מאמר שיטה

בדיקת רובד אנטי-רבייפרטיבי לסקר מולקולות ביואקטיביות במבחנה נגד טוקסופלזמה גונדי טאכיזואיטים

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 בינואר 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו שואפת לתאר שיטה פשוטה של בדיקת פלאק לסיוע בסינון מולקולות ביואקטיביות חדשות נגד שלב הטכיזואיט של הפרוטוזואנים טוקסופלזמה גונדי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טוקסופלזמוזה היא זיהום טפילי הקשור לרוב לנגעים עיניים ולמומים יילודים. מאז תחילת שנות ה-50, הטיפול הקו הראשון במחלה זו התבסס על שילוב של סולפדיאזין, פיריתאמין וחומצה פולינית. במהלך השנים הללו, הוכנסו רק כמה משטרים חלופיים. דבר זה מדגיש את הצורך בגילוי מולקולות ביואקטיביות חדשות נגד טוקסופלזמה גונדי. בהינתן שהפתוגן הזה הוא טפיל תוך-תאי חובה, סקר תרופות מסורתי במעבדה דורש בדרך כלל חומרים וציוד יקרים, כגון בדיקות באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים או טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז. בנוסף, שיטות כמו כימות מיקרוסקופ אופטי עלולות להיות גוזלות זמן. בדיקת הפלאק היא שיטה שמעריכה את עוצמת התרבות הפתוגנים התוך-תאית על ידי מדידת מספר האזורים ואזור ההרס בשכבת תא מונו-שכבה שנפגעה ממחזור הליטי של הטפיל. עבודה זו מתארת פרוטוקול בדיקת פלאק אופטימלי שנועד לסינון מולקולות פעילות מול טכיזואיטים תוך-תאיים של T. gondii במבחנה. פרוטוקול זה עושה שימוש בחומרים זולים ובמערכת מעבדה פשוטה, ומניב תוצאות מהירות וניתנות לשחזור שמאפשרות זיהוי מולקולות פעילות חדשות נגד טפיל זה על ידי קבוצות מחקר שונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טוקסופלזמוזיס היא מחלה זואונוטית עם תפוצה הטרוגנית ברחבי העולם, המשפיעה על כשליש מהאוכלוסייה העולמית 1,2. התסמינים של מחלה זו קשורים לרמת החסינות של המארח ולשכפול הטפיל 3,4. השלב החריף של המחלה, המאופיין בשכפול שלב הטכיזואיט, בדרך כלל ללא תסמינים אצל אנשים בעלי יכולת חיסונית 5,6. לעומת זאת, אנשים עם מערכת חיסון מוחלשת הופיעו עם תסמינים תכופים יותר, כולל תסמינים לא ספציפיים כמו חולשה כללית, חום, וכן אנצפליטיס ורטינוכרואידיטיס 6,7,8. למרות חשיבותו הקלינית, הטיפול הנוכחי אינו יעיל נגד שלב טוקסופלזמה גונדי ברדיזואיט (בשלב הכרוני) ואינו מוביל לריפוי טפילי. תופעות לוואי לתרופות קיימות גם מפחיתות את ההיצמדות לטיפול 9,10,11. לכן יש צורך למצוא טיפולים חדשים, בטוחים ויעילים יותר לטוקסופלזמוזיס.

פיתוח תרופות חדשות דורש תקופה ארוכה, השקעה של מיליארדי דולרים ומספר שלבי מחקר. מכיוון שעלות פיתוח התרופות גבוהה, תעשיית התרופות צריכה לבחור מראש את המועמד הטוב ביותר לתרופות 12,13,14,15. לצורך סקר סמים, ניתן להשתמש במספר גישות, כולל בשיטות סילקו, שימוש בבינה מלאכותית, והגישה הנפוצה ביותר, שיטות ביולוגיות 16,17,18,19. סינון ביולוגי במבחנה כולל שימוש בספריות מולקולות (כימוספריות) כדי להנגיש מולקולות לזיהוי פעילות ביולוגית 20,21,22. מכיוון שספריות כימולוגיות אלו מכילות מגוון מולקולות, יש צורך למקסם משאבים וזמן. לכן, בדיקת הפלאק יכולה להיות שיטה לסייע בסינון מהיר של מולקולות ביואקטיביות חדשות נגד פתוגנים שונים, כגון T. gondii.

בדיקת הפלאק היא שיטה במבחנה המשתמשת במחזור הליטי של פתוגנים תוך-תאיים כדי לכמת את ריכוז הפתוגנים בשכבת תא אחת, מה שמוביל להיווצרות פלאקים נמקייםלאורך זמן. המחקר הראשון שהשתמש בטכניקת בדיקת הפלאק מתוארך לתחילת המחצית השנייה של המאה ה-20, כאשר צוותו של רנאטו דולבקו השתמש בשכבות מונו-שכבות של פיברובלסטים של עוף שנדבקו בנגיף דלקת המוח הסוסי המערבי כדי להדגים את הפרופורציונליות בין מספר הפלאקים הנמקיים שנוצרו לבין ריכוז הווירוס16. השימוש בטכניקה זו ב-T. gondii תואר גם הוא היטב, כפי שהוסבר קודם לכן על ידי אופרמן ושותפיו23.

אחד המחקרים הראשונים שהשתמשו במבחן הפלאק כדי לבחון תגובה בעיכוב של T. gondii נגד ריכוזים שונים של מולקולות נערך על ידי רוברטס ואחרים בשנת 1976,17. למרות שבדיקת הפלאק משמשת רבות לטיטרציה של וירוס16,24, שיטה זו שימשה רק על ידי קבוצות מחקר בודדות להערכת פעילות אנטי-T. gondii של מולקולות 21,22,25,26,27. בחיפוש אחר מבחן שיכול לאפשר בדיקת ספריות תרכובות עם תפוקה גבוהה ושימוש בחומרים זולים ומערכת מעבדה פשוטה, נבחנה בדיקת הפלאק כחלופה לסקר סמים שגרתי במעבדה. דבר זה הוביל להקמת פרוטוקול אופטימלי שמאפשר הערכה סימולטנית של פעילות מולקולות שונות באמצעות חומרים פשוטים ומערכת רכישת תמונה, ומניב תוצאות מהירות וניתנות לשחזור. לכן, אנו מתארים כאן את הפרוטוקול המפורט, שאומת במעבדתנו, כדי לסייע לקבוצות אחרות בסינון מולקולות ביואקטיביות חדשות נגד טכיזואיטים של T. gondii.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המניפולציה של תרביות טפילים ותאיים, וכן סילוק פסולת ויעד, בוצעה בהתאם לחקיקה הברזילאית, כפי שנדרש על ידי הסוכנות הלאומית לפיקוח תברואה (ANVISA) RDC מס' 222/2018. כל ההליכים פוקחו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית הפנימית (CIBio) של ICB-UFMG. מחקר זה אינו כולל שימוש בבעלי חיים, בני אדם או אורגניזמים מהונדסים גנטית. מענקים מ-CNPq, CAPES ו-FAPEMIG תמכו בעבודה זו. ESMD (CNPq 308082/2023-0) ו-RWAV (CNPq 305574/2021-3) הם עמיתים לפרודוקטיביות CNPq. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיום RPMI-1640 עם תוספת

הערה: מדיום RPMI-1640 פותח במקור לגידול תאי לוקמיה בבני אדם הן בתנאי תלייה והן בשכבה אחת. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר הראו את התאמתו למגוון גידול תאי יונקים.

  1. לבקבוק המכיל 250 מ"ל RPMI-1640, יש להוסיף 2.5 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין (100x).
  2. הוסף 2.5 מ"ל של אנטיביוטיקה-אנטימיקוטי (100x) למדיום.
  3. לאחר מכן, הוסף לבקבוק 5.0 מ"ל או 25 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) עם RPMI-1640 (2% או 10% FBS).
  4. יש לאחסן במקרר (2-8 מעלות צלזיוס).

2. הכנת PBS (פעם אחת)

הערה: להכנת ליטר אחד של מלח מפוזר פוספט (PBS) ב-pH 7.2 ו-25 מעלות צלזיוס, עקוב אחר השלבים הבאים.

  1. מדוד את הכמויות הבאות של מלחים בנפרד: 1.4 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4, ו-8.5 גרם NaCl.
  2. הוסף את המלחים המשוקלים בנפרד לתוך של 1 ליטר המכילה 800 מ"ל מים דה-יוניים. ערבבו את התמיסה עד שכל המלחים מומסים לגמרי.
  3. מדוד את ה-pH של התמיסה באמצעות מד pH. זה אמור להיות 7.2. אם צריך, השתמש ב-6 מ' חומצה הידרוכלורית או 3 מיליון נתרן הידרוקסיד כדי להביא את ה-pH ל-7.2.
  4. באמצעות מוט זכוכית, העבר כמותית את התמיסה למעלה לבקבוק נפחי בנפח של 1 ליטר.
  5. הוסיפו מים דה-יוניים לבקבוק הנפח עד שהנפח הכולל מגיע ל-1 ליטר, כדי להבטיח שהמניסקוס נמצא במיקום הנכון.
  6. ערבבו את התמיסה בבקבוק הנפח, והפכו אותו בעדינות.
  7. חלק את תמיסת ה-PBS הסופית לבקבוקי זכוכית קטנים יותר (100-250 מ"ל).
  8. אוטוקלב את הבקבוקים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס, 1.1 ק"ג/ס"מ 2 למשך 15 דקות.
  9. אחסן את תמיסת PBS במקרר (2-8 מעלות צלזיוס).
    הערה 1: השתמש ב-PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לכל הניסויים.

3. הכנת תמיסת פורמלדהיד 4%

  1. ערבב 35.68 מ"ל של 1x PBS ו-4.32 מ"ל של 37% פורמלדהיד P.A.
  2. אחסן את התמיסה בבקבוק פלסטיק בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).

4. הכנת תמיסת המלאי של המולקולות הפעילות

הערה: בדקו את המסיסות של המולקולות ב-DMSO, DMF, אתנול או מים, ובחרו את הממס המתאים ביותר. כדי למזער את השפעות הרעילות המדללות האפשריות על טפילים, תמיסת המלאי צריכה להיות מרוכזת לפחות פי 1000 מהריכוז הגבוה ביותר של התרכובת שיש לבדוק. לדוגמה, אם הריכוז הגבוה ביותר שיש לבדוק הוא 1 מיקרומון, תמיסת המלאי צריכה להיות לפחות 1 מילימטר. להכנת תמיסת מאגר של 10 מ"מ, יש לעקוב אחר השלבים הבאים:

  1. שקלו את התרכובת לבדיקה באמצעות איזון אנליטי בדיוק של 0.0001 גרם.
  2. קבעו את נפח המדלל הנדרש לקבלת תמיסה של 10 מ"מ באמצעות הנוסחה הבאה:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    כאשר:
    Y: מסה של תרכובת במיליגרם (mg)
    MM: מסה מולרית של התרכובת
    V (mL): נפח הממס
  3. הוסף את המדלל למקבל המכיל את התרכובת המשוקללת.
  4. הומוגניזציה באמצעות מערבל מערבולת.
  5. חלק את התמיסה לאליקוטים קטנים ואחסן אותם במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20°C.
  6. לפני השימוש, אפשר לתמיסת האליקווט להפשיר לחלוטין ולהומוגן שוב באמצעות מערבל וורטקס.
    הערה: להכנת תמיסות תת-מלאיות בריכוזים אחרים, השתמשו בנוסחה הבאה
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ נפח התמיסה המקורית הנדרש להכנת התמיסה החדשה
    x mM: הריכוז הרצוי של התמיסה החדשה.
    y (μL): הנפח הרצוי של התמיסה החדשה.

5. תרבית תאים

  1. השתמש בתאי NHDF על ידי סיבוב עדין של הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: תאי NHDF יכולים להיות מוחלפים בפיברובלסטים של עורלה אנושית (HFF) או קווי תאים אחרים היוצרים שכבה מונו-שכבה יציבה. בדיקת פלאק פועלת רק עם קווי תאים היוצרים שכבה אחת יציבה, כלומר תאים שצמיחתם נעצרת במגע. קווי תאים שאינם מראים עיכוב רבייה, כמו קווי גידול, אינם יכולים לשמש, שכן התאים מתחרים עם הטפילים על חומרים מזינים בתווך התרבית וממלאים את אזור הפלאק שנוצר על ידי הטפילים.
  2. העבר מיד תאים מופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל מדיום RPMI-1640 עם תוספת (סיטה 1).
  3. צנטריפוגה את התאים בעוצמה של 200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר מחזור הסיבוב מסתיים, כדור תא צריך להיות גלוי בתחתית הצינור.
  4. השליכו בזהירות את הסופרנטנט כדי לשמור על כדור התא.
  5. החזירו את כדור התא עם 12 מ"ל מדיום RPMI-1640 המכיל 10% FBS וזרעו שלושה בקבוקים של25 ס"מ 2 תרבית או בקבוקון אחד 75 ס"מ 2 . לאחר 2-3 ימים, בדקו את בקבוק התרבית באמצעות מיקרוסקופ ניגוד הפוך כדי לקבוע את התאוששות התרבות התאים (תאים צריכים להראות לפחות 40%-50% מפגש תאים).
  6. כאשר התאים מגיעים לשכבה אחת מלאה (100% מפגש אחד), הסר את המדיום מהבקבוקון באמצעות פיפטת פסטר. זרוק את המדיום ואת הפיפטה.
  7. מוסיפים 1-2 מ"ל PBS פעם אחת לבקבוקון, חכו דקה אחת, והסירו את ה-PBS.
  8. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-וורסן 0.05% לבקבוק והנח אותו באינקובטור עם 5%CO2, לחות וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  9. לאחר שתי דקות, התבוננו בתאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים נפרדו.
  10. החזירו את התאים המנותקים עם מדיום RPMI-1640 של 24 מ"ל עם 10% FBS באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל ומתקן פיפטות אוטומטי.
    הערה: כל בקבוק תרבית בגודל 25 או 75 ס"מ² עם שכבת מונוליינט מתאחדת מסוגל לשכפל ב-5 או 15 בקבוקי תרבית נוספים בגודל 25 ס"מ רבוע, בהתאמה.
  11. לאחר הוספת נפח המדיום הנדרש (24 מ"ל), הומוגניזציה של תליית התא עם הפיפטה הסרולוגית.
  12. העבר 4 מ"ל מתליית התא במידה בינוניתלכל בקבוק בגודל 25 ס"מ או 12 מ"ל עד 75 ס"מ2 בקבוק. זכור להשאיר 4 מ"ל של מתלה תא בבקבוק הראשוני.
  13. הניחו את הבקבוקים באינקובטור עם 5%CO2, לחות וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  14. חכו עד שתתקבל שכבה אחת מלאה של תאים (100% מהמפגש).
    הערה: זהה כל בקבוק עם התאריך ומספר המעבר.

6. הכנת צלחת גידול

  1. בדוק את שלמות שכבת התא (100% מפגש בבקבוק) בבקבוק התרבית באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
  2. פעל לפי הליך הטריפסיניזציה כפי שתואר לעיל (שלבים 5.7-5.9).
  3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, החזירו את התאים המנותקים עם מדיום RPMI של 4 מ"ל והעבירו אותם לצינור קוני של 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  5. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
  6. החזירו את כדור התא עם 1 מ"ל של מדיום RPMI-1640 טרי.
  7. הומוגניזציה באמצעות מערבל מערבולת.
  8. העבר 10 מיקרוליטר לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 490 מיקרו-ליטר של תמיסת פורמלדהיד 4% (דילול 1:50) באמצעות מיקרופיפטה עם קצה סטרילי.
    הערה: גורם הדילול = (נפח כולל (μL)) / (נפח דגימה (μL))
  9. להקים תא נויבאואר.
  10. הומוגניזציה של התמיסה הקיבועית עם הטפילים (שהוכן בסעיף 6.8) באמצעות מערבל מערבולות.
  11. הוסף 10 מיקרוליטר מהתמיסה עם הטפילים הקבועים לתא נויבאואר.
  12. סופרים את ארבעת הרבעים של חדר נויבאואר, שכל אחד מהם מורכב מ-16 ריבועים.
  13. קבע את מספר התאים למילילטר:
    מספר התאים (למיליטר) = [(n° תאים לריבוע)/4] x Fd x 104
    כאשר:
    FD (גורם דילול) = 50
  14. זרעו כל באר של פלטת תרבית בת 12 או 6 בארות, עם 5 ×10 4 או 10תאים באורך 1 או 2 מ"ל של מדיום RPMI-1640 שהושלמו עם 10% FBS.
  15. הניחו את הלוחות באינקובטור עם 5%CO2, אווירה לחה, וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  16. חכו עד ששכבת התא תגיע ל-100% מפגש משותף.

7. גידול בטכיזואיט במבחנה

הערה: לבדיקת הפלאק, אנו ממליצים על זן RH של T. gondii.

  1. השליכו את המדיום הישן מבקבוק2 ס"מ המכיל שכבה אחת מלאה (100% מפגש תאי NHDF) באמצעות פיפטת פסטר. לאחר מכן, הוסיפו 4 מ"ל של RPMI-1640 מדיום מלא טרי לבקבוק.
  2. העבר 5 מיקרוליטר של סופרנטנט המכיל טכיזואיטים טריים שיצאו מבקבוק קודם עם תרבית נגועה מפורקת. הנפח של 5 מיקרוליטר מאפשר מחזור ליטי של 6-7 ימים לכל בקבוק בגודל 25 ס"מ².
  3. הניחו את הבקבוק הנגוע החדש באינקובטור עם 5%CO2, אווירה לחה וטמפרטורה של 37°C.

8. כימות טכיזואיט

  1. הסרת המדיום מבקבוק התרבית המכיל טפילים שיצאו זה עתה באמצעות פיפטת פסטר והעבר לצינור קוני בקוטר 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 760 x g בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. כאשר מחזור הסיבוב מסתיים, נראה כדור גלוי נראה בתחתית הצינור.
  3. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
  4. החזירו את כדור הטפיל עם 1 מ"ל של RPMI-1640 בינוני טרי עם 2% FBS.
  5. הומוגניזציה של תליית הטפיל באמצעות מערבל מערבולת.
  6. העבר 10 מיקרוליטר של תליית הטפיל לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 490 מיקרוליטר של תמיסת פורמלדהיד 4% (דילול של 1:50) עם פיפטה עם קצה סטרילי.
  7. עקבו אחרי השלבים המתוארים ב-6.10 עד 6.12.
  8. קבעו את מספר הטכיזואיטים ל-1 מ"ל.
    הערה: מספר הטכיזואיטים (למילילטר) = [(n° טכיזואיטים בריבוע)/4] x Fd x 104
    כאשר:
    FD (גורם דילול) = 50

9. הכנת בדיקת פלאק ליצירת מולקולות פעילות מספריית כימולוגיה

הערה: מבחן זה נועד לזהות מולקולות שמפחיתות את התרבות T. gondii ביותר מ-50% בריכוז של 1 מיקרומון. לפני תחילת הבדיקה, יש לבצע בדיקת ציטוטוקסיות (למשל שיטת MTS או MTT) כדי לוודא שריכוזי התרכובות המשמשים בבדיקת הפלאק אינם רעילים לתאי המארח.

  1. אשר כי תרביות התאים הגיעו למפגש של 100% בלוחות של 12 או 6 בארות.
  2. השליכו את המדיום הישן והוסיפו 1 או 2 מ"ל של RPMI-1640 מדיום טרי עם 2% FBS לכל באר בלוחות עם 12 ו-6 בארות, בהתאמה.
  3. הוסף את התרכובות לבדיקה לכל באר בריכוז הרצוי. לסקר הראשוני מומלץ ריכוז של 1 מיקרומון.
    הערה: השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את הנפח שיש להוסיף לכל באר.
    V (μL) = (ריכוז סופי בבאר (μM) x נפח בתוך באר (μL)/(תמיסת סטוק (μM))
  4. הוסף 600 טכיזואיטים (לפלטת 12 בארים) או 1,000 טכיזואיטים (ללוח 6 בארות) של זן RH לכל באר.
    הערה: שינויים בהתרבות הטפילים עשויים להתרחש כתוצאה מהבדלים בין ספקי מדיום התרבית או FBS, או בקווי התאים בהם משתמשים. לכן, מומלץ לבצע ניסוי פיילוט כדי לקבוע את מספר הטפילים האופטימלי לכל מצב מעבדה. התאימו את כמות הטפיל ששימשו לניסוי זה, אם צריך.
  5. הניחו את הלוחות באנינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 ואטמוספירה לחה למשך 7 ימים ללא הפרעה.
    אזהרה: אין להזיז או לגעת בלוחות במהלך תקופת הדגירה בת 7 הימים. אם זה יקרה, הניסוי ייהרס.

10. צביעת לוחות בסגול קריסטלי ורכישת תמונה

  1. לאחר 7 ימים, הסר את המדיום מכל באר.
  2. שטוף כל באר בזהירות עם 1x PBS בטמפרטורת החדר.
  3. השליכו את ה-PBS והוסיפו בזהירות 1 מ"ל אלכוהול בטמפרטורה של 70% לכל באר. משאירים בטמפרטורת החדר ל-15 דקות, ואז זרקו.
  4. הוסף את תמיסת הקריסטל סגולת 0.5% ומשאיר אותה לעמוד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את תמיסת הסגול הקריסטלי.
  6. שטפו כל באר בזהירות פעם אחת עם מים דה-יוניים.
    זהירות: בעת הסרת המדיום או ה-PBS במהלך שלבי הכביסה, אל תיגע בתחתית הבאר עם קצה הפיפטה, שכן הדבר עלול לפגוע בשלמות השכבה המונולרית. במהלך שלבי הכביסה, אל תזרוק זרם של PBS או אלכוהול ישירות על התאים. הוסיפו אותם היטב לאורך גבול הבאר.
  7. הנח את הצלחת הפוכה על נייר סופג כדי לנקז את עודפי המים ותן לה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
  8. צלם את הלוחות באמצעות סורק שטוח באיכות גבוהה28,29 או מערכת תיעוד המותאמת לאפשרות הג'ל הכחולCoomassie 21,22,30.

11. מבחן הפיכות

הערה: המטרה העיקרית של מבחן ההפיכות עם טכיזואיטים של T. gondii היא לקבוע האם יכולת ההתרבות של הטפילים מטופלים מבוטלת לחלוטין או הופחתת לאחר הסרת התרכובות מהמדיום31.

  1. זרע לוח 6 בארות עם תאי NHDF כפי שמתואר בשלב 6. לכל באר, הוסף 1 x10 5 תאים שתלויים מחדש ב-2 מ"ל של RPMI-1640 עם תוספת של 10% FBS.
    הערה: כאשר שכבת התאים מגיעה ל-100% מפגש בכל באר, הפלטה מוכנה לבדיקת הפלאק.
  2. זרוק את המדיום והוסיף 1 x 104 טכיזואיטים תלויים ב-2 מ"ל חומר בינוני טרי עם 2% FBS לכל באר.
  3. לאחר שמאפשרים לטכיזואיטים לקיים אינטראקציה עם תאי ה-NHDF למשך שעה, מוסיפים את התרכובות הנבחרות בריכוז סופי הקרוב לריכוז המעכב של 90% (IC90). באר שמכילה רק את מדלל התרופה משמשת כבקרה חיובית.
  4. טפלו בטכיזואיטים במשך 4 ימים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 ואטמוספירה לחה.
  5. לאחר תקופת הטיפול בת 4 ימים, שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 1x PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח הסרה מלאה של התרכובות.
  6. הוסף לכל באר 2 מ"ל מדיום טרי ללא התרכובות ושמור את הפלטה באינקובטור למשך 7 ימים נוספים.
  7. צבע את הפלטה בצבע קריסטל סגול וצלם אותו כפי שתואר בשלב 10.

12. ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ

  1. פתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ32.
  2. בחרו את השטח המתאים לבאר אחת באמצעות כלי הבחירה האובלי (איור 1A,B).
    הערה: בעת הבחירה, התעלם מאזורים בגבול הבאר שמציגים פגמים. אלה נמצאים לעיתים קרובות בקצוות הבאר.
  3. העתק ויצירת תמונה חדשה: העתק את האזור הנבחר על ידי לחיצה על Ctrl + C; יצירת קובץ תמונה חדש על ידי לחיצה על Ctrl + N; מדביקים את התמונה המועתקת לחלון שחור חדש באמצעות Ctrl + V.
    הערה: בעת יצירת התמונה החדשה, השתמשו בהגדרות ברירת המחדל: 8-ביט, מילוי בשחור, 512 x 512 פיקסלים, ופרוסה אחת (איור 1C).
  4. נווט ל: תמונה > כוון > סף, או לחץ Ctrl + Shift + T (איור 1D).
  5. בחלון הסף, בחר באפשרויות הואנג ואדום, ואז לחץ על אוטומטי (איור 1E).
  6. לחץ על ניתוח, ואז בחר בניתוח חלקיקים (איור 1F). שמור את האפשרויות ברירת המחדל בחלון שמופיע ולחץ על אישור (איור 1G).
  7. חלון חדש ייפתח. העתק את הערך המוצג ב-%Area (מודגש על ידי מלבן אדום באיור 1H) כדי לחשב את אחוז התרבות או עיכוב הטפילים.
  8. חזור על השלבים האלה עבור כל באר על הצלחת.
  9. כדי לחשב את אחוז ההפצה, השתמשו בנוסחה הבאה:
    אחוז התפשטות = (%שטח מטופל היטב/%אזור בקרת באר) × 100
  10. כדי לחשב את אחוז העיכוב, השתמשו בנוסחה הבאה:
    אחוז העיכוב = [1- (% אזור מטופל היטב/%שליטה טובה בשטח)] × 100

איור 1
איור 1: ניתוח שלב אחר שלב של תוצאות בתוכנת ImageJ. (א) בחירת כלי "אובל". (ב) בחירת תחום העניין בתמונה. (C) חלון תמונה חדש (Ctrl + N) עם הגדרות מומלצות. (ד) שלבים לניתוח סף לאחר הדבקת אזור העניין בחלון התמונה החדש. (ה) בחירת אפשרויות הואנג ואדום בחלון הסף, מה שגורם לכך שכל האזורים הלבנים מתמלאים באדום. (ו) רצף השלבים המשמשים ל"ניתוח חלקיקים". (G) ההגדרה ששימשה לניתוח חלקיקים. (H) תוצאת אחוז השטח ההרוס הכולל מוצגת בחלון הסיכום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

13. ניתוח סטטיסטי

  1. ארגן את הנתונים בגיליון אקסל בתוך תוכנת Office לאחר חישוב אחוז עיכוב ההתפשטות.
  2. פתח את תוכנת GraphPad Prism 5.0, ולחץ על XY (מתחת לטבלה החדשה והגרף).
  3. בסעיף Y (מתחת ל"X:פס השגיאה"), הזין את מספר החזרות על הנתונים (בדרך כלל שלושה שכפולים ביולוגיים). מספר זה עשוי להשתנות בהתאם למספר החזרות שבוצעו.
  4. בחר ממוצע רק ליד הגרף ואל תבחר "הזן ותגרף ערכי שגיאה שכבר חושבו במקום אחר", ואז לחץ על יצירה.
  5. מקם את נתוני הריכוז על ציר ה-X ואת נתוני אחוזי עיכוב ההתפשטות בעמודות A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. לחץ על = ניתוח ואז לחץ על טרנספורמציה, ואז אישור. חלון חדש ייפתח. בחלון החדש הזה, לחצו על Transform X values באמצעות X = Log(X), ואז לחצו על יצירת גרף חדש של התוצאות, ואז OK.
  7. לחצו על = ניתוח ואז על נרמל. חלון חדש ייפתח. בסעיף 'איך מוגדר 0%?', לחץ והגדר Y = 0.0. בסעיף "איך מוגדר 100%?", לחץ והגדר Y = 100; בחר אחוזים ולחץ על צור גרף חדש של התוצאות.
  8. לחץ על הסמל: התאמת עקומה עם רגרסיה לא ליניארית שממוקמת למעלה = ניתוח. לחצו על Dose-response - Inhibition, ואז על log (מעכב) לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה, ואז לחצו על אישור.
    הערה: ייפתח חלון שיציג את התוצאות הבאות: IC50 (ריכוז מעכב של 50%), רווח הביטחון של 95%, וערך R2. ערכים אלו חיוניים ויש לכלול אותם בטבלת תוצאות בתוך המאמר.
  9. להערכת ריכוזים מעכבים אחרים, כגון IC25, IC90 או IC95, השתמשו בקישור (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: ריכוז אפקטיבי. דווחו על IC50 ו-HillSlope שהושגו על ידי תוכנת Prism עבור כל בדיקת סמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להערכת בדיקת הפלאק לאחר הטיפול, הן הבדיקות החיוביות (תאים נגועים בטכיזואיטים ולא מטופלים) והן השליליות (תאים לא נגועים עם 0.1% DMSO) הן קריטיות. בסיום הניסוי, באר הבקרה החיובית צריכה להציג מרחבים ריקים מוגדרים היטב עם שאריות של תאים דבוקים (איור 2). לעומת זאת, באר הבקרה השלילית צריכה להציג שכבה מונולרית שלמה ללא חללים ריקים. הבקרה השלילית קריטית לאישור שלמות השכבה המונולרית וחיוניות התאים לאורך כל הניסוי. הביקורת החיובית משמשת כנקודת ייחוס לחישוב אחוז העיכוב של התרבות T. gondii על י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסטנדרטיזציה של פרוטוקולים חדשים לבדיקות אנטי-פרופרטיביות היא צעד יסודי לקידום המחקר המדעי בזיהוי תרופות עתידיות. הפרוטוקול המוצג כאן מציע גישה חלופית להערכת פעילות מולקולות ביואקטיביות במבחנה מול טכיזואיטים של T. gondii. בהינתן ש-T.gondii הוא טפיל תוך-תאי חובה שמתמקם על ידי תנועתיות מחליקה, כאשר הטפילים יוצאים מתא מרוסק, הם יפלשו לתאים הסמוכים לתא שנדבק קודם. לכן, ככל שהטפיל מתרבה, הוא גורם לאזורי הרס מוגדרים היטב (איור 2), שגודלם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ביניהם ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים גם מודים למימון של המועצה הלאומית להגנה על הכדורים והפסקיצה (CNPq), קרן האמפארו למינאס ג'ראיס (FAPEMIG), ו-CAPES/PROEX. המחברים רוצים להודות לפרו-רייטוריה דה פסקיסה מהאוניברסיטה הפדרלית של מינאס ז'ראיס על תמיכתה במחקר זה. ESMD (CNPq 308082/2023-0) ו-RWAV (CNPq 305574/2021-3) הם עמיתים לפרודוקטיביות CNPq.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Trypsin-EDTAטכנולוגיות חיים25300-062
פיפטה סרולוגית 10 מ"לאולןK17-110
צנטריפוגה של צינור בז 15 מ"לפאנםדגם: 206
פיפטה סרולוגית 5 מ"לאולןK17-115
לוח גידול בעל 6 בארותסארסטדט833920
איזון אנליטימטלר טולדו  דגם: AB204 מספר סידורי: 1116473813
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X)טכנולוגיות חיים15240-062
פיפטה אוטומטיתקסוויK1-AID
צנטריפוגהאפנדורףדגם 5415 R מספר סידורי: 0023591
חממת CO2תאגיד PHCמספר דגם: MCO-230AICUVL-PA מספר סידורי: 210360090
בקבוק תרבית 25 ס"מ רבועסארסטדט833910
מערכת הכריזה דימתיל סולפוקסיד (DMSO)מרק 1,02,95,21,000
אתנול P.Aמרק1,00,98,31,000
סרום בקר עוברי (FBS)טכנולוגיות חיים12657-029
פורמלדהיד 37-38%פנריאק131328
GraphPad Prism תוכנת GraphPad-גרסה 8.0.1
ImageJ  software --גרסה 1.52e
מערכות תיעוד דימותביו-ראדמודל:  מערכת ההדמיה של ChemiDoc MP מספר סידורי: 734BR2249
מכסה זרימה למינריוקו דו ברזילדגם: VLFS-09
L-גלוטמין 200 מ"מ (100X)טכנולוגיות חיים25030-081
מיקרו צינור 0.5 מ"לסארסטדט72,699
פיברובלסט דרמלי אנושי תקין לתינוקות (NHDF)לונזהCC-3132בנדיבות מסופקת על ידי ד"ר שילה נארדלי, מפיוקרוס פאראן´, ברזיל
תא נויבאואר 0.100 מ"מ 0.0025 מ"מ²אופטיקה חדשה7301-1
מד pHmמיקרונלידגם: B374 מספר סידורי: 30/37
Pipette 20-200 ומיקרו; Lבסיס קסווי22032893
Pipette 2-20 ומיקרו; LLabmate Pro656630226
Pipette  0.2-2 ומיקרו; LLabmate Pro556610114
Pipette  1000-5,000 ומיקרו; LיוניסיינסYM4A021482
Pipette  100-1000 ומיקרו; Lאפנדורף ריסרץ' פלוסQ34354C
אשלגן פוספט מונובסיסי  (KH2PO4) P.A סינתיסייזר01F2002.01.AF
RPMI-1640 בינוניסיגמא-אלדריץ'  R0883
נתרן כלוריד (NaCl) P.A. Cromoline Quí מיקה פינה  -
נתרן פוספט די-בסיסי (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
טיפ 1.000 ומיקרו; Lסארסטדט7,01,186
טיפ 10 ומיקרו; Lסארסטדט7,03,010
טיפ 5,000 ומיקרו; Lסארסטדט70,11,83,001
טיפ  200 ומיקרו; Lסארסטדט7,03,030
Transfer Pipette  (3.5 מ"ל) סארסטדט86,11,71,001
צינור 15 מ"לסארסטדט6,25,54,502
קריסטל סגולמרק101408
מערבל מערבולתפיניקסדגם: AP56 מספר סידורי: 6633
אמבט מיםHemoquimica do Brasilדגם: HM1003 מספר סידורי: 700001556

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vitro

מאמרים קשורים