הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

ון יאנג דינג צ'ואן טאנג מפחית את עיצוב דרכי הנשימה האסטמטיים על ידי עיכוב הפעלת פיברובלסטים מונעים על ידי M2 על ידי מקרופאגים

195 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69737

⸱

24 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 2Department of Respiratory, The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 3Department of Clinical Pharmacy, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 4Department of Central Laboratory, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 5Department of Stomatology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 6Department of Magnetic Resonance, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר מחקר על ויסות פיברוזיס פיברובלסטים ריאתיים על ידי ווניונג דינגצ'ואן דקוקשן באמצעות עיכוב קיטוב מקרופאג' M2.

תקציר

לחקור את השפעות וון יאנג דינג צ'ואן טאנג (WYDCT) על תפקוד הפיברובלסטים, שינוי דרכי הנשימה באסתמה, והמנגנון הבסיסי. IL-4 שימש לגרימת קיטוב M2 של מקרופאגים RAW264.7, והמקרופאגים המקוטבים טופלו לאחר מכן ב-WYDCT כדי לבדוק את השפעתו על פיברובלסטים בריאותיים בעכברים. תאי RAW264.7 מקוטבים נחשפו לטיפולים שונים ואז תורכלו יחד עם פיברובלסטים. רמות הסמנים של M1 ו-M2, מורפולוגיית התאים וריכוז IL-6 הוערכו. רמת חלבון STAT3 נותחה. חיוניות, התפשטות, יצירת מושבה, ביטוי PCNA והביטוי של פיברונקטין, COL1A1 ו-α-SMA נותחו באמצעות בדיקות שונות, כולל בדיקות PCR בזמן אמת, Western blot, CCK-8, Edu, אימונופלואורסצנציה ובדיקות היווצרות מושבה. WYDCT הפך את השינויים המורפולוגיים שנגרמו על ידי IL-4 בתאי RAW264.7, הפחית את רמות הסמנים M2 (Arg-1, CD206) ו-IL-6, והפחית את ביטוי STAT3 בתאי RAW264.7, בעוד שתוסף IL-6 שיחזר את השפעת WYDCT על סמני M2. יתרה מזאת, WYDCT עיכב את החיוניות והתרבות של הפיברובלסטים, הפחית את ביטוי ה-PCNA, והפחית את סמני הפיברוזיס (פיברונקטין, COL1A1, α-SMA), מה שמרמז ש-WYDCT מעכב את החיוניות, ההתרבות והפיברוזיס של פיברובלסטים בריאותיים על ידי דיכוי קיטוב מקרופאגים M2, שבו מסלול האיתות IL-6/STAT3 עשוי למלא תפקיד מרכזי.

מבוא

אסתמה, הידועה גם כאסטמה ברונכיאלית, היא מצב דלקתי מתמשך במעברי הנשימה1. לעיתים קרובות קשור לחשיפה לאלרגן, טמפרטורות קרות וגירויים פיזיים וכימיים, מצב זה מאופיין בחדירת תאים דלקתיים, היצרות הפיכה של דרכי הנשימה, הפרשת ריר ועיווץ סימפונות2. נכון להיום, יש לפחות 300 מיליון חולי אסתמה ברחבי העולם, והשכיחות עולה משנהלשנה שלישית. בשנת 2015, 400,000 אנשים מתו מאסתמה, מה שהופך את הבעיה לבריאות עולמית חמורה 4.5. גם סין מתמודדת עם אותה בעיה, כאשר מחקרים מראים שיעור שכיחות אסתמה של 4.2%, המהווים כ-45.7 מיליון מטופלים בוגרים, עם שיעורי ביקורת נמוכים יותר בהשוואה למדינות מפותחות 6.7. רווחתם של הנפגעים ממחלה זו נפגעת מאוד, מה שמוביל לעומס כלכלי משמעותי על המשפחות.

שיקום דרכי הנשימה נחשב לגורם קריטי בטיפול באסתמה שקשהלשלוט בו. לכן, הטיפול באסתמה כרונית ומתמשכת הופך לנקודה מרכזית. הפרקטיקה הקלינית כוללת לעיתים קרובות שימוש בסטרואידים בשאיפה בשילוב עם מרחילי סימפון, שיכולים להקל ביעילות על התסמיניםאצל מטופלים. עם זאת, לטיפולים אלו יש תופעות לוואי מסוימות ועלולים להיות פחות יעילים בשיפור התסמינים אצל חלק מהמטופלים. בנוסף, אסתמה נוטה להיחזור לאחר הפסקת התרופות. מחקרים הראו שהפעלת פיברובלסטים בריאותיים קשורה לשיפוץ דרכי הנשימה במהלך התקדמות אסתמה10. עם ההפעלה, פיברובלסטים בריאותיים עוברים טרנספורמציה פנוטיפית ומפרישים חלבונים מרכזיים להנעת הצטברות מטריצה חוץ-תאית (ECM) – התכונה הפתולוגית המרכזית של עיצוב דרכי הנשימה. בפרט, פיברונקטין משמש כבסיס מוקדם להרכבת ECM, ומקדם גיוס והיצמדות של רכיבים אחרים במטריצה; COL1A1 (שרשרת קולגן α1 מסוג I) הוא החלבון המבני העיקרי של ECM, והצטברות המופרזת שלו גורמת לעיבוי וקשיחות דופן דרכי הנשימה; α-SMA (α-אקטין שריר חלק) מסמן את הטרנספורמציה של פיברובלסטים למיופיברובלסטים בעלי יכולות כיווץ והפרשה חזקות, מה שמאיץ עוד יותר את הצטברות ECM ופיברוזיס דרכי הנשימה.

IL-6 הוא גורם האיתות הציטופלזמי החשוב ביותר להפעלת מסלול STAT311. IL-6 מוגברת מפעילה את מסלול STAT3. ברקמת ריאה של עכבר אסתמטי, ביטוי STAT3 ו-mRNA ומזרחן משתפרים משמעותית. מסלול האיתות IL-6/STAT3 הוא אחד היעדים לטיפול באסטמה. מחקרים אישרו כי הפעלת מסלול האיתות IL-6/STAT3 קשורה לדלקת דרכי הנשימה באסתמה, ועיכוב מסלול זה יכול להפחית את דלקת דרכי הנשימה12,13. IL-6/STAT3 קשור גם לקיטוב M2 של מקרופאגים. מחקרים זרים הראו כי ביטוי IL-6 מפחית משמעותית את הפעלת STAT3 במורד הזרם, מה שמתאם עם ירידה במספר פני הגידול, ירידה בהתרבות וירידה במספרי מקרופאגים M2 בכבד14.

תאי חיסון הידועים כמאקרופאגים יכולים להיות מסווגים לפנוטיפים מובחנים, כלומר הפעלה קלאסית (M1) והפעלה חלופית (M2), שכל אחד מהם ממלא תפקידים ייחודיים15. מקרופאגי M1 יכולים לגרום לתגובות דלקתיות ונזק לרקמות, בעוד שמקרופאגים M2 מקדמים התרבות תאים ומאפשרים ריפוי פצעים ותיקון רקמות. מחקרים הראו כי שינוי דרכי הנשימה באסתמה קשור למקרופאגים M216. ניסויים במבחנה הראו כי השראת קיטוב M2 של מקרופאגים עם IL-4 משפרת משמעותית את יכולת השתרבות של תאים חיוביים ל-α-SMA17. עיכוב קיטוב מקרופאג M2 הוא גישה יעילה לטיפול בעיצוב מחדש דרכי הנשימה באסתמה.

אסתמה משתייכת לקטגוריית "שיאו בינג" ברפואה הסינית המסורתית. הגורמים הפתולוגיים של שיאו בינג כוללים בעיקר ליחה. ייצור הליחה נובע מחוסר איזון בין יין ויאנג באיברים הפנימיים, בשילוב עם גורמים חיצוניים כמו פתוגנים חיצוניים, תזונה ומצבים לאחר מחלה, המשפיעים על תנועת נוזלי הגוף, מה שמוביל לקיפאון והצטברות. עם המשך חקירה של מנגנוני הרפואה הסינית המסורתית בטיפול באסטמה, יותר ויותר מחקרים הראו כי לרפואה הסינית המסורתית יש השפעות משמעותיות בהקלה על דלקת דרכי הנשימה, הפחתת הפרשת ריר מופרזת ועיכוב שיקום דרכי הנשימה18,19. בשיאו בינג, הריאה מושפעת בעיקר, ואחריה הטחול והכליות. מטופלים עם שיאו בינג סובלים מחוסר בצ'י ריאות והגנה חלשה מפני פתוגנים חיצוניים, מה שמוביל לאובדן הפצת צ'י ריאה ולפציעה ממושכת וחוזרת ביאנג צ'י, מה שמוביל למחסור ביאנג ריאות. חוסר ביאנג גורם לזרימת נוזלי גוף לא תקינה, אשר מתעבים לליחה. בהתקפים ממושכים, ליחה קרה משפיעה על היאנג של הטחול והכליות, מה שמוביל לדפוס של חוסר ריאות-טחול-כליות יאנג, חוסר איזון בין יין ליאנג, דומיננטיות מופרזת או חוסר בחוסן הגוף, וזרימת נוזלי גוף לא תקינה. הריאה אינה יכולה לפזר נוזלים, הטחול אינו יכול להפוך מים ומהות, והכליות אינן יכולות לאדות ולהפוך נוזלים, מה שמוביל לעיבוי הליחה ולהיווצרות סטזיס, המתבטאת באסתמה. לכן, חוסר ביאנג הוא הגורם המרכזי לשיאו בינג, והסטאזיס של הליחה הוא תכונתו. ון יאנג דינג צ'ואן טאנג מורכב מ-12 עשבי מרפא סיניים, כולל אפימדיום (15 גרם), אפדרה (מעובדת) (10 גרם), ג'ינסנג (15 גרם), אסטרגלוס (15 גרם), גינקו בילובה (15 גרם), פלוס פארפארה (15 גרם), גרעין משמש מר (15 גרם), פינליה טרנטה (מעובדת) (10 גרם), שיסנדרה כיננסיס (10 גרם), תולעת אדמה (10 גרם), פרסיקה (10 גרם) וליקריץ (מעובד) (10 גרם). נוסחה צמחית זו נגזרת מהנוסחה המותאמת של דינג צ'ואן טאנג בספר "ה שנג ג'ונג מיאו פאנג" ויש לה השפעות של חימום היאנג, חיזוק הצ'י, פתרון הליחה, קידום זרימת הדם והקלה על שיעול ואסתמה. היעילות הקלינית של טיפול זה הוכחה, מה שהוביל לחקירות ניסיוניות עכשויות בנוגע למנגנון שלו לטיפול בשיפוץ דרכי הנשימה באסתמה.

בהשוואה לטיפולים פרמקולוגיים עכשוויים לאסתמה, כגון קורטיקוסטרואידים בשאיפה, אגוניסטים β2, ותרופות ביולוגיות מונוקלונליות מבוססות נוגדנים המיועדות ל-IgE או IL-5, Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) מציע אסטרטגיה טיפולית מרובת מטרות ובטוחה יותר. קורטיקוסטרואידים קונבנציונליים מקלים ביעילות על דלקת דרכי הנשימה, אך לעיתים קרובות קשורים לתופעות לוואי כמו דיכוי חיסוני, חוסר איזון הורמונלי והישנות לאחר הגמילה. סוכנים ביולוגיים, אף שהם ספציפיים יותר, יקרים ומוגבלים לפנוטיפים מסוימים של אסתמה. לעומת זאת, WYDCT, שמקורו בתיאוריה המסורתית של הרפואה הסינית של "חימום יאנג ופתרון ליחה", מפעיל השפעות מקיפות על ויסות איזון מערכת החיסונים, הפחתת דלקת בדרכי הנשימה ודיכוי שינוי דרכי הנשימה, כפי שהודגם במחקרים קלינייםוניסויים 20. ההרכב הרב-רכיבי שלו עשוי לווסת בו-זמנית קיטוב מקרופאג'ים, הפעלת פיברובלסטים ושחרור ציטוקינים, ולספק שיפור רחב יותר ופוטנציאלית בר-קיימא יותר בפתולוגיה של אסתמה.

במחקר זה, תמצית המים של Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) הוכנה מ-12 עשבים ביחס מסורתי קבוע, מרוכזת לתמיסת מלאי סופית של 1 גרם למ"ל (שווה ערך תרופתי גולמי), וסוננה לשימוש בתרבות תאים. התמצית יושמה בריכוזים של 50, 100 ו-200 מיקרוגרם/מ"ל, שנבחרו בהתבסס על בדיקות קיום ראשוניות של התאים כדי להבטיח אי-סיטוטוקסיות תוך שמירה על פעילות פרמקולוגית. מודל ה-in vitro כלל קיטוב M2 מושרה IL-4 של מקרופאגים RAW264.7 ותרבות משותפת עם פיברובלסטים בריאותיים בעכברים (תאי L929), מה שאפשר לנו להעריך השפעות פאראקריניות של מקרופאגים על הפעלת הפיברובלסטים ותגובות הקשורות לפיברוזיס. פרטים אלו מספקים מסגרת ניתנת לשחזור למחקרים עתידיים החוקרים את מאפייני המינון-תגובה והמסלולים המכניסטיים של WYDCT בשיפוץ דרכי הנשימה.

בהתבסס על הממצאים לעיל, אנו משערים כי ון יאנג דינג צ'ואן טאנג מפעיל את אפקטיו נגד שינוי דרכי הנשימה באסתמה על ידי עיכוב קיטוב M2 של מקרופאגים ודיכוי הפעלת הפיברובלסטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם להנחיות בינלאומיות, לאומיות ומוסדיות לטיפול הומני בבעלי חיים ובהתאם לחקיקה הרלוונטית. באופן ספציפי, כל ההליכים הכוללים עכברים אושרו על ידי ועדת הטיפול האתי בבעלי חיים של בית החולים השלישי המסונפ של מכללת הרפואה צ'יקיהאר (AECC-2022-009). העכברים הוחזקו בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם גישה למזון ומים לפי החופשיות, ונעשו כל המאמצים למזער סבל. נקודות קצה הומניות נקבעו ונודחו לאורך כל המחקר.

1. הכנת תמצית WYDCT

12 עשבי התיבול של ון יאנג דינג צ'ואן טאנג נשקלו לפי היחס המסורתי: אפימדיום (15 גרם), אפדרה מעובדת (10 גרם), ג'ינסנג (15 גרם), אסטרגלוס (15 גרם), גינקו בילובה (15 גרם), פלוס פארפארה (15 גרם), גרעין משמש מר (15 גרם), פינליה טרנטה מעובדת (10 גרם), שיסנדרה כיננסיס (10 גרם), תולעת אדמה (10 גרם), פרסיקה (10 גרם), וליקריץ מעובד (10 גרם).

הוספו פי עשרה מכמות המים המזוקקים, והתערובת הובשלה במשך 30 דקות. החילוץ חזר פעמיים, והסינון שולבו. התמצית המשולבת רוכזה בלחץ מופחת לריכוז שקולה גס של 1 גרם למ"ל. התמצית סיננה דרך ממברנה של 0.22 מיקרון, נלקחה ואוחסנה בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס. ריכוזי עבודה (50, 100 ו-200 מיקרוגרם/מ"ל) הוכנו על ידי דילול מיד לפני השימוש.

2. תרבית תאים וקיטוב M2

תאי RAW264.7 (ATCC, ארה"ב) הופשרו וזרעו בצפיפות של 1 × 10⁶ תאים לכל צלחת 10 ס"מ ב-10 מ"ל DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. התאים דגרו בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה שהכילה 5% CO₂ במשך 24 שעות עד שהושגה 80%-90% מפגש משותף.

מדיום התרבית הוחלף לאחר מכן ב-DMEM טרי המכיל 20 ng/mL IL-4, והתאים הועברו ל-24 שעות נוספות כדי לגרום לקיטוב M2. לאחר הדגירה, התאים נשטפו פעמיים עם PBS וטופלו בתמצית WYDCT (תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל מדוללת לריכוזים הסופיים המוצגים) למשך 24 שעות. בניסויים בתוספי IL-6, נוספו 50 ng/mL IL-6 במהלך טיפול WYDCT.

תאים שטופלו ב-0.1% DMSO שימשו כבקרה שלילית. המורפולוגיה התאית נבדקה תחת מיקרוסקופ הפוך, ונלקחו תמונות מייצגות.

3. בידוד ותרבות של פיברובלסטים בריאותיים בעכבר

עכברים הושמתו בהתאם לפרוטוקולים אתיים מאושרים. אונות הריאות נאספו והונחו בתמיסת מלח מאוזנת קרה של הנקס. כלי דם נראים ורקמת חיבור הוסרו, ורקמת הריאה נחתכה לחתיכות קטנות (~1 מ"מ 3).

שברי הרקמה עוכלו ב-0.25% טריפסין למשך 40 דקות בטמפרטורה של 37°C עם ערבוב עדין, ולאחר מכן עיכול נוסף ב-0.25% טריפסין למשך 30 דקות. תליית התא צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות, הסופרנטנט הושלך, והכדור הושעה מחדש ב-DMEM עם 10% סרום בקר עוברי.

המתלה דוגר למשך 100 דקות כדי לאפשר לפיברובלסטים להידבק, ולאחר מכן התאים צונטריפוגה שוב ב-300 × גרם למשך 5 דקות לשיפור הטיהור. פיברובלסטים מטוהרים הוזרעו לפלטות תרבית מתאימות ודגרו בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂ עד שהושגה כ-80% מפגש המים.

4. קו-תרבות של פיברובלסטים עם מדיום מותאם

הסופרנטנט נאסף מתאי RAW264.7 מטופלים וצנטריפוגה ב-3000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מדיום תרבית הפיברובלסטים הוחלף במדיום שנאסף על ידי מקרופאגים. הפיברובלסטים דוגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂ לפני בדיקות פונקציונליות. לאחר הדגירה, פיברובלסטים נקטפו לצורך חילוץ RNA וחלבון לצורך ניתוחי qRT-PCR ו-Western Blot לאחר מכן.

5. כדאיות תאים (בדיקת CCK-8)

פיברובלסטים נזרעו בצפיפות של 5 × 10³ תאים לבאר בלוחות של 96 בארות המכילות 100 מיקרו-ליטר של מדיום תרבית. התאים עברו את הטיפולים המומלצים במשך 24 שעות. לאחר מכן, נוספו 10 מיקרוליטר של תגובת CCK-8 לכל באר, והלוחות דוגרו למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הצפיפות האופטית (OD) נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. חיוניות התאים חושבה כ-(OD_treated / OD_control) × 100%. כל הניסויים בוצעו עם שלושה שכפולים ביולוגיים.

6. מבחן היווצרות מושבות

התאים זרעו בצפיפות של 1 × 10³ תאים לבאר בלוחות של 6 בארות, עם שלושה בארות שכפול בכל מצב. הלוחות דגרו במשך 10-14 ימים עד שנוצרו מושבות נראות לעין. המושבות צובקו ב-0.1% קריסטל סגול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצביעה, המושבות נשטפו וצולמו. הצבע הקשור הומס ב-30% חומצה אצטית למשך 15 דקות, והצפיפות האופטית נמדדה ב-590 ננומטר. בוצעו שלושה ניסויים עצמאיים.

7. מבחן הפצת EdU

התאים טופלו כפי שנדרש במשך 24 שעות. לאחר מכן נוספו 100 מיקרוליטר של 50 מיקרומולר EdU לכל באר, והתאים דוגרו למשך 2 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. התאים הוקבעו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות והוקפאו ב-2 מ"ג/מ"ל גליצין למשך 5 דקות. התאים עברו חדירות עם 0.5% Triton X-100 ב-PBS, נשטפו ודגרו בתמיסת צביעת אפולו למשך 30 דקות. הגרעינים צובקו ב-Hoechst 33342 (1×) למשך 30 דקות. תאים חיוביים ל-EdU נצפו וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. ELISA עבור IL-6

הסופרנטנט של תא RAW264.7 עבר צנטריפוגה ב-3000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. רמות IL-6 נמדדו באמצעות ערכת Beyotime ELISA לפי הוראות היצרן. הספיגה נמדדה באמצעות קורא מיקרופלט, וריכוזי IL-6 חושבו על בסיס עקומה סטנדרטית.

9. אימונופלואורסצנציה

הפיברובלסטים היו מקובעים באצטון מקורר מראש למשך 10 דקות ונשטפו שלוש פעמים עם PBS. התאים היו חדירים עם 0.1% Triton X-100 למשך 10 דקות וחסמו עם 1% BSA ב-PBS למשך 30 דקות. התאים נדגרו עם נוגדן ראשוני נגד PCNA (1:100) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBS, התאים נדגרו בנוגדן משני מצומד FITC (1:200) למשך שעה בטמפרטורת החדר. הגרעינים צובעו נגד ב-DAPI, נשטפו וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

10. qRT-PCR

סך ה-RNA הופק באמצעות תגובת טריזול (ביוטיים, סין) בהתאם לפרוטוקול היצרן. שעתוק הפוך בוצע באמצעות ערכת סינתזת cDNA באמצעות 2 מיקרוגרם RNA ופריימרים אקראיים. תגובות PCR הוכנו בנפח של 20 מיקרוליטר שכלל 10 מיקרוליטר SYBR Green Master Mix, 0.5 מיקרוליטר מכל פריימר ספציפי לגן (ריכוז סופי 0.5 מיקרומון), ו-1 מיקרוליטר של תבנית cDNA. הפריימרים ששימשו כללו CD16, iNOS, Arg-1, CD206, פיברונקטין, COL1A1, α-SMA ו-GAPDH (רצפים מסופקים).

תנאי המחזור התרמי כללו דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. ניתוח עקומת ההתכה בוצע מ-60°C עד 95°C במרווחים של 0.5°C כדי לאמת את הספציפיות של ההגברה.

ניתוח נתונים: הביטוי היחסי חושב בשיטת 2^−ΔΔCT ונרמל ל-GAPDH. הפריימרים היו כדלקמן: CD16 (עכבר): 5′- AGGAGCTGAGGAGGAGGAGG-3′ ו-5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGGC-3′, iNOS (עכבר): 5′-TGCTCCCCAGGAGATGTGTGT-3′ ו-5′-TGGTCTGGTGTACGG-3′, Arg-1 (עכבר): 5′- GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3′ ו-5′- GGTGGCTGCTGCTGTGTC-3′ ��, CD206 (עכבר): 5′- GGCTTCTGAGCTGGGTGA-3′ ו-5′- CTGGGCTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTGTTGT-3′, פיברונקטין (עכבר): 5'-CGTGGTGAGTGTGTCTGCTGC-3' ו-5'-GAGGTCACAGTGTCTTGCTGCT-3', COL1A1 (עכבר): 5'-CCCTGGACCTGGTTCTCT-3' ו-5'-GCGGGTCACCTTCTCTCTCTC-3', α-SMA (עכבר): 5'-CTGGAACAGCACACAGCTTC-3' ו-5'-GGGACATAGCACACTTCTC-3', GAPDH (עכבר): 5′- TGTGTCCGTCGTGTGTGTGATCTGA -3′ ו-5′- CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3′.

11. כתם מערבי

תאים עברו פירוק באמצעות בופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז. ריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת BCA. עבור SDS-PAGE, 60 מיקרוגרם חלבון הועמסו לכל נתיב של ג'ל פוליאקרילאמיד 10% והופרדו ב-120 וולט למשך 1.5-2 שעות. החלבונים הועברו לממברנת PVDF באמצעות שיטת העברה רטובה ב-100 וולט למשך שעה. לאחר חסימה עם 5% חלב דל שומן ב-TBS-T למשך שעה בטמפרטורת החדר, הממברנה דוגרה בנוגדנים ראשוניים (דילול של 1:1000) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C. לאחר שטיפות עם TBS-T, הממברנה נדגרה בנוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (דילול 1:5000) למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפות נוספות, זוהו רצועות חלבון באמצעות מגיב כימילומינסנציה ECL והודגמו באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנציה. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ, ורמות החלבון נורמל ל-GAPDH כבקרה פנימית.

12. ניתוח סטטיסטי

הנתונים נותחו באמצעות SPSS 17.0. משתנים רציפים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן t לא מזווג, בעוד שהשוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של LSD. ערך p קטן מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השפעות WYDCT על קיטוב תאי RAW264.7 M2 של מקרופאגים

צפינו במורפולוגיה של תאי RAW264.7 באמצעות מיקרוסקופ אור. כפי שמוצג באיור 1A, גירוי IL-4 גרם לתאים להתארך, מה שגרם לצורה מוארכת יותר, דמוית ציר בהשוואה לתאים שלא טופלו. בנוסף, התאים המונעים על ידי IL-4 הראו גרנולריות ציטופלזמית מוגברת והפגינו היצמדות מוגברת למצע התרבית. שינויים מורפולוגיים אלו הצביעו על כך שלגירוי IL-4 יש השפעה משמעותית על המבנה התא והפנוטיפ של תאי RAW264.7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מטרת המחקר הייתה לבחון את השפעת WYDCT על פעילות הפיברובלסטים ועל עיצוב דרכי הנשימה באסטמה, וכן את המנגנונים הבסיסיים. הממצאים הנוכחיים מראים כי WYDCT יכול לעכב קיטוב M2 של מקרופאגים RAW264.7, מה שמשפיע בהמשך על החיוניות, ההתרבות והפיברוזיס של פיברובלסטים בריאותיים בעכברים. יתרה מזאת, מסלול האיתות IL-6/STAT3 שיחק תפקיד מרכזי בתיווך השפעות אלו.

קיטוב המאקרופאגים הוא תהליך קריטי בפתוגנזה של אסתמה ופיברוזיס21. מקרופאגים M2, המאופיינים ברמת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

אנו מודים מעומק הלב לכל השותפים שתרמו לפרויקט המחקר הזה. עבודה זו נתמכה על ידי הוצאות המחקר המדעי הבסיסי של האוניברסיטה במחוז היילונגג'יאנג בשנת 2022 (מס' 2022-KYYWF-0827), על כך אנו מודים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגיב היברידיזציה של אפולו 643גואנגג'ואו ריבוביו בע"מC10371-2
ארגינאז-1 (E4U1I) עכבר mAb טכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.43933T
ערכת קביעת ריכוז חלבון BCABeyotime Biotechnology Co., Ltd.P0012
BeyoBlot עכבר אנטי-ארנב מקורית (H+L) עם עכבר מצומד ב-HRP (H+L)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.A0210
חממת פחמן דו-חמצניחברת ציוד מדעי של שנחאי לישן בע"מ.HF240
CD206/MRC1 (E6T5J) XP® ארנב mAbטכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.24595T
ערכת ספירת תאים-8Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0037
COL1A1 (E8F4L) XP Rabbit mAb טכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.72026T
דימתיל סולפוקסידBeyotime Biotechnology Co., Ltd.ST038-100ml
DMEM בינוני עם סוכר גבוהחברת גרנד איילנד ביולוגית11965092
EDUBeyotime Biotechnology Co., Ltd.ST067-250mg
FcΓ RIII/CD16 (F6K6G) mAb Rabbit טכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.71345T
סרום עגל עובריחברת גרנד איילנד ביולוגיתA5256701
נוגדן פיברונקטין/FN1Cell Signaling Technology, Inc63779S
FITC-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.A0568
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטייארוי ביוטכנולוגיה בע"מ.MA-6000
תמיסת צביעת תאים חיים Hoechst 33342 (100X)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C1029
iNOS (E1W4J) ארנב mAbטכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.70706SF
מיקרוסקופ הפוךגואנגג'ואו מינגמיי אופטואלקטרוניקס טכנולוגיה בע"מMI52-N
LRRK2 T1348N mut RAW 264.7ATCCSC-6005
בופר חדירת mmunostaining (עם Triton X-100)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P0096-100ml
ערכת ELISA Mouse IL-6Beyotime Biotechnology Co., Ltd.PI326
תאי פיברובלסטים בריאות עכברWuhan Procell Life Technology Co., Ltd.CP-M006
עכבר mAb של PCNA (PC10)טכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.2586T
פניצילין-סטרפטומיציןחברת גרנד איילנד ביולוגית15140148
עכבר רקומביננטי IL-4Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P5916-5μ g
מורין רקומביננטי IL-6Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P5925-10μ g
מכשיר תווית אנזימי רדורייטו לייף סיינסRT-6100
Stat3 (124H6) mAb טכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.9139T
ספסל סופר-קליןג'ינאן ביובייס ביוטכנולוגיה בע"מ.BBS-SDC
SynGAP-α 2 (E4Y6I) מחקר ארנב טכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.56927T
Thermo Fisher Scientific RIPA Lysis and Extraction Bufferתרמופישר89901
טריזול (תגובת חילוץ RNA כוללת)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.R0016
β-נוגדן אקטיןטכנולוגיית איתות סלולרי, בע"מ.4967S

מקורות

  1. Chetta, A., Calzetta, L. Bronchial asthma: An update. Minerva Med. 113 (1), 1-3 (2022).
  2. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: The ins and outs. Annu Rev Immunol. 26, 205-232 (2008).
  3. Ding, S., Zhong, C. Exercise and asthma. Adv Exp Med Biol. 1228, 369-380 (2020).
  4. Bateman, E. D., et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 31 (1), 143-178 (2008).
  5. GBD Risk Factor Collaborators. Global, regional, and national comparative risk assessment of 84 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1345-1422 (2017).
  6. Huang, K., et al. risk factors, and management of asthma in China: A national cross-sectional study. Lancet. 394 (10196), 407-418 (2019).
  7. Bousquet, J., et al. Next-generation Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA) guidelines for allergic rhinitis based on Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation (GRADE) and real-world evidence. J Allergy Clin Immunol. 145 (1), 70-80.e3 (2020).
  8. Varricchi, G., et al. Biologics and airway remodeling in severe asthma. Allergy. 77 (12), 3538-3552 (2022).
  9. Cardet, J. C., Papi, A., Reddel, H. K. 34;As-needed" inhaled corticosteroids for patients with asthma. J Allergy Clin Immunol Pract. 11 (3), 726-734 (2023).
  10. Zhou, Z., et al. TGF-β1 promotes SCD1 expression via the PI3K-Akt-mTOR-SREBP1 signaling pathway in lung fibroblasts. Respir Res. 24 (1), 8(2023).
  11. Sun, J. Y., et al. An IL-6/STAT3/MR/FGF21 axis mediates heart-liver cross-talk after myocardial infarction. Sci Adv. 9 (14), eade4110(2023).
  12. Francisco, D., et al. Surfactant protein-A protects against IL-13-induced inflammation in asthma. J Immunol. 204 (10), 2829-2839 (2020).
  13. Xue, Y., et al. STAT3 and IL-6 contribute to corticosteroid resistance in an OVA and ozone-induced asthma model with neutrophil infiltration. Front Mol Biosci. 8, 717962(2021).
  14. Zhao, J., et al. PRMT1-dependent macrophage IL-6 production is required for alcohol-induced HCC progression. Gene Expr. 19 (2), 137-150 (2019).
  15. Landis, R. C., Quimby, K. R., Greenidge, A. R. M1/M2 macrophages in diabetic nephropathy: Nrf2/HO-1 as therapeutic targets. Curr Pharm Des. 24 (20), 2241-2249 (2018).
  16. Wang, Q., et al. Targeting M2 macrophages alleviates airway inflammation and remodeling in asthmatic mice via miR-378a-3p/GRB2 pathway. Front Mol Biosci. 8, 717969(2021).
  17. Wang, J., et al. FIZZ1 promotes airway remodeling through the PI3K/Akt signaling pathway in asthma. Exp Ther Med. 7 (5), 1265-1270 (2014).
  18. Bao, H. R., et al. Sinomenine attenuates airway inflammation and remodeling in a mouse model of asthma. Mol Med Rep. 13 (3), 2415-2422 (2016).
  19. Wei, L., et al. Effects of Shiwei Longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).
  20. Wen, L., et al. Modified Dingchuan Decoction treats cough-variant asthma by suppressing lung inflammation and regulating the lung microbiota. J Ethnopharmacol. 306, 116171(2023).
  21. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  22. Fang, J., et al. TcpC inhibits M1 but promotes M2 macrophage polarization via regulation of the MAPK/NF-κB and Akt/STAT6 pathways in urinary tract infection. Cells. 11 (17), (2022).
  23. Nam, S. Y., et al. NecroX-5 ameliorates inflammation by skewing macrophages to the M2 phenotype. Int Immunopharmacol. 66, 139-145 (2019).
  24. Zhao, B., et al. Matrine suppresses lung cancer metastasis via targeting M2-like tumour-associated-macrophages polarization. Am J Cancer Res. 11 (9), 4308-4328 (2021).
  25. Braune, J., et al. IL-6 regulates M2 polarization and local proliferation of adipose tissue macrophages in obesity. J Immunol. 198 (7), 2927-2934 (2017).
  26. Zhang, B., et al. Hyperglycemia modulates M1/M2 macrophage polarization via reactive oxygen species overproduction in ligature-induced periodontitis. J Periodontal Res. 56 (5), 991-1005 (2021).
  27. Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu Decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701(2022).
  28. Liu, G., et al. Therapeutic targets in lung tissue remodelling and fibrosis. Pharmacol Ther. 225, 107839(2021).
  29. Ramaesh, K., Billson, F. A., Madigan, M. C. Effect of bile acids on fibroblast proliferation and viability. Eye (Lond). 12 (4), 717-722 (1998).
  30. Zhu, B., et al. Formononetin ameliorates ferroptosis-associated fibrosis in renal tubular epithelial cells and in mice with chronic kidney disease by suppressing the Smad3/ATF3/SLC7A11 signaling. Life Sci. 315, 121331(2023).
  31. Han, D., et al. Hesperidin inhibits lung fibroblast senescence via IL-6/STAT3 signaling pathway to suppress pulmonary fibrosis. Phytomedicine. 112, 154680(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מקרופאגים M2מסלול IL-6 STAT3פיברובלסטים של הריאהקיטוב מקרופאגיםסמני פיברוזיסWestern BlotReal-Time PCR
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.