המחשה של נקטרי עלים וברקטיאלים של כותנה באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית לשיפור דיוק הניקוד ושימור הנתונים

Summary

כאן, אנו ממחישים תהליכים שלב אחר שלב לפנוטיפ של נקטרי עלים וברקטיאלים בצמחי כותנה באמצעות תמונות שנוצרו במיקרוסקופיה דיגיטלית. זו שיטה יעילה לצביעת הצוף של העלים והברקטים של כותנה, שכן ניתן לאסוף ולשמר את המידע בצורת תמונות דיגיטליות.

Abstract

נקטריים הם בלוטות מייצרות צוף מובחנות, הנמצאות במגוון מיני צמחים. הנקטריים מציגים מבנים ופונקציות מגוונים. בכותנה, הניקוד המסורתי של תכונת נקטרי נוטה לטעויות, לא אמין ויש לו מגבלות, שכן פנוטיפים של תכונה זו לעיתים קרובות אינם נראים לעין בלתי. ביטויי תכונות צוף נשלטים על ידי גנים Ne1 ו/או Ne2. בנוסף, ביטוי התכונות יכול להיות מושפע מהסביבה ומשלבי הצמיחה, מה שמדגיש את הצורך בשיטות ניקוד מדויקות. במיוחד, ניקוד פנוטיפי באמצעות תמונות דיגיטליות מוביל לשיטת ניקוד מדויקת יותר של נקטריים. שיטה זו מתגברת על מגבלות הניקוד המסורתי על ידי יצירת תמונות ברזולוציה גבוהה. בנוסף, מקל על זיהוי והבחנה בין הבדלים עדינים בביטוי תכונות צוף תוך שמירה על תמונות דיגיטליות אלו לעתיד. שיטת הניקוד הפנוטיפית המתוארת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות לציון תכונות צמחיות אחרות כמו בלוטות, שערות וצבע. שיטות הניקוד הללו ניתנות להתאמה למינים אחרים של צמחים. במאמר זה נסביר שלב אחר שלב כיצד לאסוף דגימות מהשדה או מהחממה, לנתח אותן לצפייה באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית, ולשמר את התמונות הללו לניתוח ניקוד עתידי. בשיטה זו נשתמש, למשל, בדירוג דגימות עלים וברקטיאלים של צמחי כותנה כדי להבדיל בין נוכחות צוף (מפותח, מצומצם ושרידים) לבין היעדר צופים.

Introduction

לצמחים יש בלוטות מיוחדות הנקראות נקטרים, שמסנתזות ומייצרות צוף ברוב האנגיוספרמים, בחלק מהשרכים ובחלק מהגימנוספרמים 1,2,3,4. נקטריים מסווגים לשלושה סוגים: מזופילריים, טריכומטיים ואפיתליים, בהתבסס על מקור התאים שמייצרים נקטר⁵. נקטריים בכותנה הם סטומטות מותאמות המורכבות מטריכומות בלוטותיות הידועות כפפילות ומדורגות כסוג טריכומטי ^5,6. רוב מיני הגוסיפיום מכילים צופים; עם זאת, מספר הנקטרים הקיימים בסוג זה משתנה ממין למין⁷. נקטרי פרחים (FNs) נפוצים יותר מנקטרי חוץ-פרחוני (EFNs) בצמחים⁸. נקטרים אלו יכולים להימצא בכל מקום בצמח פרט לשורשים ^1,2. לדוגמה, Gossypium hirsutum מציג גם נקטרים פרחוניים וגם חיצוניים⁹. צמחי כותנה ביתיים מראים שלושה צוף פרחוני נוסף ואחד פרחוני¹⁰. שלושת הנקטרים הפרחוניים הנוספים הם נקטרי עלים, ברקטלי וסביבי¹¹. הצוף העלים הוא צמחי ונמצא בדרך כלל על עלים בצד התחתון של העצל האמצעית, בעוד שהנקטריים הברקטיאליים והסביבתיים הם רבייתיים ומתפתחים בבסיס הברקט ולפני השטח של הקליקס האחורי. צוף הפרחים קשור לפרח, המתפתח על פני השטח העליונים (אדקסיאל) של הקליקס. תכונת צוף זו נשלטת על ידי לוקוס גן^{יחיד 12}. מחקרים של שתי קבוצות מחקר עצמאיות זיהו כי תכונת הצוף נשלטת על ידי גן אחד, Ne1 של הגנום A או Ne2 של הגנום D, הממופה לכרומוזומים 12 ו-26, בהתאמה^12,13. תכונה זו מתבטאת רק בתנאי רצסיבי כפול, כלומר רק תנאי רצסיבי הומוזיגוטי יביע את התכונה ללא נקטרי.

בנוסף לגנים אלו, תנאי הסביבה ושלבי הגדילה ממלאים תפקיד בשליטה על מידת הביטוי. לכן, חייבת להיות שיטה מדויקת לדירוג תכונה זו. המחקר הנוכחי מתמקד בפנוטיפ של נקטרי עלים וברקטיאליים בכותנה. צמחים עם צוף מייצר צוף נראים נדורגים כצופים, בעוד שצמחים שחסרים תכונה זו מדורגים כחסרי נקטרי 1,2,3,4. המטרה העיקרית של מאמר זה היא להציג שיטות ניקוד מדויקות של תכונת הצוף באמצעות טכנולוגיית מיקרוסקופיה דיגיטלית. ניקוד מסורתי באמצעות תצפית חזותית ישירה אינו יכול בקלות לזהות הבדלים בשונות הביטוי של תכונת הנקטרי במקום בעין בלתי. הבדלים עדינים אלה בביטויי תכונות צוף ניתנים להמחשה באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית. להמחשה, בצומת עלי כותנה, רובריקת הניקוד עוקבת אחרי סולם סטנדרטי של 1-4 שבו 1 מייצג ללא צוף, 2 מייצג בליטה על פנוטיפ הווריד, 3 מייצג כריות או רכסים לא מפותחים ללא צוף, ו-4 מייצג צוף שלם/שלם עם רפידות שקופות ורכסים¹³. ניקוד פנוטיפ זה נוצר באמצעות תמונות דיגיטליות של צוף העלים [באמצעות תמונות דיגיטליות של הצד האפקסיאלי (התחתון) של צלע העלה]. באופן כללי, היעדר נקטרים מדורג כ-0, אך למשמעות סטטיסטית לא ניתן להשתמש בערך 0 ולהחליף אותו בערך 1. לכן, טווח הניקוד של הפנוטיפ שונה ל-1-4 מהסיווג הסטנדרטי של 0-4¹³. רובריקת הניקוד לפרחים עוקבת אחרי דפוס ניקוד דומה של 1-4 שבו: 1 מייצגת ללא נקטרי, ללא בלוטות בולטות ללא כריות או רכסים, 2 לבלוטות מוסתרות שבהן לנקטריים יש סימני כריות עדינים בלבד וללא צוף, 3 לבלוטות לא מעוצבות עם רכסים חלשים או חסרים ו/או רפידות, ו-4 לנקטריות מלאות עם צוף. דפוס ניקוד זה מראה 4 לפנוטיפים צופים (הדומיננטי הומוזיגוטי/הטרוזיגוטי לאחד הגנים), 3, 2 לביטוי שונה של תכונת צוף כמו בהטרוזיגוטי, ו-1 עבור חסרי נקטרי (הומוזיגוטי רצסיבי לשני הגנים).

באופן דומה, פרחים נאספים וננתחים כפי שמתואר במאמר זה לצורך איסוף תמונות דיגיטליות לניקוד צופים ברקטאליים. פנוטיפ זה ניתן להמחשה באמצעות המיקרוסקופ לציון מדויק שניתן לאחסן בצורת תמונות דיגיטליות. בכותנה, תכונות צוף לא רק מושכות מאביקים אלא גם מושכות מזיקים שגורמים לאובדן יבול¹⁴. כדי לפתור בעיה זו, המגדלים בחרו צמחים ללא תכונות צוף (ללא נקטרי) כחלופה לשליטה טבעית במזיקים ללא שימוש בחומרי הדברה כימיים^9,15. תכונת חסר נקטרי הובאה במקור מ Gossypium tomentosum ל Gossypium hirsutum (כותנת אפלנד מעובדת)⁸. שיטת הניקוד הזו שימושית במיוחד לזיהוי ההפרדה של תכונות חסרות נקטרי באוכלוסיות שנוצרות משילוב הורים עם הורים חסרי נקטרי. כתוצאה מההכלאות האלה של הורים מגוונים, F₂ (הדור השני של ההורים) מציג גנוטיפים שונים של הומוזיגוט נקטרי, הטרוזיגוטי נקטרי, והומוזיגוטי חסר נקטרי. רק גן דומיננטי אחד נדרש לביטוי תכונות צוף, אשר עוקב אחרי יחס הפרדה של 15:1 (9:3:3:1). לכן, 1 מתוך 16 יבטא את התכונה ללא נקטרי במצב הומוזיגוטי רצסיבי עם גנוטיפ ne1ne1ne2ne2. עם זאת, חוקרים בתוכניות רבייה הבחינו ביותר קווים ללא נקטרי מהיחס הצפוי של 1 ל-16. משמעות הדבר היא שהתכונה הנקטרית מתבטאת כאשר הגנים מתבטאים כ- Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. הדפוס המגוון של ביטוי תכונות צוף באוכלוסיות כאלה של נקטריים הומוזיגוטיים (Ne1Ne1Ne2Ne2), הטרוזיגוטי נקטרי (Ne1ne1Ne2ne2), והומוזיגוטי ללא נקטריון (ne1ne1ne2ne2) ניתן להעריך צמחים בצורה מושלמת על ידי זיהוי השינויים המוצגים בתמונות הדיגיטליות^12,13. מכיוון שצמחים הטרוזיגוטיים עם נקטרי מופחת עשויים שלא להראות תכונת צוף באופן חזותי ועשויים להידמות לתכונה ללא נקטרי ללא צוף, הפנוטיפ הוויזואלי מציב אתגרים בבחירה האמינה של תכונה זו. בעיות אלו מתעצמות בעונת הגידול המאוחרת, כאשר צופים אינם קיימים בזני כותנה מסוימים. הבדלים בין צמחים הטרוזיגוטיים לצמחים חסרי נקטרי הומוזיגוטיים ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות הדמיה דיגיטלית, שכן צמחים הטרוזיגוטיים עשויים להראות צוף קטן או מצומצם בעוד שצמחים הומוזיגוטיים חסרים תכונה זו לחלוטין. באופן פנוטיפי, נוכחות הנקטרי מסווגת כנקטרי (הומוזיגוט/הטרוזיגוטי עם לפחות גן דומיננטי אחד), נוכחות של נקטריים קטנים או שרידים כהטרוזיגוטיים, והיעדר נקטריים כצמחים הומוזיגוטיים ללא נקטרי. ניקוד תמונות דיגיטלי הפחית את הניקוד הלא מדויק של צמחים הטרוזיגוטיים כצמחים חסרי נקטרי. באופן דומה, שלב הפריחה הבינונית מועדף כאשר יש ביטוי תכונה מקסימלי. לכן, נאספו דגימות עלים ופרחים בשלב זה לביצוע ניסויי ניקוד פנוטיפיים אלו לצורך ניקוד מדויק ואמין של תכונות צוף. בנוסף, הדמיית תכונות נקטריות באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית מונעת/מפחיתה תוצאות חיוביות שגויות של אוכלוסיות ללא תכונות צוף. ניקוד פנוטיפי זה של תכונת הנקטרי משמש גם במחקרי מיפוי לזיהוי סימני DNA הקשורים לתכונה ללא נקטרי, שמגדלים יכולים להשתמש בהם לבחירה בסיוע סמן (MAS) של התכונה ללא נקטרי¹³. טכניקת הניקוד הזו יכולה להיות מורחבת למינים אחרים של צמחים בנוסף לחקר תכונות נוספות כמו בלוטות, שיער וצבע. בסך הכול, ניקוד תמונות דיגיטלי לא רק פותר את בעיית ניקוד תכונות הצוף השגוי על ידי מתן תמונות ברזולוציה גבוהה, אלא גם מזהה שינויים עדינים בביטוי ושומר את התמונות הדיגיטליות לשימוש עתידי. כותנה עם תכונה ללא נקטרי עשויה לשמש לשליטה ביולוגית במזיקים, בנוסף למענה על שאלות מחקר על איך תכונה זו מעודדת אינטראקציות מועילות עם חרקים.

Protocol

1. דגימת עלים בחממה/שדה (איור 1)

1. הכינו שקיות זיפלוק לדוגמה עם תעודות זהות לדוגמה. אחסן שקיות דגימות בטמפרטורת החדר עד השימוש.
2. שים את המקרר יום לפני איסוף הדגימות. הנח שקית קרח מהמקפיא בתחתית המקרר. הנח מגש פלסטיק על שקית הקרח במקרר.
   הערה: כל מקרר נייד יכול לשמש למטרה זו. יש להניח שקית קרח במקרר ואחריו מגש פלסטיק (הפרדה זו מונעת נזקי הקפאה המתרחשים במגע הישיר של הדגימה עם הקרח) לפני העברת המקרר לאתר איסוף הדגימות.
3. העבירו שקיות זיפל עם מקרר ומזומן עם תוויות לחממה/שדה לאיסוף דגימות. נקבעו ריסוסים קבועים לצמחי שדה לאיסוף דגימות נטולות מזיקים. באופן דומה, עבור צמחי חממה, נקבעו ריסוסים קבועים ולוחות זמנים של דשנים לצמחים בריאים.
4. אסוף רקמת עלים צעירה מצמחי חממה או כותנה שגדלה בשדה בגיל 8 עד 12 שבועות בשקיות דגימות מסומנות.
   1. בחרו את שלב הפריחה האמצעי לבחירת הדגימה בשל הביטוי הגבוה ביותר של תכונת הצוף בשלב זה. בחרו עלים צעירים מכל הצמחים בשלב ההתפתחותי הזה. בנוסף להשפעה גנטית וסביבתית, תכונת הצוף מושפעת גם משלב ההתפתחות.
   2. כדי לשמור על שלב ההתפתחות קבוע להשוואה בין גנוטיפים שונים באוכלוסיית_F2 , יש לאסוף דגימות עלים באופן אחיד בשלב מסוים כדי להגביל את ההשוואה לשלב זה. השתמש בגודל העלה של 5 עד 7 ס"מ כמדד, אך ניתן לאסוף עלים צעירים בגודל זהה מכל הדגימות. עלים ישנים מראים ביטוי של תכונת צוף, אך בחלק מהקווים, תכונת הצוף לא תתבטא בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות. כדי להימנע מהשונות הזו ולשפר את עקביות איסוף הנתונים, יש לעקוב אחרי ההוראות הללו בעת איסוף הדגימות.
5. אסוף את רקמת העלה הדגימה והניח אותה בשקית הדגימה המתאימה. אסוף לפחות 2 עלים לכל דגימת צמח.
6. לגבי רקמת העלה, בחרו עלים בריאים באורך 5 עד 7 ס"מ לאורך להב העלה מהענף העליון של הצמח.
   הערה: עלים צעירים על הענפים העליונים מועדפים לכל הדגימות. סוג איסוף דגימות זה לא רק מגביל את הדגימה לשלב התפתחותי מסוים, אלא גם מפחית את השגיאות בפנוטיפינג על ידי שמירה על סוג הדגימה קבוע. פרמטרים נוספים כוללים גישה נוחה ועלים בריאים. השוואת נתונים עקבית תתבצע כאשר ייאספו מספר עלי צמחים מאותו שלב התפתחותי כדי לזהות הבדלים פנוטיפיים מבוססי גנוטיפ באוכלוסייה.
7. שים כל שקית דגימה אטומה עם רקמת העלים במקרר. העבר את המקרר למעבדה.
8. העבר דגימות בודדות למקרר כדי לשמור על תנאי קירור של 4 מעלות צלזיוס. אחסן דגימות במקרר עד להדמיה דיגיטלית של הצוף. ניתן לאחסן עלים עד יומיים להדמיה דיגיטלית, אך עדיף לצלם באותו יום או ביום שאחריו.
9. לסינון מספר רב של דגימות עלים, אסוף דגימות במנות כדי לסיים את ההדמיה ביום אחד לאחר הקציר. אסוף דגימות בקבוצות של 10-20 או השתמש במספר מקררים כדי למנוע נזק לרקמות או קיפול הרקמה. יש להקפיד באיסוף דגימות לתמונות דיגיטליות טובות.

2. דגימת פרחים בחממה/שדה (איור 1)

1. עקבו אחרי השלבים 1.1 עד 1.6. אספו פרחים מחממה או צמח כותנה שגדל בשדות בן 8 עד 12 שבועות. אסוף לפחות 2 פרחים לכל דגימת צמח.
   1. אוספים פרחים בדרך כלל מהענפים העליונים כאשר הצמחים נמצאים בשלב הפריחה הבינוני. תכונת הצוף מציגה את הביטוי הגבוה ביותר בשלב הפריחה הבינוני.
2. קטף פרחים בריאים. הניחו כל שקית דגימה אטומה עם לפחות שני פרחים במקרר. העבר את המקרר למעבדה.
3. העבר דגימות בודדות למקרר כדי לשמור על תנאי קירור של 4 מעלות צלזיוס. אחסן דגימות במקרר עד להדמיה דיגיטלית של נקטרי הברקטל.
   1. עיבוד דגימות באותו יום או ביום הבא לאחר האיסוף. אספו דגימות פרחים, שמרו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומעבדים נקטרי ברקטיאלי באותו יום. אספו פרחים שנוצרים מאוחר יותר ביום הבא או מאוחר יותר בשבוע ועברו תהליך הדמיה דיגיטלית של נקטרי הברקטיאל באותו יום.

3. התקנה ראשונית של מיקרוסקופ דיגיטלי (איור משלים 1)

הערה: מיקרוסקופים דומים נוספים יכולים לשמש ללכידה ואחסון דיגיטלית של התמונות.

1. הפעל את המיקרוסקופ (VHX 600) והשלים את השלבים הראשונים. הנח דף לבן חצי מקופל בגודל A4 התואם לגודל שלב המיקרוסקופ.
2. כוון את האור על פלטפורמת המיקרוסקופ/הבמה באמצעות כפתורי האור הקטנים שנמצאים בבקר הקונסולה.
3. סובב את מתג האור (כפתור קטן בקונסולה) למקסימום כדי לקבל מקסימום אור ובהירות מתג (כפתור גדול בקונסולה) לבינוני גבוה על ידי סיבוב הכפתור של הקונסולה בשלושה רבעים מהדרך.
4. תוכנת VHX 600 המובנית מציגה אפשרויות לכיוון העדשה על מסך המחשב. כוון את העדשה להגדלה של פי 10 על ידי בחירת אפשרות עדשה פי 10 על המסך. הפעל את מתג ההפעלה של המסך במסך הקדמי של המחשב, ותפריט הראשי יופיע, שמציג אפשרויות לעדשה ולהקלטת תמונות.
5. קח מספר קטן של דגימות (3 עד 5) מהמקרר למקרר לצילום דיגיטלי. הניחו את המקרר עם דגימות ליד המיקרוסקופ.
6. שמור את קרש החיתוך והלהב הסטרילי על הספסל קרוב למיקרוסקופ. בחר דגימה אחת מהמקרר והוציא את רקמת הדגימה כדי להמשיך בהדמיה דיגיטלית (איור 1).

4. הדמיה דיגיטלית וניקוד של צוף עלים (איור 2)

1. עקבו אחרי השלבים 1 ו-3. פתח את שקית הזיפלוק הדוגמית והניח את דגימת העלים על קרש החיתוך. חתכו את הפטיול של העלה באמצעות להב סטרילי.
   הערה: לשימוש בטוח בלהבים, לבש כפפות ושמור על הקצוות החדים של הלהב פונים הרחק מהאצבעות, כאשר הרקמה ממוקמת בין האצבעות בזמן ביצוע חתכים.
2. העבר את רקמת העלה לדף הלבן החתוך מראש שהונח על הבמה. הפוך את רקמת העלה במרכז שלב המיקרוסקופ כשהצד האפקסיאלי פונה כלפי מעלה.
3. התמקד במרכז העלה על ידי סיבוב עדין של ההתאמות הגסות והעדינות של כפתורי המיקרוסקופ. המשך לכוון עד שלא יהיה טשטוש בתמונה.
4. מכיוון שהנקטריה נמצאת בקצה התחתון של הרבע האמצעית, שמרו אותו במרכז במקום שבו נצפו הוורידים המרכזיים והורידים המתפצלים המאוחרים יותר. שמור על העלה במרכז בפוקוס על הבמה.
   הערה: רק נקטרי עלה אחד נצפה בכותנה ביתית, בעוד שסוגי הבר מציגים שלושה צופים, אחד על הצלע האמצעי ואחד בכל וריד צדדי משני צידי הצלע האמצעי (סך הצופים :3).
5. כוון את ההתאמות הגסות והעדינות של המיקרוסקופ כדי לשפר את בהירות התמונה הדיגיטלית. בצע את כל התאמות התמונה כדי ללכוד ולשמור את תמונת הצוף של העלה.
   1. כדי למנוע השתקפות אור בתמונה הדיגיטלית, כבה את כל האורות והקלט את התמונה על מסך המחשב. כבו את כל האורות בחדר והשתמשו במנורת שולחן כדי לעבד כל דגימה. לאחר ביצוע כל השלבים, כבו את המנורה והשאירו רק את אור המיקרוסקופ דולק והקליטו את התמונה.
6. שמור את התמונה ברגע שהתוכנית מבקשת חלון שמציג כמה אפשרויות לשמירה. שמור את התמונה (על ידי תיוג כל תמונה) עם מספר מזהה של הדגימה. דירגו את התמונה הדיגיטלית של צוף העלה ל-1, 2, 3 ו-4 בהתבסס על הפנוטיפ של הצוף. עדכן את דף הניקוד שלך עבור כל מזהה לדוגמה.

5. הדמיה דיגיטלית וניקוד של צוף הברקטה (איור 3)

1. עקבו אחרי השלבים 2 ו-3. העבר מספר קטן של דגימות פרחים (2-3) להדמיה. הוצא את דגימת הפרחים מתיק הזיפל.
2. הסר ברקטים מהפרח באמצעות מלקחיים או ידנית ביד. הנח את הפרח על קרש החיתוך הנקי. השתמש בלהב סטרילי כדי לחתוך את גבעול הפרח. השתמשו בלהב סטרילי כדי ליצור חתך ישר לאורך קצה הברקטים שהוסרו.
3. מניחים את הרקמה הפוכה (עם הפטיול כלפי מעלה) על הדף הלבן החתוך מראש שמונח על שלב המיקרוסקופ.
4. השתמש בהתאמות גסות ועדינות כדי לשפר את בהירות התמונה המוצגת על המסך. בצע את כל התאמות התמונה ולחץ על כפתור ההקלטה בשלט הקונסולה כדי לתפוס את תמונת העלה.
   1. בצע התאמות תמונה על ידי הגדרת הכפתור/מתג האור הקטן למקסימום ואת כפתור הגדול/מתג הבהירות לבינוני גבוה (על ידי סיבוב הכפתור ל-3/^4th). לאחר מכן, לשפר את רזולוציית התמונה על ידי סיבוב ההתאמות הגסות והעדינות של המיקרוסקופ. שמור על ההתאמות האלה קבועות והחלף דגימות עד שהתמונות מוקלטות לכל סט הדגימות. כדי למנוע השתקפות אור בתמונה הדיגיטלית, כבה את כל האורות והקלט את התמונה במחשב.
5. לאחר מכן, התוכנית מבקשת חלון שמציג את כל מיקומי המחשב כדי לשמור את התמונה. שמור את התמונה הדיגיטלית במחשב עם מספר הזיהוי של הדגימה.
6. לדרג את נקטרי הברקטל (איור משלים 2) עם 1, 2, 3 ו-4 בהתבסס על הפנוטיפ שנצפה בתמונות הדיגיטליות שנרכשו. עדכן את דף הניקוד עם מזהה לדוגמה והציון המתאים לניתוח עתידי

Results

צמחי כותנה שגודלו בשדה במשך 8 עד 12 שבועות נבחרו למחקר זה. נאספו לפחות שני שכפולים טכניים לכל צמח לכל סוג רקמה. דגימות עלים צעירות ובריאות נאספות מהענפים העליונים עם להבי עלים באורך 5 עד 7 ס"מ. דגימות פרחים בריאות נאספות מפרחים פתוחים או ניצני פרחים שייפתחו באותו יום. דגימות עלים ופרחים נאספו מהשדה מקווי צמחים שונים, ונוצרו תמונות דיגיטליות לשני סוגי הרקמות במעבדה באמצעות מיקרוסקופ (איור 1). כל השלבים בוצעו כפי שתואר לעיל בהליך מאיסוף הדגימות ועד להדמיה (כפי שמוסבר באיור 2 ובאיור 3). התוצאות המייצגות הן לנקטרי העלים והן לנקטרי הברקטיאלי מראות בדרך כלל היעדר צוף (1), נוכחות צוף עם פנוטיפים ביניים (2, 3), וצוף מפותח לחלוטין המפיק צוף (4). הנתונים שנוצרו באיור 4 הם התמונות הדיגיטליות שנאספו משני צמחי כותנה שונים (נקטרי וללא נקטרי). תוצאות הניקוד הדיגיטלי של פני העלה האבקסיאליים (בצד התחתון של הרבע האמצעית) הראו שני פנוטיפים עם ציונים 1 (ללא נקטריות על הצלע האמצעית) ו-4 (עם נקטריה מפותחת לחלוטין עם צוף; איור 4A,B). באופן דומה, כאשר דגימות פרחים נותחו לצוף ברקטאלי, הראו שני פנוטיפים: 1 (ללא צוף) ו-4 (נקטר מלא המפיק צוף; איור 4C,D). באופן אידיאלי, גם העלים וגם הפרחים שנאספו מאותו צמח צריכים לעקוב אחרי אותו דפוס, כלומר העלה והפרח ללא נקטרי שייכים לצמח אחד, בעוד שהעלה והפרח המצוף שייכים לאותו צמח. איור 5 נוצר על ידי איסוף תמונות דיגיטליות של צופים עלים וברקטיאלים של צמחים מצופים ב-10x, 20x ו-40x, לצורך המחשה ברורה של תכונות הצוף. יתרה מזאת, כדי להבין כיצד ניתן דירוג זה באוכלוסיות_F2 מופרדות של הורים כותנה נטופים וללא נקטרי, נאספו רקמות עלים מאחת מהאוכלוסיות הללו, והופקו תמונות דיגיטליות עבור כל דגימת צוף עלה. תמונות דיגיטליות נבחרות של עלים, המתאימות לניקוד הפורמט הסטנדרטי של 1, 2, 3 ו-4 מודגשות באיור 6¹³. הדפוס הנפוץ והקל לזיהוי הוא היעדר צוף ונוכחות של צוף. היעדר צוף מקבל את הציון הנמוך ביותר, בעוד שצוף מפותח מקבל את הציון הגבוה ביותר של 4. טווח הציונים בין 1 ל-4, שהם 2, 3, הוא לא מפותח וקטן יותר מהנקטריים הרגילים. דפוס זה ניתן להבחין במצב הומוזיגוטי ללא נקטרי, שהוא מצב 1 (נעדר), הטרוזיגוטי כמו ב-2 ו-3 ציונים (נקטריים מופחתים), ו-4 (מפותחים במלואם). בנוסף, ניתן לגדל קווי הורים נטופים וללא נקטרי יחד עם אוכלוסיות כדי להשוות ולהבנת ההבדלים הללו.

איור 1: סקירה של שלבי ויזואליזציה של צופי עלים וברקטיאלים החל מדגימה ועד מיקרוסקופיה דיגיטלית. (א) בחר צמחי כותנה בשלב הפריחה הבינוני לאיסוף דגימות עלים ופרחים. (ב) לאסוף דגימות עלים מהשדה לצורך תצפית על תכונות צוף על העלה. (ג) להפוך את העלה כך שהצד האבקסאלי של העלה פונה כלפי מעלה והתבונן בתכונת הנקטרי באזור הקופסה השחורה המודגש. (ד) למקם את העלה על שלב המיקרוסקופ, ולשמור על המיקוד באזור התיבה השחורה המודגשת לצורך הקלטת תמונות דיגיטליות של צוף העלה. (ה) לאסוף פרחים בשלב הפריחה האמצעי מהשדה (א). (ו) לבצע חתך על ידי הנחת הפרח על קרש חיתוך וחריטה בקו ישר באזור הקופסה הלבנה בכיוון החץ, תוך הפרדת בסיס הפרח. (ז) למקם את החתך החרוט על שלב המיקרוסקופ להדמיה דיגיטלית של נקטרי הברקטאלים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: הליך שלבי להדמיה דיגיטלית וליטוש של נקטרי העלים בכותנה. 1. לאסוף חומר עלים מהשדה בשקיות דגימות מסומנות ולשים אותם במקרר 2. העבר את המקרר עם הדגימות למעבדה 3. הוצא דגימות בודדות מהמקרר 4. פתח את שקית הדגימה האישית והוציא עלה 5. חתכו את הפטיול של העלה ידנית או השתמשו בלהב. 6. מניחים את העלה על שלב המיקרוסקופ המוגדר מראש כאשר הצד האבקסיאלי (התחתון) פונה כלפי מעלה 7. כוון את הזום ל-10x בתוכנת המסך VHX 600. כוון את ההתאמות הגסות והעדינות של המיקרוסקופ לקבלת הרזולוציה הטובה ביותר של התמונה. 8. הסתכלו על מסך המחשב לכל התאמת התמונה שנצפית על מסך המחשב (כוונו את האור והבהירות הנשלטים על ידי כפתורים קטנים וגדולים על ידי סיבוב הכפתורים האלה, השתמשו בכפתורים עדינים וגסים במיקרוסקופ לרזולוציה הטובה ביותר של התמונה וכיבוי אורות אחרים להסרת השתקפות, וכו') בצוף העלים 9. שמור את התמונה הדיגיטלית לניקוד. מעגל מקף סביב הצוף בעלה מדגיש את אזור צוף העלים בתמונות 8 ו-9. צפו בצופי עלים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 (100 מיקרון). רק צוף עלה אחד נצפה בכותנה ביתית (כפי שנראה בתמונה זו). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: הליך שלבי להדמיה דיגיטלית ודירוג של צופי הברקטיאל בכותנה. 1. לאסוף דגימות פרחים מהשדה בשקיות המסומנות ולשמורן במקרר 2. הוציאו דגימה אחת מהמקרר 3. תוציא פרח אחד 4. הסר את הברקטים ידנית על ידי חיתוך הפרח 5. בצע חתך באמצעות להב סטרילי על ידי חיתוך לאורך קצה הברקטיאל בקו ישר (הקופסה הלבנה המוצגת באיור 1 לפני המשך להדמיה דיגיטלית של נקטרי ברקטאל) 6. הפוך את החלק החרוט 7. הניחו את החלק החרוט עם צד הפטיול פונה כלפי מעלה על שלב המיקרוסקופ שלב 8. בצע התאמות אור באמצעות מתגי האור והבהירות בקונסולה שמחוברת למיקרוסקופ. השתמש בהתאמות גסות ועדינות על המיקרוסקופ לאיסוף תמונות ברזולוציה טובה. כל התמונות נצפות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 (100 מיקרון). אסוף תמונות דיגיטליות לציון נקטרי הברקטל. עיגולים בתמונות הדיגיטליות של צוף הברקטיאל מדגישים את נוכחות הצוף, וישנם 3 צופים ברקטאליים בכותנה ביתית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: תמונות דיגיטליות של צוף עלי כותנה וצוף ברקטיאל. (א) עלה עם צוף; (ב) עלה ללא צוף; (ג) פרח המציג 3 צופים ברקטאליים, ו-(ד) פרח שאינו מראה נקטרי ברקטיאל. התבונן בצוף העלים והפרחים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 (100 מיקרון). מעגלי מקף מראים נוכחות והיעדר צוף בצוף עלים ובנקטרי ברקטאלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: נקטרי העלה והברקטאל הוגדלו ב-10x, 20x ו-40x לזיהוי ברור של הצוף בתמונות דיגיטליות. (א) לאסוף דגימות עלים כדי לצפות בתכונת הנקטרי על המרבע. (ב) התבונן בצוף העלה על העצל האמצעי תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 10. (ג) להתבונן בצוף העלה במרכז העלים תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 20. (ד) התבונן בצוף העלה על העצל האמצעי תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 40. (ה) חתך פרחים לנקטרי ברקטל. (ו) לצפות בצופי ברקטאל תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10. (ז) לצפות בצופי ברקטאל תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 20. (ח) התבוננות בצוף הברקטיאלי תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40. פסי קנה מידה בכל תמונה מייצגים את ההגדלה שבה צולמו תמונות צוף העלים או נקטרי הברקטה (כפי שמוצג כאן כ-10x, 20x ו-40x). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: דפוס ניקוד סטנדרטי של צוף עלים לפי דפוסים של 1,2,3 ו-4. (א) דגימת עלה ללא צוף כפי שמודגש במעגלים המקווקו (ציון 1 על היעדר צוף). (B) צוף העלה הקטן שנצפה מציג דפוס של אחד מהמצבים ההטרוזיגוטיים (תמונת מעגל מקווקו של הנקטרי עם ציון 2). (ג) נקטרי עלים עם ציון 3, דפוס נוסף של ההטרוזיגוט. (ד) נקטרים שלמים עם ציון 4. קנה מידה 10x מייצג את ההגדלה שבה צולמו התמונות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: צוף עלים ונקטרי ברקטאל ללא שימוש במיקרוסקופ. הדמות מתארת כיצד נראות נקטריות עם ניקוד מסורתי. מספר זה הותאם^מ-13. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: גנוטיפים אפשריים של האוכלוסייה האיור מציג גנוטיפים של אוכלוסיות_F2 הנוצרים מהכלאה של הורים מגוונים, נטופים וללא נקטרי. טבלה זו הותאמה מתוך¹³. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: הגדרת מיקרוסקופ דיגיטלי. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: מספר שונה של נקטרי ברקטאל שנצפה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

נקטריים הם טריכומות בלוטות מיוחדות שמייצרות צוף בצמחים להאבקה מוצלחת. גם צופים צמחיים וגם רבייתיים קיימים בצמחים. סוג Gossypium (כותנה) כולל יותר מ-50 מינים, ורובם מכילים צוף עלים¹⁶. עם זאת, תכונה זו בכותנה מושכת גם מזיקים, מה שמוביל לאובדן יבול נוסף¹⁷. המגדלים בחרו תכונות טבעיות ללא נקטרי (היעדר נקטרים) שהתגלו לראשונה ב-G. tomentosum כדי לפתור בעיה זו. מסיבה זו, הם הכניסו תכונה חסרת נקטרי זו לכותנה ההררית המעובדת¹⁷. בסופו של דבר, נוצרו מספר אוכלוסיות על ידי בחירת קווים צופים וללא נקטרי כהורים. מכיוון שאוכלוסיות חסרות נקטרי והטרוזיגוטיות אינן מראות הבדלים בעין בלתי, יש צורך בכלי מיוחד להבדיל בין צמחים אלו. לכן, שיטת הניקוד הזו באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית, בניגוד לניקוד המסורתי (כפי שמוצג באיור 7), לא רק מדגימה צוף מצומצם אלא גם מונעת ניקוד שגוי של צמחים נטולי נקטרי הטרוזיגוטיים כצמחים הומוזיגוטיים ללא נקטרי.

הניקוד הפנוטיפי באמצעות תמונות דיגיטליות תלוי במספר גורמים מרכזיים, כגון נקודת הזמן הספציפית של איסוף הדגימה, בחירת המדגם, השימוש בסולם ניקוד סטנדרטי לנקטרי עלים וברקטיאלים, גנוטיפ אפשרי, וכיצד ניתן לפרש את נתוני הניקוד ליישומים בהמשך. ראשית, חשוב לאסוף עלים ופרחים בעונת הגידול כאשר ההפרשה הצפונית בשיאה, בדרך כלל בשלב הפריחה האמצעי ביולי. שנית, בחירת העלים או הפרחים בגודל ובשלב הנכונים משחקת תפקיד קריטי בניקוד הפנוטיפ. לעלים, ענפים עליונים עם להבי עלים באורך 5 עד 7 ס"מ היו מועדפים לסיקור צוף עלים. באופן דומה, לניקוד נקטרי ברקטיאל, נבחרו פרחים בריאים מענפים עליונים. בחירת דגימה בשלבי התפתחות מסוימים תעזור, אפילו בהשוואה בין כל הצמחים באוכלוסייה על ידי החרגת ביטויי תכונות התלויים בשלב ההתפתחות (כפי שמוצג באיור 8). כדי לבדוק אם הניקוד ניתן לחזרה, נוצרו תמונות דיגיטליות לפחות לשתי דגימות לכל רקמה לכל צמח. איסוף מספר שכפולים של אותו צמח מסייע באיסוף נתונים עקבי.

המגבלה האפשרית של השיטה היא שמירה על צמחים נקיים ממזיקים עד לאיסוף דגימות. אזורים של התפשטות מזיקים ניתן לזהות על ידי כתמים של רקמות או ביצים שהונחו ברקמות או על ידי נזק לאזורי הצוף, כאשר אזורים שחורים ללא מראה ויזואלי של צוף בגלל צריכתם על ידי כנימות או חרקים אחרים. דבר זה נצפה במהלך סקר מאות דגימות. במקרים כאלה, נאספו שוב עלים ופרחים בריאים ונותחו לנתונים עקביים מהדגימות הללו. ניתן לפתור זאת על ידי שמירה על לוחות זמנים קבועים להדברה והוספת דשן להשגת צמחים בריאים. ביצוע כל השלבים הקריטיים כפי שתואר יסייע בפתרון תקלות בניקוד פנוטיפ.

לטכניקה זו יש מספר יישומים, כגון מיפוי לזיהוי סימני DNA המסייעים למגדלים לזהות גנוטיפים לברירה בעזרת סמנים. דירוג פנוטיפ זה דורש אישור מסמני DNA בשל ההשפעות הסביבתיות וההתפתחותיות, בנוסף לגנים השולטים בתכונה זו. לכן, פנוטיפינג של תכונה זו באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית יהיה נקודת התחלה לצמצום מספר רב של צמחים ממספר אוכלוסיות למספר קטן של קווים חשודים ללא נקטרי. באמצעות סמני DNA, קווים אלו מאומתים לשימוש בתוכניות רבייה לפיתוח עמידות למחלות ללא תכונות נקטריות בזנים שפותחו לאחרונה. שיטה זו יכולה גם לסייע לחוקרים להבין את תפקיד תכונת הצוף בצמחים ואת האינטראקציות המועילות עם חרקים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ דיגיטלי	Keyence VHX	VHX 600	ניתן להשתמש במיקרוסקופים נוספים
קרש חיתוך פארברוואר	פארבר	מספר דגם 78892-10	14''L X 11''W X 0.5''Th, ניתן להשתמש בכל מותג, זה זמין במחיר amazon.com
מקרר קטן של Igloos Laguna בנפח 9 QT	איגלו	חלק מספר 00043567	ניתן להשתמש בכל מותג/כל גודל בהתאם לצורך הפרויקט
שקיות פלסטיק (400 יחידות), 3 על 4 אינץ'	מותג אובקו	NA	4''L X 3''W X 0.01''H, ניתן להשתמש בכל מותג, מועדפים על פלסטיק בצבע שקוף
Single  Edge Razor Blades, חבילת 100	Weupe	NA	ניתן להשתמש בכל מותג, זה זמין ב-amazon.com