הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

RNA מעגלי ZBTB46 מפחית אפופטוזיס ועומס חמצוני בתאי אנדותל אנושיים שנפגעו מליפופוליסכרידים על ידי מודולציה של איתות ERBB2-AKT

253 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69765

⸱

13 בפברואר 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

במאמר זה

סיכום

פגיעת כליה חריפה הקשורה לאלח דם (SA-AKI) קשורה לשיעורי תמותה גבוהים. מחקר זה מגלה ש-circZBTB46 מופחת ב-HUVECs המושרים על ידי LPS (SA-AKI in vitro). הביטוי המופרז שלו מגביר את הקיימות של HUVEC, מפחית אפופטוזיס, דלקת ועקץ חמצוני בשילוב עם איתות ERBB2/AKT, מה שמרמז על יעד טיפולי פוטנציאלי הרלוונטי ל-SA-AKI.

תקציר

RNA מעגלי הם רגולטורים מתפתחים של תגובות לחץ, אך תפקידם בפגיעת אנדותל שמובילה לפגיעת כליה חריפה הקשורה לספסיס נותרו לא מוגדרים במלואם. השענו כי ה-RNA המעגלי ZBTB46 (circZBTB46) מעניק הגנה לאנדותל על ידי הפעלת איתות ERBB2-AKT. באמצעות מודל מבוסס תאים שבו תאי אנדותל של וריד הטבור האנושי אותגרו עם ליפופוליסכריד, כמתנו את ביטוי circZBTB46 ובדקנו את השפעות הביטוי הכפוי שלו על הישרדות, אפופטוזיס, מתווכים דלקתיים והומאוסטזיס של רדוקס. בדיקות קיום תאים וציטומטריית זרימה העריכו הישרדות ואפופטוזיס. בדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים מדדו אינטרלוקין-6, פקטור נמק גידול-α ואינטרלוקין-1β, בעוד שמיני חמצן פעילים, מלונדיאלדהיד, סופראוקסיד דיסמוטאז וקטלז הוערכו כמדדים לפגיעה חמצונית וליכולת נוגדי חמצון. כדי להגדיר את המנגנון, ביצענו פרופיל טרנסקריפטום עם ניתוח העשרת קבוצות גנים, אישרנו חלבוני מסלול באמצעות Western blotting, והערכנו את הצורך באמצעות מעכב ERBB2 AG-825. דיכוי ליפופוליסכרידים סביבZBTB46. ביטוי יתר של CircZBTB46 הגביר את החיוניות, הוריד אפופטוזיס, הפחית ציטוקינים פרו-דלקתיים ומיני חמצן תגובתי, הפחית את המלונדיאלדהיד והעלה את פעילות הסופר-אוקסיד דיסמוטאז וקטלזה. ניתוחים טרנסקריפטומיים וחלבונים תמכו בהפעלה של ציר ERBB2-AKT, וחסימת ERBB2 פרמקולוגית קהה את ההגנה הציטוגרפית והפכה את ההתקדמות באיזון החמצון האדום. ממצאים אלו מזהים את circZBTB46 כבלימה אנדוגנית לנזק אנדותלי שנגרם על ידי ליפופוליסכרידים באמצעות איתות ERBB2-AKT ומצביעים על circZBTB46 כצומת מכנית ומטרה טיפולית פוטנציאלית לפגיעה חריפה בכליות הקשורה לספסיס.

מבוא

אלח דם, מפל דלקתי מערכתי מסכן חיים שמתחיל על ידי פלישה פתוגנית, לעיתים קרובות מגיע לשיאו בכשל רב-איברי1. בהקשר קריטי זה, SA-AKI מתגלה כסיבוך דומיננטי ומשמעותי קלינית ביחידות טיפול נמרץ2. המצב מאופיין בהידרדרות פתאומית בקיבולת סינון הכליות במקביל לזיהום מערכתית, והוא מראה שיעורי תמותה העולים על אלו של AKI לא ספטי ב-38%-42% בקבוצות קליניות2. כ-60% מהאנשים שאובחנו עם אלח דם או הלם ספטי צפויים לפתח SA-AKI3. לכן, SA-AKI הפכה לאתגר מרכזי בטיפול נמרץ, ותורמת משמעותית לתחלואה ותמותה4. נכון לעכשיו, מנגנון SA-AKI נותר בלתי מובן לחלוטין. למרות שמחקרים פרה-קליניים כללו הפרעה בתפקוד מיקרוקולטורי, שינויים במטבוליזם תאי וחוסר איזון במערכת הרנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון (RAAS), תפקוד לקוי של מיטוכונדריה וחוסר ויסות דלקתי, המנגנון הפתופיזיולוגי של SA-AKI נותר חמקמק, וכיום קיימת מחסור באמצעים אופטימליים לתמיכה באבחון מוקדם ובניהול מתמשך 5,6,7,8 . SA-AKI מתאפיין באפופטוזיס מוגבר, לחץ חמצוני מופרז ודלקת9. במסגרת מחקר זו, ליפופוליסכריד (LPS) שימש במערכת חוץ-גופית לחיקוי ביטויים של AKI הקשור לספסיס בתאי אנדותל של ורידי הטבור (HUVECs) לצורך חקר מטרות ראשוני5.

בשנים האחרונות, RNA מעגלי (circRNAs), קטגוריה שזוהתה לאחרונה של מולקולות RNA לא מקודדות, זכו לתשומת לב גוברת בשל תפקידם במחלות שונות10. ל-circRNA יש מבנה מעגלי יציב ומשתתף בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים תאיים על ידי כך שהם משמשים כספוגים מולקולריים למיקרו-RNA (miRNA), ויסות שעתוק גנים או מעורבות באינטראקציות עם חלבונים11. מחקרים הראו כי circRNA מעורבים באופן קריטי בוויסות דלקת, לחץ חמצוני ונתיבי אפופטוזה, ובכך מייצרים מיקוד מחקרי מוגבר בהשלכותיהם האפשריות באלפח דם ובמצבים נלווים, כולל פגיעת כליה חריפה12. לדוגמה, hsa_circ_0072463 זוהה כסמן אבחוני מבטיח ומטרה טיפולית ל-SA-AKI13. דווח כי Circ_001653 הקלה על SA-AKI באמצעות גיוסBUD13 14. עם זאת, המשמעות הפונקציונלית של circRNA ב-SA-AKI נותרה ברובה לא נחקרת.

מחקר זה נועד לבחון את השפעת circZBTB46 על תפקוד תאי האנדותל, לחץ חמצוני ותגובות דלקתיות באמצעות מערכת SA-AKI במבחנה . על ידי בניית מודל HUVEC המושרה על ידי LPS, חקרנו פגיעה באנדותל תחת גירוי אנדוטוקסין. יש לציין כי HUVECs עם אתגרים ב-LPS מייצגים מודל לחץ אנדותליאלי מונע על ידי אנדוטוקסין/TLR4 רדוקציוניסטי, הרלוונטי אך אינו שווה ערך לפתופיזיולוגיה הרב-גורמית של פגיעה חריפה בכליה הקשורה לספסיס. מודל זה לוכד בעיקר הפעלה דלקתית מתווכת TLR4, לחץ חמצוני ותגובות אנדותליות הקשורות לאפופטוזיס, תוך השמטת רכיבים מרכזיים ב-vivo כגון שינויים המודינמיים, מפלים של משלים וקרישה, דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק, וגירויים מיקרוביאליים הטרוגניים. במסגרת ניסויית זו, חקרנו האם circZBTB46 מקל על לחץ חמצוני ונפגע אפופטוזיס שנגרם על ידי LPS על ידי ויסות מסלול האיתות של ERBB2, ובכך להגן על תפקוד תאי האנדותל. למיטב ידיעתנו, מחקר זה מספק את הראיה הראשונה המקשרת בין circZBTB46 לתגובות לחץ אנדותליאלי בהקשר של פגיעה חריפה בכליה הקשורה לספסיס. על ידי הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההגנה האנדותלית המתווכת circZBTB46, מחקר זה עשוי להעמיק את ההבנה של המנגנונים הפתוגנים של SA-AKI ולסלול את הדרך לגישות טיפוליות חדשניות המתמקדות ב-circRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הניסיוניים המשמשים לחקר השפעות המודולציה של circZBTB46 על איתות דלקתי, לחץ חמצוני והפעלת מסלולי ERBB2-AKT ב-HUVECs.

תרבית תאים
תאי ה-HUVECs ששימשו במחקר זה התקבלו ממקור מסחרי. HUVECs שימשו כמודל תאי אנדותל מייצג בשל זמינותם הרחבה, תנאי התרבית הניתנים לשחזור ויעילות הטרנספקציה הגבוהה, המסייעים במניפולציה גנטית וחקירה מכנית של מסלולי איתות אנדותליים תחת לחץ דלקתי15,16. HUVECs גודלו ב-DMEM עם תוספת של 10% (v/v) סרום בקר עוברי וקוקטייל אנטיביוטיקה-אנטימיקוטי בריכוז 1%. כל תרביות התאים נשמרו בתנאים פיזיולוגיים סטנדרטיים בתא לחות (37°C, 5% CO2), מה שעודד התרבות תאית מתמשכת תוך שמירה על >95% חיוניות כפי שאושר על ידי בדיקת הדרה כחולה טרייפן. למרות שמדיות ספציפיות לאנדותל (למשל, EGM-2 או M199 עם תוספי גדילה אנדותליים) מומלצות בדרך כלל לתחזוקה ארוכת טווח של HUVEC, DMEM שימש במחקר זה כדי להבטיח עקביות בין טיפולים ניסיוניים והתאמה לגירוי LPS ולבדיקות מעכבים פרמקולוגיות. לבדיקות מעכבי AG-825, יש לדגור HUVECs עם DMEM טרי המכיל 10 מיקרומום AG-825 למשך שעה אחת. לאחר מכן, מוסיפים את תמיסת ה-LPS לבארות כדי להגיע לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל, וממשיכים את התרבית במשך 24 שעות. כדי למזער סטייה פנוטיפית פוטנציאלית, HUVECs שימשו במספרי מעבר נמוכים ונחשפו לתנאים ניסיוניים מבוססי DMEM רק לבדיקות קצרות טווח. כל הניסויים התפקודיים בוצעו בתוך חלונות טיפול מוגדרים ולא במהלך תרבית ממושכת.

טרנספקציה תאית
כדי להבהיר את התפקיד הביולוגי של circZBTB46, פלסמידים בעלי הבעה יתר (oe-circZBTB46) ומבני ביקורת שליליים תואמים (oe-NC) סונתזו ואומתו על ידי GenScript. HUVECs נזרעו ללוחות בעלי 6 בארות בצפיפות של 1 x 10⁵ תאים לבאר ותרבתו במהלך הלילה כדי להגיע למפגש ~70%-80% בזמן הטרנספקציה. לכל באר, 2.5 מיקרוגרם DNA פלסמיד (oe-circZBTB46 או oe-NC) דולל ב-125 מיקרוליטר של תווך סרום מופחת ומעורבב עם 2.5 מיקרוליטר של תגובת P3000 (צינור A). במקביל, 3.75 מיקרוליטר של ליפופקטמין 3000 דולל ב-125 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת (צינור B). צינור A וצינור B שולבו, מעורבבים בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 15-20 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקס (נפח קומפלקס סופי: 250 מיקרוליטר לבאר). הקומפלקסים נוספו בדרופ בתאים במדיום מלא ללא אנטיביוטיקה. לאחר 6 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, הוחלף מדיום הטרנספקציה במדיום צמיחה טרי ומלא. התאים תורבדו במשך 48 שעות לפני הבדיקות הבאות. כל הנהלים פעלו לפי הוראות היצרן.

מודל מושרה על ידי LPS
כדי ליצור מודל SA-AKI במבחנה, HUVECs (5 x 105 תאים לבאר) שהועברו עם oe-circZBTB46 או NC הוזרעו בלוחות של 96 בארות ונשמרו במשך 24 שעות עד שהושגה 80% מפגש נקודות. לאחר מכן, תאים אלו עברו טיפול ב-LPS ב-10 מיקרוגרם/מ"ל במשך 24 שעות. HUVECs ללא טיפול ב-LPS שימשו כקבוצת הביקורת.

qRT-PCR
הפקת ה-RNA הכוללת מ-HUVECs השתמשה במגיב מסחרי. שעתוק הפוך לסינתזת cDNA בוצע באמצעות ערכת המגיב המסחרית. PCR כמותי (qPCR) בוצע בשלושה עותקים באמצעות מערכת PCR בזמן אמת לצד מיקס ראשי. כמויות הביטוי של גני המטרה כויללו מול U6, כאשר הניתוח בוצע באמצעות שיטת 2−ΔΔCT 17,18. לניתוח ביטוי circRNA, RNA גרעיני קטן U6 שימש כהתייחסות פנימית לנרמול, שכן הוא משמש לעיתים קרובות לכימות RNA קטנים שאינם מקודדים ודווח כי מציג ביטוי יציב יחסית בתנאי ניסוי קצרי טווח במבחנה. רצפי פריימר שיושמו במחקר זה מפורטים כדלקמן:

circZBTB46-קדימה: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-הפוך: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-חלוץ: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCAGCA-3'

U6-ריברס: 5'-GAGGTCATGCCTAATCTTCTG-3'.

מבחן CCK-8
הקיימות של HUVEC הוערכה באמצעות CCK-8 שנרכש מסחרית. בקצרה, תאים הוזרעו ללוח של 96 בארות, והתאים עברו תרבית הידבקות במשך 24 שעות. לאחר מכן נוספו 10 מיקרוליטר של תמיסת CCK-8 לכל באר, והתאים הועברו לדגירה נוספת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. קורא מיקרופלט שימש למדידת צפיפות אופטית (OD) באורך גל של 450 ננומטר. תצפיות ראשוניות הראו כי 10 מיקרוגרם/מ"ל של LPS הפחיתו משמעותית את הקיימות של HUVECs, מה שהוביל לבחירת ריכוז זה לתהליכים ניסיוניים עתידיים.

ציטומטריית זרימה
בתחילה, HUVECs הופרדו עם טריפסין ללא EDTA בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. בהתאם להנחיות היצרן עבור ערכת בדיקת אפופטוזיס Annexin V-APC/PI, תלשות תאים צונטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, לאחר דיסוציאציה אנזימטית. התאים הגולגולים נשטפו 2 פעמים עם PBS קר בתנאים זהים והושעו מחדש ב-100 מיקרוליטר של בופר קישור 1x. כל דגימה טופלה ב-5 מיקרוליטר של אנקסין V-FITC קונגוגט ו-5 מיקרוליטר של תמיסת צביעה ביודיד פרופידיום (PI), ואחריה דגירה של 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס). לבסוף, נוספו 400 מיקרוליטר של בופר קישור 1x לכל הדגימות, ואפופטוזיס נותח תוך שעה באמצעות ציטומטר זרימה. האירועים הוגדרו תחילה על ידי FSC/SSC כדי למנוע פסולת. לניתוח אפופטוזיס, הוחלו שערי רבע על גרף Annexin V-FITC מול PI באמצעות בקרות מתאימות (בקרות לא צבועות ויחידות צביעה/פיצוי) כדי להגדיר אוכלוסיות חיות (Annexin V-/PI-), אפופטוטיות מוקדמת (Annexin V+/PI-), אפופטוטיות מאוחרות (Annexin V+/PI+) ונמקיות (Annexin V-/PI+). אותו תבנית שער וספים הוחלו על כל הדגימות.

בדיקת ELISA
ריכוזי הגורמים הדלקתיים – פקטור נמק הגידול – α (TNF-α), אינטרלוקין-6 (IL-6) ואינטרלוקין-1β (IL-1β) – בסופרנטנט של HUVECs מתורבתים נמדדו באמצעות ערכות ELISA מסחריות. באופן ספציפי, ערכת ELISA של ה-TNF-α האנושית, ערכת ELISA אנושית IL-6 וערכת ELISA אנושית IL-1β שימשו לפי הוראות היצרנים. לכל בדיקה נטען 50 מיקרו-ליטר של סופרנטנט תרבית תאים לא מדולל לכל באר. עקומות סטנדרטיות נוצרו באמצעות דילול סדרתי שסופקו (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). לאחר דגימה ותוספת סטנדרטית, הצלחות דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, ואחריהן חמש שטיפות עם בופר שטיפה. לאחר מכן נוספו נוגדנים לזיהוי מצומדים לביוטין ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר שלב שטיפה נוסף, נוסף סטרפטווידין-HRP ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שטיפה אחרונה, נוסף מצע 3,3',5,5'-טטראמתילבנזידין (TMB) והוחזק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 15 דקות. התגובה הסתיימה בתמיסת עצירה, והספיגה נמדדה מיד ב-450 ננומטר עם אורך גל ייחוס של 630 ננומטר. כל דגימה ותקן נבדקו בשכפול, וכל הניסויים כללו שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים. רמות סמני הלחץ החמצוני - מלונדיאלדהיד (MDA), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) וקטלז (CAT) - בסופרנטנט הוערכו באמצעות ערכת MDA ELISA, ערכת SOD ELISA וקיט ELISA, בהתאמה בהתאם לפרוטוקולים 19,20,21. לבדיקות MDA ו-SOD, נעשה שימוש ב-40 מיקרוליטר של סופרנטנט לכל באר ללא דילול; ב-CAT, דגימות דוללו ביחס 1:10 עם בופר מבחן לפני הטעינה. עקומות סטנדרטיות הוכנו לפי מפרטי הערכה (MDA: 0-60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; CAT: 0-100 U/mL). שלבי הדגירה בוצעו כך: MDA - 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס; SOD - 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס; חתול - 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הלוחות נשטפו 4 פעמים בין שלבי הדגירה המרכזיים. התפתחות צבע הושגה על ידי הוספת המצע המתאים ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (MDA: 15 דקות; SOD: 20 דקות; חתול: 15 דקות). הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר עבור SOD ו-CAT, וב-532 ננומטר עבור MDA. כל המדידות בוצעו בבארות כפולות וחזרו על פני שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

רצף RNA
RNA כולל הופק מ-HUVECs באמצעות תגובות מסחריות לפי הוראות היצרן. טוהר וריכוז ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מדידת ספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר (A260/A280), ושלמות ה-RNA הוערכה באמצעות ביואנלייזר. רק דגימות RNA עם מספר שלמות RNA (RIN) ≥ 7 שימשו להכנת ספרייה מאוחרת יותר. RNA ריבוזומי הוסר במהלך הכנת הספרייה באמצעות הליך סטנדרטי של דלדול rRNA שבוצע על ידי חברה מסחרית. כאשר נדרש, טיפול ב-RNase R יושם לפני בניית הספרייה לעיכול סלקטיבי של RNA ליניארי ולהעשיר מיני RNA מעגליים. פריסת RNA בוצעה לאחר מכן בתנאי טמפרטורה גבוהים בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של מדריך ערכת הכנת ספריית ה-RNA, ליצירת קטעי RNA בגודל מתאים. ספריות הרצף הוכנו באמצעות ערכת הכנת ספריות RNA לפי הוראות היצרן ורצפו על פלטפורמת Illumina באמצעות אסטרטגיית רצף זוג עם אורך קריאה של 150 bp (PE150). עומק הריצוף היה מספיק כדי לתמוך בניתוח רחב של טרנסקריפטום. קריאות רצף גולמיות עובדו באמצעות נהלי בקרת איכות סטנדרטיים להסרת רצפי מתאם וקריאות באיכות נמוכה. קריאות נקיות הותאמו לגנום הייחוס האנושי, ורמות ביטוי הגנים נמדדו בהתאםל-22,23. גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) בין HUVECs שמביעים יתר על המידה circZBTB46 לבין HUVECs שטופלו ב-NC תחת גירוי LPS זוהו באמצעות שיטות סטטיסטיות מבוססות. בוצע ניתוח העשרת קבוצות גנים (GSEA) לזיהוי מסלולי איתות הקשורים לביטוי יתר של circZBTB46. הגנים דורגו על פי ביטוי שונה בין קבוצות ניסוי. מערכי גנים שנבחרו מתוך מאגר החתימות המולקולריות (MSigDB) שימשו לניתוח העשרה. מובהקת ההעשרה הוערכה על בסיס ציון ההעשרה המנורמל (NES) ושיעור גילוי שגוי (FDR), כאשר FDR < 0.25 נחשב למובהק סטטיסטית. ריצוף CircRNA וכל הניתוחים הביואינפורמטיים הנלווים הועברו למיקור חוץ.

זיהוי DEGs
כדי לסרוק DEGs, רמות הביטוי בין שתי קבוצות שונות הושוו באמצעות חבילת התוכנה DESeq (2012) R. הספים למובהק סטטיסטי הוגדרו כ-p < 0.05 עם |log2FC| ערך מעל 0.58. מפת החום נוצרה על ידי חבילת pheatmap R, וגרף הר געש השתמש בחבילת Goplot2 R לציור.

ניתוח העשרה פונקציונלית
ניתוחי העשרה של GO ו-KEGG שהתבססו על תמלילים ליניאריים נערכו באמצעות הפלטפורמה המקוונת EnrichR, ותרשים הבועה נכתב על בסיס חבילת GOplot R. תוכנת GSEA שימשה בהתבסס על מטריצת הביטוי וקבצי סט גנים שסופקו על ידי מסד הנתונים MSigDB, עם פרמטרים ניתוחים (למשל, מספר ההחלפות ושיטות סטטיסטיות). העשרת מערכי הגנים הוערכה באמצעות ציון ההעשרה המנורמל (NES), ערך P וערך FDR, מה שסיפק חקירה מעמיקה של הפונקציות והמנגנונים הביולוגיים הפוטנציאליים של הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי.

כתם מערבי
חלבון כולל הופק מ-HUVECs (בערך תאים בגודל 1 x 10⁶) באמצעות בופר ליזיס RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז. ריכוז החלבון נקבע באמצעות ערכת כימות חלבון BCA. כמויות שוות של חלבון (20 מיקרוגרם לנתיב) נפתרו באלקטרופורזה על ג'לים דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד 10% נתרן (SDS-PAGE) בעוצמה של 80 וולט למשך 30 דקות, ואחריה 120 וולט למשך 60 דקות. לאחר מכן, חלבונים הועברו לממברנות פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) באמצעות מערכת העברה רטובה ב-100 וולט למשך 90 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן במלח טריס-בופר עם 0.1% Tween-20 (TBST) למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים באותו בופר חסימה (בדרך כלל 1:1000 לחלבוני יעד ו-1:5000 ל-GAPDH) בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה. הנוגדנים העיקריים ששימשו היו כדלקמן: ERBB2, p-AKT, AKT ו-GAPDH. לאחר הדגירה, הממברנות נשטפו 3 פעמים (10 דקות בכל שטיפה) עם TBST ואז דוגרו בנוגדן משני IgG אנטי-ארנב עם פרוקסידאז חזרת (HRP) (1:5000 בבופר חסימה) למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש שטיפות נוספות של TBST (10 דקות כל אחת), רצועות החלבון הוצגו באמצעות ערכת Western Blotting Substrate של Enhanced Chemiluminescence (ECL) וצולמו באמצעות מערכת הדמיה. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות תוכנה.

ניתוח סטטיסטי
הערכות סטטיסטיות בוצעו באמצעות GraphPad Prism 10. הנתונים מוצגים כממוצעים ± שגיאת תקן של הממוצעים (SEMs). ערך p < 0.05 הוגדר כדי להצביע על מובהקות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח qRT-PCR של ביטוי circZBTB46 במודל SA-AKI במבחנה
סט ניסויים זה נערך כדי לבדוק את ההשערה שהביטוי של circZBTB46 משתנה תחת גירוי LPS וכי מודולציה של circZBTB46 משפיעה על חיוניות תאי האנדותל ואפופטוזיס במודל SA-AKI במבחנה . בתחילה, ביטוי circZBTB46 נבדק בתנאי ביקורת ובמערכת SA-AKI במבחנה . כפי שמודגם באיור 1A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במהלך ספסיס, דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים (PAMPs), כגון LPS המשתחררים על ידי פתוגנים, מפעילים קולטנים דמויי Toll (למשל, TLR4), ומתחילים תגובה דלקתית מערכתית26. תהליך זה גורם להפרשה של מספר מתווכים פרו-דלקתיים, כגון TNF-α, IL-6 ו-IL-1β, מה שמוביל לסערת ציטוקינים27. במקביל, LPS פוגע ישירות בתאי אנדותל כלי דם, מה שמוביל להפרעות מיקרוקולטוריות, חדירות וסקולית מוגברת ולטרומבוזיס, שבסופו של דבר פוגעותבזרימת הדם הכליי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים. המחברים מצהירים כי התוצאות המרכזיות המוצגות בכתב יד זה לא פורסמו קודם לכן ואינן נבדלות לפרסום במקום אחר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AG-825 (מעכב ErbB2)MedChemExpressHY-1019710 & mu; M עבור חסימת שביל
אנלייזר ביולוגי Agilent 2100אג'ילנטG2939BAשלמות RNA (RIN≥ 7)
נוגדן AKTפרויטנטק60203-2-IgWB (1:15000)
ערכת אפופטוזיס ANNEXIN V-APC/PIElabscienceE-CK-A327זיהוי אפופטוזיס
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיתגיבקו15240062ריכוז 1%
ערכת כימות חלבון BCAביוטייםP0012ריכוז חלבון
ערכת אליסה של חתולמיימיאןMM-0897H2אנזים נוגד חמצון
ערכת CCK-8דוג'ינדוCK04בדיקת כחיות תאים
המשך CircRNAפוז'ואו חוארונג קיהוי ביוטכנולוגיה בע"מPE150ריצוף CircRNA וכל הניתוחים הביואינפורמטיים הנלווים
ציטומטר זרימה CytoFLEXבקמן קולטרB53000ניתוח אפופטוזיס
DMEMגיבקו (Invitrogen)11965092מדיום תרבית תאים
ערכת מצע ECLמיליפורWBKLS0100זיהוי חלבונים
נוגדן ERBB2סינו ביולוגי100271-T32WB (1:10000)
סרום בקר עוברי (FBS)תעשיות ביולוגיות04-001-1ACSתוסף 10% (v/v)
נוגדן GAPDHפרויטנטק60004-1-IgWB (1:50000)
HUVECsמערכת פרוסלCP-H082מקור קו התאים
IL-1 ובטא; ערכת אליסהמיימיאןMM-0181H2גורם דלקתי
IL-6 אליסה קיטמיימיאןMM-0049H2גורם דלקתי
Illumina NovaSeq 6000אילומינה20012850רצף RNA
ליפופקטמין 3000InvitrogenL3000008תגובת טרנספקציה
LPS (E. coli O111:B4)סיגמא-אלדריץ'L263010 & mu; g/mL לדגם SA-AKI
ערכת MDA ELISAמיימיאןMM-2037H2סמן לחץ חמצוני
ננודרופ 2000תרמו פישרND-2000כימות RNA
ערכת ספריית RNA של NEBNext Ultra IINEBE7770Sהכנת ספריית RNA-seq
פלסמיד oe-circZBTB46GenScriptסינתזה מותאמת אישיתוקטור ביטוי יתר circZBTB46
פלסמיד oe-NCGenScriptסינתזה מותאמת אישיתוקטור בקרה שלילי
נוגדן p-AKT (Ser473)פרויטנטק66444-1-IgWB (1:1200)
ערכת ריאגנט PrimeScript RTטקארהRR047Aסינתזת cDNA
ממברנות PVDFמיליפורIPVH00010העברת כתם מערבי
מערכת QuantStudio 5תרמו פישרA28137PCR בזמן אמת
ריבונוקלאז RלוסיגןRNR07250הסרת rRNA
RIPA Lysis BufferביוטייםP0013Bהפקת חלבון
RNAiso Plusטקארה9109חילוץ RNA כולל
סולד אליסה קיטמיימיאןMM-25469H2אנזים נוגד חמצון
TB Green Premix Ex TaqטקארהRR420Aריאגנט qPCR
TNF-α ערכת אליסהמיימיאןMM-0122H2גורם דלקתי

מקורות

  1. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMedicine. 86, 104318(2022).
  2. White, K. C., et al. Sepsis-associated acute kidney injury in the intensive care unit: incidence, patient characteristics, timing, trajectory, treatment, and associated outcomes. Intensive Care Med. 49 (9), 1079-1079 (2023).
  3. Poston, J. T., Koyner, J. L. Sepsis-associated acute kidney injury. BMJ. 364, k4891(2019).
  4. Bora, E. S., Arda, D. B., Erbas, O. The renoprotective effect of tibolone in sepsis-induced acute kidney injury. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 168 (4), 311-318 (2024).
  5. van der Slikke, E. C., et al. Sepsis is associated with mitochondrial DNA damage and a reduced mitochondrial mass in the kidney of patients with sepsis-AKI. Crit. Care. 25 (1), 36(2021).
  6. Kuwabara, S., Goggins, E., Okusa, M. D. The pathophysiology of sepsis-associated AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1050-1069 (2022).
  7. Pais, T., Jorge, S., Lopes, J. A. Acute kidney injury in sepsis. Int J Mol Sci. 25 (11), 5924(2024).
  8. Sun, J., et al. Mitochondria in sepsis-induced AKI. J Am Soc Nephrol. 30 (7), 1151-1161 (2019).
  9. Zheng, Q., et al. PRDM16 suppresses ferroptosis to protect against sepsis-associated acute kidney injury by targeting the NRF2/GPX4 axis. Redox Biol. 78, 103417(2024).
  10. Beltrán-García, J., et al. Circular RNAs in sepsis: biogenesis, function, and clinical significance. Cells. 9 (6), 1544(2020).
  11. Xu, X., et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 19 (1), 128(2020).
  12. Chen, Y., et al. Non-coding RNAs in sepsis-associated acute kidney injury. Front Physiol. 13, 830924(2022).
  13. Peng, X., et al. Discovery and verification of mmu_Circ_26986/hsa_Circ_0072463 as a potential biomarker and intervention target for sepsis-associated acute kidney injury. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 154(2024).
  14. Li, X., et al. Circ_001653 alleviates sepsis-associated acute kidney injury by recruiting BUD13 to regulate KEAP1/NRF2/HO-1 signaling pathway. J Inflamm (Lond). 21 (1), 37(2024).
  15. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  16. Kocherova, I., et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: from molecular communication to engineering prevascularised bone grafts. J Cell Mol Med. 23 (8), 5253-5267 (2019).
  17. Duan, Z. Y., et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Sci Rep. 8 (1), 10875(2018).
  18. Veryaskina, Y. A., Titov, S. E., Zhimulev, I. F. Reference genes for qPCR-based miRNA expression profiling in 14 human tissues. Med Princ Pract. 31 (4), 322-332 (2022).
  19. Demirci-Çekiç, S., et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense. Arch Biochem Biophys. 724, 109077(2022).
  20. Ighodaro, O. M., Akinloye, O. A. First line defence antioxidants—superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid. Alexandria J Med. 54 (4), 287-293 (2018).
  21. Del Rio, D., Stewart, A. J., Pellegrini, N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 15 (4), 316-328 (2005).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2026).
  24. Dauphinee, S. M., Karsan, A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. Lab Invest. 86 (1), 9-22 (2006).
  25. Li, F., et al. Qiliqiangxin alleviates Ang II-induced CMEC apoptosis by downregulating autophagy via the ErbB2–AKT–FoxO3a axis. Life Sci. 273, 119239(2021).
  26. Cicchinelli, S., et al. PAMPs and DAMPs in sepsis: a review of their molecular features and potential clinical implications. Int J Mol Sci. 25 (2), 962(2024).
  27. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1322(2023).
  28. Zhou, W. Y., et al. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 19 (1), 172(2020).
  29. Li, S., et al. CircZBTB46 predicts poor prognosis and promotes disease progression of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Clin Exp Med. 23 (8), 4649-4664 (2023).
  30. Fu, Y., et al. Circular RNA ZBTB46 depletion alleviates the progression of atherosclerosis by regulating the ubiquitination and degradation of hnRNPA2B1 via the AKT/mTOR pathway. Immun. Ageing. 20 (1), 66(2023).
  31. Long, F., et al. CircZBTB46 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptotic cell death by upregulating SCD. Cancers (Basel). 15 (2), 459(2023).
  32. Uckun, F. M., Qazi, S. Upregulated expression of ERBB2/HER2 in multiple myeloma as a predictor of poor survival outcomes. Int J Mol Sci. 24 (12), 9943(2023).
  33. Moutafi, M., et al. Quantitative measurement of HER2 expression to subclassify ERBB2-unamplified breast cancer. Lab Invest. 102 (10), 1101(2022).
  34. Wei, D., et al. KIF11 promotes cell proliferation via ERBB2/PI3K/AKT signaling pathway in gallbladder cancer. Int J Biol Sci. 17 (2), 514-526 (2021).
  35. Fan, K., et al. ERBB2 S310F mutation independently activates PI3K/AKT and MAPK pathways through homodimers to contribute to gallbladder carcinoma growth. Med Oncol. 39 (5), 64(2022).
  36. Zhu, W., et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in acute myocardial infarction through upregulating miR-133a-3p. J Nanobiotechnol. 19 (1), 61(2021).
  37. Du, H., et al. Anti-leukemia activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme via the PI3K/AKT/BAD pathway in vivo and in vitro. Mar Drugs. 21 (5), 289(2023).
  38. Wang, W., et al. Hydroxysafflor yellow A ameliorates alcohol-induced liver injury through PI3K/Akt and STAT3/NF-κB signaling pathways. Phytomedicine. 132, 155814(2024).
  39. Yao, L., et al. Finerenone ameliorates mitochondrial dysfunction via PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in diabetic tubulopathy. Redox Biol. 68, 102946(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CircZBTB46פגיעה בליפופוליסכרידבקרה על אפופטוזיסמבחן חיוניות תאיםציטומטריה של זרימהפגיעה כלייתית חריפה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.