מודולציה תלויה בליגנד כולינרגי של קישור זרחון חמצוני בתאי נוירובלסטומה BE(2)-C עם פרי דיגיטונין

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לחדירות סלקטיבית של ממברנת הפלזמה, המאפשר אספקה ממוקדת של סובסטרטים ומעכבים להערכת פוספורילציה חמצונית מיטוכונדריאלית (OXPHOS) בתאים מתורבתים, תוך התגברות על מחסומי העברת ממברנת הפלזמה שבדרך כלל מונעים ניתוח כזה. באמצעות טכניקה זו הראינו כיצד תפקוד OXPHOS מווסת על ידי אגוניסטים ואנטגוניסטים מוסקריניים.

Abstract

מטרת מחקר זה הייתה להעריך את תפקוד הזרחון החמצוני (OXPHOS) בתאים מתורבתים באמצעות שילובים מוגדרים של סובסטרט-מעכב, תוך שמירה על מבנה תאי והקשר ציטוזולי שאבד בתכשירים מיטוכונדריאליים מבודדים. מכיוון שתאים שלמים חדירים בצורה לקויה למספר ביניים במחזור קרבס, הערכה ישירה של נשימה נתמכת בסובסטרט דרך נקודות כניסה ספציפיות בשרשרת העברת אלקטרונים (ETC) מוגבלת. כדי להתגבר על כך, יישמנו חדירות קרום פלזמה סלקטיבית בתיווך דיגיטונין וביצענו בדיקות קישור וזרימת אלקטרונים מבוססות אנלייזר זרם חוץ-תאי בתאי נוירובלסטומה BE(2)-C. כדי לקבוע תלות בסוג התא, דיגיטונין עבר טיטרציה אמפירית בתאי HEK293 ובנוירונים ראשוניים של הגנגליון השורש הגבי של חולדה (DRG) באמצעות סוקסינט + רוטנון לבידוד נשימה מונעת על ידי קומפלקס II–IV.

נשימה נתמכת בסוקסנט עם עיכוב קומפלקס I הראתה עלייה בצריכת חמצן (O₂) המונעת על ידי קומפלקס II–IV בתאים חדירים בהשוואה לתאים שאינם חדירים, בהתאם לשיפור בגישה של סובסטרט אימפרמיין ממברנה למיטוכונדריה. לעומת זאת, הנשימה הנתמכת על ידי סובסטרטים הנכנסים דרך מסלולי הובלה אנדוגניים (למשל, פירובאט/מלט) הראתה הבדלים קטנים יותר בין התנאים. באמצעות פלטפורמה זו לבדיקת ליגנדים מוסקריניים, ראינו הבדלים בין אגוניסטים לאנטיגוניסטים בצריכת O₂ במבחן הצימוד, בעוד שבדיקת זרימת האלקטרונים הראתה השפעות מינימליות הקשורות לליגנדה בתנאים שנבדקו. ממצאים אלו מצביעים על כך שהשפעות הליגנד הניתנות לזיהוי היו בולטות יותר ברמת מצבי הנשימה המוגדרים על ידי קישור מאשר בקיבולת העברת אלקטרונים מרבית. בסך הכול, חדירות סלקטיבית מרחיבה את הנגישות לסובסטרט בבדיקות ביואנרגטיות של תאים מתורבתים ומאפשרת ניתוח של ויסות פרמקולוגי של נשימת מיטוכונדריה.

Introduction

תפקוד לקוי או תכנות מחדש של מטבוליזם האנרגיה המיטוכונדריאלית הוא מרכזי למגוון רחב של הפרעות, כולל ניוונית עצבית, סרטן, מחלות דלקתיות, מצבים קרדיומטבוליים והפרעות גנטיות שונות. כדי להבין טוב יותר את תפקיד המטבוליזם המיטוכונדריאלי בפתוגנזה של מחלות, פותחו מספר אסטרטגיות אנליטיות. אלה כוללים מדידות של קצב צריכת חמצן₂ (OCR), קצב החמצה חוץ-תאית (ECAR), כימות ATP, ניצול סובסטרט, פרופילינג או ניתוח מטבוליטים במחזור קרבס, ומעקב אחר איזוטופים¹. מבין הטכניקות הללו, OCR משמש כאינדיקטור מרכזי לנשימה מיטוכונדריאלית וניתן להעריך אותו באמצעות כלים כגון מסריפת נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR; לדוגמה, Oroboros O₂ ^k)2, אלקטרודה מסוג קלארק או מנתח שטף חוץ-תאי

מערכת Oroboros O₂k מודדת ריכוז O₂ בתא אטום_{באמצעות חיישן} O 2 פולרוגרפי מסוג קלארק (POS)^3,4,5 ומתאימה לדגימות כמו מיטוכונדריה מבודדת, תאים חדירים והומוגנטים של רקמות. הוא מורכב מקתודה זהב/פלטינה, אנודת כסף ומאגר אלקטרוליטים KCl המופרדים מהדגימה באמצעות ממברנת פרופילן פלואורית אתילן פלואורית (FEP)_חדירה ועמידה כימית בגודל 25 מיקרון O 2. אלקטרודה מסוג קלארק³ פועלת גם היא בתא סגור, ומזהה שינויים בריכוז חמצן₂ באמצעות אלקטרודה רגישה_{ל-O 2}, והיא משמשת בדרך כלל למיטוכונדריה מבודדת או תלויות תאים. לעומת זאת, מנתח השטף החוץ-תאי מכמת את OCR ו-ECAR בתאים דבקים חיים או במיטוכונדריה מבודדת באמצעות חיישני פלואורסצנטיים המוטמעים במיקרופלטות, ומאפשר פרופיל מטבולי בקצב גבוה. יתרון מעשי של פלטפורמת אנלייזר השטף החוץ-תאית הוא הערכה אוטומטית ורב-פרמטרית בתנאים מרובים במקביל, בעוד שמערכות סגורות (כגון HRR או אלקטרודות מסוג קלארק) בדרך כלל מספקות תפוקה נמוכה יותר ודורשות טיפול ידני רב יותר.

אנלייזר השטף החוץ-תאי שימושי במיוחד להערכת תפקוד מיטוכונדריה בתאים דבקים שלמים או בתאי תלייה המתיישבים בתחתית המיקרופלטה. במבחנים המשתמשים בתאים דבקים שלמים, ניתן לפרופיל את מטבוליזם האנרגיה המיטוכונדריאלית באמצעות סובסטרטים כמו גלוקוז או פירובט⁶. חלופה נוספת היא בדיקות המשתמשות בכמויות קטנות של שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מאפשרות מדידה רציפה של נשימה בסיסית, נשימה מונעת על ידי ADP (מצב 3), נשימה במנוחה (מצב 4), ונשימה מגויה ללא מקשר באמצעות שילובים של סובסטרטים ומעכבים⁷. עם זאת, במערכות תאים שלמות, מטבוליטים במחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA) שאינם חדירים לתאים אינם יכולים לשמש להערכת חילוף החומרים שלהם ישירות. בעוד שמיטוכונדריה מבודדת מאפשרת שימוש במטבוליטים כאלה בשל היעדר מחסומי ממברנה בפלזמה. ניתוח הגישה הביואנרגטית של מיטוכונדריאלית מבודדת ומועשרת סובל ממגבלות: מבנה המיטוכונדריה יכול להשתנות במהלך הבידוד, וגורמים ציטוזוליים המשפיעים על מטבוליזם המיטוכונדריה והובלת מטבוליטים מופחתים או נעדרים. בהתאם לכך, גישות פרמיאביליזציה סלקטיביות משמשות לעיתים כפשרה שיכולה לשמר היבטים של ארכיטקטורת התא תוך מתן גישה מבוקרת למיטוכונדריה. כדי להתגבר על המגבלות של שימוש בתאים שלמים או מיטוכונדריה מבודדת לבדיקות מטבוליות, פרוטוקול זה מתאר שיטה לחדירת תאי נוירובלסטומה דבקים (BE(2)-C) באמצעות דיגיטונין. גישה זו מאפשרת ייבוא מטבוליטים שאינם תאי דרך ממברנת הפלזמה, תוך שמירה על תגובות מיטוכונדריאליות פונקציונליות לסובסטרטים ומעכבים מוגדרים.

הסלקטיביות של דיגיטונין מבוססת על הבדלים בהרכב השומנים של הממברנה: ממברנת הפלזמה עשירה בכולסטרול, בעוד שממברנות המיטוכונדריאל—במיוחד הממברנה הפנימית—מכילות מעט מאוד כולסטרול⁸. בריכוזים נמוכים, דיגיטונין (או סאפונין) חודר באופן סלקטיבי ומלא לממברנת הפלזמה בשל תכולת הכולסטרול הגבוהה בו, בעוד שקרומנותיו המיטוכונדריות מושפעות רק בריכוזים גבוהים^{יותר 9,10}. דיגיטונין נקשר לכולסטרול ויוצר נקבוביות בקרום הפלזמה, ומאפשר למולקולות קטנות כמו ביניים במחזור TCA להיכנס לציטוזול מבלי להפריע למבנה או לתפקוד המיטוכונדריאלי כאשר הם מאופטמים כראוי. גישה זו מתאימה במיוחד לתאים מתורבתים שניתן לצלום באופן חוזר כשכבות מונו-שכבות דבקות במיקרופלטה של מנתח שטף חוץ-תאי, ודורשת טיטרציה אמפירית של ריכוז הדיגטונין לכל סוג תא וצפיפות זריעה. אינדיקטורים תפעוליים של שלמות מיטוכונדריה נשמרת כוללים תגובות OCR חזקות ורגישות למעכבים (למשל, ירידות צפויות עם רוטנון/אנטימיצין A ונשימה שלמה מונעת קומפלקס IV עם אסקורבט/TMPD), יחד עם היעדר קריסת OCR שתסמן חדירות יתר. לכן, יש לבצע אופטימיזציה של דיגיטונין לפני השוואות ניסיוניות ולחזור על עצמה כאשר תנאי התרבית או צפיפות התא משתנים. יתרה מזאת, ריכוז הדיגיטונין האופטימלי משתנה לפי סוג התא ויש לקבוע אותו אמפירית כדי לקבוע חלון חדירות שמאפשר כניסה של סובסטרטים אימפרמיים (למשל, סוקסינט) תוך שמירה על תפקוד מיטוכונדריה רגיש למעכבים. במחקר זה, אנו ממחישים עיקרון זה על ידי אופטימיזציה של דיגיטונין לא רק בתאי BE(2)-C, אלא גם בתאי HEK293 ובנוירונים ראשוניים של הגנגליון השורש הגבי של העכברים (DRG).

פרוטוקול זה הודגם באמצעות תאי נוירובלסטומה BE(2)-C, שבודדו במקור ממוחו של גבר עם נוירובלסטומה. תאי BE(2)-C מבטאים קולטנים מוסקריניים שונים, במיוחד הקולטן הכולינרגי מוסקריני סוג 1 (CHRM1). במחקרים הקודמים שלנו הראינו כי CHRM1 קשור למיטוכונדריה הן בגופי התאים והן בנויריטים של נוירוני גנגליון שורש גבי של עכברוש מתורבת, וכן בתאי HEK293 שעברו טרנספקט CHRM1¹¹. יתרה מזאת, מחיקה גנטית של Chrm1 בעכברים משנה היבטים רבים של מבנה ותפקוד המיטוכונדריה^12,13. לכן, אנו משערים שתאי BE(2)-C יכולים לשמש לחקירת ההשפעות המודולטוריות של ליגנדים מוסקריניים על תפקוד OXPHOS. בהדגמה זו בחנו את השפעות החומרים המוסקריניים — כולל אגוניסטים אצטילכולין, האנטגוניסט המוטה פירנצפין¹⁴, והאנטגוניסט אטרופין — על נשימת מיטוכונדריאלית בנוכחות סוקסינט או פירובאט/מלאט כסובסטרטים והשווינו את השפעתם.

Protocol

1. הפשרה וציפוי ראשוני

הערה: המדיום הבסיסי לתאי BE(2)-C הוא תערובת 1:1 של מדיום Eagle's Minimum Essential Medium ו-F12 Medium שנוסחו על ידי ATCC, בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 10%.

1. הפשרה של תאי BE(2)-C קפואים מתאי קריוביאל באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה את התאים 200 × גרם למשך 5 דקות כדי להסיר את המגן הקריופרוטנטי.
2. החזירו את כדור התא לתחום גדילה מלא וצלחו את התאים בצלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂ באוויר עד שהתאים מגיעים לתת-מפגש (תת-מפגש מגוונים).

2. תת-תרבות

1. תת-תרבית של התאים במשך 2–3 מעברים כדי להבטיח שהם מגיעים לשלב גדילה אקספוננציאלי יציב.

3. טריפסיניזציה והכנת תלים חד-תאיים

1. כאשר התרבית מגיעה ל-60–80% התנגשות, יש לטריפסינז את התאים. העבר את מתליית התא מספר פעמים דרך פיפטות העברה עם קצה דק עם קצות מלוטשים כדי להפריד גושים ולהשיג תלייה חד-תאית.
2. הוסף מדיום טרי המכיל FBS כדי לנטרל את הטריפסין. צנטריפוגות את התאים ב-200 × גרם למשך 5 דקות כדי להזריק אותם.

4. פרוטוקול זריעת תאים למיקרופלטות תרבית תאים עם 24 בארות המשמשים באנלייזר שטף חוץ-תאי

1. החזירו את הכדור לתווך מלא בריכוז סופי של 10,000 תאים ל-100 מיקרוליטר לבאר.
2. זרעו את התאים בצפיפות אופטימלית כדי להבטיח שיגיעו למפגישה מלאה בתוך יום–יומיים. השאירו או את ארבעת הבארות בפינות או באר פינה אחת ריקות, בהתאם לעיצוב הניסוי. הבארות הללו ישמשו כבקרות רקע.
   הערה: ייתכן שזה ידרוש ניסוי וטעייה, כולל התאמות בנפח המדיה ובתזמון.
3. עקבו אחרי התרבית לשינויים בצבע המדיה — הצהבה מעידה על ירידה ב-pH ומחייבת החלפה מיידית במדיום טרי לשמירה על בריאות התא.

5. הכנה לבדיקה מבוססת אנלייזר שטף חוץ-תאי

הערה: פורמטים של בדיקת צימוד וזרימת אלקטרונים כאן פועלים לפי תהליכי נשימה מיטוכונדריאלית מבוססי מיקרופלטות⁷, עם שינויים הכוללים חדירות תאי BE(2)-C באמצעות טיטרציה של דיגיטונין ותנאי טיפול בליגנד מוסקריני.

1. הכינו תמיסות מלאיות ו-2x תמיסת בדיקה מיטוכונדריאלית (MAS). הכינו מראש 2 תערובות MAS ותמיסות מאגר (סובסטרטים ומעכבים) (ראו טבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3).
2. אחסן את כל פתרונות המלאי וה-MAS בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי, מה שמאפשר הקמת מבחנים יעילה.
   בטיחות: רוטנון, אנטימיצין A, אוליגומיצין, FCCP, דיגיטונין ו-TMPD הם מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. כל תמיסות המלאי של המעכבים צריכות להיות מוכנות ומטופלות באמצעות מכסה אדים כימי מוסמך תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות ניטריל והגנה על עיניים). תמיסות המכילות תגובות אלו, וכן פסולת המכילות DMSO, צריכות להיאסף ולהיפטר מפסולת כימית מסוכנת בהתאם לתקנות מוסדיות ומקומיות. יש לנקות את משטחי העבודה לאחר השימוש.
3. הרטבת מחסנית החיישן
   1. בלילה שלפני הניסוי, יש להרטיב את מחסנית חיישן אנלייזר השטף החוץ-תאי על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר כיול מחסנית חיישן או סליין מפוזר (PBS, pH 7.4) לכל באר. תן למחסנית החיישן לעמוד ללילה (12–18 שעות) בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס).
      הערה: אינקובציה באינקובטור ללא CO₂ בטמפרטורה של 37°C אינה הכרחית, שכן המקלט יתאזן לטמפרטורת החדר במהלך תהליך הטעינה. לאחר שמונחים באנלייזר השטף החוץ-תאי לכיול, המחסנית תגיע ל-37 מעלות צלזיוס תוך כ-15 דקות.

6. יום הניסוי

הערה: הכינו את כל התמיסות טריות, כווננו את ה-pH במידת הצורך, והשאירו על הקרח עד השימוש.

1. הפשיר את מצעי הקרקע הקפואים ו-2x MAS בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) למשך 15–30 דקות או באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5–10 דקות.
2. הכינו את כל התתמיסות של המצע וההזרקה (ראו טבלה 4, טבלה 5, טבלה 6 וטבלה 7) ואשרו שה-pH הוא 7.4. התאם אם צריך והשאיר את התמיסות על הקרח עד השימוש. השתמשו בטבלה 4 ובטבלה 5 לבדיקת הצימוד. לבדיקת זרימת אלקטרונים, השתמשו בטבלאות 6 ובטבלה 7.
3. טעינו את המעכבים והתת-קרבעים לפתחים המתאימים של מחסנית החיישן והכינו את עצמם לביצוע הבדיקה. בהתאם לסוג המבחן — מבחן קישור או מבחן זרימת אלקטרונים ⁷ — יש להתייחס לטבלאות 4 וטבלה 5 או לטבלה 6 וטבלה 7, בהתאמה, לפי הצורך.
4. הכינו את כל תמיסות המצע והמעכבים לנפחים סופיים מוגדרים (תערובות בתפזות: 15 מ"ל; תערובות הזרקת מחסנית: 2 מ"ל לכל פורט). חישב ריכוזים להשגת הריכוזים הסופיים הרצויים בתוך הבאר לאחר הזרקה (נפח באר סופי: 700 מיקרוליטר לאחר פורט D).
5. הוסף 450 מיקרוליטר של תמיסת הבדיקה המוכנה לכל באר של לוח ניתוח שטף חוץ-תאי עם 24 בארות המכיל ליגנדים מוסקריניים (ריכוז הליגנד הסופי: 1 מיקרומון; נפח באר כולל: 500 מיקרוליטר). ודא שכל באר כבר מכילה 50 מיקרוליטר של 1x MAS buffer ותאים שקועים.
   הערה: בצע שלב זה מיד לפני טעינת הפלטה לאנלייזר.
6. טעין 50 מיקרוליטר מכל תגובה מוכן לתוך פורט ההזרקה המתאים של מחסנית החיישן.

7. תכנות מכשירים וביצוע בדיקות

1. הפעל את מנתח השטף החוץ-תאי לפחות שעה עד שעתיים לפני הניסוי כדי לאפשר לאינקובטור הפנימי להתייצב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שמור על התא בטמפרטורה של 37°C לאורך כל הכיול וביצוע הבדיקה.
2. תכנת את האנלייזר לבצע את מחזורי הערבוב, ההמתנה והמדידה המתאימים לפי טבלה 8.
3. בארות תיוג וקבוצות ניסוי בתוכנה בהתאם לעיצוב הניסוי.
4. תתחיל את ריצת הבדיקה. אפשר למכשיר לכייל את מחסנית החיישן (~15 דקות).
5. הכינו את לוח הבדיקה לטעינה במהלך כיול המחסנית. התעכבות בטעינה במידת הצורך; מקלט החיישן יישאר יציב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתוך המכשיר.
6. השלים את הבדיקה כאשר מחזור המדידה הסופי לאחר הזרקת פורט D מסתיים. המשך מיד לנירמול לאחר הבדיקה ולניתוח נתונים.

8. הכנת לוחות תא לבדיקת אנלייזר שטף חוץ-תאי

1. התחל להכין את לוח התא מיד לאחר הכנסת מחסנית החיישן לאנלייזר לכיול. הוסף 700 מיקרוליטר של 1x MAS buffer לכל באר המכילה תאים דבקים. דגרו בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) למשך דקה.
2. שאפו בזהירות את הבופר מבלי להפריע לתאים מחוברים. חזור על שלב השטיפה לפחות 3 על 1 דקות כדי להסיר את שארית המדיום ולהשלים את כל השטיפות תוך 10 דקות.
3. הוסף 50 מיקרוליטר של 1x MAS buffer לבאר רקע ייעודית (ללא תאים) כדי ליצור ייחוס נפח חזותי.
4. שואב בופר מבארות ניסיוניות, ומשאיר כ-50 מיקרוליטר של בופר שאריתי בכל באר.
5. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, תוך שמירה על הפלטת מעל פני המים כדי למנוע אידוי. שמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (מקסימום 20 דקות) לפני הטעינה.
6. מיד לפני טעינת הלוח, הוסף 450 מיקרוליטר של בופר MAS 1x המכיל את המצע המתאים לכל באר כדי להגיע לנפח סופי של 500 מיקרוליטר.
7. הכנס את הצלחת למנתח השטף החוץ-תאי.

9. סיום הבדיקה וניתוח הנתונים

1. הסר את פלטת התא ומחסנית החיישן מהאנלייזר לאחר סיום ההפעלה.
2. נרמול ערכי OCR לכל באר באמצעות כימות חלבון כולל או ספירת תאים כוללת. תאי לייז עם בופר RIPA וכימות את כל החלבון באמצעות מבחן ברדפורד או בדיקת חלבון ספקטרופוטומטרית אחרת.
3. נרמול ערכי OCR באמצעות תוכנת הניתוח וייצא נתונים לפי הצורך.
4. יישם את קריטריוני הקבלה הבאים: לאשר יציבות בסיסית של OCR (≤15% סטייה בשני מחזורי מדידה רצופים) ולאשר הפחתה ב-OCR של ≥60% לאחר הזרקת רוטנון, אוליגומיצין או אנטימיצין A.
5. יש להוציא ריצות שאינן עומדות בקריטריונים אלו ולייעל מחדש את ריכוז הפרמיאבילייזר או את צפיפות הזריעה של התאים לפי הצורך.

10. ייצוא תוצאות

1. הכנס כונן USB למכשיר.
2. יייצא את נתוני הבדיקה.

11. עיבוד נתונים

1. נתח נתונים באמצעות תוכנת הכלי.
2. ייצוא נתונים מעובדים בפורמטים התואמים לתוכנת ניתוח מועדפת לניתוח והדמיה נוספת.

Results

אופטימיזציה של ריכוז דיגיטונין לחדירות תאי C של BE(2) במבחן צימוד
בתחילת הפרוטוקול הזה, קבענו את ריכוז הדיג'טונין האופטימלי הנדרש לחדירות תאים יעילה מבלי לפגוע בנשימת המיטוכונדריה. בפרוטוקול זה, בדקנו ריכוזי התחלה של 5 מיקרומום ו-10 מיקרומום דיגיטונין וביצענו בדיקת צימוד. בדיקה זו מעריכה את מידת הקישור בין ה-ETC למנגנון OXPHOS, ומאפשרת לנו להבחין בין נשימה מונעת ETC ל-OXPHOS. רוטנון שימש לעיכוב קומפלקס I, בעוד שסוקסינאט שימש כתורם אלקטרונים לקומפלקס II, הניע את זרימת ...

Discussion

מחקר זה מציג פרוטוקול מהיר וחסכוני להערכת מודולציה של OXPHOS בתאי נוירובלסטומה מתורבתים על ידי ליגנד מוסקריני. על ידי שימוש בדיגיטונין הפרמייביליזר הסלקטיבי של ממברנת הפלזמה, בשילוב עם זוגות מוגדרים של סובסטרטי-מעכב, אפשרנו אספקה ממוקדת של מצעים מטבוליים כמו סוקסינאט ישירות למיטוכונדריה במקום. גישה זו מתגברת על המגבלות של ממברנות תא שלמות, שבדרך כלל מגבילות את הגישה למחזורי TCA מרכזיים. חשוב לציין שהפרוטוקול שומר על ארכיטקטורה תאית ואינטראקציות ציטוזוליות, ומציע פלטפורמה פיזיולו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אצטילכולין כלוריד	מיליפורסיגמא	A6625	אגוניסט מוסקריני
ADP	MP Biomedicals, Inc.	ICN19014901	מקבל אלקטרונים, מצע לסינתזת ATP.
אנטימיצין A	AAJ63522MA	תרמו-סיינטיפיק	מעכב קומפלקס מיטוכונדריאלי III
אטרופין	מיליפורסיגמא	1044990	האנטגוניסט המוסקריני
תאי Be2C	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	CRL-2268	תא נוירובלסט שבודד ממוחו של גבר עם נוירובלסטומה, מבטא קולטן מוסקריני
דיגיטונין	מיליפורסיגמא	D141	דטרגנט עדין, חודר ממברנה.
D-מניטול	תרמו-סיינטיקה כימיקלים	AA3334236	אלכוהול סוכר שאינו ניתן למטבוליזציה, המשמש לייצוב אוסמוטי והגנה על הממברנה
EGTA	מיליפורסיגמא	E0396	כילציה של סידן, מונעת הפעלה של פרוטאזות תלויי סידן ואנזימים אחרים שעלולים לפרק חלבונים מיטוכונדריאליים.
BSA ללא חומצות שומן	מיליפורסיגמא	126575	מונע השפעות לא מבוקרות של חומצות שומן, מייצב מיטוכונדריה
FCCP	קיימן כימיקל	NC0904863	פרוטונופור ומפריד של פוספורילציה חמצונית במיטוכונדריה
HEPES	מיליפורסיגמא	391340	בופרינג pH, תאימות לתפקוד מיטוכונדריה
L-אסקורבייט	TCI אמריקה	A053925G	מחזור TCA ביניים, תת-קרקע של OXPHOS
כלוריד מגנזיום	מיליפורסיגמא	M8266	לאיזון יוני, תמיכה בפעילות אנזימטית
N1,N1,N1,N1,N1-טטרמתיל-1,4-פנילן דיאמין (TMPD)			תורם אלקטרונים לציטוכרום c, הערכת פונקציית IV מורכבת על ידי עקיפת קומפלקס I ו-II, TMPD/אסקורבט מאפשר מדידה ישירה של צריכת חמצן התלויה בקומפלקס IV
אוליגומיצין	מיליפורסיגמא	1404-19-9	מעכב סינתזת ATP מיטוכונדריאלית, קומפלקס V
פירנצפין דיהידרוכלוריד	מיליפורסיגמא	P7412	אגוניסט מוסקריני מוטה
חומצה פירוביק	תרמו-סיינטיקה כימיקלים	AC132155000	מצע מחזור TCA
רוטנונה	מיליפורסיגמא	557368	מעכב קומפלקס מיטוכונדריה I
לוחות מיקרופלטות תרבית תאים של Seahorse XF24 V7 PS	אג'ילנט	102340-100	מיקרולוחות תרביות תאים
אנלייזר Seahorse XFe24	אג'ילנט	S7801BR	אנלייזרים Agilent Seahorse XFe24 מודדים את קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) של תאים חיים בפורמט לוחות של 24 בארות.
חומצה סוקסינית	פישר כימיקל	AC158742500	מחזור TCA ביניים, תת-קרקע של OXPHOS
בופר כיול מחסנית לחיישן XFe24	אג'ילנט	102340100	pH 7.2 במאגר PBS
מחסניות חיישן XFe24	אג'ילנט	102340-100	חיישן למדידת OCR ו-ECAR