מאמר שיטה

הזרקה תוך-ראשית מותנית של SOD1-ASO למטרות מיקוד מדויק במערכת העצבים המרכזית (CNS) ויעילות חיזוי בעכברי ALS בני אדם עם SOD1-G93A

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69788

⸱

24 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מפרט את שיטות המתן התוך-אתקלית לטיפולים ממוקדים במערכת העצבים המרכזית בעכברים בוגרים, תוך התמקדות בדיוק בפרוטוקול ובאפשרות הזרקה חוזרת. הוא כולל ממצאים ממחקר אימות שבו אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים הפחיתו ביטוי SOD1 מוטנטי בעכברי מודל SOD1-ALS, מה שתומך בתועלת הגישה במחקר פרה-קליני במחלות נוירודגנרטיביות.

תקציר

מתן תוך-תקלי (IT) של תרופות ממוקדות מערכת העצבים המרכזית (CNS) מציע מסלול זעיר-פולשני להעברה ישירה של תרופות לנוזל המוח השדרתי (CSF), ומקל על שיפור הספציפיות והמעורבות במטרה. בעוד שקטטריזציה של IT היא סטנדרטית ללידה ממושכת אצל חולדות, יישומו בעכברים מוגבל בשל מגבלות אנטומיות וסיכון מוגבר לסיבוכים הקשורים לפרוצדורות, כולל פגיעות בעמוד השדרה וזיהום. כדי להתגבר על מגבלות אלו, השתמשנו בטכניקת דקירה חריפה במחט למתן תרופות IT בעכברים בוגרים, שסיפקה חלופה שניתנת לשחזור ופחות פולשנית התואמת לשיטות מינון בודדות או חוזרות. במודל עכבר טרנסגני של טרשת צידית אמיוטרופית (ALS) המכיל את מוטציית SOD1-G93A, השגנו אספקה יעילה של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים (ASOs) המכוונים לגן SOD1. גישה זו הפחיתה ביעילות את ביטוי SOD1 המוטנטי ושיפרה משמעותית את הפנוטיפ של המחלה, כפי שהודגם בהערכות אלקטרופיזיולוגיות וביומרקרים. תוצאות אלו מאשרות הן את שיטת מתן ה-IT והן את היעילות הטיפולית, עם תוצאות השוות למתן תוך-חצי-חם (ICV). החשוב מכל, הטכניקה משקפת את ההליכים המשמשים במחקרים קליניים אנושיים, ומציעה רלוונטיות תרגומית חזקה ותועלת בהערכה פרה-קלינית של התערבויות מונחות מערכת העצבים המרכזית. למרות שמומחיות טכנית נדרשת כדי להבטיח עקביות ולמנוע השפעות לא מדויקות, אסטרטגיית אספקת ה-IT הזו מייצגת מתודולוגיה חזקה, ניתנת לשחזור ורלוונטית קלינית לקידום פיתוח טיפולי במודלים של בעלי חיים קטנים.

מבוא

במחקר זה אנו מתארים פרוטוקול הזרקה תוך-תוך-מותני (IT), משווים אותו למתן תוך-חדרי (ICV), ומעריך תוצאות פרמקודינמיות וסבילות להנחיית פיתוח טיפולים ממוקדים במערכת העצבים המרכזית (CNS). טיפולים הממוקדים ב-RNA, במיוחד אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים (ASOs), מהווים שיטה מבטיחה למחלות מערכת העצבים המרכזית בכך שהם מאפשרים ויסות ביטוי גנים לאחר שעתוק. גישות אלו רלוונטיות במיוחד להפרעות ניווניות נוירודגנרטיביות, שבהן אובדן נוירוני מתקדם מדגיש את הצורך בהתערבויות מדויקות, מקומיות ובזמן שיכולות לשנות את התקדמות המחלה. כאן, אנו משווים ישירות את יעילות פרוטוקול הזרקת ה-IT למתן ICV עבור טיפולי ASO.

במחקרים פרה-קליניים, נעשה שימוש בהזרקות תוך-תוך-מותניות בעכברים בוגרים (זכרים או נקבות, בגיל 30-70 ימים, משקל 13-20 גרם) להעברת תרופות פרמקולוגיות או וקטורים ביולוגיים ישירות לנוזל המוח השדרה (CSF) עבור מערכת העצבים המרכזית המיועדתל-1,2. נפחי הזרקה של 5-10 מיקרוליטר ניתנים בדרך כלל באיטיות כדי להגביל עליות חולפות של לחץ נוזל נוזלי ונחל, כאשר הגישה התוך-ראשית מושגת דרך המרחב הבין-חולייתי L5-L6 1,2. הצלחה פרוצדורלית תלויה בטכניקה זהירה למניעת פגיעה נוירולוגית, כאשר הגיל ומשקל הגוף משפיעים על נפח וטיפול ב-CSF. שימוש במחטים ברוחב דק (למשל, מחט 27-30 G המחוברת למזרק המילטון בנפח 25 מיקרוליטר) מאפשר אספקה אמינה2. אתגרים טכניים מרכזיים כוללים מזעור אובדן במרחבים מתים, מניעת הזרקה שגויה ודליפה באפידורל, והפחתת שונות תלויה במפעיל העלולה להשפיע על דיוק המינון ועל התפלגות נוזל נוזלי נוזלי.

פיתוח טיפולים יעילים להפרעות מערכת העצבים המרכזית נותר אתגר משמעותי בשל המורכבות המבנית וההטרוגניות התאית של מערכת העצבים המרכזית. תכונות אלו מעכבות על אספקת תרופות ממוקדות ומגבילים את ההתפלגות הביולוגית בין מחסומים אנטומיים ופיזיולוגיים רבים, מה שמחייב אסטרטגיות אספקה מיוחדות. מכשול מרכזי נובע ממחסומים פיזיולוגיים ואנטומיים לאורך מערכת העצבים המרכזית שמגבילים את חדירת התרופה. המוח וחוט השדרה מוקפים בשלוש שכבות מנינגיאל: דורה מטר, ארכנואיד ומיה מאטר, אשר יחד עם מחסום הדם-מוח (BBB) מספקים הגנה חזקה מפני תרופות במחזור הדם ומולקולות אחרות בדם. למרות שהם חיוניים לשמירה על יציבות מערכת העצבים המרכזית, מחסומים אלו פוגעים משמעותית בהעברת מולקולות גדולות והידרופיליות כגון ASOs, נוגדנים מונוקלונליים ווקטורים ויראליים 1,2,3,4. ניהול ה-IT מציע דרך לעקוף מגבלות אלו על ידי הכנסת תרופות ישירות ל-CSF בתוך מרחב התת-עכביש. מסלול אספקה זה מקל על חלוקת התרופות בין תאי מערכת העצבים המרכזית, מקדם חדירה רחבה יותר לרקמות ובכך מאפשר מעורבות יעילה עם מטרות המבוטאות בסוגי תאים מגוונים בתוך מערכת העצבים המרכזית. מאז השימוש הראשון ב-Hylden and Wilcox בשנת 1980 למתן מורפין בעכברים1, הזרקות IT הפכו לשיטה נפוצה יותר להעברת מגוון תרופות טיפוליות, כולל מולקולות קטנות, ביולוגיים, וקטורי טיפול גנטי ו-ASOs 5,6,7,8,9,10.

ASO הם אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים מהונדסים כימית, שנועדו לקשור רצפי RNA משלימים ולווסת ביטוי גנים באמצעות מנגנונים כגון פירוק H בתיווך RNase, מודולציית חיבור, ועיכוב סטרי של תרגום 11,12,13,14,15. שיפורים כימיים כמו שינויים בעמוד השדרה של הפוספורותיואטים, החלפות 2'-O-מתוקסיאתיל (2'-MOE), ושאריות אתיל מוגבלות משפרים את יציבותם, זיקת הקשר שלהם ועמידותם לנוקלאזים6. תכונות אלו תמכו ביישומן במיקוד בגנים פתוגניים המעורבים בהפרעות נוירוגנטיות. טיפולים מבוססי ASO שניתנו תוך-תלותית הוכיחו תועלת קלינית במחלות כמו אטרופיה שרירית עמוד שדרה (SMA) וטרשת לטרלית אמיוטרופית (ALS)12,13,14,15. לדוגמה, Nusinersen (Spinraza) משפר את הכללת אקסון 7 בתמלילי SMN2 כדי לפצות על אובדן SMN1 ב-SMA 7,14. אסטרטגיות דומות שהתמקדו בתמלילי הנטינגטין מוטנטי נבדקו גם במחלת הנטינגטון12,13. למרות שניסויים אלו הופסקו בתחילת16, הם מדגישים את העניין המתמשך בגישות ASO המונחות על ידי CNS.

ALS היא הפרעה נוירודגנרטיבית קטלנית המתאפיינת בניוון מתקדם של נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים. המחלה, המשפיעה בין 6 ל-9 אנשים לכל 100,000 ברחבי העולם ומתרחשת בקצב של כ-2 מקרים ל-100,000 אדם-שנה, מציגה החמרה הדרגתית בחולשת שרירים וספאסטיות, כאשר רוב המטופלים מתים מכשל נשימתי נוירומוסקולרי בתוך 2 עד 3 שנים לאחר תחילת התסמינים בגיל17. בעוד שרוב המקרים הם מפוזרים (sALS), כ-10% הם משפחתיים (fALS), מה שמספק תובנות לגבי הגורמים הגנטיים למחלה. בין הגנים הנחקרים ביותר נמצא Cu/Zn סופר-אוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1), שאחראי לכמעט 15 עד 20% מ-fALS, פחות מ-2% מ-sALS, והוא תורשתי באופן אוטוזומי דומיננטי18. SOD1 מקודד אנזים נוגד חמצון ציטופלזמי שמנטרל מיני חמצן תגובתיים על ידי המרת רדיקלים סופר-חמצניים למי חמצן. צורות מוטנטיות של SOD1, כגון G93A, A4V ו-H46R, מציגות חוסר יציבות קונפורמציונית, מה שמוביל להצטברות חלבונים ולרווח תפקוד רעיל התורם ללחץ חמצוני, תפקוד לקוי של מיטוכונדריה ואקסיטוטוקסיות 19,20,21,22,23,24,25 . יתרה מזאת, פתולוגיית ALS מחמירה על ידי מנגנונים אוטונומיים לא-תאיים הכוללים מיקרוגליה ואסטרוציטים, התורמים לסביבה דלקתית כרונית ולפגיעה נוירונית מתקדמת 26,27,28,29. לכן, השתקת ביטוי SOD1 באמצעות ASOs מהווה דרך טיפולית מבטיחה להפחתת פתוגנזה של מחלה.

מודל העכבר הטרנסגני SOD1-G93A (Jax Strain #: 004435), שמבטא את הצורה המוטנטית של SOD1 האנושית G93A תחת שליטת פרומוטר SOD1 אנושי אנדוגני, מסכם מקרוב את התכונות הקליניות של ALS, כולל ליקויים מוטוריים מוקדמים, ניוון נוירודגנרטיבי של חוט השדרה וקיצור הישרדות30. מחקרים פרה-קליניים קודמים הראו כי מתן ASOs ספציפיים ל-SOD1 באמצעות לידה תוך-חדרי מתמשכת באמצעות משאבות אוסמוטיות בעכברי SOD1-G93A ביום 65 לאחר הלידה במינון יומי של 100 מיקרוגרם במשך 28 ימים רצופים מביא לדיכוי משמעותי של רמות SOD1, הפחתת תגובות נוירודלקתיות, עיכוב בהופעת סימנים קליניים ושיפור בביצועים מוטוריים31. יתרה מזאת, הפלה בתיווך ASO של SOD1 אצל אנשים החיים עם SOD1-ALS נקשרה לירידה ברמות שרשרת האור הנוירופילמנטית (NfL), סמן ביולוגי מבוסס דם המצביע על נזק אקסונלי32. במחקר זה, נתנו ASO המיועד ל-SOD1 באמצעות הזרקת IT בעכברי SOD1-G93A והערכנו את השפעתם בקריאות מולקולריות, אלקטרופיזיולוגיות וביומרקרים. ניתוח כמותי של רקמת חוט השדרה חשף ירידות משמעותיות ברמות ה-mRNA של SOD1. הערכות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאלי פעולה בשריר מורכב (CMAPs) הראו שמירה על תפקוד נוירומוסקולרי. במקביל, רמות ה-NfL בסרום ירדו, מה שמשקף הקלה על פגיעה נוירונית מתמשכת.

כדי להעריך את ההתפלגות המרחבית והיעילות היחסית של שיטות אספקה חלופיות למערכת העצבים המרכזית, כללנו זרוע השוואתית המשתמשת בהזרקה תוך-חדרית (ICV), שבה החומר הטיפולי מוכנס לחדרים הצדדיים להפצה באמצעות זרימת נוזל נוזלי לאורך מרחבי האפנדימלית והפריוסקולרית33. על ידי השוואת מסלולי מתן IT ל-ICV, שאפנו להבחין בהבדלים בתוצאות פרמקודינמיות ובמיקוד רקמות, ובכך לשפר את אסטרטגיות האספקה לטיפולי ASO מונחי מערכת העצבים המרכזית. בנוסף, כדי להעריך את היתכנות התרגום, ערכנו מחקרי סבילות עצמאיים שכללו עד ארבע זריקות IT לכל בעל חיים במרווחים של שמונה שבועות. בכל המשטרים שנבדקו, לא נצפו סימנים גלויים למצוקה או תחלואה, מה שתומך בסבילות למינון של IT ASO בהקשר של הישרדות. תוצאות אלו תואמות דיווחים קודמים שהראו את הסבילות להזרקות תוך-אתקליות חוזרות בעכברים34.

הרלוונטיות הקלינית של מתן ASO ב-IT נתמכת עוד יותר על ידי האישורים הרגולטוריים האחרונים של טופרסן (QALSODY)® ל-ALS35 הקשור ל-SOD1. מחקרים קליניים הראו מעורבות מטרות חזקה, המשוקפת בירידות בחלבון CSF SOD1, ואחריהן ירידה ברמות שרשרת האור הנוירופילמנטית, סמן ביולוגי לפגיעה נוירואקסונלית. למרות שנקודת הסיום העיקרית לא הושגה בניסוי VALOR שלב 3 הראשוני, ניתוחים משולבים שכללו את ההרחבה הפתוחה הציעו יתרונות פוטנציאליים של התחלת טיפול מוקדםיותר 35.

ביחד, הנתונים כאן מראים כי אספקת IT של ASOs המיועדים ל-SOD1 במודל העכבר ALS SOD1-G93A משיגת הפלה מולקולרית יעילה, שיפור סמנים ביולוגיים ושימור פונקציונלי עם סבילות חיובית. תוצאות אלו תומכות במתן IT ASO כגישה רציונלית וקלינית ישימה להפרעות גנטיות במערכת העצבים המרכזית ומספקות מסגרת פרה-קלינית איתנה להמשך התפתחות תרגומית.

פרוטוקול

כל ההליכים כאן אושרו ובוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC ולהנחיות מוסדיות להיגיינה כימית ובטיחות ביולוגית.
הערה: בצע מחקרים על עכברים טרנסגניים C57BL/6J (JAX #000664) ו-SOD1-G93A (JAX #004435) המאוחסנים בתנאים סטנדרטיים (מחזור אור/חושך של 12 שעות, 22-24 מעלות צלזיוס, גישה חופשית למזון ולמים).

1. יישום ASOs שעברו התאמה כימית למיקוד ב-SOD1

  1. להשתמש באוליגונוקלאוטידים אנטיסנס מאומתים (ASOs) כדי למקד ספציפית נוקלאוטידים 613-629 בתוך אזור 3' לא מתורגם (UTR) של גן SOD1 האנושי (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*G*T*ToToA*T*C
  2. כלול שינויים כימיים מאומתים לשיפור היציבות והיעילות, על ידי שילוב MOE (2'-O-Methoxyethyl) (מצוין בגופן רגיל), cEt (אתיל מוגבל) (באותיות נטויות), DNA (מודגש), קישורי פוספט (o) וקישוריות פוספורותיואטים (*), כפי שדווח קודם36. קובץ משלים 1 מציג את הכימיה של ASO עם קידוד צבעים תואם.
  3. הכינו ASO בקרה שאינו ממוקד ללא השלמה לגנום של בני אדם או מכרסמים, בהתאם לאותו שיטת שינוי לשימוש כבקרה: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*C*AoGoA*A

2. הכנה וטיפול בפתרונות ASO בתנאים סטריליים

  1. שחזור ASO בנוזל מוח-שדרתי מלאכותי סטרילי (aCSF; טבלה 1) לריכוז של 10 מ"ג/מ"ל בתנאים סטריליים, עם מטרת נפח הזרקה סופי של 10 מיקרו-ליטר (100 מיקרוגרם) לכל בעל חיים.
  2. ערבבו את התמיסה בעדינות באמצעות פיפטה סטרילית לשמירה על שלמות מולקולרית, ואז מערבבים בעדינות במשך 5-10 שניות כדי לוודא שהיא מעורבבת היטב.
  3. סנן את התמיסה המדוללת דרך מסנן מזרק סטרילי בקוטר 0.2 מ"מ להסרת חלקיקים ומזהמים.
  4. מחלקים את התמיסה הסופית בצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ביחידה מבוקרת טמפרטורה עד שבוע, תוך הימנעות ממחזורי הקפאה והפשרה לשמירה על יציבות.

3. הכנת עכבר לפני הזרקה תוך-אתקלית

  1. שקלו כל עכבר ל-0.1 גרם הקרוב ביותר באמצעות מאזן דיגיטלי, ואז העבר לקונוס אף ומעוררים הרדמה עם איזופלוראן בריכוז של 2-2.5% חמצן; מעקב רציף אחרי עומק ואישור מישור ניתוחי על ידי אובדן רפלקס הדוושה.
  2. הכינו כרית חימום מבוקרת תרמוסטטית ומכוונים אותה ל-37 מעלות צלזיוס כדי לתמוך בעכברים במהלך ההכנה וההתאוששות.
  3. מרחו חומר סיכה עיני על שתי העיניים מיד לאחר השראת ההרדמה כדי למנוע ייבוש בקרנית. לאחר מכן, מקם את העכבר בשכיבה גחונית על כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה, להפחית לחץ פיזיולוגי ולתמוך בתפקודים תקינים של כלי דם ונשימה לאורך כל ההליך.
  4. הזרקת בופרנורפין בהזרקה מושחררת (1.3 מ"ג/מ"ל) תת-עורית במינון 3.25 מ"ג/ק"ג באמצעות מזרק סטרילי עם מחט 25 גרם והזרקת 0.05 מ"ל ל-20 גרם משקל גוף לפני ההליך.
  5. גלח את אזור המותן מהצלע האמצעית ועד חגורת האגן, ואז חיטא את האזור באמצעות מטוש לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל ופובידון-יוד, חזור על הפעולה שלוש פעמים, ואפשר לאתר להתייבש באוויר לחלוטין.

4. הזרקה תוך-ראשית ישירה

  1. לאחר ההרדמה וההכנה לאתר הניתוח, העבר את העכבר לאזור הזרקה נקי ומניח אותו בשכיבה וונטרלית על כרית החימום.
  2. הנח את העכבר במצב שמקמר את עמוד השדרה כדי להקל על המישוש וההזרקה.
    1. הכנס מרית מעוקלת מתחת לבטן בגובה החזה התחתון ועד המותני העליון כדי לגרום לכיפוף קל של עמוד השדרה ולהרחיב את החללים הבין-חולייתיים בין החמישי לשישי (L5-L6, מועדף) או הרביעי והחמישי (L4-L5).
    2. קדימו את שיפוע המחט בין הלמינות כדי להיכנס למאגר המותני ולגשת למרחב התת-עכבישי תוך הימנעות ממגע ישיר עם עצם לשיפור בטיחות ודיוק ההזרקה.
  3. ייצוב חגורת האגן על ידי אחיזה עדינה בחגורת האגן בין האגודל לאצבע המורה של יד אחת ומישוש קו האמצע הגבי ביד השנייה כדי לאתר את המרחב הבין-חולייתי המטרה בין L4-L5 או L5-L6.
  4. יישר מזרק אינסולין סטרילי בנפח 0.3 מ"ל המצויד במחט 29 G, 1/2 אינץ', בניצב לפני העור הגבי או בזווית של 70-80°, כאשר הזווית מכוונת לראש. התקדמו את המחט עד שמתעוררת התנגדות קלה כאשר היא חודרת לדורה-מטר, ואז המשיכו אל החלל התוך-אתקי.
  5. הכנס בהדרגה עד שהקצה נכנס למרחב התוך-תוך, המאושר על ידי רפלקס תנועת זנב המצביע על כניסה תוך-תוך-ראשית מוצלחת.
  6. אם נתקלים בהתנגדות משמעותית או שאין רפלקס של זנב-פלק, משכו את המחט, מזהו מחדש את סימני האנטום, והתאימו את מיקום המחט לפני ניסיון ההזרקה. אם הניסיון הראשוני בוצע במרחב הבין-חולייתי L5-L6, יש לבצע את הניסיון הבא במרחב הבין-חולייתי L4-L5.
  7. הזרקו 10 מיקרוליטר מתמיסת ה-ASO באיטיות (מעל 10 שניות) כדי למזער שינויים בלחץ ולמנוע ריפלוקס נוזלי נוזלי. המחט יכולה להישאר במקום למשך 10 שניות נוספות לאחר ההזרקה.
  8. משוך בזהירות את המחט אנכית וחלקה כדי למנוע נזק לרקמות וזרימה חוזרת.
  9. עקבו אחרי העכבר באופן רציף במהלך תקופת ההחלמה, תוך התבוננות בנשימה, תפקוד מוטורי, יציבה וכל סימן לכאב או מצוקה.
  10. ודאו שהעכבר משיב לעצמו תנועה והתנהגות רגילה לפני החזרתו לכלוב הבית.
  11. תעד את כל הפרטים הפרוצדורליים הרלוונטיים, כולל אתר ההזרקה, מינון ה-ASO, נפח ההזרקה, וכל תצפית התנהגותית או פיזיולוגית במהלך ואחרי ההליך, בהתאם לפרוטוקולי ה-IACUC.

5. ניטור עכברים ותמיכה בהחלמה לאחר הזרקה

  1. הניחו כל עכבר בתא נפרד או מרווח היטב בתוך תא התאוששות מחומם מראש שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. שמרו על טמפרטורת התא מבוקרת במהלך ההתאוששות מההרדמה כדי למנוע היפותרמיה.
  3. יש לעקוב באופן רציף אחר קצב נשימה ודפוס, יציבה ותגובה לגירויים מישושים.
  4. התבונן בעכבר עד שהוא חוזר למצב ההתיישרות ומפגין תנועה מתואמת.
  5. הימנעו מצפיפות יתר כדי להבטיח ראות ברורה ולמנוע הפרעות.

6. קביעת קריטריונים לחזרה לכלוב הבית

  1. וודא שהעכבר יציב עם תנועה מתואמת וספונטנית.
  2. ודאו שאין סימני מצוקה, כולל נשימה כבדה או לא סדירה, קולות וחוסר תגובה ממושך.
  3. ספקו תמיכה תזונתית רכה, כמו תוסף דיאטה ג'ל מלא תזונתית, כדי לסייע בשמירה על הידרציה וצריכת קלוריות במאמץ מינימלי.

7. ביצוע תצפיות לאחר התאוששות בעכברים

  1. בדוק התנהגויות רגילות כמו חקירה, טיפוח ואינטראקציה חברתית אם העכברים מאוחסנים בקבוצה.
  2. עקבו באופן רציף אחר הופעת סימנים להחלמה חריגה, כגון יציבה לא תקינה, חולשה או שיתוק, נשימה לא סדירה או ירידה בתגובת, וערכו מחדש במהירות אם מופיעים תסמינים אלה.
  3. פנה להתערבות וטרינרית אם ההחלמה מתעכבת או נפגעת.

8. הזרקה תוך-חדריים לחדר הלטרלי באמצעות ניתוח סטריאוטקסי וטיפול לאחר הניתוח

הערה: כלול זרוע השוואתית המשתמשת בהזרקה תוך-חדרית (ICV) להערכת התפלגות מרחבית ויעילות יחסית, תוך העברת ASOs לחדרים הצדדיים להפצה בתיווך CSF והשוואה ללידה תוך-תוך-ראשית. בצע את הזרקות ה-ICV בהתאם לפרוטוקולים מבוססים וסטנדרטיים לעכברים37.

  1. הרדימו את העכבר באיזופלורן בריכוז של 2-2.5% בחמצן לצורך חוסר תנועה, ומקמו את העכבר במצב שכיבה בטן על כרית החימום, ולאחר מכן הזרקו בופרנורפין בהזרקה ממושכת שחרור (1.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין הידרוכלוריד) תת-עורית ב-3.25 מ"ג/ק"ג באמצעות מזרק סטרילי של 1 מ"ל עם מחט של 25 גרם ב-0.05 מ"ל ל-20 גרם משקל גוף לפני ההליך. לגלח את הקרקפת של העכבר עם קוצצים.
  2. בצע את כל ההליכים הכירורגיים תחת הרדמה. שמרו על שדה אספטי סטרילי לאורך כל ניתוח ה-ICV. השתמש רק בכלים סטריליים וטפל בהם בזהירות כדי למנוע מגע עם משטחים לא סטריליים.
  3. אבטח את העכבר במסגרת סטריאוטקסית עם קונסולת תצוגה דיגיטלית במצב שכיבה סטנדרטי. הניחו את השיניים הקדמיות במוט השיניים של מתאם העכבר כדי לייצב את הראש, ואז אבטחו את המתאם באמצעות צינורות הנשימה של השאיפה והפליטה המספקים איזופלורן. הכנס את מוטות האוזניים לאוזניים והדק את הברגים כדי לייצב את הראש היטב.
  4. חטא את האזור באמצעות מטוש חלופי של אלכוהול איזופרופיל ופובידון-יוד, חוזר על עצמו שלוש פעמים, ובצע חתך קו אמצע עם סכין סטרילית לחשיפת הגולגולת. השתמשו בקצה כותנה סטרילי להסרת רקמות רכות וודאו שהברגמה נראית בבירור.
  5. סמנו את הברגמה על הגולגולת. מקם את המזרק המכיל ASO עם מחט (26-G, 26s/2"/2, בסגנון נקודה) ממש מעל הברגמה. יישר את המחט לקואורדינטות המטרה: AP -0.3 מ"מ, ML ±1.0 מ"מ, DV -3 מ"מ משטח הגולגולת. סמן את הגולגולת בקואורדינטות AP ו-ML.
  6. צור חור בור בקואורדינטות המסומנות ואז השתמש במסגרת סטריאוטקטית כדי להוריד את מחט המזרק לעומק של -3 מ"מ מפני הגולגולת. הזרקו את התמיסה בקצב של 10 מיקרוליטר/דקה עד שנפח כולל של 10 מיקרוליטר. לאחר סיום ההזרקה, החזק את המחט במקום במשך 4 דקות, ואז משכו אותה בהדרגה כדי למזער את הריפלוקס.
  7. תפרו את חתך הקרקפת, הניחו את העכבר בתא התאוששות מחומם מראש בטמפרטורה של 37°C עד שהתעוררות מלאה, והחזרו לכלוב הבית לאחר אישור יציבות. ספק תוסף דיאטה ג'ל שלם תזונתית ועקוב באופן רציף אחר סימני החלמה חריגה, כגון יציבה לא תקינה, חולשה או שיתוק, נשימה לא סדירה או ירידה בתגובת; יש להעריך מחדש במהירות אם מופיע אחד מהתסמינים הללו.

9. הערכות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאלי פעולה בשריר מורכב (CMAP)

  1. ודאו שהניסויים עיוורים הן לגנוטיפ והן לקבוצת הטיפול של כל עכבר כדי למנוע הטיה במהלך איסוף וניתוח הנתונים.
  2. הרדימו את העכבר באיזופלוראן לחוסר תנועה ונוחות, ושמרו על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס.
  3. אשר הרדמה מספקת על ידי הבטחת אובדן רפלקס הדוושה.
  4. השתמש באלקטרודות מחט חד-קוטביות של 28 G הן לגירוי והן להקלטה. הכנס את אלקטרודת ההקלטה 1 מ"מ לשריר הקדמי של השוק.
  5. גירוי העצב הסיאטי ליד החריץ הסיאטי באמצעות פולסים מונופאזיים של 0.1 מילישניות בגל ריבועי המועברים כל 2 שניות, החל מ-1.0 mA וגדלים בהדרגה של 0.5 mA עד להשגת תגובה על-מקסימלית (בדרך כלל 1.5-3.5 mA).
  6. לאחר שנקבע סף העל-מקסימלי, יש להקליט תגובות CMAP ב-0.5 mA מעל הרמה הזו. מדדו את משרעת CMAP (משיאים לשיא) ב-0.8 ms לאחר הגירוי כדי להוציא השהיה ולממוצע את המשרעות מהרגל השמאלית והימנית לכל עכבר.

10. מדידת רמות pNFH בסרום

  1. איסוף 100 מיקרוליטר דם מלא באמצעות ניקוב ורידים בפנים באמצעות צינורות איסוף דם קפילריים המכילים מפעיל קרישים וג'ל להפרדת סרום בנקודות זמן מוגדרות.
  2. דגימות דם בצנטריפוגה ב-2000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לבידוד הסרום.
  3. כמת את רמות השרשרת הכבדה (pNFH) של נוירופילמנט מזרחרח בסרום באמצעות תגובות אימונואסיי מאומתות למדידת pNFH בדגימות ביולוגיות על אנלייזר אימונואסיי מיקרופלואידי מבוסס מחסנית אוטומטי לחלוטין.

11. בידוד RNA וביצוע RT-qPCR

  1. טחינת רקמות חוט השדרה הצווארי/החזה של העכבר באמצעות חרוז פלדה בקוטר 6 מ"מ במפעל חרוזים מתכנתים קריוגני באנרגיה גבוהה לפירוק דגימה במהירות של 1,000-1,200 משיכות לדקה למשך 30-40 שניות.
  2. הומוגניזציה של הרקמה המרוסקת (15 מ"ג) באמצעות חרוזי קרמיקה בקוטר 2.8 מ"מ ב-700 מיקרוליטר ליזיס מבוסס פנול-גואנידיניום תיוציאנאט ומגיב להפקת RNA באמצעות הומוגניזר מכני מבוסס חרוזים מהיר ומתוכנת במהירות 5.62 מ"ש לשני מחזורים של 30 שניות.
  3. יש לחלץ RNA מלא באמצעות, כולל טיפול DNase בעמודה, בהתאם להוראות היצרן.
  4. סינתז cDNA באמצעות מערכת תגובת שעתוק הפוך בעלת קיבולת גבוהה לסינתזה של cDNA.
  5. לזיהוי qPCR, תעצבו סטים מותאמים אישית של פריימר/גשואים לזיהוי הגן המעניין המכוון לאקסון 4 של גן SOD1 האנושי:
    פריימר קדמי (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    פריימר הפוך (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    גשושית (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. השתמש ב-GAPDH של העכבר (מזהה בדיקת TaqMan: Mm99999915_g1) כגן לניהול בית.
  7. לבצע qPCR על מכשיר PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) בעל תפוקה גבוהה באמצעות 20 ng של cDNA לכל תגובה, תערובת מאסטר מבוססת גלאי מהיר, פריימרים ספציפיים לגן, וגלאי הידרוליזה מסומנים פלואורסצנטית לזיהוי תמלילי ניקיון (VIC/MGB) ומטרה (FAM/MGB).

12. ניתוח סטטיסטי של הנתונים

  1. הציגו נתונים ממדדים בחיים (CMAP), pNFH בסרום וניתוח ביטוי גנים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).
  2. הערכת מובהקות סטטיסטית בין ממוצעים קבוצתיים באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחר מכן מבחן ההשוואות המרובות של טוקי, תוך התחשבות ב-p < 0.05 כמובהק סטטיסטית.
  3. השתמשו בתוכנות ניתוח סטטיסטי מתאימות ליצירת גרפים וביצוע כל הניתוחים, בהתאם לאלו שבוצעו במחקר.

תוצאות

כדי לאפיין במדויק את הדיוק והיעילות של מתן תוך-תיקי (IT) בעכברים בוגרים, ערכנו תחילה ניסויי אימות יסודיים תוך שימוש בצבע הכחול של אוונס (0.5%) כמעקב חזותי לזרימת נוזל הנוזל המוחי וחדירות הרקמות. עכברים בוגרים מסוג בר מסוג C57BL/6J (זן #000664; משקל 25-30 גרם) הורדמו באיזופלוראן (2-2.5%) בחמצן כדי להסיר תופעות תנועה, והאזור המותני הוכן בתנאים אספטיים. הזרקות ה-IT בוצעו באמצעות ניקור מותני למרחב התת-עכבישי במינונים עולים בודדים של 20 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר ו-50 מיקרוליטר, כדי להעריך מינון/נפח ויחס עוצמת הצביעה. מיקום המחט הנכון אושר על ידי התבוננות בתנועת זנב או התנגדות שלילית במהלך ההזרקה.

בתוך 5 דקות ממתן הצבע, העכברים עברו פרפיוז טרנסקרדיאלי עם מי מלח עם בופר פוספט קר (PBS) כדי להסיר שאריות צבע מהוסקולטורה. חוט השדרה הוצא בעדינות וצולמו תחת תאורה סטנדרטית על רקע ניטרלי. בדיקה ויזואלית גילתה התפלגות אחידה ואחידה בין הגב לבטן של כחול אוונס בכל העכברים שקיבלו צבע. נפחי הזרקה גבוהים יותר היו קשורים להגברת רוויית הצבע על ציר הרוסטרוקאודל, אם כי גם העכבר שהוזרק בנפח 20 מיקרוליטר הציג צביעה חזקה. לעומת זאת, עכברים שלא קיבלו צבע כחול של אוונס (קבוצת הביקורת שהוזרק לה סליין סטרילי) לא הראו צבע נראה או כתמים ברקמת חוט השדרה (איור 1). ממצאים אלו מראים שהזרקות IT בעכברים מאפשרות משלוח מהיר וניתן לשחזור של מומס לאורך חוט השדרה. מגבלות ניסויים אלו כוללות היעדר הערכה כמותית של התפלגות הצבע והיעדר ניתוח התפלגות צבע בנפח ההזרקה של 10 מיקרוליטר המשמש למתן ASO. עם זאת, בוצעה כימות במדידות מעורבות מטרות מאוחרות יותר ברמת ביטוי הגנים בעכברי SOD1-G93A אנושיים באמצעות ניתוח ביטוי גנים ספציפי ל-SOD1 בבני אדם. נפח ההזרקה של 10 מיקרולטר ששימש בניסויים הבאים למתן ASO נבחר כדי להבטיח מינון בטוח וסובל היטב בעכברים, וצפוי לספק חשיפה מספקת למערכת העצבים המרכזית בהתבסס על מחקרים קודמים38.

בהתבסס על אימות אנטומי זה, הערכנו לאחר מכן את הרלוונטיות הפונקציונלית של מתן IT באמצעות ASOs המכוונים ל-SOD1 המוטנטי, אסטרטגיה טיפולית מאומתת במודלים של SOD1-ALS. עכברים טרנסגניים המיזיגוטיים SOD1-G93A, הנושאים את גן SOD1 המוטנטי האנושי, מציגים ניוון נוירון מוטורי צפוי וירידה נוירומוסקולרית, מה שהופך אותם למודל פרה-קליני מבוסס. בגיל 5 שבועות, לפני הופעת התסמינים, העכברים קיבלו בולוס IT יחיד של ASO ספציפי ל-SOD1 בריכוז של 100 מיקרוגרם ב-10 מיקרוליטר. מינון זה נבחר בהתבסס על מחקרי אופטימיזציה קודמים שנערכו באמצעות מתן ICV בעכברים, כפי שדווח על ידי McCampbell ואח' (2018)36. כדי להשוות את היעילות בין מתן IT למתן ICV, קבוצה נפרדת קיבלה זריקות ICV באותו מינון ASO באמצעות מתן סטריאוטקטי. הבקרות קיבלו את ה-ASO הלא פעיל (בקרה שאינה מיקודת) דרך נתיב IT.

חמישה שבועות לאחר הטיפול (בגיל 10 שבועות), העכברים עברו בדיקת פוטנציאל פעולה שרירית מורכב (CMAP) תחת הרדמה איזופלורנית קלה. הקלטות CMAP משרירי הגפה האחורית שהושגו באמצעות פרוטוקולי גירוי עצב סיאטי סטנדרטיים חשפו שימור משמעותי של עוצמה הן בקבוצות שטופלו ב-IT והן בקבוצות ICV בהשוואה לקבוצות ביקורת לא פעילות שטופלו ב-ASO (p < 0.0001 באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של טוקי). חשוב לציין כי שימור המשרעת לא היה שונה באופן משמעותי בין שיטות העברת IT ל-ICV (p > 0.05), מה שמעיד על הגנה נוירומוסקולרית דומה (איור 2A).

כדי להעריך סמנים ביולוגיים מערכתיים של שלמות העצבים, נמדדו רמות השרשרת הכבדה של חוטי העצב המזורחנים (pNFH) בסרום באמצעות מבחן אלקטרוכימינציה רגיש מאוד. דגימות דם שנאספו בנקודת הזמן של 5 שבועות לאחר ההזרקה הראו ירידה של >40% בריכוז pNFH בעכברים שטופלו ב-ASO ביחס לעכברים שטופלו ברכב (p < 0.0001), ללא הבדל משמעותי בין שיטות ה-IT ל-ICV (איור 2B). התגובה האחידה של הביומרקר המולקולרי מאשרת את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, ומרמזת כי העברת IT מפחיתה ביעילות תהליכים נוירודגנרטיביים במודל ALS זה.

כדי להעריך את מעורבות המטרה של SOD1-ASO ברמה המולקולרית, ביצענו PCR כמותי (RT-qPCR) על רקמות חוט השדרה הצווארי והחזה שנחתכו. סך ה-RNA הופק באמצעות פרוטוקול מבוסס עמודות, שהבטיח טוהר גבוה (A260/A280>1.8), ואחריו סינתזת cDNA עם פריימר אקראי של הקסמר. הגברה כמותית של PCR המיקוד בתמלולי SOD1 אנושיים, שנורמל ל-GAPDH, חשף ירידה ממוצעת של 60% לאחר מתן IT ו-35% לאחר מתן ICV, שניהם משמעותיים יחסית לביקורת ASO לא פעילה (p < 0.0001 לשניהם). השוואה ישירה בין מסלולי המשלוח הראתה פגיעה משמעותית במתן IT (p < 0.0001), מה שמעיד על מעורבות יעילה יותר במטרה בעמוד השדרה דרך גישה ישירה לעמוד השדרה (איור 3). נדרשים מחקרים נוספים להערכת מעורבות מטרות באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית.

ביחד, הנתונים המקיפים הללו מציעים אימות משכנע של הזרקות IT כטכניקה מדויקת, שחזורית ומינימלית פולשנית להעברת ASOs למערכת העצבים המרכזית (CNS) במודלים של עכברים. ניהול ה-IT הראה יעילות טיפולית ברמה של מתן ICV במגוון רחב של מדדי תוצאה, כולל שימור מתמשך של תפקוד נוירולוגי (CMAP), נורמליזציה של סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה (pNFH), והפלה מולקולרית חזקה של תמלילי SOD1 אנושיים באזורים ממוקדים של מערכת העצבים המרכזית. ממצאים אלו מדגישים את הרב-שימושיות של מתן IT כמסלול קליני שניתן לתרגום לטיפולי ASO ממוקדים במערכת העצבים המרכזית, ומציע יעילות השווה ל-ICV תוך שמירה על פשטות פרוצדורלית והפחתת פולשניות. לכן, מתן IT ו-ICV הם גישות יעילות באותה מידה להתערבויות ממוקדות מערכת העצבים המרכזית, ומציעים גמישות בסביבות פרה-קליניות בהתאם לנגישות אנטומית, היתכנות פרוצדורלית והקשר טיפולי. דבר זה מציב את אספקת ה-IT כפלטפורמת תרגום מבטיחה לטיפולים עתידיים המיועדים למערכת העצבים המרכזית. כדי לתמוך במאמצי התרגום, אנו מציעים לבצע מחקרים פרה-קליניים נוספים להערכת התפוצה הפרמקוקינטית בנוזל המוח השדרה, באזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית וקליטת תאי היעד, באמצעות טכניקות כמו היברידיזציה פלואורסצנטית במקום או אימונופלואורסצנציה.

איור 1
איור 1: הדמיית התפלגות צבע כחול של אוונס לאחר הזרקה תוך-אתקלית בעכברים בוגרים. Evans Blue Dye (0.5%) ניתנה באמצעות הזרקה תוך-תכלית ישירה (IT) בעכברים בוגרים כדי להעריך באופן איכותי את התפוצה של חוט השדרה. שלושה נפחי צבע שונים: 20 מיקרוליטר, 30 מיקרוליטר ו-50 מיקרוליטר סופקו בקבוצות ניסוי נפרדות (n = עכבר אחד לכל תנאי נפח). לאחר ההזרקה, חוטי השדרה נקטפו ונשטפו כדי להעריך את חדירת הצבע לפי עוצמת הצביעה לאורך הרקמה. תמונות של רקמת חוט השדרה מראות את היקף פיזור הצבע הקשור לכל נפח הזרקה, ומדגימות עלייה תלויה בנפח המינון בכיסוי ובעוצמת הצביעה בכל חוט השדרה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2
איור 2: טיפול אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס שמכוון SOD1 משיב תפקוד מוטורי ומפחית את רמות הנוירופילמנט הפתולוגי בעכברים. עכברים טרנסגניים בוגרים SOD1-G93A קיבלו מנה אחת של אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס פעיל המיועד ל-SOD1 (SOD1-ASO) באמצעות הזרקה תוך-תוך-תוך-חדרית (ICV) בגיל 5 שבועות, או הזרקת ASO בקרה לא פעילה באמצעות הזרקת IT. ההשפעה הטיפולית הוערכה בגיל 10 שבועות, כלומר 5 שבועות לאחר הטיפול. (א) הושגו הקלטות פוטנציאל פעולה של שריר מורכב (CMAP) להערכת תפקוד נוירומוסקולרי בבעלי חיים מטופלים. קבוצות שטופלו ב-SOD1-ASO (n = 5 - 6 לקבוצה) הראו היפוך בירידה ב-CMAP ביחס לקבוצת הביקורת, מה שמעיד על התאוששות פונקציונלית. (B) רמות פריפריאליות של שרשרת נוירופילמנט כבדה (pNFH), סמן ביולוגי של נוירודגנרציה, נמדדו מסרום שנאסף בשבוע 10 (n = 5 - 8 לכל קבוצה). טיפול ב-SOD1-ASO הוביל לירידה משמעותית ברמות pNFH במחזור בהשוואה לביקורת, מה שמרמז על החלשה של נזק נוירוני הקשור למחלה. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. המובהקות הסטטיסטית נקבעה באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי, כאשר ערכי p ≤ 0.0001 הצביעו על הבדלים חזקים בין קבוצות הטיפול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3
איור 3: מתן SOD1-ASO מדכא באופן משמעותי ביטוי mRNA של SOD1 אנושי בחוט השדרה הטרנסגני של עכבר SOD1-G93A. כדי להעריך את יעילות המיקוד של אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס (SOD1-ASO) המיועד SOD1 המועבר באמצעות הזרקה תוך-תוך-תוך-חדרית (ICV), נותח חתך צווארי ובית חזה של רקמת חוט השדרה מ-SOD1-G93A שעברו הרדמה בגיל 10 שבועות (5 שבועות לאחר ההנחה) לביטוי mRNA של SOD1 בבני אדם באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) עם שעתוק הפוך. רמות תמלול SOD1 בבני אדם נמדדו ונרמלו ביחס לביטוי בקבוצה שטופלה ב-ASO הלא פעילה. התרשים מציג את שינוי הקפלים ב-mRNA של SOD1 אנושי (מנורמל ל-GAPDH) עבור כל קבוצת טיפול (n = 5-7 עכברים בכל קבוצה), ומדגיש ירידה משמעותית בוויסות בתגובה למתן SOD1-ASO. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות נקבעו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי, כאשר ערכי p ≤ 0.0001 הצביעו על הבדלים חזקים בין קבוצות הטיפול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

רכיבFWכמות התוספת (לליטר או ק"ג)יחידות
נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידרט0.034g
נתרן פוספט די-בסיסי אנהידרוס1420.111g
כלוריד נתרן58.448.766g
כלוריד אשלגן74.560.224g
סידן כלוריד דיהידרט147.020.206g
מגנזיום כלוריד הקסיהידרט0.163g
מים (מילי-קיו)993g
פולוקסאמר 1880.01g

טבלה 1: הרכב aCSF.

איור משלים 1: מיקום העכבר להזרקה תוך-תוך-מותנית. מרית מעוקלת או סקופולה המונחת מתחת לבטן מכופפת את עמוד השדרה ומרחיבה את המרחב הבין-חולייתי. ההזרקה מכוונת לרמות L4-L5 או L5-L6, עם יישור נכון לאורך הציר המדיאלי של עמוד השדרה כפי שמוצג. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: רצף וכימיה של ASO. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

טכניקת ההזרקה התוך-תוך-תכלית הישירה (IT) המוצגת כאן מייצגת שיטה זעיר-פולשנית אך יעילה מאוד להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS), במיוחד במודלים של מכרסמים קטנים כמו עכברים. הליך המקל העיוור הזה הוא מאתגר טכנית אך הוכח שהוא גם ניתן לשחזור וגם לרלוונטי קלינית כאשר הוא מבוצע על ידי מזרק מיומן. שיטה זו עושה שימוש באנטומיה מדויקת ובטכניקה יעילה כדי לספק גישה מהירה למערכת העצבים המרכזית ללא צורך בקטטריזציה, פישוט חשוב עם יתרונות משמעותיים להרחבת המחקרים הפרה-קליניים; עם זאת, הרלוונטיות התרגומית שלה תיהנה מהערכה כמותית נוספת ואימות מתודולוגי סטנדרטי 5,8,10.

הזרקת IT מוצלחת תלויה במספר שלבים מרכזיים. הכנה מדוקדקת של בעלי חיים היא חיונית: הרדמה מתבצעת תחילה באמצעות תא ומטופלת עם קונוס אף, לאחר מכן מגילוח את אזור המותן ומתן משככי כאבים להבטחת נוחות בעלי החיים. המיקום הנכון של העכבר מושג על ידי הנחת מרית מעוקלת מתחת לבטן, תוך כיפוף עמוד השדרה להרחבת המרחב הבין-חולייתי (איור משלים 1). המטרה של ההזרקה התוך-ראשית המתוארת כאן היא למקם את שיפוע המחט בתוך המאגר המותני על ידי קידומו בין הלמינות ברמת החוליות המתאימה. מיקוד מדויק במרחב הבין-חולייתי בין L4 ל-L5 או, רצוי, למינאות L5 ו-L6 הוא קריטי לגישה למרחב התת-עכבישי 5,10. המרחב התת-עכבישי, המכונה גם המרחב התוך-אתקי, נמצא בין הארכנואיד לפיה מאטר39. מכיוון שחוט השדרה קצר יותר מתעלת החוליות, מקטעי חוט השדרה הזנביים ממוקמים יותר רוסטרלית ביחס לרמות החוליות המתאימות להם. כדי למנוע עמימות, אתרי ההזרקה מוגדרים לפי מרחב בין-חולייתי ולא לפי גובה חוט השדרה. ראוי לציין כי קיימת שונות משמעותית בסגמנטציה של חוליות מותניות בעכברים, הן בתוך זן40 והן מעבר לו. ההזרקה חייבת להתבצע לאורך קו האמצע של עמוד השדרה כדי למנוע סטייה צדדית, שעלולה לגרום לשיתוק בגפה האחורית או, במקרים חמורים, לשיתוק עקב פגיעה בחוט השדרה. כאשר מתבצעת במיקום אנטומי נכון, הסיכון לפגיעה ישירה בחוט השדרה הוא מינימלי. עם זאת, קיים סיכון קטן לגירוי או נזק לשורש העצב, מה שמדגיש את חשיבות ההכשרה המספקת של המפעילים ושליטה פרוצדורלית לצמצום תוצאות שליליות. רפלקס הזנב משמש כאינדיקטור מועיל למיקום מחט מוצלח, ומאפשר למזריק להעריך עומק ולהימנע מחדירה שטחית או עמוקה מדי. טכניקה זו דורשת תרגול כדי לשלוט בה, ודורשת שליטה יציבה בעומק, בזווית ונפח ההזרקה כדי למנוע זרימה חזרה ודליפה לרקמות הסובבות. למרות שאנו ממליצים לשמור על נפח ההזרקה ≤10 מיקרוליטר, הערכנו עד 20 מיקרוליטר ללא תופעות לוואי. מחקרים קודמים זיהו נפח הזרקה תוך-תוך-10 מיקרוליטר כאופטימלי למתן תרופות38. למרות שזה מהווה 25-30% מנפח הנוזל הנוזלי הכולל בעכברים 41.42, דווח כי נפח ההזרקה התוך-תוך-תקלי המרבי הנסבל בעכברים בוגרים הוא 30מיקרוליטר 10. נפחי הזרקה העולים על הגבולות המומלצים עלולים לשבש את דינמיקת נוזל המוח השדרה (CSF), ולהוביל לשינוי בלחץ נוזל מוח-שדרה ולסיכון מוגבר לתופעות לוואי. נפח נוזל הנוזל הנוזלי הכולל בעכברים מוערך ב-35-40 מיקרוליטר ומסתובב 12-13 פעמים ביום41.42, מה שמקביל לחידוש מלא בערך כל 1.8 שעות42.43. בהתחשב בתחלופה מהירה של נוזל מוחי ותצפיות אמפיריות וכן במחקרים קודמים שהראו שימוש בטוח בנפחי הזרקה תוך-ראשיים עד 20-30 מיקרוליטר ללא סיבוכים, נפח הזרקה של 10 מיקרוליטר לא צפוי לגרום לתופעות לוואי10.44.

יכולת הרחבה היא יתרון משמעותי של טכניקה זו. לאחר שהשתלטו, מזרקים מיומנים יכולים לטפל ב-10-12 בעלי חיים בשעה, מה שמקל על מחקרים פרה-קליניים גדולים יותר ללא העומס הלוגיסטי של השתלת קטטר או שיטות כירורגיות פולשניות יותר. ההליך נמנע מכלים מורכבים, מפחית לחץ על בעלי חיים ומקצר את זמני ההחלמה בהשוואה לקטטריזציה כרונית, מה שהופך אותו למתאים למחקרים אורכיים הדורשים מינון חוזר. כדי לדמות משטרי מינון קליניים, אימתנו את מתן ה-IT הסדרתי בעכברים, שסיפקנו עד ארבע מנות בהפרש של שמונה שבועות. ההזרקות הללו נסבלו היטב, ללא סימני מצוקה, שינויים התנהגותיים או סימני מחלה, בהתאם למחקרים קודמים שלא דיווחו על שינויים משמעותיים בדינמיקת נוזל הנפש המוחי או במבנה חוט השדרה לאחר טיפולי IT מרובים34,45. לכן, המחקרים שלנו מאשרים כי מינון חוזר של IT אפשרי עם מרווחים מתאימים, בהתאם לפרדיגמות הטיפול האנושיות שבהן יש צורך במעורבות מטרה מתמשכת לטובת הטיפול. מניסיוננו, הזרקות ה-IT החוזרות הללו בוצעו בהצלחה בטווח גילאים רחב של 5 עד 29 שבועות. בעוד שהגדלת הגיל ומסת הגוף יכולה להשפיע במעט על הנגישות לחוט השדרה בשל רקמה תת-עורית גדולה יותר, מתן מוצלח עדיין אפשרי עם מפעיל מיומן שמכיר את תחושת מיקום המחטים. עם זאת, אנו מציינים כי מספר גורמים מעבר לאתר ההזרקה ונפח הבולוס, במיוחד מהירות ההזרקה והתכונות הפיזיקליות של התמיסה המוזרקת, כגון צפיפות יחסית לנוזל נוזלי נוזלי, יכולים להשפיע משמעותית על התפלגות המומסים בתוך מערכת העצבים המרכזית. למרות שפרמטרים אלו לא נמדדו או שונו ישירות במחקר הנוכחי, מחקר עדכני של Linninger ואחרים (2023) מראה באמצעות מודל פרמקוקינטי מכני כי גורמים אלו משפיעים באופן משמעותי על הפצת ביולוגית אנטיסנס תוך-תקלי (ASO) ולרקמות המיוקדותל-46. בהתאם לכך, אנו מכירים בכך כמגבלה של המחקר ומדגישים את מהירות ההזרקה ותכונות התמיסה כמשתנים חשובים למחקר עתידי לאופטימיזציה של אספקת מערכת העצבים המרכזית ורלוונטיות תרגומית. יחד, תוצאות אלו מדגישות את האמינות וההיתכנות של מינון חוזר של טכנולוגיית מידע בפרדיגמות פרה-קליניות מרובות מינונים, התומכות בשימוש במטרה מתמשכת ובמודלים תרגומיים של משטרי טיפול אנושיים.

הגישה הטכנולוגית מספקת גם גמישות בבדיקות טיפוליות. הוא כולל מגוון רחב של מודליות, כולל ASOs, מולקולות קטנות, פפטידים ווקטורים ויראליים, ומאפשר הערכה ישירה של התערבויות ממוקדות מערכת העצבים המרכזית. היכולת לספק נפחים מדויקים ומבוקרים של תרופות למאגר המותני מבטיחה חשיפה יעילה של חוט השדרה וחשיפה רחבה יותר למערכת העצבים העצבית, תוך הגבלת השפעת המערכת המערכתית. רפלקס הזנב ורמזים פרוצדורליים נוספים מאפשרים אימות בזמן אמת של הצלחה במשלוח תוך-תיקי, מה שמשפר עוד יותר את השחזוריות ומפחית את שיעורי הכישלון בניסויים 5,6,8,47.

מחקרים קודמים בעכברי SOD1-G93A הראו שהפתולוגיה של המחלה משפיעה באופן בולט על חוט השדרה, במיוחד באזור המותני, מאשר בקורטקס29,48. לכן, טכניקה זו רלוונטית במיוחד בהקשר של SOD1-ALS, צורה גנטית של ALS הנגרמת ממוטציות בגן הסופר-אוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). מוטציות אלו יוצרות אגרגטים חלבוני SOD1 מקופלים בצורה שגויה שמובילים לעלייה רעילה בתפקוד בתוך נוירונים מוטוריים, מה שמוביל לירידה הנוירמוסקולרית הפרוגרסיבית49,50. במחקר זה, השתמשנו ב-ASO המיקוד ב-SOD1 כדי להדגים מעורבות מוצלחת עם mRNA המטרה והתאוששות פונקציונלית. ניתוח RT-qPCR חשף דיכוי משמעותי של תמלילי SOD1 אנושיים בחוט השדרה לאחר מתן IT, בעוד שהקלטות CMAP הצביעו על היפוך בתפקוד לקוי של נוירונים מוטוריים. יתרה מזאת, ניתוח הסרום הראה ירידה ברמות השרשרת הכבדה (pNFH) של חוטי העצב המזורחנים, סמן ביולוגי של נוירודגנרציה, ומחזק את יעילות האסטרטגיה הטיפולית.

הרלוונטיות הקלינית של מודל זה מודגשת באישור האחרון של ה-FDA לטופרסן (QALSODY®), ASO שנועד למקד את ה-mRNA של SOD1 לטיפול ב-SOD1-ALS35. טופרסן, ניתן תוך-תוך-תקלי לאנשים החיים עם SOD1-ALS והראה פעילות פרמקודינמית ברורה, כולל ירידה ברמות החלבון הכוללות של CSF SOD1 (סמן עקיף של המעורבות במטרה) וב-NfL בפלזמה (סמן לפגיעה אקסונית וניוורדגנרציה). בניתוחים משולבים של מחקר VALOR שלב 3 וה-OLE שלו, התחלת טיפול מוקדמת יותר בטופרסן הייתה קשורה להפחתה בירידה במדדים של תפקוד קליני, חוזק ואיכות חיים, וכן להפחתה בסיכון לאירועים מקבילים למוות35. נתונים אלו מאשרים את המסלול התוך-ראשי כדרך חזקה לטיפול ASO ממוקד מערכת העצבים המרכזית ומעניקים משקל תרגומי חזק למחקרים פרה-קליניים המשתמשים באסטרטגיות מתן דומות.

בנוסף לשימושו ב-ALS, מסלול ה-IT הוכיח הצלחה באטרופיה שרירית עמוד שדרה (SMA)14,51,52, כאשר הטיפול המאושר הראשון של ASO Nusinersen (Spinraza®) שהועבר על ידי IT. הזרקות IT עוקפות את מחסום הדם-מוח ומאפשרות הפצה ביולוגית רחבה של מערכת העצביםהמרכזית 53, שהיא קריטית למחלות המאופיינות בפתולוגיה עצבית מפוזרת. בעוד שמינון חוזר מציב אתגרים לוגיסטיים וסבילות, התקדמות בטכניקות הניסוח והאספקה ממשיכה להפוך את ניהול ה-IT ליעיל יותר לטיפול ארוך טווח.

ניהול ה-IT מציע רלוונטיות תרגומית רבה יותר לפרקטיקה הקלינית האנושית מאשר הזרקות ICV. הזרקות ICV ו-IT בעכברים בוגרים שונות בעיקר במיקום היעד שלהן בתוך מערכת העצבים המרכזית ובהתפלגות וההשפעות של החומר הניתן. הזרקות ICV מעבירות חומרים ישירות לנוזל המוח השדרתי (CSF) בתוך החדרים הצדדיים של המוח, ומכוונות בעיקר לאתרים על-שדרתיים. לעומת זאת, הזרקות IT מעבירות חומרים ל-CSF בתוך המרחב התת-עכבישי של השדרה, ומכוונות בעיקר לחוט השדרה. בעוד ששתי השיטות עוקפות את מחסום הדם-מוח ומאפשרות משלוח ישיר במערכת העצבים המרכזית, מתן IT יכול להוביל למשך פעולהארוך יותר עבור תרכובות מסוימות ובדרך כלל מוביל להעברה חזקה יותר בחוט השדרה, בעוד ש-ICV יכול להגיע לריכוזים מקומיים גבוהים באזורים המוחיים הסמוכים לחדרון הלטרלי54. עם זאת, חשוב לציין שתרכובות הניתנות ל-CSF בעמוד השדרה יכולות להגיע למוח, אם כי קצב ההעברהאיטי מאוד. הבדלים אלו משתקפים גם בסיכונים פרוצדורליים. הזרקות ICV נושאות סיכון גבוה יותר לזיהום אם הסטריליות נפגעת, בעוד שהזרקות IT, אף שאינן נטולות סיכון, נושאות פחות פגיעויות הקשורות למכשירים. לאחר ההליך, הזרקות IT עשויות לגרום לאי נוחות חולפת או תגובות הקשורות לגפיים האחוריות, בעוד שהזרקות ICV קשורות לאי נוחות פחות מיידית, אם כי גירוי מקומי בגולגולת עדיין אפשרי.

יישומים עתידיים של טכניקה זו מתרחבים מעבר למחקרים פרה-קליניים קיימים. אספקת IT יכולה לשמש להערכת טיפולים ממוקדים במערכת העצבים המרכזית מהדור הבא, כולל כלי עריכת גנים (כגון מערכות CRISPR/Cas), שיטות הפרעת RNA וטיפולים גנטיים מבוססי וקטורים ויראליים. הגישה ניתנת להתאמה לטיפולים משולבים המיועדים למספר מסלולי מערכת העצבים המרכזית, ומאפשרת הערכה בזמן אמת של אינטראקציות פרמקודינמיות55,56. יתרה מזאת, ניתן לשלב את ניהול ה-IT עם מודאליות הדמיה כדי לעקוב אחר הפצה ומעורבות מיקוד ב-vivo, ובכך להאיץ את תהליכי התרגום. הטכניקה גם מספקת פלטפורמה ללימוד אסטרטגיות רפואה מדויקת על פני מודלים גנטית מוגדרים של מחלות נוירולוגיות בעכברים, ומקלה על גילוי סמנים ביולוגיים, הערכות פונקציונליות לאורך זמן והערכות בטיחות לפני תרגום קליני.

לסיכום, טכניקת ההזרקה הישירה ל-IT מותני באמצעות הרדמה איזופלורנית מייצגת שיטה זעיר-פולשנית, מהירה וניתנת לתרגום קליני להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית של העכברים. היישום המוצלח שלו במודלים של SOD1-ALS ותאימות למינונים סדרתיים מספקים בסיס חזק לפריסה רחבה יותר במחקר נוירוביולוגי תרגומי. ככל שהתחום מתקדם עם דגש גובר על מודולציה גנטית של מערכת העצבים המרכזית, טיפולים ממוקדי RNA ורפואה מדויקת, מסלול ה-IT יישאר אסטרטגיית אספקת תרופות מרכזית, המחבר בין מודלים פרה-קליניים להצלחה קלינית.

גילויים

SM ו-S-C L הם עובדים נוכחיים של Biogen, Inc., בעוד TC, DF, YL, JD ו-MZ הם עובדים לשעבר של החברה. האוליגונוקלאוטידים האנטיסנסיים שנדונו במאמר זה סופקו למחברים על ידי חברת Ionis Pharmaceuticals. טופרסן (QALSODY) הוא מוצר שפותח במשותף של Biogen ו-Ionis Pharmaceuticals.

תודות

ברצוננו להודות ל-Ionis Pharmaceuticals על אספקת ה-ASOs המתוארים במאמר. אנו מודים לריאן גמבל, סטיב גאראפלו, אדריה מרטיג, איזבל איסאזה, טארס טוצ'קוויץ' ודיוויד קוסקה מ-Biogen על תרומתם המומחית, שהעשירה משמעותית את כתב היד באמצעות תיקונים מהותיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.3 מ"ל 29 גרם, מזרק אינסולין 1/2 אינץ' להזרקת ITסמית'ס מדיקל4429-3
קידוח סטרילי בקוטר 0.5 מ"מכלי מדע מדויק (FST), או מקבילים1900705
תפר מונופילמנט פרולן 5-0אתיקון 8870H 
מקלות אלכוהולדינרקס1203
מקלות אלכוהולדינרקס1203
משכך הכאבים - בופרנורפין שחרור ממושךנדרש מרשם
קליפר של בעלי חייםוואהל08787-450A
ערכת שעתוק הפוך cDNA בעלת קיבולת גבוהה של Applied Biosystemsפישר סיינטיפיק43-688-14
הומוגנייזר Bead Ruptor 24אומני אינטרנשיונל, בע"מ.19-070
איסוף דם וחצוצרות הפרדת סרוםבקטון דיקינסון (BD)365967
סידן כלוריד דיהידרטJT בייקר1335
משאבת מזרק דיגיטליתמנגנון הרווארד70-4507
מערכת אימונואסיי אוטומטית של אלהR& D Systems600-100
משחת עיניים-פורלובהדקרה17033-211-38
ג'נו/גריינדרSPEX SamplePrep2010
Germinator 500 חומר חיטא יבשבריינטרי סיינטיפיק, או מקבילGER 5287-120V
מזרק המילטון עם מחט (26s/2"/2 (סגנון נקודה)המילטון8030026s/2"/2:                                                                                              26 שניות: 26 שערים;                                                                                                             אורך 2 אינץ';                                                                                                                             2: סגנון נקודות
תערובת הומוגניזציה של רקמות קשות 2.8 מ"מ קרמית (צינורות מחוזקים בעומק 2 מ"מ) (50/pk)פישר סיינטיפיק50-280-9286ספק: Revvity Health Sciences Inc
משטח חימוםק & H Manufacturing1060
פלטפורמת ICVסטולטינג502063
תא איזופלוראן עם מערכת סקוואנגינגVetEquip901820
מגנזיום כלוריד היהידרטEMD כימיקלים1.05832
מספריים מטצנבאוםכלי מדע מדויק (FST), או מקבילים14016-14
Mouse GAPDH TaqMan Assay ID Mm99999915_g1תרמופישר סיינטיפיק4331182
אלקטרודות מחט ל-CMAP, 28 Gנאטוס מדיקל (מותג טקה)#902-DMF25-TP
NutraGel: תזונה מלאהשירות ביולוגיNGB-2
מחזיק המחט אולסן-הגרכלי מדע מדויק (FST), או מקבילים12502-12
פולוקסאמר 188מאצ'לר
כלוריד אשלגןJT בייקר3045
קדם-מגבר (ל-CMAP)מכשירי דיוק עולמיים (WPI)SYS-DAM50
ערכת pNFH של ProteinSimpleR& D SystemsSPCKB-PS-000519
מקלות דגימה פרובידון-יודידדינרקס1201
QIAzol Lysis Reagent קיאגן79306
מערכת QuantStudio 12K Flexמערכות ביולוגיות יישומיות4471087
סקופולהפישרברנד01-257-567
סיגנל v6.04קיימברידג' עיצוב אלקטרונימספר סידורי 061144CMAP Software 
תא חילוץ בעלי חיים קטניםיחידות טיפול נמרץ לבעלי חיים ניידות Thermocare דגם FW-1FW-1 
מסגרת סטריאוטקסית של חיה קטנה עם קונסולת תצוגה דיגיטליתKOPFדגם 940 
עכברי SOD1 G93Aמעבדת ג'קסוןסטוק # 004435
כלוריד נתרןEMD כימיקלים1.16224
נתרן פוספט די-בסיסי אנהידרוססיגמא אולדריץ'55136
נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידרטסיגמא אולדריץ'3819
סכין חד-פעמית סטריליתMed Vet International, או המקבילהMIL4410
וילון סטרילידינרקס4410
רפידות גזה סטריליותדיינארקס, או המקבילהDRX-3354
סליין סטריליתרמופישר סיינטיפיק14190094
כפפות כירורגיות סטריליותאנסל, או מקביל20277290
מבודד גירוי (עבור CMAP)מכשירי דיוק עולמיים (WPI)SYS-A365D
סטולטינג מיקרו דריל סטולטינג58610
מלקחיים כירורגיים מעוקלים (מלקחיים גראף - טיטניום)כלי מדע מדויק (FST), או מקבילים11652-10
מלקחיים כירורגיים (מלקחי גרף - טיטניום)כלי מדע מדויק (FST), או מקבילים11650-10
סרט כירורגידיינארקס, או המקבילה3572
מזרק להזרקה תת-עורית של משכך כאביםBD309582
TaqMan Fast Advanced Master Mixתרמופישר סיינטיפיק4444556
מים (מילי-קיו)
משקל משקלמטלר טולדו                                         דגם XSR2002S23-112795
עכברים מסוג פראי C57BL/6Jמעבדת ג'קסוןסטוק # 000664

מקורות

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SOD1ALSPCR
הזרקה תוך-ראשית מותנית של SOD1-ASO למטרות מיקוד מדויק במערכת העצבים המרכזית (CNS) ויעילות חיזוי בעכברי ALS בני אדם עם SOD1-G93A
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.