מאמר שיטה

מידול עמידות לאינסולין של שדיפוציטים באמצעות חלק וסקולרי סטרומלי תת-עורי שמקורו ברקמת שומן בעכברים

DOI:

10.3791/69769

⸱

27 במרץ 2026

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג פרוטוקול ניסיוני המשתמש בחלק הווסקולרי סטרומלי שמקורו ברקמת שומן תת-עורית של העכברים ומטופל בדקסמתאזון לסימולציה של עמידות לאינסולין. על ידי שמירה על מורכבות רקמת השומן, היא מציעה פלטפורמה פיזיולוגית אותנטית למחקר מכניסטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עמידות לאינסולין ברקמת שומן היא תכונה מרכזית של הפרעות מטבוליות כמו סוכרת סוג 2, אך מודלים רבים במבחנה מסתמכים על קווי תאים מונצחים המשקפים באופן חלקי את המורכבות התאית של רקמת השומן הטבעית. מטרת הפרוטוקול היא להקים שיטה ניתנת לשחזור ונגיש ניסיונית למידול עמידות לאינסולין של שדיפוציטים ראשוניים שמקורם בחלק הווסקולרי סטרומלי (SVF) של רקמת השומן התת-עורית של העכברים. הפרוטוקול מתאר את הבידוד של תאי SVF באמצעות עיכול אנזימטי, את התמיינתם האדיפוגנית לדיפוציטים בוגרים עמוסים בשומן, ואת השראת עמידות לאינסולין באמצעות דקסמתאזון. עמידות לאינסולין מוגדרת ותאומת באופן תפעולי באמצעות קריאות פונקציונליות ומולקולריות, כולל הפחתת קליטת וצריכה של גלוקוז המופעל על ידי אינסולין, וכן הפחתת פוספורילציה של חלבוני איתות אינסולין מרכזיים במסלול PI3K-AKT. על ידי שמירה על הטרוגניות תאית שמקורם ב-SVF, גישה זו מספקת מערכת מבוססת תאים ראשונית התומכת בחקירת איתות אינסולין של שומן בתנאים הקרובים יותר לפיזיולוגיה של רקמת השומן מאשר קווי תאים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מיועד לחוקרים המחפשים פלטפורמה סטנדרטית לחקר מנגנוני עמידות לאינסולין של שומנים או להערכת התערבויות מטבוליות, תוך הכרה בכך שהקריאות משקפות תגובות מתרבות מעורבת שמקורה ב-SVF ולא מאוכלוסיית שומנים מטוהרת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוכרת סוג 2 (T2DM) הפכה לאחת המחלות המטבוליות הלא-מדבקות הצומחות ביותר בעולם, כאשר מספר המטופלים הכולל עולה כיום על 537 מיליון וצפוי לעבור את 783 מיליון עד 2045. המאפיינים הפתופיזיולוגיים המרכזיים שלו מתבטאים כעמידות לאינסולין ברקמות ההיקפיות (IR), המלווה בתפקוד לקוי מתקדם של תאי β2. מהות ה-IR טמונה בהשפעות הביולוגיות המופחתתות משמעותית הנגרמות מאינסולין מרוכז פיזיולוגית באיברי המטרה, מה שמוביל לירידה בספיגת הגלוקוז, לעלייה בתפוקת הגלוקוז בכבד, ולפגיעה בעיכוב הליפוליזה3. רקמת שומן היא אחד האיברים הקריטיים ביותר של האינסולין. השמנה גורמת לתאי השומן להיות לא רגישים לאינסולין, מפחיתה את קליטת הגלוקוז, מעכבת את סינתזת הטריגליצרידים, ובמקביל מגבירה את הליפוליזה ושחרור חומצות שומן חופשיות נוספות, ובכך מחמירה את עמידות האינסולין הסיסטמית 4,5.

במצבים פיזיולוגיים, האינסולין מפעיל את מסלול PI3K-AKT להעברת נשא גלוקוז 4 (GLUT4) לממברנת התא, ומקדם קליטת גלוקוז וסינתזת טריגליצריד בשומנים (שומרים). במקביל, האינסולין מעכב את פעילות הליפאז הטריגליצריד השומני (ATGL) וליפאז הרגיש להורמונים (HSL) על פני שטח טיפות השומן, ובכך חוסם את הליפוליזה6. כאשר מתרחש IR, פגיעה באיתות אינסולין מחלישה את עיכוב השומן, מה שמוביל לשחרור נרחב של חומצות שומן חופשיות (FFAs) לזרם הדם. כתוצאה מכך, שחרור נרחב של FFAs לזרם הדם, וגורם להצטברות טריגליצריד חוץ רחמי באיברים כמו הכבד, שריר השלד והלבלב. זה גורם לרעילות שפתיים ולדלקת כרונית, ובסופו של דבר תורם להופעה והתקדמות של סוכרת סוג2 7. לכן, הקמת מודל שומני שומן בוגר המשכפל מאפייני IR בחיים היא קריטית להבהרת המנגנונים המולקולריים של IR ולפיתוח אסטרטגיות התערבות חדשות.

נכון להיום, קו תאי הפיברובלסטים העובריים של עכבר 3T3-L1 הפך לכלי קלאסי למחקרים חוץ-גופיים של IR שדיפוציטים, בשל מחזור ההשראה הקצר שלו ויכולת השחזור הטובהשלו 8,9. עם זאת, המקור העוברי של תאי 3T3-L1, הרקע הגנטי האחיד שלהם, והרגישות להסטה פנוטיפית לאחר מעבר ארוך טווח גורמים להבדלים משמעותיים בהתנהגות מטבולית בהשוואה לשומנים בוגרים במקום, מה שמגביל את ערכם הרפואי התרגומי 10,11. לעומת זאת, החלק הווסקולרי הסטרומלי (SVF) המבודד מרקמת שומן תת-עורית של מכרסמים עשיר בתאי גזע שומן רב-פוטנטיים (ASCs). שדיפוציטים בוגרים המובחנים מה-ASCs הללו מציגים תכונות מורפולוגיות, פונקציונליות ושעתוקיות הדומות יותר לאלו של שומנים לבנים מקומיים מאשר קו התאים הנפוץ 3T3-L1. דבר זה הופך את הדיפוציטים שמקורם ב-SVF למודל משלים לחקר איתות אינסולין ועמידות בהקשר שמתקרב טוב יותר למורכבות הרקמה הראשונית12.

פרוטוקול זה מתאים במיוחד לחוקרים השואפים לחקור את פעולת האינסולין במודל ראשוני של שדיפוציטים השומר על הטרוגניות רקמתית גבוהה יותר מאשר קווי תאים אלמוותיים. עם זאת, יש לשים לב ש-SVF היא אוכלוסייה מעורבת הכוללת תאי אנדותל ותאי חיסון; לכן, הקריאות משקפות את התנהגות התרבות שבה השומניות הן מרכיב עיקרי אך לא בלעדי. מודל זה עשוי להיות פחות מתאים למחקרים הדורשים אוכלוסיית שומנים טהורה ומסונכרנת.

מחקר זה מציע פרוטוקול לבניית מודל תאים עמיד לאינסולין המשתמש בשומנים בוגרים שמקורם ב-SVF. הפרוטוקול מפרט את כל תהליך הבידוד של SVF, תרבית, הבחנה והשראת עמידות לאינסולין, ומחקה בהצלחה את מצב עמידות האנטיפולין של שדיפוציטים ב-vivo. הערכת המודל תתבצע ברמות צריכת הגלוקוז, המורפולוגיה התאית והמנגנונים המולקולריים. דבר זה מספק בסיס טכני לחקירת המנגנונים המולקולריים שמאחורי עמידות לאינסולין בשומני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של אוניברסיטת שינג'יאנג הרפואית (אישור אתי מס': IAGUC-20240228-41).

1. בידוד SVF

  1. בעלי חיים ניסיוניים: השתמשו בעכברים בדרגת SPF C57BL/6J בני 4-6 שבועות במשקל 9-11 גרם. אכסן אותם בטמפרטורה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס במחזור אור-חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ומים.
  2. הכנה סטרילית: אוטוקלב לכל המכשירים והצרכנים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לפני הניסוי, רססו את מכסה הזרימה הלמינרי ב-75% אתנול והקרינו באור UV למשך ≥15 דקות. לבצע את כל ההליכים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מסוג Class II. לבש כפפות ומסכות סטריליות.
  3. קצירת רקמת שומן: המתת חסד לעכברים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני ואחריה ניתוק צוואר הרחם. טבלו מיד ב-75% אתנול למשך 10 דקות לחיטוי פני השטח. באמצעות מספריים עיניים סטריליים, יש לבצע חתך עגול לאורך קו האמצע של החזה והבטן. בצע ניתוח קהה לחשיפת רקמת השומן הלבנה המפשעתית הדו-צדדית, הממוקמת על הירך הפנימית ומתארכת לכיוון אזור האשכים בצורת V. הסר בזהירות כל בלוטת לימפה נראית לעין. אסוף את רקמת השומן ל-PBS מקורר מראש ובצע שלוש שטיפות מהירות.
  4. עיכול בקולגנאז: העבר מיד את רקמת השומן השטופה לתבנית סטרילית וטחון לחתיכות בגודל 1-2 מ"מ מעוקב. הוסיפו 0.2% קולגנאז מסוג II (מומס ב-PBS של דולבקו, pH 7.4, מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס) בנפח של פי 1.5 עד פי 2 מזה של הרקמה. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר בטמפרטורה קבועה ב-100 סל"ד למשך 10 דקות. הפוך בעדינות כל 3 דקות כדי למנוע עיכול יתר.
  5. סיום וסינון: לאחר סיום העיכול, מוסיפים נפח שווה של מדיום שלם מחומם מראש (DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) בטמפרטורה של 37°C כדי לסיים את התגובה. פיפט עדין 5x-8x עם קצה פיפטה של 1 מ"ל. סיננו דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרון כדי להסיר שברי רקמה לא מעוכלים ושומנים בוגרים.
  6. צנטריפוגה ושטיפה: צנטריפוגה את הסינון בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. השליכו בזהירות את הסופרנטנט המכיל שדיפוציטים בוגרים. החזירו את הכדור למצב מדיום מלא. צנטריפוגה שוב ב-300 x g למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. חזור על שלב השטיפה הזה פעמיים כדי להסיר את שאריות הקולגנאז וכל שדיפוציטים בוגרים שנותרו.
  7. זריעה ותרבות: החזירו את הכדור האחרון ל-1 מ"ל של מדיום מלא. זרעים בצפיפות של 4 דגימות שומן מפשעתי של עכברים לכל צלחת תרבית תאים באורך 10 ס"מ. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. בצע את החלפת המדיום הראשונה לאחר 24 שעות כדי להסיר תאים לא דביקים לאזור. לאחר מכן, החליפו את המדיום כל 48 שעות. עברו את התאים כשהם מגיעים ל-80%-90% מפגש ביניהם.
    הערה: אין להעביר תאים כאשר המפגש עולה על 90%, שכן התאים הגיעו לעיכוב מגע ויכולת ההתרבות שלהם פוחתת.

2. הכנת תמיסת קולגנאז מסוג II

  1. חומרים וחומרים מתכלים: השגת קולגנאז מסוג II (פעילות ≥ 120 U/mg); BSA (חומצה שומנית ≥ 98%); HEPES; PBS של דולבקו (מכיל Ca²⁺ 1.8 mmol/L, Mg²⁺ 0.9 mmol/L), pH 7.2-7.4; מסנן סטרילי בעל קושר חלבון נמוך של 0.22 מיקרון.
  2. הכנת תמיסת קולגנאז מסוג II של 0.2%: משקל 60 מ"ג אבקת קולגנאז סוג II, 800 מ"ג BSA, ו-48 מ"ג HEPES בתוך צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל. מדלל ל-40 מ"ל עם PBS של Dulbecco. כוונן את ה-pH ל-7.4 ± 0.1 באמצעות 1 מטר NaOH או HCl. סטריליזציה באמצעות סינון דרך פילטר של 0.22 מיקרון. Aliquot 5 מ"ל לכל צינור ואחסן בטמפרטורה של -20°C. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.
  3. השרה התמיינות כאשר התאים מגיעים ל-100% מפגש לאחר המעבר. מצב ההתמיינות האופטימלי מסומן על ידי תאים המציגים מורפולוגיה דמוית מערבולת. השתמש בתמיסת אינדוקציה I ל-48 השעות הראשונות, ואז לעבור לתמיסת אינדוקציה II (טבלה 1).
  4. אשר התמיינות מוצלחת לפי הקריטריונים הבאים: ביום 4 לאינדוקציה, צביעת O-אדום-שמן מגלה הצטברות טיפות שומן ברוב התאים (כ-50%), מלווה בעלייה מובהקת סטטיסטית (p < 0.05) בביטוי סמנים מרכזיים של אדיפוגנזה.

3. הקמת מודל עמידות לאינסולין

  1. בחר ביום 4 של התמיינות כנקודת התחלה ליצירת עמידות לאינסולין. אשר תחת מיקרוסקופ שכל התאים מציגים מעבר מורפולוגי מצורת ציר לעגול, כאשר הציטופלזמה של רוב התאים מלאה בטיפות שומן בעלות מקדם שבירה גבוה.
  2. החלף את המדיום במדיום השראה II המכיל 1 מיקרומול/ליטר דקסטריזציה והמשך את העיבוד במשך 48 שעות (טבלה 1). לאחר הליך זה, יש לשקול את מודל השומן העמיד לאינסולין שהוקם. יש לשים לב שתאים אלו אינם מציגים שינויים מורפולוגיים נוספים. השתמש בתאים אלה ישירות לבדיקות קליטה/צריכה של גלוקוז ולזיהוי חלבוני מסלול איתות אינסולין.
  3. קריטריונים להקמת מודל עמידות לאינסולין מוצלח: לאחר 48 שעות של טיפול בדקסמתזון, יש לאשר כי יכולת קליטת הגלוקוז ברוב התאים המעוררים ב-100 ננומטר אינסולין יורדת בכ-40%. כמו כן, יש לאשר ירידה מובהקת סטטיסטית (p < 0.05) ברמות הפוספורילציה של חלבוני מסלול איתות אינסולין מרכזיים.
    הערה: תהליך זה דורש תוספת רציפה של מדיום תחזוקת אינדוקציה II.

4. גילוי גלוקוז שאריתי בסופרנטנט התרבית

  1. אסוף את הסופרנטנטים של תרבית התאים בנקודת זמן מוגדרת. הסר תאים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-300 x גרם למשך 5 דקות.
  2. מדדו את ריכוזי הגלוקוז בסופרנטנטים באמצעות ערכת הבדיקה של גלוקוז אוקסידאז-פרוקסידאז (GOD-POD). חשב ריכוזים באמצעות הנוסחה:
    ריכוז הגלוקוז (mmol/L) = (A(דגימה) - A(ריק)) / (A(סטנדרטי) - A(ריק)) * C(סטנדרטי)
    צריכת גלוקוז (mmol/L) = ריכוז גלוקוז בתווך חופשי של תאים (mmol/L) - ריכוז גלוקוז בסופרנטנט התא (mmol/L)
    צריכת גלוקוז מנורמלת (mmol/mg חלבון) = צריכת גלוקוז גולמי (mmol/L) / ריכוז חלבון תאי כולל (mg/L)

5. כתם מערבי

  1. גירוי תאים בנקודת הזמן המיועדת עם 100 ננומטר אינסולין במדיום מלא למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את מסלול PI3K-AKT. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של בופר ליזיס תאים לכל צלחת תרבית תא בגודל 3.5 ס"מ. דגרו על קרח למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב-13,040 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. כמת את ריכוז החלבון באמצעות תמיסת ה-BCA.
  2. טעין דגימות על ג'ל SDS-PAGE של 8%. הרץ את הג'ל ב-80 וולט עד שהדגימות מגיעות לממשק הג'ל הערימה/הפרדה. הגדילו את המתח ל-120 וולט והריצו עד שרצועות הסימון ייפתרו לחלוטין. לבצע העברה בזרם קבוע של 200 mA למשך 2 שעות.
  3. דגרו את הממברנה בטמפרטורת החדר עם 5% חלב דל שומן או BSA למשך שעתיים לחסימה. שטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBST. לאחר מכן, דגרו עם נוגדן ראשוני בלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. נוגדנים ראשוניים (דילול): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-אקטין: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, פוספו-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
  4. שטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBST. לאחר מכן, דגרו עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP בטמפרטורת החדר למשך שעה. נוגדנים משניים (דילול): IgG-HRP אנטי-עכבר לעזים: 1:5000, IgG-HRP אנטי-ארנב של עזים: 1:5000.
  5. לזהות את האות באמצעות כימלומינסצנציה של ECL. המחישו ותקליטו את תוצאות הניסוי באמצעות מדמת כתמים מערביים.
  6. נתחו את ערכי הגווני האפור של הפסים המתקבלים באמצעות תוכנת ImageJ.

6. בדיקת צביעת קליטת גלוקוז

  1. הרעיבו את התאים בשתי נקודות הזמן שנקבעו בנפרד למשך 12 שעות באמצעות RPMI 1640 המכיל 1% FBS כדי לבטל הפרעות מגלוקוז בסיסי.
  2. לאחר 10 דקות גירוי עם אינסולין של 100 ננומטר, הוסף 1 מ"ל תמיסה 1x2-NBDG לכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, מוגנת מאור.
  3. לשטוף את התאים פעמיים-שלוש פעמים. הוסף 1 מ"ל של תמיסת צביעה מוכנה לשימוש של Hoechst לכל באר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 10 דקות. הוסף את תמיסת הצביעה באיטיות לאורך דופן הצד של כלי התרבית, תוך הימנעות ממגע ישיר עם שכבת התא כדי למנוע התנתקות תאים.
  4. שטפו את התאים פעמיים-שלוש, ואז הוסיפו PBS. לצלם תמונות פלואורסצנטיות של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך.
  5. בצע ניתוח כמותי של התמונות באמצעות תוכנת ImageJ. השתמש ב-ImageJ כדי להפריד כל ערוץ, ולבודד את אות קליטת הגלוקוז (הערוץ הירוק) מהאות הפלואורסצנציה הגרעינית (הערוץ הכחול).
  6. המור את כל התמונות לתמונות בגווני אפור של 8 ביט. החלו את אלגוריתם הסף האוטומטי ברירת המחדל כדי להגדיר אזורים של אות חיובי.
  7. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת בתוך אזורים ייעודיים אלו. נרמול אות הפלואורסצנציה של קליטת הגלוקוז על ידי חלוקת עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של הערוץ הירוק בעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת המתאימה של הערוץ הכחול.

7. צבע O אדום שמן

  1. מדלל את תמיסת המלאי Oil Red O במים ללא RNase ביחס של 3:2. סנן את התמיסה ברצף דרך נייר סינון ומסנן 0.22 מיקרון להכנת התמיסה הפועלת.
  2. שאופי את מדיום תרבית התאים ושוטפים בעדינות את התאים פעמיים עם PBS. הוסף 4% פאראפורמלדהיד לכל באר וקבע את התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. הוסף את הקיבע ושוטף את התאים במים מזוקקים כפול. הוסיפו 1 מ"ל תמיסת Oil Red O לכל באר. דגר את הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 25 דקות.
  4. לאחר הצביעה, שאיפת את תמיסת הצביעה. שטפו היטב את התאים במים מזוקקים כדי להסיר את הרקע והכתמים. הוסיפו 1 מ״ל מים מזוקקים כדי לכסות את התאים. לצלם מיד תמונות שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

8. בודיפי

  1. דילל את תמיסת הקת BODIPY במים סטריליים ביחס נפח של 1:200 להכנת תמיסת העבודה.
  2. שטוף את כיסויי התאים עם PBS סטרילי. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת פרפורמלדהיד 4% לכל כיסוי וקיבע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. שאפתי את הקיבוץ ושטפי 3 פעמים עם PBS. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של BODIPY לכל כיסוי תא. דגרו בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות.
  4. שטוף את הכיסוי 3 פעמים עם PBS. הוסף 30 מיקרוליטר של צבע DAPI לכל כיסוי. דגרו בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות כדי לסמן גרעיני תאים.
  5. שטוף את הכיסוי עוד שלוש פעמים עם PBS. המשך בהרכבה: הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה על סלייד מיקרוסקופ נקי. באמצעות מלקחיים, הפוך בעדינות את הכיסוי של התא (צד התא כלפי מטה) אל מדיום ההרכבה. תן למתקן להתייבש בחושך.
  6. צלם מיד תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. כל ניסוי כלל שלושה שכפולים ביולוגיים. נתח נתונים באמצעות תוכנת GraphPad Prism 10.0. הצג נתונים כמותיים, העומדים בקריטריונים להתפלגות נורמלית כסטיית תקן ממוצעת ± (ממוצע ± SD). לשתי קבוצות המקיימות נורמליות והומוגניות של שונות, יש להחיל את מבחן t הבלתי תלוי במדגמים. עבור מספר קבוצות, לבצע ANOVA חד-כיווני, p < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

10. בטיחות וסילוק פסולת

  1. טיפול ברקמות בעלי חיים
    1. בצע את כל ההליכים הכוללים תאים ראשוניים בארון בטיחות ביולוגית מחלקה II בתנאים סטריליים.
    2. סווג את כל פסולת רקמות החי, איברים לא בשימוש וצרכנים מזוהמים כפסולת ביולוגית מסוכנת. הניחו פסולת זו בשקיות מסוכנות ביולוגיות ייעודיות, מעובדות באמצעות אוטוקלב, ולבסוף מושלקות אותה.
  2. טיפול בדקסמתזון
    1. לבשו כפפות, מסכות רפואיות וחלוקי מעבדה בעת שקילת אבקת דקס. הכנת תמיסה מולכת בתוך מכסה אדים כימי.
    2. אסוף פסולת מזוהמת בדקס בנפרד והשליך אותה כפסולת כימית.
  3. טיפול בחומרים ביולוגיים מסוכנים
    1. חיטאו היטב את משטחי העבודה ואת פנים ארונות הבטיחות הביולוגית עם 70% אתנול לפני שניתן להתחיל בהליכים ניסיוניים.
    2. ודאו שכל הפסולת הנוזלית שנוצרת מתרבות תאים עוברת אוטוקלבה כדי להפוך אותה ללא זיהום לפני ההשלכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי SVF שבודדו מ-iWAT של עכברי C57BL/6J הראו השעיה מנוקדת בעת הזרעה הראשונית בצלחות התרבית. כ-40% מהתאים השלימו את ההיצמדות הראשונית לאחר 18 שעות של זריעה; עד היום החמישי לאחר הזריעה, התאים התפזרו במלואם, כאשר המפגש הגיע ל-95% (איור 1A,B). כאשר התאים הגיעו למפגש והציגו סידור דמוי מערבולת אופייני, תווך ההתמיינות הוחלף. ביום הרביעי של ההשראה, נראו טיפות שומן רבקות רבות בתוך התאים, כאשר שומנים בוגרים מהוויםכשליש מהאוכלוסייה (איור

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים נרחבים מראים שמודלים מבוססי תאי SVF מציעים ערך ייחודי בסימולציה של תכונות פתולוגיות של רקמת שומן. עם זאת, מחזור הבנייה הארוך של מודלים אלו, שדורש בדרך כלל כ-14 ימים לבידוד רקמות, תרבית ראשונית, התמיינות מושרה וטיפול בדקסטריט, מציב אתגרים להמשכיות ניסויית וליציבות מצב תאי. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, מחקר זה אימץ ואופטימיזציה של תהליך ניסויי שהתמקד במדדים המרכזיים הבאים: (1) בחירת עכברים צעירים בריאים בני 3-4 שבועות במשקל כ-10 גרם כמקור לתאי SVF לקבלת פרה-אדיפוציטים פעילים מאוד. (2)...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים בעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82260177) ומהמעבדה הממלכתית המרכזית לפתוגנזה, מניעה וטיפול במחלות בשכיחות גבוהה במרכז אסיה (SKL-HIDCA-2023-20). סוכנות המימון לא השפיעה על עיצוב, יישום או פרשנות המחקר. סוכנות המימון לא השתתפה בכתיבה או בהגשת כתב היד לפרסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 & mu; מסנן mביושארפBSF-XS-0232-01
2-NBDGביוטייםS0561M
3-איזובוטיל-1-מתילקסנתיןסיגמא15879
4% פוליפורמלדהידביושארפBL1278A
70 & mu; מסננת תא MביושארפBS-70-CS
אנטי-AKTפרויטנטק10175
אנטי-C/EBPαאבקלוןAB40764
אנטי-FABP4טכנולוגיית איתות סלולרי שנות ה-2120
אנטי-pAKT (Ser473)פרויטנטק28731
אנטי-PI3K ביולוגיה10657R
אנטי-pPI3K (עמ' 110)ביולוגיה6417R
אנטי-&בטא;-אקטיןפרויטנטק60008
ערכת בדיקת חלבון BCAתרמו פישר23225
בודיפי 493/503InvitrogenD3922
BSA סיגמאA7030
פרוסות טיפוס תאים Biosharp ביושארפBS-14-RC
צלחת תרבית תאים, 100 מ"מ על 20 מ"מקורנינג430167
צלחת תרבית תאים, 35 מ"מ על 10 מ"מקורנינג430165
פתרון DAPIסולרביולוגיה28718-90-3
דקסמתזוןסיגמאD2915
DMEM/F-12גיבקוC11330500BT
דולבקו' s PBSציטיבהSH30264.02
צינור אפנדורףקורנינגMCT-175-C 
FBSלייף-איי-לאבAC03L0555
מיקרוסקופ פלואורסצנציהלייקהDMi8
גלוקוז אוקסידאז-פרוקסידאזנאנג'ינג ג'יאנצ'נגF006-1-1
IgG-HRP נגד עכבר עזיםג'ונגשאן ג'ינג'יאו בבייג'ינגZB-2305
IgG-HRP נגד עזיםג'ונגשאן ג'ינג'יאו בבייג'ינגZB-2301
פריזמת GraphPadגרסה 10.0.0/
הפסBioFroxx1112GR025
הוצ'סטביושארפBL803A
ImageJגרסה 1.54p/
אינסוליןסולרביולוגיה18040
מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזרNikon Ti-E
הרכבה של אנטי-דפיידינג בינוניסולרביולוגיהS2100
תמיסת צביעת שמן אדום OסיגמאO0625-25G
פניצילין-סטרפטומיציןהייקלוןSV30010
RIPA Bufferתרמו פישר89901
רוזיגליטאזוןסיגמאR2408
RPMI 1640VivaCellC3010-0500
אבקת חלב רזהBioFroxx1132GR500
בופר TBSסולרביולוגיהT1060
קולגנאז סוג IIסיגמאC6885

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PI3K AKT

מאמרים קשורים