מאמר שיטה

פרופיל נגישות כרומטין בזחלים שלמים של Caenorhabditis elegans L4

352 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69791

⸱

17 באפריל 2026

 ,  , 
1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ATAC-seq מהיר ופשוט שיושם בתולעת שלמה בשלב L4 Caenorhabditis elegans באמצעות 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת בלבד.

תקציר

נגישות הכרומטין ממלאת תפקידים חיוניים בשעתוק, תיקון DNA והפרדת כרומוזומים. אזורים נגישים במיוחד בדרך כלל קשורים לפרומטורים ומגבירים פעילים, ומאפשרים קישור פקטורי שעתוק ופעילות רגולטורית. המבחן לכרומטין הנגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq) מאפשר פרופילינג גנומי רחב של נגישות הכרומטין עם מעט מאוד תאים. עם זאת, יישומו ב-Caenorhabditis elegans מוגבל על ידי קוטיקולה הקולגן העשירה של הנמטודה שמסבכת את פירוק התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לביצוע ATAC-seq בתולעים שלמות בשלב L4. ההליך מתחיל בתרביות מסונכרנות וכולל הפרעות בקוטיקולה, דיסוציאציה אנזימטית והכנת תליית תאים. גרעינים חמורים עוברים לאחר מכן טרנספוזיציה של Tn5, ולאחר מכן הגברה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) וטיהור ספריות מוכנות לרצף מהדור הבא (NGS). פרוטוקול זה דורש 30 מיקרוליטר של כדור תולעת, ניתן להשלמה ביום אחד, ומייצר 5,000–9,000 שיאי נגישות בזן ההתייחסות של בריסטול N2. תהליך עבודה יעיל זה יכול להיות מותאם לשלבים התפתחותיים אחרים או לאוכלוסיות תאים מטוהרות על ידי FACS. על ידי הפחתת מחסומים טכניים ל-ATAC-seq ב-C. elegans, שיטה זו מרחיבה את ההזדמנויות לחקר נגישות כרומטין כלל-גנומי בתגובה להפרעות גנטיות וסביבתיות בהקשר של אורגניזם שלם.

מבוא

גנומים אאוקריוטיים דחוסים בצפיפות בתוך גרעין התא. כדי להתמודד עם מגבלות מרחביות, ה-DNA עטוף באופן הדוק סביב נוקלאוזומים, קומפלקסים רב-חלבונים המורכבים משמונה היסטונים השמורים היטב בפילותשונות 1. דפוסי נגישות הכרומטין משתנים בהתאם למצב התא ברקמה, ולדפוסים ספציפיים לגנים 2,3,4. נגישות נוקלאוזומים קשורה קשר חזק לשעתוק פעיל, במיוחד בפרומטורים ובאזורים רגולטוריים מרוחקים כגון משפרים, הנגישים לגורמי שעתוק5. אזורים פתוחים של כרומטין ממלאים גם תפקידים חשובים בתיקון DNA, שכפול והפרדת כרומוזומים3. לעומת זאת, נגישות מופחתת בדרך כלל קשורה להטרוכרומטין מושתק ולרצפים חוזרים 6,7.

מיפוי נגישות הכרומטין היה גישה עוצמתית להבנת ויסות הגנים. טכניקות שונות שימשו כדי לבחון את נגישות הכרומטין. בין השיטות הראשונות, נעשה שימוש בעיכול נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase) ו-DNase I למיפוי מיקום ונגישות נוקלאוזומים בלוקוסי 8,9 ספציפיים. טכניקות אלו יושמו מאוחר יותר למחקרים כלל-גנומיים כאשר שולבו עם ריצוף דור חדש (NGS)10,11. עם זאת, טכניקות אלו דורשות כיול מדויק של ריכוז האנזים וזמן התגובה, יחד עם מספר משמעותי של תאים, ליישום מוצלח.

בשנת 2013, מעבדת גרינליף קבעה את הבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז באמצעות ריצוף (ATAC-seq) למיפוי חלק של נגישות כרומטין ברמת הגנום הכוללת באמצעות מספר נמוך של תאים12. ATAC-seq מנצל את הטרנספוזאז Tn5 הזמין מסחרית כדי להחדיר באופן מועדף רצפי DNA קצרים (כלומר, ברקודים) לאזורי כרומטין פתוחים, בדרך כלל ללא נוקלאוזומים, ומתאם עם פרומטורים ומגבירים פעילים. הפרוטוקול דורש חדירות תאים ובידוד גרעינים, ואחריו עיכול מוגבל עם Tn5 לתיוג כרומטין נגיש במיוחד. בהמשך, אינדקסים משלימים משולבים במהלך PCR, מה שמקל על ריבוב דגימות לפני NGS13. ATAC-seq הוכיח את עצמו כפרוטוקול חזק שמאפשר גם טביעת רגל של פקטור שעתוק בסיליקו ויושם ברזולוציה חד-תאית 14,15,16,17. בנוסף לעכברים ולדגימות אדם, ATAC-seq יושם במערכות שונות, כולל דגי זברה וחסרי חוליות כמו דרוזופילה והנמטודה Caenorhabditis elegans 18,19,20.

במשך עשרות שנים, C. elegans הייתה מערכת מודלים עוצמתית בתחומים כמו פיתוח, ביולוגיה תאית ומדעי המוח, והובילה לתגליות פורצות דרך כולל זיהוי מיקרו-RNA והפרעות RNA (RNAi)21,22. יש לו גנום קומפקטי של 100 מגה-בייט עם ~20,000 גנים מקודדי חלבונים23. ויסות הגנים מתרחש דרך פעילות פרומוטרים וכן משפרים מרוחקים, אשר מופו באמצעות ATAC-seq ברקמות שונות, שלבי התפתחות ונקודות זמן הזדקנות24,18. פרופיל נגישות כרומטין הפך אפוא לכלי חשוב להבנת ויסות גנים אצל C. elegans. כתוצאה מכך, ATAC-seq מבטיח במיוחד לחקר נופים אפיגנטיים בתנאי סביבה שונים או מבודדים פראיים כדי לחשוף תגובות שעתוק מגוונות. בנוסף, היא עשויה לספק תובנות לגבי ארכיטקטורת הכרומטין של נמטודות פתוגניות ולא-פתוגניות אחרות.

אחד האתגרים המתודולוגיים המרכזיים ב-C. elegans הוא נוכחות של קוטיקולה עשירה בקולגן שיש להפריד אותה כדי לקבל תלות תא הומוגניות מתולעיםשלמות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אספנו ואופטימיזציה של פרוטוקולים שונים לפירוק הנמטודות ואז לבצע ATAC-seq ב-C. elegans18,26. השימוש בשלב הזחל L4 מועדף, שכן בעלי חיים בנקודת התפתחות זו מחזיקים בקו נבט פעיל שעתוק, המתורגם לכרומטין פתוח, ומספק מקור עקבי ומעשיר לנגישות כרומטין בתאים סומטיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מהיר ויעיל לפירוק תולעים ויצירת תליית תאים, המאפשר ATAC-seq ב-C. elegans. השיטה שלנו מותאמת במיוחד לתולעים בשלב L4 ודורשת עד 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת, עם פוטנציאל להתאמה לשלבים התפתחותיים אחרים או לדגימות קטנות יותר, כגון תאים מטוהרים ב-FACS. פרוטוקול זה יכול להתבצע בזנים ותנאים שונים של C. elegans, ומאפשר זיהוי של 5,000–9,000 שיאי נגישות כרומטין בזן הייחוס Bristol-N2, מה שמניח את היסודות לניתוחי נגישות כרומטין נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מומלץ ללבוש כפפות בכל עת.

הערה: יום 1: הכנת אוכלוסיית התולעים המסונכרנת. כל התולעים גודלו על לוחות NGM שזרעו ב-E. coli OP50. הדברים הנדרשים לפני ההתחלה: (לכל דגימה או זן), לוח תולעת בוגרים בקוטר 90 מ"מ או שני צלחת תולעת בוגרת בקוטר 60 מ"מ, אחד 90 מ"מ או שני לוחות 60 מ"מ עם מזון, בופר סטריליM9 27 (3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל 1 M MgSO4, H2O עד 1 L. סטריליזציה באמצעות אוטוקלב)

1. איסוף תולעים

  1. קחו לוח בגודל 90 מ"מ (או שניים בגודל 30 מ"מ) עם אוכלוסיית הבוגרים של התולעת.
  2. לשחזר את התולעים עם בופר M9 ולהעביר אותן לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  3. חזור על השלב הקודם כדי לשחזר את כל התולעים מהצלחת(ות).
  4. תן לתולעים לשקוע בצינור של 15 מ"ל לדקה ולהסיר בזהירות את בופר ה-M9.
  5. תוודא שיש לך ~1 מ"ל תולעים.

2. הלבנה

  1. הוסף 5 מ"ל של בופר M9 + 650 מיקרוליטר של NaOH 5M + 1,300 מיקרוליטר אקונומיקה ביתית (5% תמיסה של NaClO).
  2. מערבולת במהירות מקסימלית למשך 1–2 דקות (לא יותר מ-2.5 דקות).
  3. צנטריפוגט ב-1,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
  4. הסר את הסופרנטנט והוסיף 9 מ"ל של בופר M9.
  5. חזור על קטעים 2.3 ו-2.4 עוד חמש פעמים.
  6. החזירו את העוברים ל-7 מ"ל של בופר M9.
    הערה: פרוטוקול ההלבנה עשוי להשתנות ביעילות בהתאם לטמפרטורה, לסוג האקונומיקה המסחרית28.

3. בקיעה בלילה של M9 (נוזלי)

  1. ודאו שצינור האיסוף עם הביצים המולבינות סגור כראוי.
  2. שים את הצינור בתנועה איטית בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס (למשל, בשייקר בתוך חדר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס).
  3. התולעים יבקעו בלילה וייעצרו ב-L1.
    הערה: אל תשאיר את הצינור ליותר מ-12 שעות.

4. יום 2: צמיחת תולעים: החלמת תולעי L1 .

  1. קח את הצינור מהשייקר ואמת תחת מיקרוסקופ שיש תולעים מסוג L1 .
  2. תן לצינור לשקוע אנכית בערך שעה ב-RT.
  3. הסר את הסופרנטנט והעבר ~300 תולעים L1 לצלחות 90 מ"מ אחת או לשתי צלחות 30 מ"מ עם מזון.
  4. הניחו אותם באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס ותנו להם לגדול במשך 26 שעות עד שיגיעו לשלב L4.

5. יום 3: הכנת פתרונות מלאיים: יש להכין את הפתרונות הבאים לייצור פתרונות חדשים ביום 4

הערה: אפשר לעשות זאת ביום השני או השלישי.

  1. 1 מ"ל של 10% SDS.
  2. 50 מ"ל של 1M HEPES pH 8 (אוטוקלאב).
  3. 250 מ"ל של 20% סוכרוז (אוטוקלאב).
  4. 100 מ"ל של 2M NaCl: הכן (אוטוקלאב).
  5. 50 מ"ל של 2M KCl (אוטוקלאב).
  6. 10 מ"ל של 1M CaCl2 (אוטוקלאב).
  7. 10 מ"ל של 1M MgCl2 (אוטוקלאב).
  8. 100 מ"ל של 1M Tris, pH 7.4.
  9. 5 מ"ל של 5M NaCl (אוטוקלאב).
  10. 500 מיקרוליטר של 10% טווין-20.
  11. 500 מיקרוליטר של 10% Nonidet P40/IGEPAL.
  12. 100 מיקרוליטר של 5% דיגיטונין (יש לחמם ל-65 מעלות צלזיוס כדי להמיס).
  13. 500 מיקרוליטר של 10% BSA (מסנן עם 0.22 מיקרון) מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    יום 4: תולעים בשלב L4 עבור ATAC
    הערה: לפני ההתחלה, ודאו שיש חממה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס מוכנה, לחמם את הדגיטונין ל-65 מעלות צלזיוס (להכנת בופר טרי), להחזיק בופר M9 סטרילי, מסנני H2O סטריליים ו-20 מיקרון.

6. הכנת תמיסה

  1. הכינו פתרונות טריים (ראו טבלה 1). תמיד לטפל ב-L-15 10% FBS ובביצים בתנאים סטריליים ולשמור עליהם קרים.

טבלה 1: מלאי להכנת תמיסה טרייה. מתכונים להכנת ציר לפירוק נמטודות ופרוטוקול השעיית תאים (סעיפים 6 ו-7). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

7. דיסוציאציה של נמטודות ופרוטוקול השעיית תאים

הערה: יידרשו לוח אחד בקוטר 90 מ"מ או שניים בקוטר 30 מ"מ עם אוכלוסיית תולעים מסונכרנת L4.

  1. לאחר 26 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, יש לאמת תחת מיקרוסקופ שרוב התולעים נמצאות בשלב L4.
  2. לשחזר את כל התולעים מהלוחות עם בופר M9 ולשים אותן בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  3. שטוף 5 פעמים עם 1 מ"לH2O סטרילי על ידי מתן לתולעים לשקוע בכוח הכבידה.
  4. העבר את הצינור עם התולעים לאינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להיפטר משאריות מזון מהמעיים.
  5. קח 50 מיקרו ליטר של כדור התולעת והכניס אותו לצינור חדש.
  6. הוסף 200 מיקרוליטר של בופר SDS-DTT טרי וערבב עם רוטטור צינורות בדיוק ל-5 דקות (לא יותר).
  7. הוסף 1 מ"ל של בופר ביצה קרה ותן סיבוב על פיקופוגה כדי להסיר את הסופרנטנט. חזור על זה 6 פעמים.
  8. הוסיפו 80 מיקרו-ליטר של פרונאז טרי מוכן (15 מ"ג/מ"ל).
  9. עם פיפטה של 200 מיקרוליטר (עם קצוות מסוננים), ערבבו 70 פעמים את תערובת התולעים והפרונאז ודגרו במשך 15 דקות ב-RT.
  10. הוסיפו 800 מיקרוליטר של מדיום L-15 עם 10% FBS וצנטריפוגה 5 דקות בטמפרטורה של 500 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  11. מוסיפים 1 מ״ל של מדיום L-15 עם 10% FBS וחוזרים על הצנטריפוגה.
  12. חזור על השלב הקודם פעמיים נוספות.
  13. הסר את הסופרנטנט והשלים מחדש ב-900 מיקרוליטר של מדיום L-15 עם 10% FBS.
  14. מסנן עם פילטר של 20 מיקרון.

8. בידוד גרעינים ותיג כרומטין

הערה: השתמשו בקצוות פילטרים עם פיפטה. לפני שמתחילים: הוצא את בופר Tn5, נותן לו להפשיר, כוון תרמובלוק ל-37 מעלות צלזיוס, הוצא ערכת טיהור מוצר PCR (טבלת חומרים), שים בופר EB ב-37 מעלות צלזיוס, יש לבצע צנטריפוגה של העמודות ב-RT.

  1. צנטריפוגה את מתלה התא המסונן למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 x g בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. הסר סופרנאנט, משאיר ~50 מיקרוליטר.
  3. הוסיפו 45 מיקרולטר של בופר ליזיס (טרי) ותשאו בזהירות את הבופר מחדש.
  4. הוסיפו בזהירות 50 מיקרו ליטר של בופר שטיפה (אל תערבבו).
  5. צנטריפוגה ל-5 דקות 500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט. תשאיר את זה בקרח.
  6. במהלך הסיבוב, יש להכין לכל תגובה (Rx) את תערובת Tn5 הבאה לכל דגימה: 25 מיקרוליטר Tn5 בופר29, 24.8 מיקרוליטר H2O, 0.2 מיקרו-ליטר Tn5. הכינו מיקס מאסטר למספר דגימות שונות.
  7. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט. שמרו על הגרעינים על הקרח. הוסיפו 50 מיקרוליטר תערובת Tn5 לכדור הגרעינים והפיפטה באיטיות שבע פעמים. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על תרמובלוק. תוודא לתת טפיחות קטנות לכל צינור כל 10 דקות.
    הערה: הסר את ערכת טיהור ה-PCR והנח את בופר ה-EB באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. חמשת השלבים הבאים ישתמשו במאגרים של הערכה הזו.
  8. לאחר דגירה של Tn5, הוסף 300 מיקרוליטר של בופר PB (צהוב) מהערכה ומערבב מערבולת במהירות מקסימלית למשך 25 שניות.
  9. קח את כל הנפח מהצינור והעבר אותו לעמוד הסיבוב (סגול, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) ולצנטריפוגה דקה אחת במהירות מקסימלית ב-RT.
    הערה: העמודה תכיל את ה-DNA, כך שניתן להשליך את הסופרנטנט באמינות.
  10. הוסיפו 750 מיקרוליטר של בופר PE לעמוד הסיבוב והצנטריפוגה דקה אחת במהירות מקסימלית ב-RT.
  11. זרוק את הסופרנטנט עם צינור האיסוף. הניחו את העמוד בצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל וחזרו על צנטריפוגה; זרוק את צינור ה-1.5 מ"ל.
  12. הניחו את העמודה בצינור חדש שמסומן בנפח 1.5 מ"ל והוסיפו 10 מיקרוליטר של בופר EB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למרכז העמודה. תוודא לא לגעת בעמוד. תשאיר את זה ב-RT לדקה.
  13. צנטריפוגט למשך דקה אחת במהירות מקסימלית ב-RT; לעולם לא ב-4 מעלות צלזיוס.
  14. חזור על שני השלבים האחרונים לסך של 20 מיקרולטר בבופר EB.
    הערה: הפסקה אופציונלית: אם עוצרים, ניתן לאחסן דגימה בטמפרטורה של מינוס 20°C. כאן, הכרומטין המתויג נמצא בנפח של 20 מיקרוליטר.

9. הגברה בספרייה

  1. להגברת ספריית ATAC, יש לבצע PCR בזמן אמת כדי להעריך את מספר ההגברה הנכון של המחזור (ראו טבלה 2). בצע זאת על פלטת PCR.
  2. כדי להעריך את מספרי המחזור להגברה הסופית, יש לקחת את מספר המחזור המתאים לשליש הראשון של עקומת ההגברה. אידיאלי שמספר המחזור לא יעלה על 15. יש להעריך את מספר המחזור עבור כל דגימה.
    הערה: לאחר qPCR, ה-DNA המתויג נמצא בנפח של 18 מיקרוליטר. הפסקה אופציונלית: אם רוצים לעצור, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20°C.
  3. הגברה סופית של ספריית ATAC:
    1. כל דגימה חייבת להכיל פריימר RV שונה (רשום הערות).
    2. כל דגימה חייבת להיות מוגברת עבור מספר המחזור (N) המוערך לכל אחת.
    3. בצע PCR זה בצינורות של 200 מיקרוליטר (ראו טבלה 3).
    4. כאן יש 8 מיקרוליטר DNA מתויג ו-50 מיקרוליטר של ספריות ATAC מוגברות
    5. הפסקה אופציונלית: אם רוצים לעצור, ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

טבלה 2: הוראות להגברה ראשונה של הספרייה. מתכון ותוכנית PCR להגברה ראשונה בספרייה (סעיף 9). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3: הוראות להגברה סופית של ספריית ATAC. מתכון ותוכנית PCR להגברה סופית של הספרייה (סעיף 9). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

10. טיהור ספרייה

הערה: לפני שמתחילים, הוציאו מהמקרר את חרוזי בחירת הגודל (AMPure, SPRIselect או חרוזים מכוילים ביתיים) כדי לאפשר להם להתאים לטמפרטורת החדר. ערבב את החרוזים בעוצמה עם הוורטקס בכל פעם לפני השימוש.

  1. הכינו 1 מ"ל של 80% אתנול (דרגה מולקולרית).
  2. הוסף 25 מיקרוליטר (0.5 וול) של חרוזים לצינור הדגימה (כאשר יש 50 מיקרוליטר) ומערבב עם הפיפטה.
  3. תדגר ב-RT ל-10 דקות.
  4. שים את הצינורות במתקן המגנטי למשך 5 דקות.
  5. העבר את הסופרנטנט (70 מיקרוליטר) לצינור נקי חדש בנפח 200 מיקרוליטר.
    הערה: בשלב זה, שברי ה-DNA של <200 bp מושלכים.
  6. הוסף 65 מיקרוליטר (1.3 וול) של חרוזים וערבב 10 פעמים.
  7. תדגר ב-RT ל-10 דקות.
  8. שים את הצינורות במתקן המגנטי למשך 5 דקות.
  9. להשליך את הסופרנטנט (בלי להוציא את הצינור מהמדף המגנטי).
    הערה: בשלב זה, החרוזים מחזיקים את שברי ה-DNA של >200 bp ו-<1000 bp.
  10. כשהצינור עדיין על מתקן המגנטי, הוסיפו 200 מיקרוליטר של אתנול טרי עם 80% מוכן ישירות מעל החרוזים והפינו כמה פעמים למעלה ולמטה כדי לשטוף אותם.
  11. הסר אתנול וחזר על הכביסה עם 200 מיקרוליטר אתנול.
  12. זרוק את האתנול, ואז תן לחרוזים להתייבש עם המכסה פתוח ל-~2–5 דקות (אל תתן להם להתייבש יותר מדי).
  13. הוצא את הדגימה(ים) מהמדף המגנטי. תלה מחדש ב-50 מיקרוליטר שלH2O סטרילי. ודא לשטוף את כל החרוזים מדפנות הצינור.
  14. לבסוף, דגרו את הצינור(ים) במתקן המגנטי למשך 5 דקות.
  15. העבר את הסופרנטנט לצינור נקי חדש. כאן מאוחסנות ספריות ATAC המוגברות והמטוהרות.
    הערה: ניתן לאחסן ספריות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לזמן קצר (עד ארבעה שבועות) או לפרקי זמן ארוכים יותר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

11. התפלגות גודל המקטעים

  1. לאחר ההגברה הסופית, מומלץ להעביר חלק מהדגימה דרך אלקטרופורזה קפילרית כדי לראות את דפוס התפלגות גודל המקטעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בקרת איכות לאחר התיוג מבטיחה הכנה מדויקת של הספרייה
במהלך הפרוטוקול, חשוב לשים דגש מיוחד על qPCR המתבצע לאחר תיוג הכרומטין (סעיף 9), שכן זהו שלב חיוני להערכת איכות ה-DNA וביצועי הניסוי. איור 1A מציג שתי עקומות הגברה; השמאלי (מתחת ל-15 מחזורים) מייצג חומר איכותי שמראה שהכל היה מוצלח עד לנקודה הזו, אז זה בסדר להמשיך. העקומה מימין (איור 1A) מראה חומר באיכות ירודה, ולכן אין להמשיך עם דגימה זו. הנקודה הבאה שיש לשים לב אליה היא שלאחר הגברה וטיהור ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לפרופיל נגישות כרומטין כלל-גנומי באמצעות ATAC-seq בתולעי Caenorhabditis elegans שלמות בשלב L4. נגישות הכרומטין משפיעה ישירות על ביטוי גנים, תיקון DNA, שכפול ורקומבינציה, ובזמן ש-ATAC-seq הפך לגישה סטנדרטית לדגימות תאים ורקמות, יישומו על אורגניזמים שלמים מציב אתגרים טכניים ייחודיים, במיוחד בנמטודות עם קוטיקולה אטומה ועשירה בקולגן. במקביל, הערכת בדיקות אורגניזמים שלמים מספקת הזדמנות ייחודית ללכוד תגובות אפיגנטיות גלובליות. השיטה שלנו מתמודדת עם אתג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ביניהם ניגוד עניינים. לא נעשה שימוש בבינה מלאכותית גנרטיבית בכתיבה, ניתוח או הכנת כתב היד הזה.

תודות

ג' הרש-גונזלס קיבל מלגת דוקטורט מה-Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías, CONAHCYT (כיום Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI) (#CVU 846476). ג' הרש-גונזלס נתמך על ידי מלגת CONAHCYT (כיום SECIHTI) (788519). הפרויקט נתמך על ידי IN217824 מענק PAPIIT-UNAM ומענק SECIHTI CBF-2025-I-2275 ל-VJV. ב-IFC אנו מודים ל-UBM: לורה אונגיי-לאריוס, גואדלופה קודיס הוארטה, ומינרווה מורה קבררה; ה-UBMI: אוגוסטו סזאר פוט-הרננדס וקרלוס פרלטה אלברז; ו-Unidad de Cómputo, Imagenología, Taller ו-Biblioteca. אנו מודים במידה רבה למרכז הגנטיקה לדלקת Caenorhabditis (CGC) על מתן הזנים בהם השתמשו בעבודה זו. ה-CGC ממומן על ידי משרד תוכניות התשתיות המחקריות של NIH (P40 OD010440).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
250 mL, 0.22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10Gמזיק
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML

מקורות

  1. Poulet, A., et al. Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom. NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).
  2. Meléndez-Ramírez, C., et al. Dynamic landscape of chromatin accessibility and transcriptomic changes during differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Sci. Rep. 11 (1), 16977(2021).
  3. Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  4. Koyanagi, K. O. Inferring chromatin accessibility during murine hematopoiesis through phylogenetic analysis. BMC Res. Notes. 16 (1), 222(2023).
  5. Gómora-García, J. C., Furlan-Magaril, M. Pioneer factors outline chromatin architecture. Curr. Opin. Cell Biol. 93, 102480(2025).
  6. Boivin, A., Dura, J. M. In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila. Genetics. 150 (4), 1539-1549 (1998).
  7. Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front. Cell Dev. Biol. 8, 579137(2020).
  8. Escamilla-Del-Arenal, M., Recillas-Targa, F. G. GATA-1 modulates the chromatin structure and activity of the chicken alpha-globin 3′ enhancer. Mol. Cell. Biol. 28 (2), 575-586 (2008).
  9. Zhong, J., et al. Mapping nucleosome positions using DNase-seq. Genome Res. 26 (3), 351-364 (2016).
  10. Johnson, S. M., et al. Flexibility and constraint in the nucleosome core landscape of Caenorhabditis elegans chromatin. Genome Res. 16 (12), 1505-1516 (2006).
  11. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  12. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins, and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Buenrostro, J. D., et al. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015).
  14. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), eaav1898(2018).
  15. Shema, E., Bernstein, B. E., Buenrostro, J. D. Single-cell and single-molecule epigenomics to uncover genome regulation at unprecedented resolution. Nat. Genet. 51 (1), 19-25 (2019).
  16. Cao, J., et al. A human cell atlas of fetal gene expression. Science. 370 (6518), eaba7721(2020).
  17. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116.e20 (2020).
  18. Jänes, J., et al. Chromatin accessibility dynamics across C. elegans development and ageing. eLife. 7, e37344(2018).
  19. Dhillon-Richardson, R. M., et al. Fishing for developmental regulatory regions: Zebrafish tissue-specific ATAC-seq. Methods Mol. Biol. 2599, 271-282 (2023).
  20. Huynh, K., et al. Genetic variation in chromatin state across multiple tissues in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 19 (5), e1010439(2023).
  21. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  22. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  23. Hillier, L. W., et al. Genomics in C. elegans: so many genes, such a little worm. Genome Res. 15 (12), 1651-1660 (2005).
  24. Daugherty, A. C., et al. Chromatin accessibility dynamics reveal novel functional enhancers in C. elegans. Genome Res. 27 (12), 2096-2107 (2017).
  25. Johnstone, I. L. The cuticle of the nematode Caenorhabditis elegans: a complex collagen structure. Bioessays. 16 (3), 171-178 (1994).
  26. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), e19505(2011).
  27. Stiernagle, T. Maintenance of Caenorhabditis elegans. WormBook. , The C. elegans. Research Community. (2006).
  28. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. JoVE. (64), e4019(2012).
  29. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nat. Methods. 14 (10), 959-962 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ATAC SeqTn5

מאמרים קשורים