מאמר שיטה

מודל קדם-קליני של סינוביטיס המשתמש ברקמה סינוביאלית אנושית מחוץ לחיים עם תפקוד וארכיטקטורה נשמרים

332 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69734

⸱

20 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

במאמר זה

סיכום

פיתחנו מערכת טרנסוול אנושית מחוץ לחיים המסוגלת להעריך שינויים דלקתיים, זיהומיים ומבניים חריפים בסינוביום.

תקציר

דלקת מפרקים היא מצב דלקתי במפרקים הגורם לנזק לסחוס, כאב ואובדן תנועה. התקדמויות אחרונות במחקר דלקת מפרקים מראות במפורש כי קפסולת המפרק (למשל, סינוביום) היא מקור חשוב לדלקת זו, אך אין מודלים אנושיים המשכפלים ארכיטקטורה סינוביאלית חיונית. כדי להתמודד עם זה, נוצרה מערכת ניתוח חלל משותפת, או JSAS. הסינוביום הקדמי הושג במהלך ניתוח ממטופלים שעברו ניתוח ארתרופלסטיה מלאה בברך (TKA). הסינוביום נותח וחולק לליבות ביופסיה בקוטר 3 מ"מ. הליבות הוצבו בבאר העליונה של באר טרנסוור בגודל 5 מיקרון או 0.4 מיקרון עם 300 מיקרוליטר DMEM ו-10% FBS. בבאר התחתונה נוספו 600 מיקרוליטר של מדיה, והוחלפו כל 2-3 ימים. הערכות הוערכה עד 7 ימים בתנאי דגירה היפראוקסיים (50%), אטמוספריים/סטנדרטיים (~21%) ופיזיולוגיים (5%). הגירויים בבאר התחתונה כללו חלבון כימואטרטנטנט מונוציטים 1 (MCP-1/CCL2), ליפופוליסכריד (LPS), N-אצטיל ציסטאין, S. aureus ו-B. burgdorferi. המדיה נשמרה עבור ELISA, והרקמה אוחסנה לניתוח FFPE. בתנאים סטנדרטיים, הסינוביום נשאר חיוני לחלוטין במשך 3 ימים. הגירוי שינה את המבנה והתפקוד של תאי הרירית האינטימלית ותאי הסינוביאלים התת-ציפיים, כולל אובדן גף המקרופאגים הקבועים, התרחבות תת-השטח, הגברת ויסות הפיברובלסטים הפתוגניים, וייצור ציטוקינים IL-1β ו-TNFα. תאי החיסון והפיברובלסטים נדדו לתא התחתון (נקבוביות של 5 מיקרון) בניתוח ציטומטריית זרימה. B. burgdorferi נייד נדד לרקמה בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרון, בעוד ש-S. aureus הלא-נייד לא. ציטוקינים רלוונטיים הובאו לידי ביטוי בכמות מספקת עבור ELISA. JSAS היא מערכת מודולרית המסוגלת לחקור שינויים חריפים בסינוביום האנושי, ומאפשרת מורכבות של מבנים תלת-ממדיים במודל פרה-קליני תוך שמירה על מבנה ותפקוד ביולוגיים רלוונטיים.

מבוא

דלקת מפרקים פוגעת ביותר מ-20% מכלל המבוגרים בארה"ב ו-50% מבני 65 עם מחלות כרוניות1. הוא גם גורם מוביל לנכותברחבי העולם. דלקת מפרקים כוללת לא רק נזק לסחוס, אלא גם דלקת בקפסולת המפרק או בסינוביום (למשל, סינוביטיס). סינוביטיס כרוני הוא ככל הנראה מקור עיקרי לציטוקינים פרו-דלקתיים שמחזקים נזק לעצם ולסחוס באוסטיאוארתריטיס ודלקת מפרקים שגרונית. לכן, הבנת השינויים המתווכים על ידי מערכת החיסון בתוך הסינוביום כנראה חיונית לפיתוח אפשרויות טיפוליות חדשות ואולי גם מניעתיות עבור חולי דלקת מפרקים.

סינוביום הוא מבנה מאורגן המורכב משתי שכבות עיקריות: רירית התא האינטימי (IntL) והציפוי התת-(SubL). ה-IntL מתחבר לנוזל סינוביאלי (SF), וה-SubL מייצר רכיבי SF ומכיל מבנים וסקולריים5. בתוך ה-IntL קיימים גם מקרופאגים וגם סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים (FLS). המקרופאגים של ה-IntL הם תאים תושבים, המתחדשים מקומית על ידי מקרופאגים אינטרסטיציאליים בתוך תת-L6. המקרופאגים הסינוביאליים התושבים (RSMs) אלו מוטים ב-M2 על ידי ביטוי של CD206 ו-TREM2, אפיתליאליים ומבטאים סימני חיבור הדוקים. תת-מבנה זה של ה-IntL עשוי להיות מפתח בשמירה תפקודית ופיזית על הומאוסטזיס המשותף 5,6. דבר זה נצפה בדלקת מפרקים שגרונית (RA). לדוגמה, כאשר ה-IntL מתפרק, מטופלים עם דלקת מפרקים שגרונית חווים תסמיני התלקחות, שנעלמים כאשר הרירית מתחדשת 6,7. הפוגה ספונטנית של RA קשורה במיוחד ל-MerTK +CD206+ מקרופאגים סינוביאליים7. זוהו גם RSMs בחולים עם כאבי מפרקים חריפים, ומצאו כי חומרת המחלה הזיהומית או הדלקתית קשורה לכמות ה-RSM והציטוקינים הדלקתיים8. למרבה הצער, הקשר בין מבני IntL ו-SubL, שינויים תפקודיים של RSM ו-FLS, וייצור מתווכים דלקתיים שעלולים להזיק לסחוס ו/או לעצם, קשה לשאול, במיוחד אצל בני אדם.

כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של סינוביטיס במגוון הקשרים קליניים רלוונטיים, פותח מודל אקס ביבו אנושי בשם Joint Space Analysis System (JSAS). מערכת זו מפיקה תוצאות ניתנות לשחזור עם אלמנטים מודולריים המאפשרים הערכה רחבה של דלקת דלקתית וזיהומית. מאמר זה מתאר את תהליכי רכישת הרקמות מניתוחים נפוצים במפרק פתוח, כגון החלפת מפרק מלאה, תכנון JSAS, ההיסטומורפומטריקה הנדרשת לכימות שינויים מבניים חריפים בסינוביום, והתגובות התפקודיות של הרקמה, כולל באמצעות אימונופלואורסצנציה (IF), RNAscope ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA). JSAS שונה ממודלים אנושיים נפוצים במבחנה בכך שהוא שומר על מבני IntL ו-SubL, ומאפשר תובנות קרובות בחיים לגבי סינוביטיס חריפה או חריפה כרונית שמובילה לנזק לסחוס. על ידי שמירה על המבנה הטבעי של הסינוביום, ניתן לנתח את היכולות הפנימיות של RSM ו-FLS כדי לדכא או להנציח דלקת. כמודל אקס ויבו, הוא אינו דורש התמיינות של תאי חיסון היקפיים למקרופאגים סינוביאליים או פישוט יתר של סינוביום ל-1-2 סוגי תאים בדידים בלבד. הוא שונה ממודלים של בעלי חיים כמו דלקת מפרקים מונעת קולגן (CIA) בכך שהוא משתמש ברקמה אנושית חולה, ומאפשר הערכה ספציפית לפתוגנים הרלוונטית לאדם. לבסוף, ניתן לדמות זיהומים מרובים, מה שמאפשר מודל של דלקת מפרקים ספטית בנוסף לאוסטיאוארתריטיס ודלקת מפרקים דלקתית. המגבלה העיקרית היא תרבית למשך 3 ימים בתנאים סטנדרטיים לפני תחילת האפופטוזיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הסכמת המטופל ופרוטוקול עיבוד הרקמות אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית המקומית (IRB). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. רכישת רקמות וביופסיה

  1. זהה מטופלים לפני הניתוח בהתבסס על לוחות הזמנים של המנתח. גייסו מטופלים בגילאי 18-65 העוברים ניתוח מפרק פתוח, כגון ניתוח ארתרופלסטיה מלאה בברך (TKA) או אוסטאוטומיה של השחפת הטיביאלית (TTO, המכונה גם פולקרסון), ואינם נוטלים תרופות אימונומודולטוריות מערכתיות.
    הערה: רצוי להוציא מטופלים שעברו יותר מארתרוסקופיה אחת או יותר מהזרקה אחת לגלוקוקורטיקואידים, שכן למטופלים אלו הייתה כשל גבוה יותר ברכישת רקמות במהלך הניתוח מאשר אוכלוסיות אחרות עקב פיברוזיס. בהינתן הסיכון להעברת זיהום, יש לדחות גיוס מטופלים עם היסטוריה של הפטיטיס C או וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) אלא אם כן הדבר רלוונטי לתוצאות. נהגו בטיפול בטוח בכל עת עם רקמות אנושיות טריות, ללא קשר למצב המחלה הזיהומית.
  2. מנתחים אורתופדיים מבצעים ארתרוטומיה ודיסקציה כחלק מההליך הסטנדרטי. לזהות את הסינוביום הקדמי מיד קרוב לחריץ הטרוכלארי ולהשתמש באלקטרוקוטריה לכריתת הסינוביום בלוק תוך הימנעות מכריתת שריר הארטיקולאריס גנו או ליד האפיקונדילים המדיאליים והצידיים. סינובקטומיה היא יחסית ניטרלית לתוצאות TKA, ובמצבים דלקתיים עשויה להיות מועילה 9,10. העבירו את הסינוביום באופן סטרילי לחבר צוות המחקר והניחו אותו במיכל דגימה סטרילי עם מלח דולבקו הקר (DPBS) על קרח.
    הערה: יש להפסיק את רכישת הרקמה אם צוינו חריגות על ידי צוות הניתוח, או אם הסינובקטומיה תפגע בסגירה או בתוצאה ניתוחית. האחרון בפרט יהיה נדיר מאוד ב-TKA, שכן כריתת סינוביום יכולה לשמש כהליך מתיחה לשחרור מפרקים הדוקים... כמות הכריתה תלויה בגודל הניסוי. ניתן לקבל בערך ארבע ליבות ביופסיה בגודל 3 מ"מ לכל 1 ס"מרבוע של רקמה. במקרים רבים, ניתן לקבל 24 ס"מ רבע או יותר של רקמה. משקל הרקמה תלוי מאוד בניתוח, ולכן הוא אינו אמין כמו שטח הפנים לקביעת ההתאמה לניסוי. איור 1 ממחיש את השלבים 1.2-1.7.
  3. החזיר את הסינוביום למעבדה ושטוף פעמיים ב-DPBS קר במשך 10 דקות על נדנדה עם פלטה.
  4. העבר את הסינוביום לצלחת פטרי סטרילית בגודל 10 ס"מ ומעלה בתנאים סטריליים בארון ביו-בטיחות ברמת ביו-בטיחות 2 (BSL2). הוסיפו את מדיום Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco קר, סטרילי ודל גלוקוז, המכיל נתרן פירובט ו-L-גלוטמין, מספיק כדי למלא את המנה עד למחצה. זהה את הציפוי הסינוביאלי לפי שכבת ה-IntL הפנינתית (איור 2A), בניגוד לצד השרוף (איור 2B).
    הערה: ה-IntL שברירי. היזהרו לא לקלף אותו, אחרת הוא יתנתק מהתת-קו (איור 2A, מוחזק על ידי המוסטט). פנינה עשויה להשתנות בעקבות היסטוריה קודמת של המרטרוזיס (מראה צהוב-כתום עקב המוסידרין), BMI גבוה (מכוסה בשומן), או דלקת (אדום, פריך ונוצץ). חשוב מאוד לזהות נכון את ה-IntL לפני הפעלה. בדקו היטב סימנים לכריתה כירורגית, צריבה, דימום וקרישה כדי לקבוע שהצעדים הבאים אינם מתבצעים ב-IntL.
  5. נתח רקמות שומן וסטרומליות מיותרות בצד השרוף כדי לבודד את הסינוביום, תוך שמירה על עומק רקמה של כ-4-5 מ"מ בכל האזורים. ניתן להשתמש במספריים או סכינים לפי העדפה אישית. שנה את מדיית צלחת פטרי לפי הצורך כדי לשמור על שדה הראייה.
    הערה: רקמת סטרומל או שומן אחורית ניתנת לכריתה בקלות. עם זאת, קושי בניתוח או תחושת התנגדות גבוהה מעיד על רצועה מוחזקת, מטפלזיה ברקמות כמו הצטברות סחוס לא מתאימה, או חיתוך דרך ה-IntL.
  6. לאחר הניתוח לעומק מתאים, יש להשיג ליבות ביופסיה בקוטר 3 מ"מ לפי הצורך למינימום 2 שכפולים טכניים לכל מצב שנבדק. בצע עם הציפוי הסינוביאלי הפונה לכלי הליבה במקום מול משטח צלחת הפטרי. יכול להשתמש במאגר ביופסיה איכותי כ-10-15 פעמים לפני שצריך להחליף עקב קהות, שכן פאנץ' ביופסיה עמום עלול לגרום לנזק למבנה הרירית האינטימית.
    1. בצע קורינג עם עומס מאונך חזק וסיבוב עדין. אם זה מסובב את הרקמה, כלי הביופסיה הפך לקהה וצריך להחליף. ייצוב עם היד הלא דומיננטית באמצעות מלקחיים או המוסטטים.
      הערה: ליבות בקוטר 3 מ"מ שימשו למקסום הפרפוזיה ברקמות וכן למספר הליבות לכל מטופל ולהבטיח מספיק שכפולים טכניים לניסויים אלו. ניתן להשתמש בליבות בגודל חלופי, אך נבדקו רק 3 מ"מ לפרוטוקול זה.
      הערה: עודף שומן שנשאר עקב חיתוך לא מספק עלול לגרום לליבה לצוף ב-JSAS, מה שאינו אופטימלי. אם הליבות צפות אל פני השטח במקום להישאר שקועות במים, חזרו לניתוח או בחרו בליבה טבולה.
  7. פתח צלחת פטרי שנייה ומלא ב-5-10 מ"ל של מדיה מחוממת (37 מעלות צלזיוס) עם 10% FBS. עם מלקחיים שטוחים או ללא שיניים, העבירו ליבות לצלחת זו כדי לשטוף פסולת עם 1-2 שניות של ערבוב מכני עדין. אל תלחץ חזק על הליבה, אחרת זה עלול לפגוע ברירית האינטימית.
    הערה: ניתן לעצור כאן למשך ≤24 שעות על ידי הצבת ליבת רקמה באינקובטור בטמפרטורה סטנדרטית של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.

2. הקמת מערכת ניתוח חלל משותפת (JSAS)

  1. הכינו את הבאר התחתונה של JSAS עם 600 מיקרוליטר DMEM מחומם (37 מעלות צלזיוס) עם רמת סוכר נמוכה ו-10% FBS. למרות שנבדקו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ללא תופעות שליליות מורגשות במערכת זו, בדרך כלל לא מוסיפים אנטיביוטיקה למדיה אם העיקור נשמר כראוי.
    הערה: אם מדובר בתרבות משותפת עם חיידקים או קו תאים שדורש מדיה שונה, הבאר התחתונה עשויה להיות מדיום שונה. הימנע ממדיה אנטיביוטית אם מדובר בגידול עם חיידקים.
  2. לתחתית, הוסיפו את הטיפול המועדף. לדוגמה, ליפופוליסכריד (LPS). כדי למנוע הבדלים באוסמולריות, מומלץ שנפח הטיפול לא יעלה על 2.5% מהנפח הכולל (למשל, ≤15 מיקרוליטר עבור 600 מיקרוליטר). חסום כל שינוי ב-pH מהטיפולים כדי לשמור על pH של 7.0-7.4. אחרת, השתמש בבקרת רכב.
  3. בחר את גודל נקבובית הטרנסוול בהתאם לתוצאה הניסויית הרצויה (איור 3).
  4. הוסף 300 מיקרוליטר DMEM דל גלוקוז עם 10% FBS למערכת העבר.
  5. העבירו בעדינות ליבות בודדות עם מלקחיים סטריליים לתוך המדיה של הטרנסוול. כיוון הרקמה אינו ניתן לשליטה; עם זאת, השומן והציפה הטבעית של רקמת הסטרום גורמות באופן טבעי לריפון האינטימי להיראות כלפי מטה ברוב ליבות הרקמה.
    1. הדמיינו בזהירות את הליבות שכן תהליך הליבה עלול להפריע לריריית האינטימי, והימנעו משימוש בליבות שנראות פרומות בתחילת הניסוי. אם הליבה צפה, שפר את הניתוח ובחר ליבה חלופית.
      הערה: יש לשקול מטריצת קולגן אם כיוון הרקמה חשוב; עם זאת, זה ישפיע על הזמן לפתח גרדיאנט כימי עם הבאר התחתונה.
  6. הניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2 למשך הזמן הרצוי.
    הערה: נקודת הזמן המוקדמת ביותר המומלצת לשינויים ביולוגיים היא 8 שעות. נקודת הזמן המאומתת האחרונה לפעילות ביולוגית היא 3 ימים.

3. פירוק וניתוח ניסיוני

  1. להיסטולוגיה, השתמשו במלקחיים סטריליים ללא שיניים להעברת רקמה ל-3-5 מ"ל של 10% פורמלין ניטרלי (NBF) לניתוח FFPE (FFPE) עם פורמלין מקובע. אחסנו ב-NBF למשך 3-7 ימים לפני הטמעה וחלוקה לאזור.
    1. אל תתנו לרקמה לעמוד לפרקי זמן ממושכים, כי זה מחמיר את האוטופלואורסצנציה. לבצע ניתוח היסטולוגי, כולל צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)11 להיסטומורפומטריה, אימונופלואורסצנציה (IF)12, ו/או RNAscope עם IF13 לפי שיטות סטנדרטיות.
      הערה: יש להיזהר לא לנקב את הטרנסוול עם מלקחיים בעת הסרת הרקמה. היו עדינים מאוד בהעברת הליבה, אחרת הרירית הפנימית עלולה להתנתק. הכניסו בעדינות את הליבה למצב קיבוע ואל תעוררו. יש להשתמש ב-NBF בתוך מכסה אדים כימי מוסמך, יש להיפטר ממנו בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית (EHS) המקומיות, ואסור לשפוך אותו לכיורים. רקמות אנושיות שלא נוצלו מהניסוי מונחות על אקונומיקה מעל 10% למשך 30 דקות, לאחר מכן מונחות בבידוד משני לפי דרישות ה-EHS המקומיות, ואז מושלקות במיכלי ביוסיכון מסומנים לשריפות. ניתן לשפוך את תמיסת האקונומיקה לתוך הכיור אם תאושר על ידי EHS המקומי. פעל לפי ההנחיות המקומיות, שיכולות להשתנות בהתאם למוסד.
  2. הטמעת שכפולים טכניים באותו בלוק FFPE. השתמש בקלטות עם מסך כדי למנוע אובדן דגימה. חתך בציר האורכי בעובי 5 מיקרון. הצב שלושה קטעים סדרתיים על שקף אחד (איור משלים 1).
  3. שקופיות H&E של תמונה ב-10x ו-40x באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. זהה את ה-IntL כשכבת התא המאורגנת בממשק בין רקמה למרחב הריק.
    1. רכוש 3 מקטעים מייצגים של 10x ו-10 מקטעים מייצגים 40x במינימום של 2 שכפולים טכניים לכל תנאי טיפול, תוך שמירה על ה-IntL בשדה הראייה. צלם תמונות כ-TIFF ברזולוציה גבוהה. ביצוע ניתוח היסטומורפומטריה:
    2. בצע מדידות ב-ImageJ/FIJI. ראשית, קבע את הסקאלה באמצעות תפריט ניתוח → Set Scale. קנה מידה מחייב שימוש בשקופית כיול המצולמת על כל מיקרוסקופ רלוונטי בכל מטרה. ראשית, השתמש בכלי הקו הישר כדי ליצור קו באורך ידוע בהתבסס על תמונת שקופית הכיול. הקצה את הקנה מידה באופן גלובלי.
      הערה: ב-10x, הקנה מידה הוא 3px/μm. ב-40x, הקנה מידה הוא 12 פיקסל למיקרון.
    3. מדוד עובי תת-L באמצעות תמונות 10x עם כלי הקו הישרים. מדוד עובי כעומק פלומב מהמשטח של IntL לתחתית תת-L (מיקרון). לאחר שצייר כל שורה, השתמש בקיצור המקלדת m כדי למדוד את אורך הקו.
      1. ממוצע מינימום של 5 מדידות לכל תמונה פי 10 (איור 4A,B). המעבר בין תת-L לרקמת סטרומל מסומן על ידי מעבר לאזורים פחות מאורגנים ופחות תאיים המכילים קולגן ושומן (איור 4B). חצו את נקודת המעבר בין תאי הרקמה.
    4. למדידות של 40x של עובי IntL, תאיות IntL, שלמות IntL ותאית תת-L, התחילו בפתיחת ה-40x TIFF ב-Adobe Photoshop (או בכל עורך תמונות דומה). ה-IntL מוגדר כשכבה בעובי ~1-5 תאים, מאורגנת לשכבה תאית מובחנת בממשק בין רקמה למרחב הריק (למשל, נוזל סינוביאלי) (איור 4C).
    5. צור שכבה חדשה. בחר את כלי Polygonal Lasso . באמצעות קליק בעכבר כדי להפעיל את הלאסו וכן אינטונקציות עוגן בקו, חצו את המעבר בין ה-IntL ל-SubL לאורך כל התמונה. לאחר מכן, המשיכו עם הלאסו ממש מחוץ ל-IntL בחלל הריק.
      1. סגור את החבל בלחיצה כפולה. הפוך את האזור הנבחר (בחר → הפוך), ואז מלא את החלל בשחור באמצעות כלי דלי הצבע . זה יכסה את כל האזורים שאינם ה-IntL. שמור את התמונה הזו כ-JPG ברזולוציה גבוהה המייצג את ה-IntL, ואז הסתיר את השכבה.
    6. צור שכבה חדשה. בהגדרות הלאסו הפוליגונלי, בחרו בתכונת החיתוך (intersection ), שתבחר רק היכן אזור הלסו החדש והאזורים הישנים של הלסו מצטלבים. לסו סביב שכבת התת-קו על ידי לחיצה דרך מרכז ה-IntL, סביב הקצוות השמאליים והימניים של התמונה אל קנבס הרקע, ואז חצו את המעבר בין תת-L לרקמה הא-תאית שמאחוריה.
      1. אם תחתית ה-SubL חורגת ממידות התמונה של 40x, פשוט בחר את קנבס הרקע סביב הקצה הנותר. שוב, בחר את ההפך של האזור כפי שתואר למעלה, ואז השתמש בכלי דלי הצבע כדי למלא בשחור. שמור את התמונה הזו כ-JPG ברזולוציה גבוהה המייצג את ה-SubL. שמור את התמונה השכבתית הזו כ-PSD לעיון עתידי.
        הערה: אריתרוציטים נפוצים בשקופיות אלו ועלולים להפריע למדידות ספירת תאים עתידיות. אם יש אזורים גדולים של כלי דם, השתמשו בכלי הלאסו הפוליגונלי, כלי המברשת או כלים אחרים לבחירה כדי ליצור מסכות על שכבה נפרדת המכסה אזורים אלה.
    7. בפיג'י, פתח את תמונת מסכת  ה-IntL. מדוד עובי IntL (מיקרומטר) בממוצע מינימום של 5 מדידות על פני התמונה של 40x באמצעות כלי הקו הישר כפי שבשלב 3.3.2-3.3.3.
    8. מדדו את האורך הכולל (μm) של ה-IntL באמצעות כלי הקו המקוטע. לאחר מכן מודדים את אורך האזורים השלמים בלבד, גם כן באמצעות כלי הקו המחולק (איור 4D,E). מקטעי IntL שאינם שלמים מסומנים על ידי רווחים בין תאים, מראה של עש, ושבירה או התקלפות של IntL מהרקמה.
      1. חשב את אחוז הגבול IntL השלם ב- (IntL שלם/סך IntL)*100. יש להשוות זאת לאותן בקרות נקודת זמן כדי לפצות על כל ארטיפקט חתך.
    9. מדדו את התאית של ה-IntL באמצעות תמונת המסכה של IntL. ראשית, המרה ל-8 ביט (Image → Type → 8 ביט). לאחר מכן סף (תמונה → סף) כדי למזער רעש ולמקסם את זיהוי התאים. בתפריט הסף, בטל את הבחירה ברקע כהה והשתמש במתג התחתון להתאמות.
      1. קבעו ידנית את הסף לכל תמונה, בסיוע היעלמות הרעש (למשל, ארטיפקט רקע) תוך שמירה על מספר הגופים הגרעיניים המקורי. השווה לעיתים קרובות בין התמונה המקורית כדי לשמור על נאמנות. כאשר הרעש מצטמצם (חיובי שגוי) אך אות ההמטוקסילין מוקסם (חיובי גרעיני אמיתי), מתאים לקבוע את הסף (איור משלים 2).
        הערה: הסף יהיה עקבי בסריקת שקופית אחת, אך ישתנה בין סריקות שקופיות וגם בין תמונות בודדות של 10x או 40x. זה גם ישתנה בין קבוצות H&E, שכן עומק הצבע כנראה לא יהיה עקבי. לכן, מאקרואים פשוטים אינם מתאימים אם קיימים הבדלים באחת מהקטגוריות הבאות בין התמונות: מטופל, אצווה של H&E, עובי חתך, תנאי תאורה (בהירות אור בחדר או מיקרוסקופ/טמפרטורת צבע), תוכנה לאיסוף התמונה, מיקרוסקופ המשמש ללכת התמונה, ושימוש באלגוריתמים לאיזון לבן או לאיזון צבעים. הרשימה הזו אינה ממצה. באמצעות מיקרוסקופ AmScope T390B-3M עם מצלמה ותוכנה תואמים, עם אור מיקרוסקופ מקסימלי בחדר חשוך, עם הגדרות איזון לבן אוטומטיות, 10 תמונות אקראיות של 40x הכוללות 3 מטופלים, הסף נע בין 96 ל-182, עם ממוצע של 137. טווח רחב זה משקף את ההבדלים בהיסטוגרמות הבסיסיות של 8 ביט, לא את חוסר העקביות של המשתמש. לכן, הבטחת נאמנות ויזואלית בין התמונה המקורית לתמונת הסף היא חיונית, ולא המספר המדויק של הסף. אוטומציה של תהליך זה אינה בתחום האחריות של מדען סטנדרטי ותדרוש תכנות של מומחה לניתוח תמונות.
    10. השתמש בניתוח חלקיקים (ניתוח → ניתוח חלקיקים) בגודל תא 8-150 מיקרון2 כדי לזהות ולספור גרעינים כתחליף למספר התא. בחר מסכות שכבת בהגדרות כדי להמחיש את התאים שזוהו, שוב בהשוואה לתמונה המקורית. מכיוון שה-IntL הוא בעיקר מבנה ליניארי ולא נפחי, יש לנרמל את אורך ה-100 מיקרון הזה (למשל, #cells/100 מיקרון). הממוצע היה כ-13.19 תאים (טווח 5.4-21.9, SD 3.9) ל-100 מיקרון ברקמה סינוביאלית שנאספה זה עתה.
      הערה: הטווח 8-150מיקרון 2 נקבע בהתבסס על קנה המידה Set והשוואה חזותית איטרטיבית של התמונה הספית לתמונה המקורית. הגבולות שנקבעים אמפירית דרך מאגר הנתונים תואמים להנחות צורה המבוססות על מקרופאגים בעלי קוטר תא שיכול לנוע בין כ-8 ל-20 מיקרון14,15. גדלים גדולים יותר לא נכללו, שכן לעיתים קרובות זה ייצג גרעינים בדידים מרובים בקרבה שנקראו כתא אחד.
      הערה: ייתכן שזרימות עבודה דומות יוקמו, לדוגמה, ב-QuPath.
    11. פתח את מסכת SubL ללא אריתרוציטים (איור 4G). בצע טרנספורמציה של 8 ביטים, סף וניתוח חלקיקים כפי שצוין בשלבים 3.3.9-10. מכיוון ש-SubL היא שכבה נפחית, נרמל את מספר התאים שנספר עד 100 מיקרומטר2 של שטח תת-L (למשל, מדידת אזורים לא מוסתרים) (איור 4H).
  4. לניתוח ציטומטריית זרימה של תאים נודדים בתחתית הבאר התחתונה, יש לצנטריפוגה בעוצמה של 300 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולשמור על כדור התא על קרח. צפו ~20,000 תאים חיים נודדים לכל ליבת ביופסיה של 3 מ"מ ב-24 שעות. שיטות ציטומטריית זרימה פורסמו בעבר8.
  5. ל-ELISA, מדיום צנטריפוגה במהירות מקסימלית (>5000 x גרם) למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לפנות תאים או שאריות תאים. אחסן בטמפרטורה הרצויה. שיטות ELISA פורסמו בעבר8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אופטימיזציה של תנאי תרבית חמצן

הפרפוזיה הפיזיולוגית ברקמה היא כ-6%-8% חמצן, בעוד שתנאי הדגירה הסטנדרטיים לתרבות תאים הם ברמות חמצן אטמוספיריות (~21%)16. בהשוואה, היפר-חמצון עשוי לשפר את היכולת של תרבית תאים או להיות רעיל17. ניצול נכון של JSAS חייב קביעה מוקדמת של חיוניות הרקמה הסינוביאלית; לכן, האפופטוזיס הוערך על ידי אימונוהיסטוכימיה או אימונופלואורסצנציה של קספאז-3 בימים 0, 1, 2, 3, 5 ו-7 בשלושה מצבי חמצן: פיזיולוגיה (5% O...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבודה זו הדגימה את יכולות JSAS, במיוחד תחזוקה של רקמת סינוביאלית חיה עם ארכיטקטורה סינוביאלית שלמה ומגיבה פונקציונלית. הייתה תמותה מינימלית של תאים עד 72 שעות תרבית ברוב תנאי הדגירה. כדי להעריך את השינויים המיקרוסקופיים במבנה הסינוביאלי, תוארה מערכת מדידה היסטולוגית ייחודית, שהכימית שינויים מבניים ב-IntL ובתת-L. שינויים כאלה מעידים על סינוביטיס חריפה או חריפה על סינוביטיס כרונית. כימות זה עשוי להיות מועיל במיוחד כאשר משולב עם ניתוחים תאיים ומכניים, שכן מערכות סיווג מסורתיות מסתמכות על חד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי עניינים.

תודות

פרוטוקול זה לא היה אפשרי ללא הנדיבות של המטופלים שתרמו את הרקמה שלהם, והמיומנות של עמיתינו לניתוחי אורתופדיה, שמוכנים לרכוש רקמה בבטחה למען העבודה. K.I.C. נתמכת על ידי NIAMS K08 AR084605, ו-C.P.P. נתמכת על ידי תוכנית פיתוח הקריירה לענייני ותיקים [IK2BX004532]. קבוצה זו מכירה בשימוש במתקן המחקר המרכזי למיקרוסקופיה של אוניברסיטת איווה, משאב מרכזי הנתמך על ידי סגן נשיא למחקר של אוניברסיטת איווה ומכללת קרבר לרפואה. נתוני ציטומטריית זרימה התקבלו במתקן Flow Cytometry, שהוא מתקן מחקר מרכזי של מכללת Carver לרפואה / מרכז הסרטן המקיף Holden באוניברסיטת איווה. המתקן ממומן באמצעות דמי משתמש ותמיכה כספית נדיבה של מכללת קרבר לרפואה, מרכז הסרטן המקיף הולדן ומרכז הרפואי של מנהל הוותיקים של איווה סיטי. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי: המרכז הלאומי למשאבי מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מס' 1 S10 OD034193-01; והמכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר P30CA086862.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (for sterilization)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 must be utilized in the late exponential phase for maximum pathogenicity
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 antibodyInvitrogen14-0688-821:1000
CO2 tank (standard conditions)N/A
Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
fetal bovine serumBiotechneS11150Heat inactivated Lot: F22100
forceps (non-toothed)N/A
hemostatN/A
Humidified cell incubator (standard conditions)N/A
Hypoxia incubatorN/A
hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)N/A
IL-4 antibodyThermofisherMA5-424701:100
iNOS antibodyThermofisherPA1-0361:100
Iris scissorsN/A
LipopolysaccharideSigma-AldrichL2630
low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)Life Technologies11885084
MMP9 antibodyThermofisherMA5-327051:1000
Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)Emrbient, IncMIC-101
Monocyte chemoattractant protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-acetyl cysteineSigma-AldrichA9165Must be made fresh for each experiment and buffered in equimolar sodium bicarbonate to a pH of 7-7.4
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 dilution
Oxygen tank with liter per minute flow regulatorN/A
PDPN antibodyInvitrogen14-9381-821:100
Propidium IodideThermofisherJ66764.MC
RNAscope multiplex fluorescent V2 assayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 dilution
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310,000X stock
TNF antibodyThermofisherPA5-198101:100
transwell inserts - 0.4 um sizeMillicellPICM01250
transwell inserts - 5 um sizeCorningCLS3421

מקורות

  1. Fallon, E. A., et al. Prevalence of diagnosed arthritis - United States, 2019-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 72 (41), 1101-1107 (2023).
  2. Allen, K. D., Thoma, L. M., Golightly, Y. M. Epidemiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cart. 30 (2), 184-195 (2022).
  3. Alivernini, S., Firestein, G. S., Mcinnes, I. B. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 55 (12), 2255-2270 (2022).
  4. Mathiessen, A., Conaghan, P. G. Synovitis in osteoarthritis: Current understanding with therapeutic implications. Arthritis Res Ther. 19 (1), 18(2017).
  5. Culemann, S., Grüneboom, A., Krönke, G. Origin and function of synovial macrophage subsets during inflammatory joint disease. Adv Immunol. 143, 75-98 (2019).
  6. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572 (7771), 670-675 (2019).
  7. Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nat Med. 26 (8), 1295-1306 (2020).
  8. Cyndari, K. I., Scorza, B. M., Zacharias, Z. R., Pessôa-Pereira, D., Strand, L. Resident synovial macrophages in synovial fluid: Implications for immunoregulation. Clin Immunol. 271, 110422(2024).
  9. Kooner, S. S., Clark, M. The effect of synovectomy in total knee arthroplasty for primary osteoarthritis: A meta-analysis. J Knee Surg. 30 (4), 289-296 (2017).
  10. Lipina, M., et al. Arthroscopic synovectomy of the knee joint for rheumatoid arthritis. Int Orthop. 43 (8), 1859-1863 (2019).
  11. Rosas, L., Mora, A. L., Rojas, M. Osu tristate sennet H&E staining of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections. protocols.io. , (2023).
  12. Biologicals, N. Immunofluorescent IHC staining of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue protocol. , https://www.novusbio.com/support-by-application/Fluorescent-IHC-Staining-of-FFPE-Tissue (2025).
  13. Rnascope multiplex fluorescent reagent kit v2 with sample preparation and pretreatment. , Advanced Cell Diagnostics Inc. https://acdbio.com/rnascope-multiplex-fluorescent-v2-assay (2022).
  14. Fakoya, A. O., Naeem, A., Pierre, L. Statpearls. 20235, Treasure Island (FL). Internet (2024).
  15. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. Am Rev Respir Dis. 126 (2), 332-337 (1982).
  16. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  17. Pilarek, M., Grabowska, I., Ciemerych, M. A., Dąbkowska, K., Szewczyk, K. W. Morphology and growth of mammalian cells in a liquid/liquid culture system supported with oxygenated perfluorodecalin. Biotechnol Lett. 35 (9), 1387-1394 (2013).
  18. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Curr Issues Mol Biol. 42, 473-518 (2021).
  19. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  20. Arvikar, S. L., Steere, A. C. Lyme arthritis. Infect Dis Clin North Am. 36 (3), 563-577 (2022).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , Advanced Cell Diagnostics Inc. Newark, CA. (2022).
  22. Feng, J., Wang, T., Zhang, S., Shi, W., Zhang, Y. An optimized SYBR Green i/pi assay for rapid viability assessment and antibiotic susceptibility testing for Borrelia burgdorferi. PLoS One. 9 (11), e111809(2014).
  23. De Buys, M., Moodley, K., Cakic, J. N., Pietrzak, J. R. T. Staphylococcus aureus colonization and periprosthetic joint infection in patients undergoing elective total joint arthroplasty: A narrative review. EFORT Open Rev. 8 (9), 680-689 (2023).
  24. Ross, J. J. Septic arthritis of native joints. Infect Dis Clin North Am. 31 (2), 203-218 (2017).
  25. Kwon, H. -K., Yu, K. E., Lee, F. Y. Construction and evaluation of a clinically relevant model of septic arthritis. Lab animal. 52, 11-26 (2022).
  26. Carrel, M., Perencevich, E. N., David, M. Z. USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus, United States, 2000-2013. Emerg Infect Dis. 21 (11), 1973-1980 (2015).
  27. Parlet, C. P., Brown, M. M., Horswill, A. R. Commensal staphylococci influence Staphylococcus aureus skin colonization and disease. Trends Microbiol. 27 (6), 497-507 (2019).
  28. Bünter, J. P., et al. Wild-type AGR-negative livestock-associated MRSA exhibits high adhesive capacity to human and porcine cells. Res Microbiol. 168 (2), 130-138 (2017).
  29. Patel, H., Rawat, S. A genetic regulatory see-saw of biofilm and virulence in MRSA pathogenesis. Front Microbiol. 14, 1204428(2023).
  30. Soong, G., et al. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus adaptation to human keratinocytes. mBio. 6 (2), e00289-e00315 (2015).
  31. Ni, F., Zhang, Y., Peng, X. Correlation between osteoarthritis and monocyte chemotactic protein-1 expression: A meta-analysis. J Orthop Res. 15, 516(2020).
  32. Tsai, P. H., Liou, L. B. Effective assessment of rheumatoid arthritis disease activity and outcomes using monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and disease activity score. Int J Mol Sci. 25 (21), 11374(2024).
  33. Boyce, B. F., Xing, L. Biology of rank, rankl, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther. 9 (Suppl 1), S1(2007).
  34. Asano, T., et al. Soluble RANKL is physiologically dispensable but accelerates tumour metastasis to bone. Nat Metab. 1 (9), 868-875 (2019).
  35. Kanzaki, H., et al. Soluble RANKL cleaved from activated lymphocytes by tnf-α-converting enzyme contributes to osteoclastogenesis in periodontitis. J Immunol. 197 (10), 3871-3883 (2016).
  36. Zahan, O. M., Serban, O., Gherman, C., Fodor, D. The evaluation of oxidative stress in osteoarthritis. Med Pharm Rep. 93 (1), 12-22 (2020).
  37. Ozcamdalli, M., et al. Comparison of intra-articular injection of hyaluronic acid and N-acetyl cysteine in the treatment of knee osteoarthritis: A pilot study. Cartilage. 8 (4), 384-390 (2017).
  38. Kim, H. R., Kim, K. W., Kim, B. M., Lee, K. A., Lee, S. H. N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL production in rheumatoid arthritis. Korean J Intern Med. 34 (1), 210-219 (2019).
  39. He, T., et al. Efficacy of n-acetylcysteine as an adjuvant therapy for rheumatoid arthritis: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Br J Hosp Med (Lond). 85 (11), 1-16 (2024).
  40. Tsikas, D., Mikuteit, M. N-acetyl-l-cysteine in human rheumatoid arthritis and its effects on nitric oxide (NO) and malondialdehyde (mda): Analytical and clinical considerations. Amino Acids. 54 (9), 1251-1260 (2022).
  41. Yeh, Y. T., Liang, C. C., Chang, C. L., Hsu, C. Y., Li, P. C. Increased risk of knee osteoarthritis in patients using oral N-acetylcysteine: A nationwide cohort study. BMC Musculoskelet Disord. 21 (1), 531(2020).
  42. Kaneko, Y., et al. Oral administration of N-acetyl cysteine prevents osteoarthritis development and progression in a rat model. Sci Rep. 9, 18741(2019).
  43. Coleman, M. C., et al. Sci Transl Med. 10 (427), eaan5372(2018).
  44. Drehmer, D., et al. Nitric oxide favours tumour-promoting inflammation through mitochondria-dependent and -independent actions on macrophages. Redox Biol. 54, 102350(2022).
  45. Fang, F. C., Vázquez-Torres, A. Reactive nitrogen species in host-bacterial interactions. Curr Opin Immunol. 60, 96-102 (2019).
  46. Winyard, P. G., et al. Measurement and meaning of markers of reactive species of oxygen, nitrogen and sulfur in healthy human subjects and patients with inflammatory joint disease. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1226-1232 (2011).
  47. Xue, M., et al. Endogenous MMP-9 and not MMP-2 promotes rheumatoid synovial fibroblast survival, inflammation and cartilage degradation. Rheumatology (Oxford). 53 (12), 2270-2279 (2014).
  48. Piacenza, L., Zeida, A., Trujillo, M., Radi, R. The superoxide radical switch in the biology of nitric oxide and peroxynitrite. Physiol Rev. 102 (4), 1881-1906 (2022).
  49. Dikalov, S. I., Mayorov, V. I., Panov, A. V. Physiological levels of nitric oxide diminish mitochondrial superoxide. Potential role of mitochondrial dinitrosyl iron complexes and nitrosothiols. Front Physiol. 8, 907(2017).
  50. Krenn, V., et al. Grading of chronic synovitis: A histopathological grading system for molecular and diagnostic pathology. Pathol Res Pract. 198 (5), 317-325 (2002).
  51. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Vet Pathol. 52 (5), 819-826 (2015).
  52. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).
  53. Felson, D. T., et al. Essential fatty acids and osteoarthritis. Arthritis Care Res (Hoboken). 76 (6), 796-801 (2024).
  54. Jarraya, M., et al. Prevalence of intra-articular mineralization on knee computed tomography: The multicenter osteoarthritis study. Osteoarthritis Cartilage. 31 (8), 1111-1120 (2023).
  55. Rai, M. F., Cai, L., Zhang, Q., Townsend, R. R., Brophy, R. H. Synovial fluid proteomics from serial aspirations of ACL-injured knees identifies candidate biomarkers. Am J Sports Med. 51 (7), 1733-1742 (2023).
  56. Rivellese, F., et al. Rituximab versus tocilizumab in rheumatoid arthritis: Synovial biopsy-based biomarker analysis of the phase 4 R4RA randomized trial. Nat Med. 28 (6), 1256-1268 (2022).
  57. Paggi, C. A., Teixeira, L. M., Le Gac, S., Karperien, M. Joint-on-chip platforms: Entering a new era of in vitro models for arthritis. Nat Rev Rheumatol. 18 (4), 217-231 (2022).
  58. Li, Z. A., et al. Synovial joint-on-a-chip for modeling arthritis: Progress, pitfalls, and potential. Trends Biotechnol. 41 (4), 511-527 (2023).
  59. Thompson, C. L., et al. Human vascularised synovium-on-a-chip: A mechanically stimulated, microfluidic model to investigate synovial inflammation and monocyte recruitment. Biomed Mater. 18 (6), acf976(2023).
  60. Thangadurai, M., Sethuraman, S., Subramanian, A. A 2d inflammatory co-culture model for investigating synovial fibroblast and macrophage interactions in rheumatoid arthritis. Sci Rep. 15 (1), 30105(2025).
  61. Rosso, F., Rossi, R., Cottino, U., Bonasia, D. E. Tibial tubercle osteotomy for patellofemoral malalignment and chondral disease provided good outcomes: A systematic review. J ISAKOS. 7 (2), 78-86 (2022).
  62. Kleuskens, M. W. A., Van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Orthop Res. 39 (4), 871-879 (2021).
  63. Schwab, A., et al. Ex vivo culture platform for assessment of cartilage repair treatment strategies. ALTEX. 34 (2), 267-277 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ELISA

מאמרים קשורים