסנן המכוסה משמש לסינון הביומסה החוצה מדגימת המים. על ידי חיבור למשאבה פריסטלטית באמצעות צינור, המים נדחפים דרך המסנן. לאחר רישום הנפח הכולל של המים, המים מושלכים והביומסה שנאספת על המסנן מוכנה להפקת DNA. רכיבים: א. צינור סטרילי שמחזיק את המסנן והרכיבים לפני ואחרי השימוש, ב. פקק כניסה, ג. מהדק צינור, ד. מתאם חיבור לצינור עם נעילת לואר, ה. מסנן עטוף, ו. מכסה יציאה מגומי. התמונה בשימוש באישור Microbial Insights, ^Inc.12. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: חיבור פילטר וצינורות. הצינור נדחף מעל מתאם חיבור הצינור עם נעילת לואר ומוחזק במקום באמצעות מהדק הצינור. הקצה השני של הצינור מחובר למשאבה פריסטלטית (חיבור זה ופעולת המשאבה אינם בתחום הפרוטוקול הזה). התמונה בשימוש באישור Microbial Insights, ^Inc.12. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: רכיבי ערכת שדה בידוד DNA. כל הרכיבים סטריליים לפני השימוש. הרכיבים כוללים: (1) ערכת סינון מקופלת (ראו איור 1 לפרטים נוספים), (2) מזרק 3 מ"ל, (3) מזרק בנפח 1 מ"ל טעון מראש בתמיסה A, מכוסה, (4) מזרק 1 מ"ל טעון מראש בתמיסה B, מכוסה, (5) מזרק 3 מ"ל, (6) צינור סיליקון, (7) מזרק 1 מ"ל עם עמוד בידוד, (8) פיפטת העברה חד-פעמית בנפח 1 מ"ל, (9) מחסנית הכנת דגימת בידוד DNA, (10) צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. לא בתמונה: ריבועי פרפילם לאיטום בזמן הניעור, ומגבוני הכנה לאלכוהול ששימשו לניקוי המשטח ששימש לחילוץ. התמונה בשימוש באישור Microbial Insights, ^Inc.12. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: השוואת חילוץ שדה באמצעות דגימות מהעולם האמיתי. תוצאות qPCR השוואתיות של DNA שבודד משתי דגימות מייצגות בשיטת מעבדה (פסים אדומים) לעומת ערכת שדה החילוץ הביולוגית (פסים כחולים). אלו לא נותחו בשכפול, כפי שמצופה בניתוח qPCR סטנדרטי. מטרות גן (ציר x) מראות שפע (ציר y) בסדר גודל בשתי השיטות. מידע על כל גן יעד ספציפי אינו כלול כיוון שהוא מחוץ להיקף מאמר זה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: מכשיר ורכיבים מבוססי שדה של qPCR. הרכיבים כוללים: א. מכשיר qPCR מבוסס שדה, מגש ההכנה לדגימה B. רצועת בדיקה המכילה תגובות ליופיליות, D. טלפון טעון מראש ביישום המשמש להפעלת הכלי. התמונה בשימוש באישור Microbial Insights, ^Inc.12. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: הדגמת עמידות qPCR בשדה השטח. תקן דהלוקוקואידס (DHC) נותח בעשרה שכפולים תחת תנאי טמפרטורה חיצוניים (30°C, פסים אדומים) ופנימיים (21°C, פסים כחולים), מה שמדגיש את אמינות הכלי לשטח. מספר הריצה של השכפול מופיע לאורך ציר ה-x והשפע המחושב של ה-DHC מופיע לאורך ציר ה-y. הממוצע הפנימי (20 מעלות צלזיוס) חושב כ-4.92 × 10² תא למ"ל, SD = 1.14 × 10² תאים/מ"ל (n = 10), והממוצע החיצוני (30 °C) חושב כ-5.89 × 10² תאים/מ"ל, SD = 1.80 × 10² תא למ"ל (n = 10). המדידות שהתקבלו ב-20 °C ו-30 °C לא היו שונות באופן משמעותי (מבחן t של וולש, p = 0.17). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: הדגמת דיוק qPCR בשדה. ביצועים מדויקים בין 10 כלים שונים, הפועלים בשכפול בשלושה ריכוזים סטנדרטיים שונים. הערך האמיתי ומספר השכפול (n = 2 עבור 10 מכשירים בכל ריכוז סטנדרטי) מופיעים לאורך ציר ה-x, עם פסים צבעוניים הספציפיים ליחידת השדה. ציר ה-y מציג את השפע המחושב עבור כל ריצה. אחוז סטיית התקן היחסית לכל ריכוז תקני מוצג בקווים המקווקו מעל הפסים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Discussion

מאפיין קריטי של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר חילוץ DNA מיקרוביאלי וניתוח qPCR בתנאי שטח, ללא צורך בתשתית מעבדה^{או חשמל.} השיטה מותאמת לאיזון בין ניידות לאמינות, ומספקת תוצאות שחזוריות התואמות תהליכי עבודה מבוססי מעבדה גם כאשר מבוצעות בחוץ בטווח טמפרטורות סביבתיות¹². טווח השימוש המומלץ הוא בין 4°C ל-95°C (39°F עד 104°F), והשוואות זה לצד זה בטמפרטורות חיצוניות סטנדרטיות (30°C, 86°F) לצוות שטח מראה עקביות אמינה (איור 6). עקביות זו חיונית כדי להבטיח שתוצאות השטח יהיו ניתנות לפרשנות לצד מערכי נתונים במעבדה.

מספר שלבים הם קריטיים להצלחת הפרוטוקול. במהלך תהליך החילוץ, הסרה מלאה של נוזל ממסננים וערבוב יסודי של תגובות חשובים להבטחת ליזיס יעיל והתאוששות DNA. כמו כן, העברה זהירה של ליזאט למחסנית ההכנה של הדגימה תוך הפחתת העברת החרוזים היא המפתח למניעת סתימה או כשל בעמודה. אסטרטגיות לפתרון תקלות כוללות האטת שקיעת הבוכנה כדי להפחית לחץ אחורי וחזרה על שאיבת מזרק אם ליזטים צמיגיים מונעים תנועת נוזלים. ל-qPCR, הימנעות מבועות בבארות הבדיקה והבטחת השעיה מלאה של הפלט הם קריטיים להגברה מדויקת.

למרות יתרונותיה, לשיטה יש מגבלות. תפוקות ה-DNA עשויות להיות נמוכות יותר מאלו שהושגו בערכות מבוססות צנטריפוגה, ודגימות עשירות מאוד או עשירות באורגנים עלולות לאתגר את ביצועי העמודות. למרות שערכות הבידוד פשוטות וקלות לשימוש לכל אחד - כולל משתמשים ללא ניסיון מעבדה קודם - קיים סיכון נוסף לטעות בהשוואה בין אדם חסר ניסיון בשטח. בנוסף, בעוד שיחידת qPCR השדה מספקת תוצאות מהירות, היא מוגבלת למספר מוגבל של תגובות סימולטניות (כיום מוגבלות ל-9 יעדי גנים בכל ריצה) בהשוואה לתרמחזורים סטנדרטיים. עם זאת, מגבלות אלו מתאזנות על ידי מהירות הניתוח והיכולת ללכוד פרופילים של קהילות מיקרוביאליות בשטח. אין מגבלה מהותית על אילו יעדים ל-qPCR ניתן לנתח מלבד קטלוג המעבדה שמציעה את היחידה.

החשיבות של שיטה זו טמונה ביכולתה להפעיל ניתוחים מולקולריים, המאפשרים ניטור בזמן אמת של אוכלוסיות מיקרוביאליות בסביבות כמו שדות נפט, אתרים חקלאיים או מערכות אקולוגיות מרוחקות. על ידי שמירה על שלמות ה-DNA בנקודת הדגימה ויצירת תוצאות באתר, גישה זו מפחיתה חסמים לוגיסטיים, משפרת את איכות הנתונים ומאפשרת קבלת החלטות מהירה. יישומים עתידיים עשויים לכלול ניטור פתוגנים בבריאות הציבור, ניטור התקדמות ביורימדיציה או הערכת סיכון מיקרוביאלי במערכות מים. עם שינויים קלים, ניתן להתאים את הפלטפורמה באופן מתמשך למטרות מולקולריות נוספות ולבדיקות qPCR מתפתחות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות סיליקון 5/16"	אמזון (www.amazon.com)	796753613221	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
מקררים	סטייפלס (www.staples.com)	24299978	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
ערכת שדה בידוד DNA	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	קנייני
יחידת qPCR שדה עם אביזרים	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	קנייני
כפפות	אמזון (www.amazon.com)	תלוי בגודל	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
מסנני מי תהום	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
קרח	חנות נוחות מקומית	NA
Kamoer DIP1500 משאבה פריסטלטית 24V 1500 mL/min hig	אמזון (www.amazon.com)	701705886813	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
פליירים מחטים	אמזון (www.amazon.com)	762983170575	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
מגבות נייר	סטייפלס (www.staples.com)	2126874	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
משקפי בטיחות	אמזון (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים
טוש קצה דק של טוש	אמזון (www.amazon.com)	71641300033	מודלים חלופיים עשויים להיות מקובלים