$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
תהליך הניסוי להערכת היעילות של אינקולנטים מיקרוביאליים בשיפור סבילות ללחץ מים בחסה רומיין (Lactuca sativa L. var. Paspartu) מסוכם באיור 1. הפרוטוקול שילב ניטור רציף של משטרי השקיה מדויקים עם רכישת נתונים פיזיולוגיים ותרמיים תקופתיים. שני מוצרים מיקרוביאליים מובחנים שימשו: (I) קונסורציום מיקרוביאלי, קונסורציום מורכב של 67 זנים הכולל PGPR, אקטינומיקוטים ופטריות מועילות, שנועד לשמש כחיץ פיזיולוגי דרך התיישבות שורשים והפרשת אקסופופוליסכרידים (EPS); ו-(II) Trichoderma harzianum, אינוקולנט חד-זני של Trichoderma harzianum שמטרתו לעורר עמידות מערכתית ולשנות את ארכיטקטורת השורשים. הריאגנטים, הציוד והתוכנה בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.
1. חיסון מיקרוביאלי
הוטמע משטר חיסון סטנדרטי לשני הטיפולים המיקרוביאליים, שכלל שישה יישומים ספוגי אדמה שמכוונים לריזוספירה באמצעות מיקרופיפטות מדויקות לדימוי מינונים בקנה מידה שדה. השלב הראשון התרחש בשלב הנבטים ב-5 ו-15 ימים לאחר הזריעה (DAS). ב-30 DAS, השתילים הועברו למגשי חלל גדולים יותר, כאשר השלב השני של החיסונים בוצע יום אחד לאחר ההשתלה (DAT), ואחריו יישומים עוקבים ב-7, 15 ו-20 DAT.
עבור הקונסורציום המיקרוביאלי, המינונים הותאמו בהתאם לפנולוגיית הצמחים: שני היישומים הראשונים יושמו ב-500 גרם לדונם (3 מ"ל לדונם), אחריהם מינון ריכוז גבוה של 2 ק"ג לדונם בעת ההשתלה, והסתיימו בשלוש מנות תחזוקה של 300 גרם לדונם. באופן דומה, T. harzianum הוחל בקצב של 1 ליטר לדונם בשני השלבים הראשונים, 3 ליטר לדונם בהשתלה, ו-1 ליטר לדונם בשלושת היישומים האחרונים. גישה מדורגת זו נועדה להבטיח התיישבות שורשים חזקה ולשמור על תפקיד האוכלוסייה המיקרוביאלית כחיץ פיזיולוגי לאורך תקופות הצמיחה הקריטיות וההשראת הלחץ.
2. הכנת גידולים
זרעי חסה רומיין מוסמכים (Lactuca sativa L. var. Paspartu) נבטו במגשי פוליסטירן עם 311 חללים (11 מ"ל לחלל) באמצעות מצע מקצועי מבוסס טחב בעומק של 1 ס"מ. הנביטה בוצעה בתא ביוקלימטי מבוקר שנשמר בטווח טמפרטורות של 15°C עד 22°C ולחות יחסית של 60%–70%. עם הגעה ל-90% נביטה (כ-3–5 ימים לאחר הזריעה), השתילים הועברו למגשים גדולים יותר עם קיבולת כדורי שורשים של 55 מ"ל כדי לאפשר התפתחות שורשים ללא הגבלה (איור 2 ואיור 3). הניסוי אורגן בעיצוב אקראי לחלוטין (CRD), עם 9 יחידות ניסוי (מגשים) ו-20 שתילים בכל מגש. מבנה זה תוכנן כך שיתאים לסידור פקטוריאלי של 3 × 3 (3 טיפולים מיקרוביאליים × 3 משטרי השקיה). תכונות פיזיקליות-כימיות מפורטות של הסובסטרט ותכנות תא ביוקלימטי ספציפי14מוצגים באיור 3, טבלה משלימה 1, טבלה משלימה 2, וטבלה משלימה 3.
מגשי הניסוי חולקו בפריסה אקראית לחלוטין בתוך תא הביוקלים כדי לבטל השפעות קצה ולהבטיח חשיפה אחידה. התא תוכנת לדמות תנאים דינמיים דמויי שדה, תוך שימוש במשטר טמפרטורות גבוהות לשכפול מאמץ תרמי בשדה פתוח. בשלב הצמח, פרמטרים סביבתיים נשמרו בטווח לחות יחסית משתנה, ותקופת פוטו-מחזור של 9 שעות סופק על ידי תאורת LED בעוצמה גבוהה (שהוגדרה מעל 50% מהקיבולת המקסימלית כדי להבטיח קרינה פוטוסינתטית מספקת)15. לאחר שלב ההקמה, התוכנית הסביבתית הותאמה כדי לשקף את הדרישות המתגברות של טיפולי מחסור במים, כפי שמודגם במעברים אטמוספריים מדורגים15 (איור 4 ואיור 5). נקודות קביעות יומיות/ליליות ספציפיות לטמפרטורה, לחות ועוצמת אור מפורטות בטבלה משלימה 1 ובטבלה משלימה 2 כדי לייעל את הפרוטוקול העיקרי.
אסטרטגיית ההפריה תוכננה לעמוד בדרישות הפנולוגיות הספציפיות של חסה רומיין, תוך שמירה על זרימת תזונה מאוזנת לאורך כל המחזור הצמחי. בשלב הנבטים (12 עד 24 DAS), סופקו חומרים מזינים באמצעות יישומים ממוקדים של אשלגן ניטראט (KNO3), מונואשלגן פוספט (KH2PO4) וניטראט סידן (Ca(NO3)2). כדי לשפר את ההקמה המוקדמת, הוסיפה ביוסטימולנט מסחרי במהלך 24 הימיםהראשונים.
מ-26 DAS ועד להערכה הסופית ב-76 DAS, תוכנית ההפריה עברה למשטר תחזוקה שבו הביוסטימולנט הוסר כדי לבודד את ההשפעות הספציפיות של החיסון המיקרוביאלי. כל היישומים כויללו לשמירה על מוליכות חשמלית אופטימליות (EC) ו-pH מיטביים בתוך הריזוספירה. הלוח הזמנים הכרונולוגי המלא של ריכוזי המינרלים ונפחי המינון הספציפיים16מפורט בטבלה משלימה 3.
3. טיפול במיקרואורגניזמים
כדי להעריך את יעילות ההתערבויות הביולוגיות נגד לחץ הידרי, הוקמו שלושה טיפולים מובחנים: (I) קונסורציום מיקרוביאלי, קונסורציום מיקרוביאלי בעל מגוון גבוה הכולל 67 זנים מועילים, כולל ריזובקטריות מעודדות צמיחה (PGPR), אקטינומיקוטים ופטריות; (II) T. harzianum, נוסחה ייחודית לזן יחיד של Trichoderma harzianum; ו-(III) בקרה שאינה מחוסנת. טיפולים אלו נבחרו בהתבסס על הפוטנציאל שלהם לסבילות מערכתית מושרה (IST), בעיקר באמצעות מנגנונים כגון שינוי ארכיטקטורת השורש, ייצור ACC-דיאמינאז והפרשת אקסופופוליסכרידים (EPS).
החיסון התבצע בגישה אסטרטגית מדורגת. היישום הראשוני (3 מ"ל לצמח) בוצע באמצעות מיקרופיפטה מדויקת ישירות לריזוספירה בשלב העלה האמיתי השני כדי להבטיח קולוניזציה מוקדמת של השורשים. יישומים מאוחרים יותר כויללו למקבילים בקנה מידה שדה (המדמים צפיפות של 75,000 צמחים לדונם). עבור T. harzianum, הוחל ריכוז של 2 ליטר לדונם, בעוד שהקונסורציום המיקרוביאלי ניתן ב-1 ק"ג לדונם. נוסחאות אלו הומסו במי ההשקיה והוחלו כל 15 יום לשמירה על אוכלוסייה מיקרוביאלית יציבה כחיץ פיזיולוגי לאורך כל מחזור הצמחייה17.
4. טיפולי השקיה שונים
כדי להעריך את הפלסטיות הפיזיולוגית והאגרונומית של L. sativa בתנאים הידריים משתנים, יושמו שלושה משטרי השקיה המבוססים על החלפת אידוי גידולים (ETc). תכולת המים הנפחית כויולה לפי קיבולת השדה של המצע (FC) כדי להבטיח השראה מדויקת למאמצים. המשטרים הוגדרו כך: (I) בקרה/השקיה היטב (CC-100% ETc), שבו התמלאה אידוי והסעה מלאה; (II) מחסור במים מתון (75% ETc), שנועד לגרום להגבלה הידראולית בינונית; ו-(III) מחסור חמור במים (50% ETc), שמטרתו ליצור לחץ מים קריטי. ההשקיה בוצעה מדי יום לאחר צילום תמונות תרמיות באמצעות פיפטות מדורגות כדי להבטיח החלפה מדויקת של נפח המים שאבד בעקבות אידוי-וטרנספריזציה18.
5. הקלטת נתונים ותמונות
כדי להעריך את התפלגות התרמית של התחנה ומצב המים, צולמו תמונות תרמיות באינפרא-אדום מדי יום מיום שני עד שישי לאורך תקופת הניסוי. כל ההקלטות הצילומיות בוצעו בין השעה 12:00 ל-14:00 כדי לאחד את המדידות במהלך תקופת הטרנספירציה המקסימלית ועוצמת השמש. חשוב לצלם את התמונות הללו מיד לפני טיפולי ההשקיה היומיים כדי לתעד את עומס המים המצטבר שחוו הצמחים במהלך מחזור 24 השעות הקודם. לצורך צילום תמונה, מצלמת האינפרא-אדום התרמית חוברה למכשיר נייד ושמרה על כיוון מאונך ביחס לגב צמחי החסה במרחק עקבי של 60–70 ס"מ. התוכנה הוגדרה עם פלטת חום תרמית רב-צבעונית שבה מדרגוני הטמפרטורה מיוצגים מהנמוך ביותר לגבוה: החל מסגול (הקר ביותר), עובר דרך כחול מלכותי, טורקיז, ירוק (אמצע), צהוב, כתום, ולבסוף אדום (החם ביותר). בתוך ממשק התוכנה, אזור המגש הספציפי המכיל את חופת הצמח נבחר ידנית כדי ללכוד את נתוני התרמיים. סולם הצבעים הזה משמש כמדד פיזיולוגי: צמחים מיובשים היטב מציגים טמפרטורות חופה קרות יותר (סגול/כחול) עקב טרנספירציה פעילה, בעוד שצמחים מיובשים מציגים טמפרטורות חופה גבוהות יותר (כתום/אדום) עקב סגירת הסטומטלים וקירור אידוי מופחת. בהמשך, תמונות ברזולוציה גבוהה אלו עובדו באמצעות פונקציית מדידה בשלוש נקודות על פני אזורים ספציפיים (ROI) כדי להפיק ערכי טמפרטורת חופה (Tc) מדויקים לחישוב מדד לחץ מי הגידול (CWSI).
אם CWSI הוא:
0, אז הגידול לא נמצא תחת לחץ מים
1 אז הגידול נמצא תחת לחץ מים כבד
כאשר:
Tc היא טמפרטורת חופת הגידול, הנמדדת באמצעות הדמיית אינפרא-אדום. Tw היא טמפרטורת החופה בתנאי לחץ שאינם מים. Td היא טמפרטורת החופה בתנאי לחץ מים מקסימלי19.
מדדים לצמיחה, התפתחות ומצב פיזיולוגי של הצמח, כגון גובה, מספר עלים וטמפרטורת עלים, שהוערכו באמצעות תרמוגרפיה אינפרא-אדומה, מוצגים בטבלה המשליחה 4 יחד עם משתני המחקר וההגדרות המושגיות והתפעוליות ששימשו בניסוי. השילוב של משתנים אלו אפשר הערכה מקיפה של השפעת הטיפולים הניסיוניים על הביצועים הפיזיולוגיים וההתפתחות של כל צמח.
6. ניתוח נתונים
נתונים פיזיולוגיים ומורפולוגיים נותחו באמצעות אנובה חד-כיוונית לכל משטר השקיה כדי לקבוע את השפעת הטיפולים המיקרוביאליים השונים. כל ההליכים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנה סטטיסטית. לפני ביצוע הניתוח ההסקתי, הדרישות הבסיסיות לסטטיסטיקה פרמטרית נבדקו כדי להבטיח את אמינות התוצאות. נורמליות השאריות אושרה באמצעות בדיקת אנדרסון-דארלינג (p > 0.100), המצביעה על נורמליות. בנוסף, ההומוגניות של השונות אושרה באמצעות מבחן לבין (p = 0.989), מה שאישר הומוסקדסטיות גבוהה בין קבוצות. מכיוון ששתי ההנחות התקיימו, מבחן הפוסט-הוק של Tukey HSD (Honestly Significant Difference) שימש לזיהוי הבדלים מובהקים (p < 0.05) בין ממוצעי הטיפול. הצמח הספציפי הוגדר כיחידת הניסוי לכל ההערכות הסטטיסטיות.
