הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
* These authors contributed equally
מחקר זה מזהה חתימה של 10-lncRNA הקשורה ללחץ חמצוני בקרצינומה של תאי קשקש ריאה (LUSC) באמצעות נתונים מאטלס הגנום של הסרטן. למרות שהאימות הראה ביצועים קליניים מוגבלים, החתימה הבדילה דפוסי מיקרו-סביבה חיסונית ובדיקות במבחנה תמכו LINC01615 כמועמד הקשור לפלישה להגירה למחקר מכני נוסף.
RNA ארוך-שרשרת לא מקודד (lncRNA) משפיע משמעותית על הערך הפרוגנוסטי של קרצינומה של תאי קשקש ריאה (LUSC) ועל חדירת מערכת החיסונים. מחקר זה נועד להראות כיצד lncRNA הקשורים ללחץ חמצוני משפיעים על קרצינומה של תאי קשקש ריאתיים (SCC). מאגר הנתונים Cancer Genome Atlas (TCGA) אסף מידע על טרנסקריפטום ונתונים קליניים קשורים עבור LUSC. לבניית מודל פרוגנוסטי, זוהו 10 גנים הקשורים לפרוגנוסטיקה, באמצעות סדרת ניתוחים ביואינפורמטיים שהשוו את הביטוי החריג של גן ה-OS ברקמות גידול ובריאות, וכן את הקשר שלו לממאירות. הנבדקים חולקו לקבוצות סיכון גבוה ונמוך, בהתבסס על ציון הסיכון החציוני שנגזר מחתימת 10 גנים. בעוד שמודל הסיכון המתמטי הראה ביצועים חיזויים עצמאיים מוגבלים בקוהורט האימות (AUC ~ 0.5), הערכות פונקציונליות ואימונולוגיות חשפו הבדלים משמעותיים במיקרו-סביבת הגידול (TME) בין שכבות הסיכון. בפרט, מטופלים בסיכון גבוה הראו פרופילי חדירה חיסונית מובחנים וציונים אימונולוגיים ששינו ביחס לעמיתיהם בסיכון נמוך. לכן, במקום לשמש ככלי חיזוי קליני ישיר, חתימת lncRNA הקשורה למתח חמצוני זו מספקת תובנות ביולוגיות חשובות על הנוף החיסוני של LUSC ומדגישה מטרות טיפוליות פוטנציאליות לחקירה מכנית נוספת.
סרטן הריאות מדגים את השכיחות והתמותה הגבוהים ביותר בעולם בקרב מאירויות1. בתוך הווריאנטים ההיסטולוגיים של סרטן ריאות לא תאים קטנים (NSCLC), קרצינומה של תאי קשקש ריאה (LUSC) היא תת-סוג דומיננטי, לעיתים קרובות קשור לתוצאות קליניות שליליות ולחוסר בטיפולים ממוקדים יעילים במיוחד בהשוואה לאדנוקרצינומהריאתית 2. בעוד שגישות טיפוליות ראשוניות כוללות התערבות כירורגית, רדיותרפיה וכימותרפיה, מטופלים עם LUSC מתקדם מפגינים לעיתים קרובות עמידות טיפולית3. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף לזהות סמנים ביולוגיים מולקולריים חזקים לשיפור הסטרטיפיקציה הפרוגנוסטית ולהנחות אסטרטגיות טיפוליות חקרניות ל-LUSC4.
לחץ חמצוני, המאופיין בהצטברות פתולוגית של מיני חמצן פעילים (ROS), ממלא תפקיד קריטי בהתחלה, בצמיחה ובגרורות גידול. בהיעדר מנגנוני ניקוי ROS יעילים, רמות ROS גבוהות גורמות לנזק DNA ולגנוטוקסיות, ובסופו של דבר גורמות לשינויים גנומיים שונים התורמים להתפתחות הסרטן. ראוי לציין כי מחקרים הראו בעקביות עלייה ברמות ROS ובלחץ חמצוני, במיוחד בפתוגנזה של סרטן הריאות 5,6. מחקרים עדכניים הדגישו עוד יותר כי אשכולות גנים הקשורים לעקה חמצונית עשויים לשמש כסמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים פרוספקטיביים במלמאירויות ריאתיות7. RNA לא מקודד ארוך טווח (lncRNAs) הפכו לרגולטורים קריטיים של ביטוי גנים ומייצגים סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים מבטיחים במלמאירויות שונות. בעוד שמחקר בולטקודם 7 הקים בהצלחה מודל פרוגנוסטי lncRNA הקשור ללחץ חמצוני לאדנוקרצינומה ריאתית (LUAD), הנוף הפרוגנוסטי הספציפי וההשלכות החיסוניות של lncRNA כאלה ב-LUSC נותרו ברובן בלתי נחקרים.
במחקר זה, המחברים ניתחו באופן שיטתי מאגרי נתונים של TCGA כדי לבנות חתימת lncRNA חדשה הקשורה למתח חמצוני, המותאמת במיוחד ל-LUSC. יתרה מזאת, בניגוד לניתוחים ביואינפורמטיים טהורים, המחקר הנוכחי משלב אימות ניסוי חוץ גופי לאישור התפקיד הביולוגי של lncRNA שזוהו (למשל, Linc01615). במקום לטעון ליישום קליני מיידי להחלטות אבחון וטיפול, מחקר זה שואף בעיקר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של לחץ חמצוני ב-LUSC ואת הקשר שלו לסביבת החיסון של הגידול. ממצאים אלו נועדו לספק תובנות ביולוגיות חשובות ולהדגיש מטרות טיפוליות פוטנציאליות לחקירות מכניות עתידיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
רכישת נתונים ועיבוד מוקדם
כל הנתונים שנותחו במחקר זה התקבלו ממאגר הנתונים הנגיש לציבור של TCGA המופיע בטבלת החומרים. מחקר זה דבק בקפדנות במדיניות שיתוף הנתונים הגנומיים של המכון הלאומי לבריאות (NIH) ובהנחיות הפרסום שסיפקה TCGA. מכיוון שמאגרי הנתונים מורכבים מנתונים קליניים ומולטי-אומיקס שאינם מזוהים, זמינים לציבור, מחקר זה היה פטור מאישור נוסף של ועדת הביקורת המוסדית (IRB). נתוני טרנסקריפטום ומידע קליני מקביל עבור LUSC הורדו ממאגר אטלס הגנום של סרטן (TCGA). בתחילה, הקבוצה כללה 551 דגימות (502 גידולים ו-49 תקינות). כדי להבטיח את עמידות המודל הפרוגנוסטי הזה, מטופלים שחסרו נתוני הישרדות כוללים מלאים, מצב הישרדות או מאפיינים קליניים חיוניים הוצאו מניתוח ההישרדות בהמשך. לאחר תהליך סינון קפדני זה, הוקם קבוצה אנליטית סופית של 470 מטופלי LUSC. 470 המטופלים הללו חולקו באקראי לקבוצת אימון (n = 235) וקבוצת בדיקות (n = 235) לבניית מודל סיכון ואימותו. בסך הכל נאספו 792 גנים הקשורים ללחץ חמצוני באמצעות מאגר GeneCards, המופיע בטבלת החומרים, תוך שימוש בקריטריון הכללה של ציון רלוונטיות ≥ 7. חבילת הלימה (גרסה 3.66.0) שימשה לסינון גנים של לחץ חמצוני המובע באופן שונה. חלקות הר געש יוצרו באמצעות חבילת ggplot2 (גרסה 4.0.2). בין קבוצת האימון לקבוצת הבדיקה, לא נראתה שונות ניכרת במאפיינים הקליניים (p > 0.05). סט האימון שימש לבניית מודלים, וסט הבדיקה שימש לאימות פנימי.
בניית ואימות מודל הסיכון
כדי לזהות lncRNA הקשורים ללחץ חמצוני, בוצע ניתוח ביטוי משותף של פירסון. המחברים העריכו את המתאם בין פרופילי הביטוי של גנים הקשורים ללחץ חמצוני שזוהו במונחים שונים לבין כל ה-lncRNA המוערכים במאגר הנתונים של TCGA-LUSC. קריטריוני המתאם לבחירת lncRNA מבוטאים במשותף נקבעו במקדם קורלציה |R| > 0.4 וערך p < 0.001. בהתבסס על ספים אלו, נגזרו והופקו בסך הכל 6,088 מועמדים ל-lncRNA הקשורים ללחץ חמצוני. בהמשך, 6,088 מועמדים אלו הוערכו באמצעות רגרסיית LASSO ושיטות אנליטיות משלימות, לבניית מודל הסיכון הפרוגנוסטי. באמצעות הנתונים המעובדים, משתתפי המטופלים סווגו לשכבות סיכון גבוה ונמוך.
גורמים בלתי תלויים ועקומות ROC
מודלים של רגרסיה חד-משתנית ורב-משתנית של קוקס שימשו לזיהוי משתנים פרוגנוסטיים עצמאיים. בפרט, כדי לשלוט בשיעור השגיאה לפי משפחה במהלך ניתוחי רגרסיה חד-משתניים של קוקס (n = 236 מבחנים), יושם תיקון בונפרוני, וקבע את סף המובהקות המותאם בקפדנות ל-p < 0.00021 (מחושב כ-0.05 / 236).
ניתוח הישרדות וניתוח רכיבים עיקריים
חבילת ההישרדות (גרסה 3.8-6) שימשה לחישוב שיעורי ההישרדות הכוללים (OS), וניתוח רכיבים עיקריים (PCA) שימש להערכת עמידות מודל הסיכון.
נומוגרמה
מדד ההתאמה הוערך באמצעות חבילת rms ב-R כדי להעריך את אמינות הנומוגרמה. נטל המוטציה של הגידול (TMB) הוערך והוצג באמצעות חבילת maftools (גרסה 2.22.0). אלגוריתמים, כולל ssGSEA, שימשו לזיהוי חדירה חיסונית. בנוסף, חבילת ggpubr (גרסה 0.6.3) שימשה להשוואת נקודות בדיקה חיסוניות בין קבוצות סיכון. אלגוריתם ESTIMATE שימש לאפיון מיקרו-סביבת הגידול (TME).
ניתוח פונקציונלי
חבילת clusterProfiler (גרסה 4.14.6) ב-R שימשה לניתוח העשרה. כדי לחקור מסלולים פונקציונליים לעומק, בוצע ניתוח GSEA. באמצעות Cytoscape, נוצרה רשת קו-ביטוי לתצפית.
שיטות ניסוי
תנאי תרבית תאים וקיבוץ
קו תאי קרצינומה של תאי קשקש ריאות אנושיים NCI-H520 (RRID: CVCL_1566; רשום בטבלת החומרים) תורתח במדיום RPMI-1640 שהושלף עם סרום בקר עוברי של 10% (v/v) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. תאי לוג-פאזה הוזרעו ללוחות תרבית של 6 בארות. לאחר הקפדה מוצלחת, התאים חולקו באקראי לשלוש קבוצות ניסוי מובחנות: קבוצת ביקורת ריקה שנשמרה בתנאי תרבית סטנדרטיים, קבוצת ביקורת שלילית (si-NC) שהועברה ל-siRNA לא מכוון, וקבוצת הנקה ניסיונית (si-LINC01615) שהועברה עם siRNA ספציפי ל-LINC01615.
טרנספקציה תאית
החומרים si-LINC01615 ו-si-NC הופשרו על קרח. להכנת קומפלקס הטרנספקציה, 95 מיקרוליטר של מדיום RPMI-1640 ללא סרום הועברו לפיפטה לצינורות צנטריפוגות סטריליות, ולאחר מכן הוספנו ברצף 3 מיקרוגרם של siRNA ו-5 מיקרו-ליטר של תגובת טרנספקציה Lipo3000. אותו הליך הוחל הן לקבוצות siLINC01615 והן לקבוצות siNC. התמיסות עורבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להקל על היווצרות מורכבת, מה שהביא לנפח כולל של כ-200 מיקרו-ליטר לכל צינור. לאחר מכן, תערובת זו חולקה באופן אחיד לבארות התרבות המיועדות המכילות 800 מיקרוליטר של מדיום בסיס RPMI-1640. לאחר תקופת דגירה של 6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מדיום הטרנספקציה נשאף בזהירות והוחלף במדיום תרבית טרי ומלא.
בדיקת ריפוי פצעים (שריטות)
למבחן ריפוי הפצע, תאי NCI-H520 שגדלו לוגריתמית (RRID: CVCL_1566) זרעו בלוחות תרבית של 6 בארות בצפיפות של 5.6 ×-105 תאים לבאר. בהגעה ל-95–100% מפגש מגוון, נוצר פצע ליניארי באופן מלאכותי על ידי שריטה אנכית של שכבת התא במרכז הבאר באמצעות קצה פיפטה סטרילי בנפח 200 מיקרוליטר. הבארות נשטפו לאחר מכן שלוש פעמים באמצעות PBS להסרת תאים מנותקים ופסולת תאית, ולאחר מכן דגרו במדיום RPMI-1640 ללא סרום. תמונות של אותם אזורים פצועים צולמו ב-0, 24 ו-48 שעות באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אזור ההחלמה של הפצע נמדד על ידי מדידת מרחק הפער באמצעות ImageJ (RRID: SCR_003070; רשום בטבלת החומרים), וקצב הנדידה חושב ביחס לאזור הפצע ההתחלתי ב-0 שעות.
בדיקות הגירה ופלישה של טרנסוול
קיבולת הנדידה והפלישה התאית הוערכו באמצעות תאי טרנסוול בעלי 24 בארות המצוידים בכניסות ממברנה פוליקרבונטית בגודל נקבוביות של 8.0 מיקרון , המפורטות בטבלת החומרים. למבחן הפלישה, תאי האפיקל צופו מראש ב-50 מיקרו ליטר של Matrigel (מדולל 1:8 במדיום ללא סרום; מופיע בטבלת החומרים) ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך שעתיים לפולימריזציה, בעוד שבדיקת ההגירה השתמשה בהכנסות לא מצופות. לאחר טרנספקציה של תאים ותקופת רעב סרום של 24 שעות, תאי NCI-H520 נאספו, הושמו מחדש במדיום RPMI-1640 ללא סרום, והוזרעו לתאי האפיקלי בצפיפות של 1.8 ×-105 תאים לבאר ב-200 מיקרוליטר. תאי הבסיס מולאו ב-600 מיקרוליטר של מדיום RPMI-1640 בתוספת 10% FBS ככימואטרטנט. לאחר דגירה של 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂, הוסרו ושטפו שלוש פעמים עם PBS. התאים שנותרו על פני השטח האפיקליים של הממברנה נלקחו בעדינות באמצעות מטוש כותנה רטוב. התאים שהיגרו או פלשו למשטח הבזולטרלי הוקבעו עם 4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות ונצבעו בתמיסת גימסה המופיעה בטבלת החומרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. התאים המהגרים והפולשים הוצגו ונספרו בשלושה שדות אופטיים שנבחרו באקראי בכל אינסרט באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 40.
ניתוח סטטיסטי
כל הניתוחים הסטטיסטיים והוויזואליזציות של הנתונים בוצעו באמצעות תוכנת R (גרסה 4.1.2; RRID: SCR_001905; מופיע בטבלת החומרים). מספרי הגרסאות הספציפיים לכל חבילות ה-R ששימשו במחקר זה פורטו במפורש בתת-הסעיפים המתודולוגיים שלהן. ערך משמעותי הוגדר באופן קונבנציונלי כ-p < 0.05 אלא אם כן דווח אחרת. כאשר בוצעו השוואות מרובות (למשל, רגרסיות קוקס חד-משתניות מרובות), שיטת בונפרוני יושמה בקפדנות לשמירה על שיעור השגיאה לפי משפחה (FWER), כאשר הסף המדויק המותאם (למשל, p < 0.00021) מפורט בסעיף המתודולוגי המתאימה. נתונים כמותיים במבחנה הובאו לידי ביטוי כסטיית תקן ממוצעת ± ונותחו באמצעות מבחן t של סטודנט או ANOVA חד-כיווני לפי הצורך.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
זיהוי גנים המבוטאים באופן שונה ללחץ חמצוני
תהליך העבודה מוצג באיור 1. המאפיינים הקליניים של הקבוצה האנליטית הסופית הכוללת 470 מטופלי LUSC מפורטים בטבלה 1. בהתבסס על סף מוגדר של ציון רלוונטיות ≥ 7, המחברים שלפו בסך הכל 792 גנים הקשורים ללחץ חמצוני ממאגר GeneCards (קובץ משלים 1). בין דגימות תקינות לדגימות LUSC, 178 גנים של לחץ חמצוני הראו רמות ביטוי משתנות באופן משמעותי (קוב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
קרצינומה של תאי קשקש ריאה (LUSC) היא תת-סוג היסטולוגי דומיננטי ואגרסיבי במיוחד של סרטן ריאות לא קטן, שלעיתים מאופיין בשיעורי הישרדות קשים ועמידות לשיטות טיפוליות קונבנציונליות 8,9. ראיות מתחדשות מדגישות את הלחץ החמצוני כגורם מרכזי בפתוגנזה ובהתקדמות של ממאירות שונות. ההצטברות הפתולוגית של מיני חמצן תגובתי (ROS) והדיסרגולציה של מערכות ההגנה התאית נגד נוגדי חמצון כמו ציר האיתות KEAP1/NRF2 משפיעים עמוקות על התחלת ג...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים. לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית (AI) או טכנולוגיות בסיוע בינה מלאכותית במהלך הכנת כתב היד; כל התוכן המדעי, הניתוחים, הנתונים הגולמיים והמסקנות נוצרו, נבדקו ואושרו באופן עצמאי על ידי המחברים.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 8200430). אנו מודים בכנות לתורמים ולמוסדות המעורבים, כולל אוניברסיטת חונאן לרפואה סינית מסורתית ובית החולים המקושר לאקדמיה לרפואה סינית מסורתית של חונאן, על המשאבים והתמיכה שלהם. אנו גם מודים לכל החוקרים והמשתתפים שתרמו למחקר זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | משמש לקיבוע תאים |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | משמש ליצירת רשת קו-אקספרסיה |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | ריכוז סופי 10% (v/v) |
| GeneCards database | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | סינון גנים הקשורים למתח חמצוני |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldrich | GS500 | משמש לצביעת תאים שנדדו/חדרו |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | משמש לכימות פצע-חור |
| Lipo3000 Transfection Reagent | GLPBIO | GK20006 | משמש להעביר siRNA |
| Matrigel | Corning | 356234 | מומס 1:8 במדיום ללא סרום |
| NCI-H520 human lung squamous cell carcinoma | ATCC | HTB-182 | משמש לבדיקות מאושרות in vitro |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Gibco | 10010-023 | משמש לשטיפת תאים |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140-122 | תוסף אנטיביוטי לתרבית תאים |
| R software (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | ניתוח סטטיסטי וויזואליזציה |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | מדיום תרבית תאים |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | מקור טרנסקריפטומ ו-נתונים קליניים |
| Transwell Chambers (8.0 μm) | Corning | 3422 | משמש לבדיקות הגירה וחדירה |