מחקר זה חקר את השפעת אלקטרואקופונקטורה (EA) על תפקוד לקוי של כלי הדם הנגרמת ממלח גבוה. EA הפכה נזק כלי דם ודיסביוזיס במעי, ייתכן על ידי ויסות מיקרובים מסוימים במעי.
מאמר מחקר
* These authors contributed equally
מחקר זה חקר את השפעת אלקטרואקופונקטורה (EA) על תפקוד לקוי של כלי הדם הנגרמת ממלח גבוה. EA הפכה נזק כלי דם ודיסביוזיס במעי, ייתכן על ידי ויסות מיקרובים מסוימים במעי.
מחקר זה שואף לחקור את הפוטנציאל הטיפולי והמנגנונים של אלקטרואקפונקטורה (EA) בהקלה על תפקוד לקוי של כלי הדם הנגרם מתזונות עתירות מלח, עם דגש על ויסות מיקרוביוטה במעי. חילקנו באקראי 21 חולדות לקבוצות ביקורת נורמלית, מודל עם מלח גבוה וקבוצות התערבות EA (n = 7 לכל קבוצה). מודל "תסמונת סטאזיס דם עתיר מלח" בעכברי ויסטאר הושר על ידי הזרמת דם תוך-קיבתית של 12% NaCl. הטיפולים בוצעו בין 17:00 ל-19:00 לפי שעון בייג'ינג: העכברים הוגבלו בבד רך, ואחר כך בוצעו גירוי EA של 20 דקות ב-BL23 ו-KI3. לאחר הניסוי, נאספו דגימות דם, כלי דם וצואה של חולדות. השפעות כלי הדם הוערכו באמצעות בדיקת תפקוד קרישה, ניתוח המוריאולוגי והערכה היסטופתולוגית עורקית. ריצוף 16S rDNA שימש לניתוח הרכב ושינויים בשפע של מיקרוביוטה במעיים. הממצאים חשפו כי צריכת מלח כרונית גבוהה הפריעה לצמיגות הדם, פגעה בשלמות האנדותל של כלי הדם וגרמה לדיסביוזיס מיקרוביאלי במעי. באופן מדהים, טיפול ב-EA הפך ביעילות את השינויים הפתולוגיים הללו. ניתוח קורלציה זיהה בנוסף מיקרוביום מעי ספציפי (למשל, Lachnospiraceae ו-Ruminococcaceae) שהיו קשורים באופן חזק לשינויים בפרמטרי צמיגות הדם (P < 0.05). לכן, המחקר הנוכחי מסיק כי וסקולופתיה הנגרמת מתזונה עתירת מלח יכולה להיהפך באמצעות טיפול ב-EA, שעשוי להיות מיוחס ליכולת של EA לווסת את המיקרוביוטה במעיים המעורבים במטבוליזם של חומצות מרה ובסינתזת חומצות שומן קצרות שרשרת.
מלח תזונה ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על איזון נוזלים וההומאוסטזיס התאי, אך צריכה מופרזת מהווה גורם סיכון מבוסס היטב למחלות לב וכלי דם מוחיים1. ארגון הבריאות העולמי ממליץ להגביל את צריכת הנתרן היומית לפחות מ-5 גרם למבוגרים בריאים2. מחקרים הראו כי תזונה עתירת מלח (HSD) פוגעת בתפקוד כלי הדם ושמחלת לב וכלי דם (CVD), המחלה הנפוצה ביותר בעולם, מלווה לעיתים קרובות בוסקולופתיה3. ממצאים אלו מדגישים כי תיקון נזק לאנדותל כלי הדם הנגרם על ידי HSD מהווה אסטרטגיה קריטית למניעת התקדמות מחלות לב וכלי דם. "תסמונת סטאזיס הדם" (המאופיינת במחזור הדם הקפוא והצטברות דם פנימי) מתיישבת עם תפקוד לקוי של קרישה מדידה ברפואה מודרנית. סמנים מרכזיים לאימות כוללים קיצור משמעותי של זמן הפרותרומבין (PT) וזמן טרומבופלסטין חלקי מופעל (APTT), וכן פיברינוגן (FIB) וזמן תרומבין (TT) מוגברים באופן ניכר. אינדיקטורים אלו משקפים מצב היפר-קרישי, התואם ישירות לתכונות פתולוגיות של סטאזיס הדם.
מיקרוביוטה במעיים, השוכנת בכל מערכת העיכול, משמשת כרגולטורים מרכזיים לתהליכים אימונומטבוליים וההומאוסטזיס המעיים, תוך השפעה על מסלולים פיזיולוגיים ופתולוגיים מגוונים4. עדויות מתקדמות מצביעות על כך שצריכת מלח מופרזת גורמת לדיסביוזה במעי ולחוסר איזון תזונתי, ומפעילה הפעלה חיסונית פרו-דלקתית המתבטאת כדלקת מקומית, תוך קידום נזק מיקרוקולטורי, עיצוב כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותלהסיסטמי 1,5. דווח כי HSD כרוני גורם לעלייה יחסית ברמות Bacteroides intestinalis, Aspergillus ו-Prevotella spp. בעכברים, והוא נקשר לתרומה להתפתחות יתר לחץ דם ודלקת כלי דם6.
דיקור, אבן יסוד ברפואה הסינית המסורתית (TCM), עושה שימוש בהחדרת מחט מדויקת בנקודות דיקור ספציפיות כטיפול משלים ואלטרנטיבי מבוסס ראיות בפרקטיקה קלינית. המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) וארגון הבריאות העולמי (WHO) מכירים בדיקור כהתערבות מאומתת קלינית למספר מצבים פתולוגיים. ראיות מתפתחות מראות כי לדיקור סיני יש מנגנון תרפויטי כפול 7,8, המווסת את הרכב המיקרוביוטה במעי תוך דיכוי מתווכים דלקתיים וסקולריים, ובכך מפחית יחד התקדמות פתולוגית בהפרעות קשורות. חשוב לציין כי דיקור יעיל בהורדת לחץ הדם ובשיקום תפקוד האנדותל בכלי דםפגועים.
EA נבחרה על פני דיקור ידני בשל פרמטרי הגירוי הסטנדרטיים והניתנים לכמות, שמפחיתים שונות תלויה במפעיל ומגבירים את השחזור של התוצאות. לכן, חקרנו את השפעת טיפול ב-EA על מיקרוביום המעי בעכברים עם מודל HSBS (תסמונת סטאזיס דם עתיר מלח) והערכנו את יעילות EA על וסקולופתיה הנגרמת ממלח גבוה באמצעות ריאולוגיית דם ושינויים היסטופתולוגיים וסקולריים. כדי להבין לעומק את תפקיד המיקרוביום של המעי בשיפור נגעים וסקולריים באמצעות טיפול EA, ביצענו ניתוח קורלציה בין סוגים שונים של מיקרוביום המעי לבין קצב חיתוך דם מלא ושקיעת דם.
לכן השענו כי EA מקל על וסקולופתיה הנגרמת על ידי השבת הומאוסטזיס של מיקרוביוטי המעיים. כדי לבדוק זאת, שאפנו ל: (i) לכמת את ההשפעות המגנות של EA על תפקוד ומבנה כלי הדם, ו-(ii) לזהות את הטקסונים המיקרוביאליים הספציפיים במעי שמווסת על ידי EA ותואמים לשיפורים אלו. יתרה מזאת, ניתוח הקורלציה של פירסון זיהה קשרים משמעותיים בין מיקרוביוטה לכלי דם, במיוחד בין תנודות שונות בסוגים לבין חריגות המוריאולוגיות. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון שבוחן את מנגנוני ההגנה של EA בשיפור וסקולופתיה הנגרמת מתזונה עתירת מלח מנקודת מבט של מיקרוביוטה במעיים. עיצוב הניסוי של מחקר זה מוצג באיור 1.

איור 1: דיאגרמה טכנית ניסיונית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הניסוי נערך במרכז הניסויי של בית הספר לרפואה בסיסית של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית. כל נהלי רווחת בעלי החיים והניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים במעבדה של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (אתיקה מס' 2024078). הניסויים בוצעו בהתאם בקפדנות למדריך NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (גרסה 1986, פרסום 86-23).
בעלי חיים ותזונה
חולדות Wistar ללא פתוגנים ספציפיים (SPF) זכרים ונקבות, בגילאי 6-8 שבועות, שקלו 200 ± 20 גרם. כל העכברים הוחזקו בחדרים מאווררים היטב עם מחזור אור-חושך של 12 שעות, והיו להם גישה חופשית למזון ולמים.
דגמים וקבוצות
מודלים של בעלי חיים הושרו בהתייחס לניסיון מחקר קודם10. לאחר תקופת הסתגלות של 7 ימים, 21 חולדות Wistar (התפלגות 50% זכר/נקבה) חולקו באקראי לשלוש קבוצות ניסוי (n = 7/קבוצה) באמצעות מחולל המספרים האקראיים ב-Excel, כאשר מספר הזכרים והנקבות בכל קבוצה נשמר מאוזן בערך כדי למזער את השפעת המגדרעל התוצאות. ביקורת תקינה (NC): קיבלתי גבר קיבה יומי (1 מ"ל/100 גרם) של מים מטוהרים. מודל עתיר מלח (HS) והתערבות EA (EA): ניתנה תמיסת NaCl של 12% (1 מ"ל/100 גרם) באמצעות תמיסת מדידה יומית. כל ההתערבויות נמשכו במשך 30 ימים רצופים.
טיפול EA
הטיפול החל יום לאחר הדוגמנות המוצלחת. EA נבחרה על פני דיקור ידני בשל פרמטרי הגירוי הסטנדרטיים והניתנים לכמות, שמפחיתים שונות תלויה במפעיל ומגבירים את השחזור של התוצאות. מיקומי BL23 (שנשו, מרידיאן שלפוחית השתן) ו-KI3 (טאיקסי, מרידיאן כליות) נקבעו על בסיס קריטריוני מיקום נקודות דיקור עכברוש של אגודת הדיקור הסינית12. BL23 ממוקם 6 מ"מ לרוחב לקו האמצע הגב, תחתון לחוליה המותנית השנייה. KI3 היה ממוקם בנקודת האמצע בין הנקודה הגבוהה ביותר של המלאולוס המדיאלי לבין הגבול האחורי של גיד האכילס. השיער המקומי בנקודות האקולר הוסר ועוטרה. מחטי דיקור סטריליות חד-פעמיות (0.18 מ"מ × 13 מ"מ) שימשו לניקוב אנכי של נקודות דיקור, עם עומק החדרה של 4-6 מ"מ ל-BL23 ו-3-5 מ"מ ל-KI3. קליפס האלקטרודה החיובי של מכשיר הדיקור היה מחובר לידית המחט של מחט הדיקור ב-BL23 בצד אחד, ולקליפס האלקטרודה השלילי לזה שב-KI3 באותו צד. פרמטרים של מכשיר הדיקור החשמלי: צורת גל: גל צפוף-דליל (10/50 הרץ); תדר: 5 שניות לגל דליל, 10 שניות לגל צפוף; עוצמה: 1-2 mA, מותאמת בהתאם לתגובות העוויתות והכאב של העכברים (צעקות, התנהגויות התנגדות); רוחב הדופק: ≤ 1 MS. פרוטוקול גירוי: ההתערבות בוצעה מדי יום בין 17:00 ל-19:00 (שעון בייג'ינג), ונמשכה 20 דקות בכל פעם. מחזור: מחזור טיפול אחד נמשך 7 ימים, עם סך של 4 מחזורים ויום מנוחה אחד בין כל מחזור. התהליך הספציפי מוצג באיור 2 (נוצר עם BioGDP.com13).

איור 2: ציר זמן ניסיוני. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איסוף והכנת דגימות
חודש לאחר ה-gavage, נאסף דם ורידי אורביטלי מחולדות לפני התערבות EA. דגימות פלזמה נלקחו בצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בסיום הטיפול, נאספו צואה טרייה מכל קבוצת חולדות. חולדות הורדמו עם 10% איזופלורן אמולספי (30 מ"ג/ק"ג) והועברו להמתה. חלל הבטן נפתח, ונאספו כ-5 מ"ל דם מהאאורטה הבטנית למדידת צמיגות קצב גזירה מלא בדם (WBSRV) בתוך 4 שעות. נאספו רקמות אאורטה בטניות לניתוח היסטופתולוגי. כל הדגימות נשמרו בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
בדיקת WBSRV
לאחר סיום המודלים, נאספו כ-4-5 מ"ל דם מלא מאאורטה בטנית של חולדות באמצעות מחט לאיסוף דם והוכנסו לחצוצרות נוגדי קרישה של הפארין. הצינורות נערו בעדינות כדי להבטיח ערבוב יסודי של דגימות הדם עם נוגד הקרישה. בתוך 4 שעות, נמדדו קצב השקיעת WBSRV וקצב השקיעה של האריתרוציטים (ESR) באמצעות אנלייזר המוריאולוגיה אוטומטי מלא.
היסטופתולוגיה וסקולרית
רקמות כלי הדם הוקצו בתמיסת 4% פאראפורמלדהיד למשך לפחות 24 שעות ונחתכו בעובי של 3 מיקרון לצביעת המטוקסילין-אאוזין (HE). התמונות צולמו בהגדלות של 100× ו-400×.
ריצוף 16S rDNA
DNA גנומי הופק מדגימות צואה מכל קבוצה. רצפי הפריימר V3-V4 (341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') שימשו להגברת PCR של ה-DNA הכולל. תוכנית ההגברה של ה-PCR הייתה כדלקמן: קדם-דהנאטורציה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, דנאטורציה ב-98 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, אנילינג ב-54 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, עם סך של 32 מחזורים, ואחריה הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מוצרי PCR טוהרו וכמותו. רצף זוגות (2×250 bp) בוצע על פלטפורמת הריצוף NovaSeq 6000. קריאות זוג-קצה אוחדו וסוננו לקבלת נתונים איכותיים. באמצעות תוסף DADA2 ב-QIIME 2, בוצעו סינון אורך והפחתת רעשים. תהליך זה יצר וריאציות רצף אמפליקונים (ASVs) וטבלאות שפע ASV, ולאחר מכן הסרת ASVs בודדים. בוצעו אנוטציה טקסונומית ופרופיל שפע בהתבסס על קובץ הרצף של ASV באמצעות מאגר הנתונים SILVA כדי לחקור הבדלים בין מינים והרכב קהילות בין דגמים. מגוון מינים ושינויים בשפע היחסי הוערכו באמצעות ניתוחי α-מגוון ו-β-גיוון, ובוצעה ויזואליזציה של נתונים באתר זה (https://www.omicstudio.cn/home).
ניתוחים סטטיסטיים
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות SPSS 26.0. ערך של P < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית. לנתונים עם שונות הומוגנית, נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני להשוואות בין קבוצות, ואחריו בדיקות LSD (LSD) לאחר הוק אם נמצאו הבדלים משמעותיים. לנתונים עם שונות הטרוגנית, נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני לא-פרמטרי של קרוסקל-ווליס לפי דרגות. ניתוח מבחן Mann-Whitney U יושם להערכת שינויים בהרכב מיקרוביוטי המעי ובמבנה הקהילה. ניתוח הקורלציה בדירוג פירסון שימש להערכת קורלציות בין חיידקי מעי בשכיחות שונה לבין מדדים נוספים. ניתוח קורלציה של פירסון שימש משום שהנתונים התאימו להנחות של נורמליות וליניאריות, שאומתו במבחן שפירו-וילק ובמבחן דורבין-ווטסון. גרפים סטטיסטיים ומפות חום נוצרו באמצעות GraphPad Prism 10.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אימות מודל בעלי החיים
ארבעת פרמטרי הקרישה ממלאים תפקיד מרכזי במחקר נגעים וסקולריים על ידי מעקב אחר חריגות בתפקוד הקרישה הקשורות קשר הדוק לשינויים פתולוגיים וסקולריים. הערכת הדם לאחר המודלים של דם ורידי רטרו-אורביטלי הראתה שינויים משמעותיים בפרמטרי הקרישה (PT, APTT, FIB, TT) בין קבוצות HS/EA לעומת קבוצות בקרת NC (איור 3). ערכי בדיקה ספציפיים מופיעים בטבלה משלימה 1. דבר זה מרמז כי ה-HSD עשוי לגרום לתפקוד קרישה לא תקין בעכברים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
נגעים וסקולריים הם גורם קריטי בהתפתחות ובביטויים פתולוגיים של מחלות לב וכלי דם שונות והפרעות מטבוליות. ההשפעות המזיקות כוללות תפקוד כלי דם לקוי, קרישת דם לא תקינה, הצטברות שומנים והיווצרות פלאק, שיכולים להוביל ללחץ דם גבוה, קרישה והתפתחות רובד עורקים, ובסופו של דבר להוביל למחלות CVDשונות 14,15,16. לכן, התערבות בזמן לעצירת התקדמות הנגעים הוסקולריים ולהשבת תפקוד כלי דם תקין היא חיונית למניעה והקלה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
מחקר זה מומן על ידי מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (מענק מס' 2024NSFSC0717). תודה ל-Figdraw על הסיוע בהכנת הדמויות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחטי דיקור | מפעל ציוד רפואי סוז'ואו בע"מ | 242059 | 0.18 & פעמים; 13 מ"מ |
| ערכת בדיקה של זמן תרומבופלסטין חלקי מופעל (APTT) (שיטת קרישה) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R21D24C4 | |
| חרוזי AMPure XP | בקמן קולטר גנומיקס | A63881 | |
| מנתח קרישה אוטומטי | Beijing Succeeder Technology Inc. | SF-8050 | |
| ערכת בדיקה לפיברינוגן (FIB) (שיטת קרישה) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R31D24D2 | |
| בודק ריאולוגיית דם אוטומטי לחלוטין | Beijing Succeeder Technology Inc. | SA-5600 | |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad Software, Inc. | ||
| H& תמיסת צביעת E | חברת ווהאן סאיוייר ביוטכנולוגיה בע"מ | G1005 | |
| ערכת כימות ספריית Illumina | קאפה ביוסיינסס | 7960166001 | |
| איזופלוראן | RWD מדעי החיים | R510-22-10 | 100 מ"ל |
| ערכת חילוץ DNA גנומי בצואה מבוססת חרוזים מגנטיים | ביוטק | AU46111-96 | |
| מיקרוסקופ אור לבן זקוף של Nikon Eclipse Ci-L | ניקון | ||
| QIIME 2 | https://qiime2.org/ | ||
| מכשיר דיקור אלקטרוני SDZ-II Huatuo | מפעל ציוד רפואי סוז'ואו בע"מ | SDZ-II | |
| מסד נתונים SILVA | שחרור 138, https://www.arb-silva.de/ | ||
| כלוריד נתרן | צ'נגדו ג'ינשאן חומרים כימיים בע"מ. | 20231008 | 500 גרם |
| חולדות ויסטאר SPF | SPF (בייג'ינג) ביוטכנולוגיה בע"מ. | SCXK (בייג'ינג) 2024-0001 | |
| ערכת בדיקת זמן תרומבין (TT) (שיטת קרישה) | Beijing Succeeder Technology Inc. | R4D24E1 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה