מאמר שיטה

פלטפורמה חדשנית למתיחות והדמיה תאית חובנית

408 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים מכשיר חדשני שמיישם גלי עיוות איזוטרופיים וחד-ציריים על תאים, תוך תמיכה בתרבות על תת-קרקעיות עם קשיחות מכווננת ומטריצות חלבון מותאמת אישית. פלטפורמה פשוטה וחסכונית זו מאפשרת לחוקרים לחקור כיצד רמזים מכניים מווסתים את תפקוד התאים הן במחקרים בסיסיים והן בהקשרים רלוונטיים למחלות.

תקציר

תאים מגיבים לרמזים מכניים מהסביבה שלהם, כגון שינויים בנוקשות המטריקס החוץ-תאית (ECM) ובמתח מחזורי, שמווסתים תהליכים תאיים כולל קביעת גורל התא, תקשורת בין-תאית והתפתחות. שינויים בכוחות אלו תורמים או מניעים התקדמות מחלות במצבים כמו אסתמה, יתר לחץ דם וסרטן. בעוד שמכשירי מתיחה קיימים במבחנה יכולים להטיל מתחים חד-ציריים או איזוטרופיים, הם לעיתים קרובות משתמשים בנוקשות לא פיזיולוגית, מגבילים הדמיה חיה, או אינם מצליחים להגיע לעוצמות עיוות גבוהות הרלוונטיות לתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כאן אנו מציגים מכשיר מתיחה קומפקטי תואם מיקרוסקופ, המפעיל מתח איזוטרופי או חד-צירי מבוקר על תאים דביקים על צלחות תרבית אלסטומרית. הצלחות הללו כוללות מודולוס יאנג שניתן לכוונן והן תואמות למגוון ציפויי חלבון מטריצה להידבקות תאים, מה שמאפשרות מודולציה עצמאית של קשיחות הסובסטרט והרכב ה-ECM. חשוב לציין כי קלות התפעול של המכשיר מתאפשרת בזכות העיצוב המונע על ידי מנוע סטפר, התומך ביצירת צורות גל מחזוריות מתוכנתות. אנו מדגימים את יכולת המכשיר על ידי כימות דינמיקת הסידן התוך-תאית וכוחות האחיזה בתאי שריר חלק ראשוניים בדרכי הנשימה האנושיות תחת מתיחה מכנית. פלטפורמה זו מספקת כלי רב-שימושי לחקירת השפעת רמזים מכניים על תפקוד התאים בהקשרים בריאים ורלוונטיים למחלות.

מבוא

תאים חווים כוחות מכניים מהסביבה שממלאים תפקיד קריטי בוויסות היבטים רבים של תפקוד התאים, כולל קביעת גורל התא 1,2, התקשורת הבין-תאית 3,4, וצמיחה בריאה 2,5. בנוסף, שינויים בכוחות המכניים הללו עלולים להוביל להתקדמות מחלה מוגברת ולהופעת המחלה, כולל שיפוץ מטריצת חוץ-תאית (ECM)6 וצמיחת הגידול 7,8,9,10. תאים יכולים לחוש ולהגיב לרמזים מכניים אלו, הכוללים שינויים בנוקשות של ECM4, וכן במאמץ מחזורי באיברים כמו הלב, הריאות והשרירים11,12. מחקרים במבחנה הראו כי קשיחות והרכב ECM יכולים להשפיע על קשיחות שלד התא, הן במנוחה והן לאחר חשיפה לאגוניסטים מתכווצים13. מחקרים רבים במבחנה ובשטח בחנו כיצד זנים חולפים, סטטיים ומחזוריים משפיעים על תאים ורקמות, והראו כי התגובות משתנות בהתאם לסוג העיוות, קצב ומשרעת14. לדוגמה, מחקרים עדכניים מצאו שמתיחה זמנית מפחיתה את הקשיחות של התאים הדבוקים ביחס למאמץ המופעל, כאשר עלייה מתמשכת במאמץ מובילה לעלייה מהירה ראשונית בנוקשות, ואחריה הרפיה הדרגתית15. בנוסף, איתות סידן, הרגולטור המולקולרי הראשי ליצירת כוח, מושפע מכוחות מתיחה וכוחות מכניים נוספים 4,16,17,18,19,20. חקר האופן שבו נוקשות ומאמץ משפיעים על מסלולים מכנוביולוגיים דורש ויסות של שני הגורמים תוך ניטור תגובות תאיות. לכן, פיתחנו מתיחה תא חדשה תואמת מיקרוסקופ, המסוגלת לגרום למתיחה איזוטרופית או חד-צירית, עם שליטה עצמאית על קשיחות הסובסטרט, ציפוי חלבוני מטריצה, ומגוון גלים מתוכנתים.

בעבר, חוקרים פיתחו מכשירים דומים להטיל תנועות ספציפיות ומתיחות מכניות על תרביות תאים ורקמות21,22. המקרה הפשוט ביותר, תנועה חד-צירית, היא מתיחה מכנית המוטלת על ממד יחיד. לדוגמה, פותחו מכשירים מסוימים להטיל מתיחה ומתח מכנית על רצועות רקמה23 וסיבי קולגן24, או ליישר את כיוון התאים ולעורר נדידת תאים25. מתיחה איזוטרופית מתייחסת לסוג של מתיחה שבה כוח שווה מופעל על ג'ל או תת-קרקע מכל הכיוונים, מה שמוביל למאמץ אחיד על פני החומר. מתיחה זו מדמה את התפלגות הכוח השווה שהתאים חווים בסביבות פיזיולוגיות מסוימות, כמו בנאדיות הריאות, שם התאים חשופים להתרחבות והתכווצות רדיאלית במהלך תהליך הנשימה26,27.

למכשירי אלונקה קיימים יש מספר מגבלות שמגבילות את השימוש בהם במחקרים הקשורים למכנוביולוגיה. עיצובים רבים משתמשים בערכי קשיחות של המצע העולים על הטווח הפיזיולוגי הטיפוסי כדי לעמוד במאמץ מכני ולתמוך במשקל מדיום תרבית התאים28. עם זאת, השימוש בנוקשות לא פיזיולוגית כזו עשוי גם להשפיע על התנהגות התאים, מה שעלול להגביל את הרלוונטיות של המודל לסביבות רקמות טבעיות. בנוסף, חלק מעיצובי האלונקה חוסמים את מסלול המטרה או האור, ומונעים דימות, בעוד אחרים משתמשים בממברנות עבות מדי לתצפית ברורה28. גם כאשר מתיחות תואמות למיקרוסקופים ומשתמשות במצע דק, בעיות כמו שקיעת ממברנה ואובדן מיקוד הן נפוצות. פלטפורמות מסחריות כמו Flexcell משתמשות בעיוות מבוסס ואקום כדי למתוח ממברנות גמישות. למרות שגישה זו יכולה ליצור שדות עיוות יציבים והומוגניים, היא אינה מותאמת למיקרוסקופיה של תאים חיים, ותצורות תואמות למיקרוסקופ דורשות אביזרים יקרים נוספים. בנוסף, פלטפורמות אלו יכולות להגיע למתח מקסימלי של 21.8% בלבד, בעוד שהשראות עמוקות יכולות לייצר זנים העולים על 30%, כאשר זנים גבוהים אף יותר נצפו במחלות כמו אסתמה ו-COPD31.

לכן, עיצבנו מכשיר מתיחה חדש לתא שמאפשר שליטה מדויקת בחומר על קשיחות הסובסטרט והרכב ה-ECM, תוך מתן אפשרות ליישום מתחים איזוטרופיים וחד-ציריים משתנים על תאים דביקים. פלטפורמה זו מתאימה במיוחד לחוקרים החוקרים שאלות מכנוביולוגיות הזקוקות להדמיה חיה במהלך גירוי מכני עם סובסטרטים בעלי נוקשות פיזיולוגית רלוונטית. המכשיר משתמש בגישה מונעת מכנית בהשראת הגיאומטריה של כדור הוברמן דו-ממדי, המתרחב ומתכווץ דרך מפרקים דמויי מספריים (איור 1, איור משלים 1). מנוע צעד יחיד מניע 16 זרועות מסודרות רדיאלית דרך מנגנון קישור, ויוצר התרחבות וכיווץ מתואמות של שמונה עמודי חיבור. תצורה זו יוצרת עיוות הומוגני במישור על ידי החלת תזוזה רדיאלית שווה על כל העמודים בו-זמנית. העיצוב הייחודי וטביעת הרגל הקומפקטית של המכשיר מאפשרים הדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך במהלך מתיחה איזוטרופית וחד-צירית במישור, בעלות קטנה בהרבה מהחלופות המסחריות. מנוע הצעד הליניארי נשלט באמצעות קוד Arduino מותאם אישית, המאפשר צורות גל מחזוריות מתוכנתות עם מחזורים ומשרעים מתכווננים. במחקר זה אנו מראים שהמכשיר מספק זנים מדויקים וניתנים לשחזור הנעים בין פחות מ-1% ל-15%, עם קיבולת גיאומטרית העולה על 200%. בנוסף, אנו מכמתים את השפעות המתיחה המכנית על דינמיקת הסידן התוך-תאית וכוחות המשיכה התאית של תאי השריר החלק הראשוניים בדרכי הנשימה האנושיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תאי השריר החלק הראשוניים בדרכי הנשימה האנושיים (ASMCs) ששימשו במחקר זה התקבלו מ-ATCC (וירג'יניה), ומידע על תורמים הוסר בהתאם להנחיות NIH. מחקר זה אושר על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת נורת'איסטרן לפני הניסוי.

הערה: להוראות לגבי ייצור המכשיר וכן מממדי המכשיר, אנא עיינו בקובץ ה-CAD הזמין במאגר שלנו ב-GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. עיצוב תבנית מודפסת בתלת-ממד

  1. ממדים איזוטרופיים של תבנית
    1. הקוטר החיצוני של התבנית הוא 37 מ"מ.
    2. הגובה החיצוני של התבנית הוא 4.1 מ"מ.
    3. עובי הקיר החיצוני הוא 2.1 מ"מ.
    4. עובי הבסיס של התבנית הוא 2 מ"מ.
    5. חורי החיבור ממוקמים במרחק של 2 מ"מ מהקצה.
    6. שטח באר תרבית התאים הפנימית הוא בקוטר 20 מ"מ ועומקו 1.9 מ"מ.
      הערה: עובש ה-PDMS המושלם צריך להיות בעובי שטח תרבית תאים של 200 מיקרון.
  2. ממדי תבנית חד-צירית
    1. המידות החיצוניות של התבנית הן 41 מ"מ x 12 מ"מ x 4 מ"מ (אורך x רוחב x גובה).
    2. חורי החיבור הם 3 מ"מ מהקצה הרוחבי ו-4 מ"מ מהקצה האורך, עם עומק עמוד של 1 מ"מ.
    3. עובי הקיר החיצוני הוא 1.5 מ"מ בקצה הרוחב ו-2 מ"מ בקצה האורך.
    4. מידות באר תרבית התאים הפנימית הן 26 מ"מ x 5.5 מ"מ x 1 מ"מ (אורך x רוחב x גובה).
    5. עובי הבסיס הוא 2 מ"מ.
      הערה: התבניות עוצבו ב-SolidWorks, הודפסו בתלת-ממד באמצעות מערכת שרף אפור נוזלי של FormLabs, ויוצרו במרחב היצרנים של אוניברסיטת נורת'איסטרן.
  3. הוראות לשימוש הראשוני בלבד בתבנית
    1. לשייף את הקצוות המחוספסים של הדפס התבנית.
    2. צפה את התבנית השלילית בלק ציפורניים שקוף כדי להקל על הסרת עובש ה-PDMS לאחר הייבוש. תן לעובש להתייבש באוויר במשך 24 שעות.

2. ייצור ג'לים אלסטיים שקופים אופטית עם קשיחות תת-קרקעית ניתנת לכיוונון לתרבות תאים

הערה: לבש ציוד מגן מתאים (כפפות, חלוק מעבדה, מגן עיניים) בעת טיפול ב-PDMS ו-NuSil.

  1. הוסף בסיס סילגארד 184 וחומר ייבוש ביחס של 10:1 למשקל לתוך כלי פלסטיק.
  2. ערבב בעוצמה עם מדכא לשון (או כלי דומה) למשך 2-3 דקות.
  3. להסיר גזים מהתערובת למשך שעה.
  4. שפוך את תערובת ה-PDMS לתבנית השלילית המותאמת אישית (איור 2A,B).
    1. הוסיפו 1.3 גרם לתבנית האיזוטרופית.
    2. הוסיפו 0.5 גרם לתבנית חד-צירית.
      הערה: יש להיזהר לפזר את הג'ל באופן שווה על פני התבנית.
  5. להסיר גזים מהעובש במשך שעה.
  6. תנו לג'ל בתבנית לשקוע על משטח שטוח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  7. התייבש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  8. ערבב את חלקי A ו-B של NuSil Gel-8100 בפרופורציות שוות (1:1) למשך 15 דקות.
    1. מערבבים עם קרוסלינקר סילגארד 184 ב-0.36% מהנפח הכולל ליצירת מצע עם קשיחות של 13 קילופסקל 32.
    2. אין להוסיף קרוסלינקר כדי ליצור מצע עם קשיחות של 0.3 קילופסקל.
  9. דה-גז מהתערובת למשך 30 דקות.
  10. הסר בזהירות את הג'ל של PDMS מהתבנית המותאמת אישית. הנח את הג'ל על כיסוי 40 מ"מ.
    הערה: היזהרו לא לקרוע את הג'לים כי הם עדינים.
  11. שפוך את תערובת NuSil על האזור השלילי של ג'ל PDMS.
    1. ג'ל איזוטרופי: 100 מיקרוליטר.
    2. ג'ל חד-צירי: 50 מיקרוליטר.
  12. ציפוי את ג'לי ה-PDMS המתאימים בתערובת NuSil באמצעות ציפוי ספין ל-50 שניות בעובי 7x g כדי להגיע לעובי מצע אחיד של 100 מיקרון.
  13. תן לג'ל לשקוע על משטח שטוח בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפני שהוא מתייבש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    הערה: אנא הקפידו לוודא שכל שלבי הריפוי מתבצעים על משטח ישר. ג'ל לא אחיד לא יאפשר לאזור המעניין המלא להישאר במישור ההדמיה של המיקרוסקופ. אם ההדמיה מגלה שונות בפוקוס בשדה הראייה, ייתכן שהג'ל התייבש על משטח לא ישר ויש להכין אותו מחדש.
  14. אחסנו את כלי התרבית שהושלמו בצלחות פטרי מכוסות עד לשימוש (איור 2D-E).

3. ציפוי חלבון מטריצי

  1. הוסף 500 מיקרוליטר פולי-אל-ליזין (PLL, 500 מיקרוגרם/מ"ל) לכל מצע.
  2. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  3. מצעי שטיפה 3 × עם 1 מ"ל PBS, ואחריהם 3 × עם 1 מ"ל של בופר HEPES 10 מ"מ (pH 8.0).
  4. הוסף 500 מיקרוליטר mPEG-SVA (50 mg/mL) לכל מצע.
  5. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  6. שטוף את המצע 3 × עם 1 מ"ל PBS.
  7. החליפו PBS ב-500 מיקרוליטר PLPP (14.5 מ"ג/מ"ל).
  8. באמצעות מערכת המיקרודפוסינג PRIMO עם תוכנת לאונרדו, הקרנו את הדפוס המוגדר מראש על פני השטח של המצע באמצעות אור UV למשך 30 שניות.
  9. שטוף את המצע 3 × עם 1 מ"ל PBS והנח תחת UV למשך 15 דקות לחיטוי.
  10. הוסף 500 מיקרוליטר של ג'לטין מצומד פלואורסאין 0.1% לכל מצב.
  11. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  12. שטוף 3 × עם 1 מ"ל של PBS.
    הערה: כדי להמחיש דפוסים, דגרו עם ג'לטין מצמיד פלואורסאין של 0.1% למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  13. המשך עם ההדמיה.

4. תרבית תאי שריר חלק בדרכי הנשימה האנושיים בכלים אלסטיים

הערה: יש לבצע את כל הליכי תרבית התאים במכסה ביו-בטיחותי באמצעות טכניקה אספטית סטנדרטית.

  1. קבלו תאי שריר חלק ראשוניים בדרכי הנשימה (ASMCs) מ-ATCC (וירג'יניה) וודאו שמידע על תורמים אינו מזוהה בהתאם להנחיות NIH. אשר את אישור ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית לפני הניסוי.
  2. השתמש בתאים משלושה תורמים אנושיים בריאים ממינים וגילאים שונים ללא היסטוריה של אסתמה/מחלה. דוגמה: אישה אחת (בת 18) ושני גברים (בגילאי 34 ו-59).
  3. תרבית תאים בתנאים סטנדרטיים (37°C, 5% CO ₂) ומשתמשים בתאים עד מעבר 6 לכל הניסויים.
  4. גדל תאים במדיום הגידול המלא הבא:
    1. DMEM/F12 (500 מ"ל)
    2. סרום בקר עוברי 10% (FBS) (50 מ"ל)
    3. 1× פניצילין/סטרפטומיצין (5 מ"ל)
    4. 1× חומצות אמינו לא חיוניות MEM (5 מ"ל)
    5. אמפוטריצין B (0.5 מ"ל)
  5. החלף תאים למדיום ללא סרום לפחות 24 שעות לפני המדידות. הכינו מדיום ללא סרום עם:
    1. ה-F-12 הבינוני של Ham (500 מ"ל)
    2. 1 × פניצילין/סטרפטומיצין (5 מ"ל)
    3. אמפוטריצין B (50 מיקרוגרם/ליטר)
    4. 1× חומצות אמינו לא חיוניות MEM (5 מ"ל)
  6. לחטא צלחות תרביות תאים נמתחות ב-UV למשך 15 דקות.
  7. דגרו כלים מעוקרים עם ג'לטין של 0.1% למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני הזריעה (איור 2F).
    1. למצעי דפוס:
      1. תאי זרעים בתרבות תאים אלסטיים מתמלאים בצפיפות של10.4 תאים לס"מ רבוע.
      2. דגרו במדיום סרום של 10% למשך 10 דקות כדי לעודד היצמדות לאזורים עם דפוס.
      3. שטוף בארות עם PBS כדי להסיר תאים לא מחוברים.
      4. מלא בארות ב-10% סרום בינוני ודגר במשך 24 שעות.
      5. החלף במדיום ללא סרום ודוגר במשך 24 שעות לפני המדידות.
    2. למצע ללא דפוס:
      1. תאי זרע בצפיפות הרצויה: 102 תאים לס"מ 2 עבור תאים מבודדים. 103 תאים/סנטימטר 2 לתאים דלילים. 104תאים/סנטימטר 2 לתאים מתאחדים.
      2. דגרו במדיום סרום של 10% למשך 24 שעות.
      3. החלף במדיום ללא סרום ודוגר במשך 24 שעות לפני המדידות.

5. הדמיה וניתוח סידן פלואורסצנטי

  1. ASMC שמרעיבים לדרכי האוויר למשך 24 שעות.
  2. הכינו צבע FLIPRCa 2+ 6 לפי הוראות היצרן.
  3. ערבב צבע FLIPR Ca2+ 6 עם מדיום ללא סרום ביחס של 1:1.
  4. דגרו תאים עם תמיסת FLIPR Ca ² ⁺ 6 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO ₂ למשך 2 שעות.

6. הגדרת הדמיה

  1. השתמש במיקרוסקופ הפוך של Leica DMi8 המצויד ב:
    1. לייקה DFC6000 מצלמה
    2. מנוע לייקה LED8 קל
    3. מטרה יבשה 5×/0.12
  2. כוון את הגירור ל-480/40 ננומטר ואת הפליטה ל-527/50 ננומטר.
  3. רכוש תמונות 16 ביט בקצב פריימים של 2 הרץ במהלך ניסויי מתיחה.

7. ניתוח נתונים

  1. ייבא רצפי תמונות לפיג'י (ImageJ) 33.
  2. הגדר ידנית אזורי עניין (ROIs) בציטופלזמה של כל תא.
  3. הוציא את ערכי העוצמה הממוצעים בגווני אפור עבור כל ROI לאורך זמן.
  4. עיבוד נתוני עוצמת פלואורסצנציה באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית.
    הערה: עוצמת הפלואורסצנציה פרופורציונלית לציטוזוליק [Ca2+].

8. מדידות וניתוח כוח אחיזה

הערה: כל הקודים, כולל אלו לניתוח תמונה, מיקרוסקופיית כוח אחיזה ובקרת מוטור, זמינים במאגר GitHub שלנו: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. ציפו את מצעי הג'ל PDMS-NuSil בשכבת חרוזי פלואורסצנטיות לשמש כסמנים פידוציאליים למיקרוסקופיית כוח אחיזה.
  2. הכינו תמיסה של 0.025% של מיקרוספירות פלואורסצנטיות אדומות בקוטר 1 מיקרון בעיבוד קרבוקסיליאט ב-HBSS על ידי דילול ליחס 1:4000.
  3. Vortex, פתרון החרוזים ל-10 שניות.
  4. הוסף את תמיסת החרוזים לג'ל.
    1. 880 מיקרוליטר לג'ל איזוטרופי.
    2. 420 מיקרוליטר לג'ל חד-צירי.
  5. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה כדי לאפשר לחרוזים להידבק.
  6. אחרי שעה, הסר בזהירות את התמיסה.
    הערה: שפכו בעדינות את תמיסת החרוזים על ג'לים רכים. הסרה לא נכונה מונעת חלוקה תקינה של החרוזים.
  7. נגחו בעדינות כל תמיסה שנותרה עם מקלון אוזניים או קימוויפ.
  8. דמיינו את החרוזים עם מיקרוסקופ Leica DMi8 המצויד במטרת יבשה 10x/0.32.
  9. לצלם תמונות במצב לפני המתיחה ובאופן רציף לאורך פרוטוקול המתיחה.
    הערה: יש לבצע את כל ההדמיה במרכז המצע, שם אחידות העיוות היא הגבוהה ביותר. אם צריך, למקד מחדש את המיקרוסקופ במצב המתוח לפני צילום התמונות.
  10. ניתחו את התמונות באמצעות קוד MATLAB מותאם אישית המבוסס על מיקרוסקופיית כוח גרירה פורייה לחישוב וקטורי הזזה ושדות עיוות מישוריים מתאימים 34.
  11. ייצג נתונים כממוצע של N ניסויים.

9. כיול מכשיר המתיחה של התא

  1. הוסף 500 מיקרו-ליטר H₂o לבאר כדי לדמות את משקל מדיום תרבית התאים ולשמור על דפוס החלבון לח.
  2. לפרוטוקול הנוגע ליצירת דפוסי חלבון ספציפיים, ראו סעיף 3 שכותרתו "ציפוי חלבון מטריקסי".
  3. דפוסי פלואורסצנטי תמונה כל 400 מיקרון של תזוזה מנועית, שמגדילים עד למקסימום של 2800 מיקרון, ואז חוזרים לאפס בקצב הפוך של 400 מיקרון.
  4. אפיין את הקשר בין הזזה ליניארית ממנוע הצעד לעיוות איזוטרופי של צלחת תרבית התאים המתמתחת בקנה מידה מקרוסקופי ואזורי, על ידי מדידת השינויים באזור ובאקסצנטריות של אותיות עם תבנית חלבון פלואורסצנטי הכותבות "BREATHE" על הסובסטרט האלסטי במהלך המתיחה. השתמש בתיבת גבולות מלבנית הכוללת את כל האותיות כדי לחשב את השטח והאקסצנטריות של כל המילה.
  5. החלו סגמנטציה של תמונה ב-MATLAB כדי לכמת פרמטרים אלו עבור כל אות בנפרד.
  6. הגדר אפס תזוזה לפי הממדים הלא מתוחים של צלחת תרבית התא.
  7. חזרו על כל ניסוי על שניים עד שלושה בארות תרביות תאים נמתחות שהוכנו באופן עצמאי כדי להבטיח שחזוריות.

10. הצגת נתונים ובדיקות סטטיסטיות

  1. בניסויי כיול אלונקה, הגדר ניסויים כמספר המחזורים.
  2. הצג כל ניסוי בנפרד במקום לשלב אותם לעקומה אחת כדי להדגים חזרתיות של המערכת.
  3. ציין שורות שגיאה כסטיית תקן.
  4. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני כדי לבדוק הבדלים משמעותיים במאגרי נתונים עם שלוש קבוצות או יותר המושפעות מגורם עצמאי אחד.
  5. השתמשו ב-ANOVA דו-כיווניים ואחריהם השוואות זוגיות לאחר מכן כדי לבדוק הבדלים משמעותיים במאגרי נתונים המושפעים משני גורמים בלתי תלויים.
  6. יישם את מבחן ה-t להשוואות זוגיות כאשר הנתונים מחולקים כרגיל.
  7. יישם את מבחן סכום הדירוג של מאן-וויטני כדי להשוות ערכי חציון כאשר הנתונים אינם מחולקים כרגיל.
  8. דווח על הבדיקות הספציפיות ששימשו, מספר הדגימות, וערכי ה-P המתאימים, יחד עם התוצאות.
  9. השתמשו בסף ערך P של 0.05 כדי לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית בין מערכי נתונים.
  10. בצע בדיקות סטטיסטיות ב-SigmaStat.
  11. דמויות עלילה ב-GraphPad Prism וב-MATLAB.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מתיחת התא גורמת לשינויים מקרוסקופיים בשטח המשקפים עיוותים מקומיים. כדי להעריך התנהגות איזוטרופית, מדדנו את השינויים בשטח של דפוס חלבון ג'לטין פלואורסצנטי היוצר את המילה "BREATHE" על באר תרבית תאים נמתחת, יחד עם אותיותיה הבודדות, על מצע איזוטרופי. התוצאות שלנו הראו שגם המילה וגם האותיות הבודדות הראו שינויים שווים בשטח (איור 3A,B). באיור 3B, עיגולים כחולים ופסי שגיאה מייצגים את הממוצע והסטיית התקן של שטחי שבע האות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה אנו מתארים את העיצוב, הפיתוח, האימות והיישום של מתיחה תאית חדשה תואמת מיקרוסקופ שיכולה לחקות מתחים איזוטרופיים וחד-ציריים תוך כדי הדמיית תאים חיים בו-זמנית. מכשיר זה קומפקטי ויכול להתאים לשלב מיקרוסקופ Leica DMi8, ומגביל את כל החלקים הנעים למישור אחד כדי לאפשר הדמיה חיה תוך שמירה על המיקוד על המצע והתאים שמתחת. זה נעשה באמצעות זרועות בזווית בהשראת הגיאומטריה של כדור הוברמן דו-ממדי. תצורה דו-ממדית זו מגבילה את התנועה למישור יחיד, חיונית לשמירה על מיקוד מיקרוסקופ במהלך הדמיה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

המחברים מודים למר נואה ג'וזף על עזרתו ביצירת התבניות. המחברים מודים להייטור מוראטו ולגלן ת'אייר במתקן המכשירים המדעיים של אוניברסיטת בוסטון על עזרתם בעיבוד המכשיר. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקריירה #2047207 של הקרן הלאומית למדע (NSF) שהוענק להאריקרישנן פארמסווארן. ה.פ. יזם את המחקר. S.E.S. ו-S.R.P. פיתחו את העיצוב הכולל של המכשיר, ו-S.E.S. ו-H.P. תכננו את הניסויים האיזוטרופיים. S.E.S ערכה את ניסויי התבניות האיזוטרופיות, ניתחה את נתוני הניסוי, ופרשת את התוצאות יחד עם H.P. V.C. תכננה את התבניות החד-ציריות, אופטימציה להכנת הג'ל והחרוזים. B.M.G ביצעה את ניסויי הג'ל החד-צירי, ניתחה את נתוני הניסוי ופירשה את התוצאות יחד עם H.P. ו-V.C. S.E.S. ו-B.M.G הכינו את הנתונים. B.M.G, S.E.S, V.C. ו-H.P תרמו לניסוח ועריכה של כתב היד. H.P אישר את הגרסה הסופית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  דולבקו' s Modified Eagle' s בינונית/F12פישר סיינטיפיק12634010500 מ"ל 
(4-בנזואילבנזיל) טרימתילמוניום כלוריד (PLPP)Alvé אולהלא זמין14.5 מ"ג/מ"ל
0.1% פלואורסצאין ג'לטין מצומד  InvitrogenG13187
תמיסת ג'לטין 0.1%סיגמא-אלדריץ'ES-006500 מ"ל 
1 & mu; מיקרוספירות פלואורסצנטיות אדומות בקוטר mפלווספירותF8816
1× תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEMסיגמא-אלדריץ'M7145100 מ"ל
1× פניצילין/סטרפטומיציןפישר סיינטיפיק15-140-122100 מ"ל
10% סרום בקר עובריתרמו-מדעיA5256701500 מ"ל 
צינור 15 מ"לפישר סיינטיפיק14-959-53A
פעם אחת גלוטמין פישר סיינטיפיקMT10010CM
תוסף גדילה של אינסולין-טרנספרין-סלניוםקורנינג לייף סיינס25-800-CR
אמפוטריצין Bסיגמא-אלדריץ'A294225 & mu; ג/ליטר
כדורי מיסביםמקמאסטר-קאר לא זמין
סידן כלוריד דיהידרטסיגמא-אלדריץ'223506
רכבת קרונותמקמאסטר-קאר לא זמין
FLIPR Ca2+ 6מכשירים מולקולרייםR8190
פריזמת GraphPadדוטמטיקסלא זמין
חמ' F-12 בינונית סיגמא-אלדריץ'N8641500 מ"ל 
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס תרמו-מדעי14025092500 מ"ל 
HEPES buffer תרמו-מדעי15630080100 מ"ל
ליאונרדו סופטורAlvé אולהלא זמין
מטלאבמת'וורקסלא זמין
מתוקסי פוליאתילן גליקול & ndash; סוקינימידיל ולרייט (mPEG-SVA)לייסן ביו בע"מלא זמין50 מ"ג/מ"ל
Nusil Gel-8100Nusil לא זמין
פטרי דספסתרמו-מדעי26399190 מ"מ 
מלח ממוגן בפוספט סיגמא-אלדריץ'10010023500 מ"ל 
פולי-אל-ליזין (PLL)סיגמא-אלדריץ'P8920500μ g/mL
תאי שריר חלק ראשוניים בדרכי הנשימה האנושיות ATCCPCS-130-011
מודול אופטי PRIMO  Alvé אולהלא זמין
ברגיםמקמאסטר-קאר לא זמין
SigmaStatתוכנת Systatלא זמין
ספין קואטרלורלדגם WS-650MZ-23NPPB
רכיבי חיבור לאלונקה ולבמה מתקן המכשירים המדעיים של אוניברסיטת בוסטוןלא זמיןפלדת אל-חלד
ערכת אלסטומר בסיסית של סילגארד 184 וסוכן ריפוידאוH047J8Q026
בקבוק תרבית רקמה T-25 - מכסה אוורור, סטריליסלטריט229331
מדכא לשון תרמו-מדעי22-363-154

מקורות

  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים