מאמר שיטה

תקנון ביולוגי של ביופבריקציה אנושית מבוססת ASC עבור מבני רקמה בקנה מידה מקרו-שכפול

DOI:

10.3791/69839

⸱

5 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Eukaryotic Cell Biology (Labio), National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 2Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), UNIGRANRIO, 3Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 4Post-graduation Program in Science and Technology of Polymers, Laboratory of Catalysis for Polymerization, Recycling and Biodegradable Polymers (LCPRB), Institute of Macromolecules, Federal University of Rio de Janeiro, 5Post-graduation Program in Metrology and Technology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 6Campus of Duque de Caxias, Federal University of Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג תהליך ביופבריקציה שניתן לשחזור באמצעות ספרואידים שמקורם בשומן בתאי גזע ופיגומי GelMA מודפסים בתלת-ממד. היא מדגימה שליטה מרחבית, יכולת מיזוג ומדדי בקרת איכות, מה שמוביל למבני רקמה בקנה מידה מקרו הניתנים להשתלה עם יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעדר פרוטוקולים סטנדרטיים בין מעבדות מהווה מחסום משמעותי להשוואה בין תוצאות הניסויים להעברת טכנולוגיות ביופבריקציה יעילות. תקינה ביולוגית קפדנית לא רק משפרת את השחזור, אלא גם מאפשרת התאמה למסגרות רגולטוריות לאומיות ובינלאומיות, החיוניות לתרגום קליני של אסטרטגיות הנדסת רקמות. מחקר זה מציג תהליך ביופבריקציה סטנדרטי הכולל תרבית חד-שכבתית של hADSCs, יצירת ספרואידים, הדפסה תלת-ממדית של פיגומי ג'לטין מתקרילויל (GelMA), וביואסמבציה ספרואידית. מדדי בקרת איכות שולבו כדי להבטיח שחזוריות. הפיגום המודפס בתלת-ממד של GelMA תוכנן עם שני נקבוביות מרכזיות, שכל אחת מהן מסוגלת להכיל מאות ספרואידים. נאמנות ההדפסה אושרה על ידי השוואת ממדי הפיגום למודל CAD, עם סטיות קטנות שאינן משמעותיות. hADSCs יצרו ספרואידים אחידים בתוך 24 שעות במיקרותבניות אגרוז. כאשר זרעו לנקבוביות פיגום, הספרואידים עברו מיזוג רציף במשך 72 שעות, ויצרו מבנים בקנה מידה מאקרו שאושרו בהדמיה קונפוקלית. עיצוב פיגומים ודיוק ההדפסה הבטיחו תמיכה מבנית, בעוד אחידות הספרואידי אפשרה היווצרות צפויה של המבנה. מיזוג הספרואידים בתוך נקבוביות הפיגום הניב מבני רקמה מתאימים להשתלה, עם או בלי הפיגום, מה שמדגיש את הרב-גוניות של גישת הביואסמציה הזו. הממצאים מדגישים את התפקיד המרכזי של התקנון הביולוגי בקידום מתודולוגיות שכפוליות לביופבריקציה של מבני רקמה חיים, עם השלכות מבטיחות ליישומים קליניים עתידיים ברפואה רגנרטיבית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביואסמבלי וביופרינטינג הן גישות ביופבריקציה משלימות בהנדסת רקמות, המתמקדות בבניית רקמות ואיברים מורכבים בקנה מידה מאקרו באמצעות טכנולוגיות אוטומטיות 1,2,3,4.

ספרואידים שולבו בביופבריקציה כאבני בניין בעיקר לגישות ביוהרכבה5. ספרואידים נחשבים למיקרו-רקמות המשחזרות אינטראקציות בין תאים למיקרוסביבה של הרקמה הסובבת ב-vivo. מבין מקורות התאים המשמשים להיווצרות ספרואידים, תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) בולטים בקלות בבידודם, בתחזוקת התרביות לטווח ארוך ובפוטנציאל התמיינותם 6,7,8.

עקב היכולת הפנימית שלהם ליצור אגרגטים גדולים יותר, ספרואידים יכולים ליצור מבני רקמה מורכבים יותר כאשר הם נחשפים לגישות ביואסמבליות. ארגון מונע היתוך זה משפר את הפוטנציאל הרגנרטיבי וההתמיינות של ספרואידים של תאי גזע 9,10.

הרכבה ביולוגית ספרואידית יכולה להיות נתמכת או אפילו מונחית על ידי ביומטריאלים11, מה שהופך אסטרטגיה זו למתאימה לביו-פבריקציה אוטומטית וניתנת להרחבה12,13.

אסטרטגיות ביופבריקציה קיימות ניתנות לקטגוריה רחבה לגישות הרכבה ספרואידיות ללא פיגומים ומערכות ביופרינטינג משובצות הידרוג'ל 2,5,14. שיטות ללא פיגום מסתמכות אך ורק על הרכבה עצמית ספונטנית של תאים ומיזוג בין-ספרואידי, תוך ניצול אינטראקציות פנימיות בין תאים. עם זאת, מכיוון שהן מתרחשות ללא הנחיה אדריכלית חיצונית או הגבלה גאומטרית, גישות אלו מציגות שליטה מרחבית מופחתת וחיזוי מבני נמוך יותר 5,15. לעומת זאת, גישות לכיסוי מבוסס הידרוג'ל מטמיעות תאים בתוך מטריצות בתפזורת כדי לספק תמיכה מבנית וארכיטקטורה מוגדרת מראש16,17, שעשויה להגביל חלקית מגע ישיר בין תאים בשלבים המוקדמים של המיזוג ולהשפיע על דינמיקת נדידת התאים18. במסגרת זו, חומרים ביולוגיים להדפסה כמו ג'לטין מתקרילויל (GelMA) מציגים מוטיבים של הידבקות תאים ועשויים לשמש כפיגומים לסיוע בהרכבת ביולוגית ספרואידית19. פיגום GelMA מודפס בתלת-ממד משוער כמספק כליאה גאומטרית והנחיה מרחבית לספירואידים, ובכך לקדם היווצרות רקמה מבוקרת באמצעות מיזוג למבנים גדולים ומוגדרים מבנית. גישה זו שואפת לשפר את השליטה המרחבית ואת השחזור המבני במהלך ביואסמבציה ספרואידית על ידי שילוב ארגון מונחה על ידי פיגום עם היתוך ספרואידי בתוך ארכיטקטורת הידרוג'ל מוגדרת. עם זאת, תהליך העבודה הנוכחי מתמקד בסטנדרטיזציה של תהליכים ובפרמטרים של ביופברציה מבנית ואינו עוסק בבגרות רקמה ארוכת טווח, התמיינות פונקציונלית או ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול.

תקנון ביולוגי חיוני לא רק להבטחת שכפוליות ויכולת הרחבה, אלא גם לשמירה על שלמות פונקציונלית של רקמות ביומבריקטיביות19,20. כתוצאה מכך, שליטה מדויקת בפרמטרים הנדסיים, גיאומטריים ומבניים היא קריטית, שכן גורמים אלו משפיעים ישירות על ביצועים ביולוגיים, כולל תפקוד הרקמה והבשלות 5,21. מוצגת זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת לשחזור ביופבריקציה, הכוללת את השלבים המרכזיים הבאים: (1) תרבית חד-שכבתית ASC; (2) תצורת כדורי ASC; (3) הדפסה תלת-ממדית של פיגום GelMA; ו-(4) הרכבה ביולוגית של ספרואיד (איור 1). בתוך תהליך עבודה זה, נקבעו מדדי בקרת איכות אובייקטיביים, כולל אחידות וספיריות ספרואידית, דיוק הדפסה ושלמות צורת פיגום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת מיקרותבניות אגרוז וייצור פיגומים מודפסים בתלת-ממד GelMA

  1. ייצור מיקרומולד אגרוז 2% בתמיסת נתרן כלוריד (NaCl) של 0.9% (ראו איור 2A)
    הערה: כל הפסולת הכימית חייבת להיות מטופלת ומושמכת בהתאם לתקנות הבטיחות הכימית המוסדיות ולהנחיות הפסולת המסוכנת.
    1. הכינו תמיסה של 0.9% NaCl במים אולטרה-טהורים ואוטוקלאב למשך 30 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. שמרו בתנאים סטריליים עד השימוש.
    2. מדלל 1 גרם אגרוז אולטרה-טהור סטרילי בתמיסת 50 מ"ל של תמיסת NaCl של 0.9%. הומוגניזציה ודהפולימריזציה של האגרוז במיקרוגל במרווחים של 10 שניות במשך 3–5 מחזורים, עד שהיא מוסה לחלוטין.
    3. בארון בטיחות ביולוגית, יש למקם תבנית סיליקון מסחרית המכילה 81 שקעים מעגליים על גזה סטרילית.
    4. מניחים בזהירות 600 מיקרולטר של אגרוז במרכז תבנית הסיליקון ותנו לה לנוח במשך 40 דקות כדי להבטיח פולימריזציה מלאה.
    5. פירוק בזהירות את המיקרו-תבנית הפולימרימית של אגרוז במלואה והעבר אותה לבאר של לוח מיקרוטיטר בן 12 בארים.
    6. כוונן את מיקום המיקרו-תבנית של האגרוז ומקבע אותו לתחתית הבאר על ידי מילוי ב-600 מיקרולטר של אגרוזה.
    7. דגרו את המיקרו-מולד מראש על ידי דגירה עם Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM, 2 מ"ל לבאר) של Dulbecco למשך 15 דקות. חוזרים על ההליך פעמיים, ובדגירה השלישית החליפו במדיום תרבית תלת-ממדי (3D), המורכב מ-DMEM בתוספת חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם/מ"ל), אלבומין סרום אנושי (1.25 מיקרוגרם/מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (PS, 1×, מתמיסת מלאי של 100×), ותוסף ITS (1×, מתמיסת מלאי של 100×).
      הערה: מדיום התרבית התלת-ממדי שונה ממדיום התרחבות חד-שכבתי בהיעדר סרום בקר עוברי (FBS) ובהכללת תוספים מוגדרים המעודדים אינטראקציה בין תא לתא ותמיכה במטריצות חוץ-תאיות, ומעדיפים הרכבה עצמית וייצוב נכון של הספירואיד. אם ייצור העובש וציפוי התאים מתבצעים בימים שונים, ניתן להשהות את ההליך לאחר הדגירה השנייה של DMEM, ויש לאחסן את העובש בתנאים סטריליים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C למשך עד 5 ימים. הדגירה השלישית עם מדיום תרבית תלת-ממדי חייבת להתבצע רק ביום הציפוי. לפני זריעת התאים, הסר לחלוטין את המדיום הן מהבאר והן מהמיקרומולד.
  2. הכנת הידרוג'ל ג'לטין מתקרילויל (GelMA)
    הערה: כל ההליך צריך להתבצע בחושך, שכן החומרים רגישים לאור. במחקר זה, נעשה שימוש ב-GelMA (חוזק ג'ל 300 גרם בלום, דרגת החלפה 60%) וביוזם הפוטו-ליתיום פניל-2,4,6-טרימתילבנזואילפוספינאט (LAP). להכנת 10 מ"ל של תמיסת GelMA עם 10% עם וולט ו-LAP המכילה 0.5% עם LAP:
    1. המיס 50 מ"ג אבקת LAP ב-1 מ"ל DMEM, תוך ערבוב עדין עם פיפטה עד שמתקבל תמיסה שקופה ואחידה.
    2. העבר את תמיסת ה-LAP לצינור צנטריפוגה המכיל 9 מ"ל DMEM וערבב היטב.
    3. בארון בטיחות ביולוגי, יש לחטא את התמיסה המתקבלת על ידי סינון דרך פילטר של 0.22 מיקרון.
    4. הוסף 1 גרם GelMA לתמיסה והומוגן באמצעות ערבוב מגנטי בטמפרטורה של 50°C למשך כ-3 שעות, או עד שמתקבל תמיסה שקופה והומוגנית. החזק את הבקבוק מול האור כדי לוודא שהתמיסה נקייה מחלקיקים נראים ומעוכרות גלויה.
    5. טעין את ההידרוג'ל המתקבל למזרק בנפח 10 מ"ל להדפסה הבאה או, אם לא משתמשים בו מיד, אחסן אותו בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס, מוגן מאור, עד לשימוש.
      הערה: תמיסות GelMA ו-LAP שימשו כ-24 שעות לאחר ההכנה. אחסון ממושך של תמיסה זו אינו מומלץ. גם אבקות GelMA וגם LAP צריכות להיאחסן בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס, בהתאם להוראות היצרן. הפוטוניזטור של LAP מסווג כלא מסוכן לפי תקנים כמו ABNT NBR 14725 ותקנה (EC) מס' 1272/2008. עם זאת, היצרן ממליץ להשתמש בציוד מגן אישי למניעת גירוי נשימתי, עור ועיניים. מומלץ להשתמש במשקפי בטיחות שנבדקו ואושרו בהתאם לסטנדרטים ממשלתיים רלוונטיים, כגון NIOSH (המכון הלאומי לבטיחות ובריאות תעסוקתית - ארה"ב) או EN 166 (EU), וכן כפפות גומי ניטריל בעובי מינימלי של 0.11 מ"מ. הגנה נשימתית נדרשת רק כאשר נוצר אבק. המלצות היצרן בנוגע להגנה נשימתית באמצעות מסנן מבוססות על תקנים כמו DIN EN 143, DIN EN 14387 ותקנים משלימים נוספים הקשורים למערכת ההגנה הנשימתית הספציפית בשימוש. היצרן ממליץ להשתמש במסנן מסוג P1.
  3. עיצוב מודל תלת-ממדי, חיתוך ויצירת קובץ G-code
    הערה: דגם הפיגום התלת-ממדי תוכנן באמצעות תוכנת עיצוב תלת-ממדי בעזרת מחשב (CAD) בשם Tinkercad. לפרוטוקול זה נוצר פיגום גלילי בקוטר 15 מ"מ, עובי תחתית של 1 מ"מ, ושני נקבוביות עגולות, כל אחת בקוטר 5.50 מ"מ ועומק של 2 מ"מ.
    1. לאחר השלמת עיצוב המודל התלת-ממדי, יש לייצא אותו כקובץ *.stl (קובץ משלים 1).
    2. פתח את תוכנת Repetier-Host V2.3.2, שתשמש לפריצת המודל המתוכנן.
    3. בלשונית "חותך", בחר את אפשרות הסלייסר הרצויה. במחקר זה נעשה שימוש במנוע CuraEngine .
    4. הגדר את פרופיל הפרמטרים המתאים. בעבודה זו, מהירות 10 מ"מ לשנייה; גובה השכבה 0.2 מ"מ; תבנית מילוי: רשת; נעשה שימוש בקוטר פיה של 0.41 מ"מ.
    5. טען את קובץ *.stl של המודל התלת-ממדי להדפסה.
    6. בלשונית "Slicer", בחר את הקונפיגורציה שנוצרה קודם.
    7. לחץ על "Slice with CuraEngine". המודל התלת-ממדי הפרוס יוצג אז בממשק התוכנה.
    8. לחץ על "שמור לקובץ" כדי לשמור את קובץ קוד ה-G במקום הרצוי.
  4. הדפסה תלת-ממדית של פיגומי הידרוג'ל ג'לטין מתקרילויל (GelMA) להרכבת ביולוגית ספרואידי
    הערה: יש לבצע הדפסה תלת-ממדית בתנאים סטריליים. לכן, לפני תחילת תהליך ההדפסה, בדוק שארון הבטיחות הביולוגי שבו נמצאת המדפסת פועל ושזרימת האוויר פועלת כראוי. ודאו שגובה זכוכית ההגנה של הארון הוא באותו גובה כמו סימון חיישן הציוד.
    1. הסר את מנעולי הבטיחות מהביופרינטר הביולוגי.
    2. הסר את לוח הזכוכית ממיטת ההדפסה על ידי שחרור הקליפים המתכתיים.
    3. הצמיד מדריך אקרילי בעיצוב מתאים כדי לתמוך בקיבוע לוח התרבית לפלטפורמת ההדפסה, באמצעות קליפסים מתכתיים.
    4. חבר את המדפסת למקור הכוח. שימו לב שציוד זה תומך במתח כפול (110/220 וולט).
    5. חבר את כבל ה-USB של המדפסת למחשב.
    6. לחץ על כפתור ההפעלה/כיבוי כדי להדליק את המדפסת.
    7. תוכנת Open Repetier-Host V2.3.2, שתשמש לצפייה בדגם התלת-ממדי ולהדפסה.
    8. לחץ על האפשרות "התחבר" בממשק התוכנה.
    9. באמצעות בקרת המדריך של התוכנה, בחר את האקסטרודר (1 או 2) ושלח את ראש ההדפסה למיקום הבית (X = 0, Y = 0, Z = 0).
    10. כוון את האקסטרודר הנבחר להתאמה נכונה של המזרק באמצעות הכלי המתאים של הבקרה הידנית ב-Repetier.
    11. הכנס בזהירות את המזרק לתוך האקסטרודר, שכבר טעון בהידרוג'ל ומחובר לפיית אקסטרוזיה (במחקר זה השתמשנו בפיית פוליפרופילן חרוטית בקוטר פנימי של 0.41 מ"מ).
    12. הכניסו את לוח התרבית לתוך המדריך האקרילי שמחובר למשטח ההדפסה.
    13. כוון את מיקום הבית Z (Z = 0) באמצעות ברג הקצה Z הממוקם בצד שמאל של הביופרינטרה. כלומר, קבע את המרחק הרצוי בין פיית האקסטרוזיה למשטח ההדפסה. באופן אידיאלי, הפיזה צריכה לגעת בעדינות במצע, שבמחקר זה הייתה לוח התרבית.
    14. החזר את ראש ההדפסה למיקום הבית.
    15. טען את קובץ קוד ה-G שנוצר קודם.
    16. באמצעות כלי הבקרה הידני המתאים בתוכנה, הוצא חלק מההידרוג'ל מהמזרקה כדי להבטיח זרימת חומר דרך הפיה.
    17. תתחיל את תהליך ההדפסה.
    18. לאחר ההדפסה, יש לבצע פוטוקרוסלינקינג של הפיגום שנוצר באמצעות מערכת האור UV של הביופרינטר התלת-ממדי, המצוידת בשתי נורות LED ב-395-400 ננומטר. חשפו את הפיגום לאור UV למשך 5 דקות (עוצמת אור של 20 mW/cm2).
    19. השתמש באותו תמיסה מפורקת של 2% אגרוז המשמשת לייצור המיקרו-תבניות כדי לחבר את הפיגומים המודפסים בתלת-ממד לבארות של לוח תרבית בן 12 בארות. חיבור הפיגומים לתחתית הבארות הכרחי כדי לספק יציבות רבה יותר ולמנוע הזזות במהלך זריעת הכדורים ובמהלך תקופת הגידול.
      הערה: בעת ביצוע שלב 4.16, בדוק אם ההידרוג'ל יוצר חוט רציף במהלך האקסטרוזיה. בדרך כלל, תמיסת הג'לטין נטענת לתוך המזרק בעודו עדיין במצב נוזלי (כ-37 מעלות צלזיוס). בתוך מספר דקות בטמפרטורת החדר (22–25 מעלות צלזיוס), הביומטריה הזו מתחילה לעבור למרקם דמוי ג'ל. החומר לא אמור לטפטף במהלך האקסטרוזיה, שכן הדבר ישפיע לרעה על איכות ההדפסה. היווצרות פילמנט רציפה במהלך האקסטרוזיה מצביעה על כך שההידרוג'ל הגיע למרקם אופטימלי להדפסה. תמיסת GelMA ו-LAP המדוללת ב-DMEM מציגה גוון כתום קל. לאחר פוטוקרוסלינגינג מושרה UV, נצפית שינוי צבע לעיתים קרובות, כאשר החומר הופך ללבן או שקוף, כפי שמוצג באיור 3D,E. בעת הפעלת מערכת ה-UV, משקפי בטיחות הם חובה כדי להבטיח הגנה מספקת על העיניים מפני קרינה אולטרה סגולה.
  5. ניתוח נאמנות הדפסה
    הערה: ניתוח נאמנות ההדפסה התלת-ממדית של פיגומי GelMA מתחשב בפרמטרים הבאים: קוטר פיגום, קוטר נקבוביות ועובי פיגום. תוכנת ImageJ גרסה 1.54 שימשה לביצוע המדידות.
    1. ראשית, לצלם תמונות של הפיגומים הנראים על ידי מיקרוסקופ סטריאו. השתמש בסרגל או קליפר כהפניה.
    2. לפני ניתוח התמונות, כייל והגדר את הקנה מידה ב-ImageJ לביצוע המדידות.
    3. השתמש בכלי הקו הישר לביצוע המדידות.
    4. מכיוון שצורת הפיגום והנקבוביות הן עגולות, יש להשתמש בממוצע האריתמטי של הפיגום וקוטר הנקבוביות לניתוח סטטיסטי.
    5. לניתוח נאמנות הדפסה, השווה את המדידות שהושגו על ידי ImageJ מהפיגומים המודפסים לערכים שהוגדרו במודל התלת-ממדי שנוצר על ידי טינקרקאד.
      הערה: עובי הפיגום המודפס הנמדד מושווה לסכום עומק הנקבוביות וערכי העובי התחתון המוקרנים בטינקרקאד.
    6. בצע ניתוח סטטיסטי של הנתונים שהושגו. במקרה זה, כדי להשוות את ערכי הפיגום הנמדדים לערכים הצפויים, ניתן להשתמש במבחן מאן-וויטני U (לא פרמטרי). מבחן שפירו-וילק משמש להערכת נורמליות. הבדלים נחשבים למובהקים סטטיסטית כאשר p < 0.05.

2. הכנת hADSCs והיווצרות ספרואידים

הערה: תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (hADSCs) זמינים מסחרית גודלו בתווך גדילה ספציפי לתאים ועברו במפגש של 80%–90% לפי המלצות היצרן. תאים שימשו עד הקטע 7 לפרוטוקול זה. כל הפסולת הביולוגית חייבת להיות מזוהמת או מחטא כראוי לפני ההשלכה ולטפל בה בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות. לצורך הדמיה קונפוקלית מאוחרת, יש לסמן את השכבה המונוליירית בצבע פלואורסצנטי לפני היווצרות הספרואיד ולדגור לפי המלצת היצרן. היווצרות ספרואיד יכולה להתחיל 30 דקות לאחר הסימון.

  1. טריפסיניזציה של שכבת מונו-שכבת ה-ASC
    1. בארון בטיחות ביולוגית, פתח את בקבוק התרבית והעבר את תכולתו למיכל פסולת.
    2. שטפו את השכבה החד-שכבאית פעמיים עם 1× סליין מזרחן-בופר (PBS) והשליכו את התמיסה.
    3. הוסף 0.125% תמיסת טריפסין/EDTA מספיקה לכסות את השכבה החד-שכבתית. סגור את הבקבוק ודגר באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C למשך עד 5 דקות.
    4. השבית את הטריפסין/EDTA על ידי הוספת כמות שווה של DMEM בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) של 10%.
    5. לאסוף את תליית התא באמצעות פיפטה סרולוגית או להעביר לצינורות צנטריפוגות. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס).
    6. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    7. החזיר את כדור התא ל-DMEM והומוגניז. קח אליקו לספירת תאים והערכת כדאיות.
  2. תרבות ספרואידית (ראו איור 2B)
    1. הפרדו את מספר התאים המתאים לציפוי לכל תבנית לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל. עבור hADSCs, כל עובש אגרוז המכיל 81 שקעים אמור לקבל תא אחד × 106 תאים—נוצר ספרואיד אחד בכל מיקרובאר, ומניב 81 ספרואידים לכל מיקרועולד.
    2. הוסיפו 1× PBS וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את הסופרנטנט והוסיף 1× PBS. חזור על השלב פעמיים.
    3. לאחר הצנטריפוגה השלישית, משליכים בזהירות את הסופרנטנט וייבשו את פתח הצינור עם גזה סטרילית לפני שמחזירים אותו למצב אנכי.
    4. להחזיר את כדור התא ל-120 מיקרוליטר של מדיום תרבית תלת-ממדי לתרבות ספרואיד ולהומוגן. כוונו את נפח המתלים ל-200 מיקרוליטר עם מדיום תרבית תלת-ממדי נוסף במידת הצורך.
      הערה: כל תבנית עם 81 כריתה קיבולת של 200 מיקרוליטר.
    5. שאופים 200 מיקרו ליטר וציפו בזהירות במרכז התבנית, כדי למנוע היווצרות בועות.
      הערה: שלב זה יכול להיות מאוטומט באמצעות מערכת פיפטינג רובוטית, כפי שתואר קודם22.
    6. השאירו את הפלטה בארון הבטיחות הביולוגית למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב בניתוחים.
    7. הניחו את הצלחת באינקובטור לחות למשך 40 דקות.
    8. לאחר תקופה זו, הוסיפו בזהירות 2 מ"ל תלת-ממד בינוני לכל באר. החזירו את הלוח לאינקובטור הלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. מדידת ספרואידים וניתוח סטטיסטי
    1. לצלם תמונות של הספרואידים הממוקמים לאורך שני האלכסונים של המיקרו-תבנית האגרוזית, היוצרים דפוס "X", באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך המצויד במצלמה דיגיטלית ומטרה בקוטר 10×. השתמש במוט בקנה מידה של 100 מיקרון כדי לכייל את סולם התמונה לפני מדידת הקטרים.
    2. כדי לקבוע את הקוטר הראשי והקטן של הספרואידים, השתמש בכלי ה"קו" של התוכנה ובצע שתי מדידות ניצביות לכל ספרואיד מצולם, בזווית של כ-90° ביניהם.
    3. חשב את הקוטר הממוצע של כל ספרואיד כממוצע האריתמטי של שני הקטרים הניצבים שנמדדו קודם. חשב את הכדוריות כיחס בין הקוטר הגדול ביותר לקוטר הקטן ביותר של כל ספרואיד, כאשר ערכים קרובים ל-1 מצביעים על אחידות רבה יותר וצורה כדורית יותר.
    4. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות ערכי הקוטר והכדוריות שהושגו.

3. זריעת ספרואידים על פיגומי GelMA למיזוג ספרואידים וביואסמבציה

  1. לאחר 24 שעות של היווצרות ספרואיד, אספו אותם ממיקרו-תבניות האגרוז באמצעות פיפטה עם קצוות רחבי קדח והעבירו אותם למיקרוצינורות בקוטר 2 מ"ל.
  2. כאשר הספרואידים מתיישבים בתחתית המיקרוצינורות, השליכו את הסופרנטנט.
  3. החזירו את הספרואידים ל-50 מיקרו ליטר של תלת-ממד בינוניים.
  4. באמצעות פיפטה עם קצוות רחבים, אספו את הספרואידים והטמיעו אותם בעדינות בנקבוביות הפיגום של GelMA.
    הערה: בנקבובית תמיכה של GelMA בקוטר של כ-5.50 מ"מ ובעומק של 2 מ"מ, זרעים כ-480 עד 640 ספרואידים (המתאימים ל-6–8 מיקרותבניות אגרוז, שכל אחת מייצרת 81 ספרואידים בקוטר של 200 עד 400 מיקרון) ב-50 מיקרוליטר. הערכה זו התבססה על נפח הנקבוביות וקוטר הספרואיד הממוצע, כאשר הכימות בוצע לפי מספר המיקרותבניות השלמות שהועברו ולא לפי ספירת ספרואידים בודדת, מה שמבטיח הערכה מעשית וניתנת לשחזור של צפיפות הספרואיד בתוך הנקבובית.
  5. לאחר שהצבת הספרואידים בנקבובית התמיכה של GelMA, יש להמתין 20–40 דקות כדי לאפשר לספרואידים לשקוע. הוסיפו 1 מ"ל מדיום תלת-ממדי לכל באר.
  6. אחרי 24 שעות, הוסף 1 מ"ל של מדיום תלת-ממדי לכל באר.
  7. עוקבים אחרי מיזוג הספרואידים בתוך נקבוביות פיגומי GelMA באמצעות מיקרוסקופ פאזה-ניגודיות וסטריאומיקרוסקופיה. צלם את התמונות כל 24 שעות, מהיום 0 (מיד לאחר הזרעה) ועד יום 3 (72 שעות).
  8. קבע את המבנה הביולוגי ב-4% פאראפורמלדהיד לאחר 72 שעות לצורך הדגשה במיקרוסקופיה קונפוקלית. לטפל בפארפורמלדהיד במכסה אדים כימי מוסמך באמצעות ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על עיניים) בשל תכונותיו הרעילות והמגרות, ולהיפטר מפסולת בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מוסדיות. לצורך תצפית קונפוקלית, יש לתייג מראש את התאים בשכבה המונולרית עם צבע פלואורסצנטי לפני היווצרות הספרואיד.
    הערה: אם יש צורך להסיר את המבנה מנבוב GelMA לצורך ניתוח או יישום במצב חי , יש לשלוף אותו בזהירות באמצעות פינצטה מדויקת או מחורר ביופסיה בגודל מתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) שגודלו בשכבה מונו-שכבה (איור 2C) הושרו בהצלחה ליצירת ספרואידים בתוך 24 שעות לאחר הזרעה למיקרו-תבניות אגרוז (איור 2D). הספרואידים שהתקבלו הציגו מורפולוגיה קומפקטית ומוגדרת היטב. ניתוח מורפומטרי חשף קוטר ממוצע של 239.8 מיקרון ± 87.0 מיקרון ב-24 שעות (איור 2E) וערך כדוריות הקרוב ל-1 (0.947 ± 0.123) (איור 2F), המצביע על ספרואידים אחידים וס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות במחקר זה מדגישות את השילוב המוצלח של מדדי בקרת איכות בתהליך ביופבריקציה סטנדרטי כדי להבטיח שחזוריות. השימוש בפיגומים מודפסים בתלת-ממד המבוססים על עיצובים מוכרים מראש מספק תמיכה מבנית לביואסמבציה ספרואידית19,23. כהוכחת מושג, פותח פיגום מוצק עם שני אזורים נקבוביים מרכזיים, שגודלם לתמיכה בעומס ספרואידי בצפיפות גבוהה ובהרכבת ביולוגית מונחית.

כנקודת ביקורת ראשונה לבקרת איכות, מדידות ספרואידי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) על האיורים בדמויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)מוכן במעבדה-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead593iCAN--
AgaroseSigma-Aldrich16500-500-
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4544-100MG-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert Zeiss-415510-1101-000
Celldiscover Zeiss-LSM 900 with Airyscan 2
CelltrackerInvitrogen C7025-
CentrifugeEppendorf -5702
Class II Biological Safety CabinetStreamline-Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell cultureThermo Fisher Scientific-Series 8000 WJ 
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm593iCAN--
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose Sigma-Aldrich D2902-10L-
EDTASigma-Aldrich E9884-
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco 12657-029-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%Sigma-Aldrich900622מספר פריט/מגרש: MKCS2673. תיעוד עבור כל מגרש, כולל גיליון נתוני הבטיחות (SDS) ותעודת הניתוח (CoA), ניתן לקבל מאתר האינטרנט של היצרן’s.
GraphPad Prism 6.0 softwareGraphPad Inc--
Hot plate magnetic stirrerIKAZ671797Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/mlFUJIFILM Irvine Scientific9988-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x Sigma-AldrichI3146-5ML-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope Labomed--
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroidsSigma-AldrichZ764019-
Penicillin-streptomycin 100xSigma-Aldrich15140122-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)Lonza PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich71382-500G-
Trypsin/EDTAGibco 27250018-

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spagnuolo, F. D., Kronemberger, G. S., Storey, K. J., Kelly, D. J. The maturation state and density of human cartilage microtissues influence their fusion and development into scaled-up grafts. Acta Biomater. 194, 109-121 (2025).
  2. Baptista, L. S., et al. Bioprinting using organ building blocks spheroids organoids and assembloids. Tissue Eng Part A. 30 (13–14), 377-386 (2024).
  3. Shojaei Barjuei, E., et al. Precision improvement of robotic bioprinting via vision-based tool path compensation. Sci Rep. 14 (1), 17764 (2024).
  4. Li, H., Zhou, H., Xu, C., Wei, Y., Tang, X. 3D bioprinting and scaffold-free strategies for fabrication of multicellular tissues or organoids. Int J Bioprinting. 9 (1), 135 (2023).
  5. Mironov, V. R., et al. Organ printing tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (11), 2164-2174 (2009).
  6. Côrtes, I., et al. Mimicking lipolytic adipogenic and secretory capacities of human subcutaneous adipose tissue using spheroids. Front Cell Dev Biol. 11, 1219218 (2023).
  7. Shi, Y., et al. Advances in culture of adipose-derived stromal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1343255 (2024).
  8. Suchanecka, M., et al. Adipose-derived stem cells in regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036 (2025).
  9. Kim, E. M., et al. Fabrication of core shell spheroids for engineering vascularized tissues. Acta Biomater. 100, 158-172 (2019).
  10. Kronemberger, G. S., et al. Hypertrophic cartilage induction influences building block capacity of ASC spheroids. Artif Organs. 45 (11), 1208-1218 (2021).
  11. Caprio, N. D., Burdick, J. A. Engineered biomaterials guiding spheroid formation and function. Acta Biomater. 165, 4-18 (2023).
  12. Kopinski-Grünwald, O., et al. Scaffolded spheroids for cartilage tissue engineering. Acta Biomater. 174, 163-176 (2024).
  13. Mekhileri, N. V., et al. Automated 3D bioassembly of microtissues. Biofabrication. 10 (2), 024103 (2018).
  14. Groll, J., et al. Biofabrication reappraising the definition. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
  15. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly of cells. Tissue Eng Part A. 14 (3), 413-421 (2008).
  16. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  17. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Advances in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  18. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Spheroids as building blocks in tumor microenvironment models. Int J Bioprinting. 7 (3), 444 (2021).
  19. Levato, R., et al. From shape to function in bioprinting. Adv Mater. 32 (12), 1906423 (2020).
  20. Moroni, L., et al. Biofabrication terminology and technology. Trends Biotechnol. 36 (4), 384-402 (2018).
  21. Sun, W., et al. The 2022 biofabrication roadmap. Biofabrication. 15 (1), 012001 (2023).
  22. Kronemberger, G. S., et al. Automated production of ASC spheroids for bioprinting. J Vis Exp. (181), e63430 (2022).
  23. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  24. Arguchinskaya, N. V., et al. Properties and printability of GelMA hydrogels. Int J Mol Sci. 24 (3), 2121 (2023).
  25. Compaired, P. M., García-Gareta, E., Pérez, M. &. #. 1. 9. 3. ;. Workflow for bioprinting optimization. Int J Bioprinting. 11 (3), 397-415 (2025).
  26. Gaglio, C. G., et al. GelMA synthesis and comparison for bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1383010 (2024).
  27. Gillespie, G. J., et al. Influence of printing parameters and cell density on bioink outcomes. Tissue Eng Part A. 26 (23–24), 1349-1358 (2020).
  28. Maggiotto, F., et al. Perfusable vascularized cancer niche via 3D bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1484738 (2025).
  29. Shie, M. Y., et al. Effects of GelMA concentration on properties and fibroblast behavior. Polymers (Basel). 12 (9), 1930 (2020).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing. Adv Mater. 32 (12), 1902026 (2020).
  31. Pepelanova, I., Kruppa, K., Scheper, T., Lavrentieva, A. GelMA hydrogels for tissue engineering. Polymers (Basel). 10 (11), 1134 (2018).
  32. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting from bench to translation. Adv Mater. 31 (23), 1805510 (2019).
  33. Kronemberger, G. S., Chattahy, K., Spagnuolo, F. D., Karam, A. S., Kelly, D. J. Bioassembly of fibrocartilage microtissues for meniscal grafts. Adv Healthcare Mater. 14 (32), e02208 (2025).
  34. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting for regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  35. Decarli, M. C., et al. Bioprinting stem cell spheroids for cartilage engineering. Adv Healthcare Mater. 12 (7), 2203021 (2023).
  36. Zhang, Z., Liu, Y., Tao, X., Du, P., Enkhbat, M., et al. Engineering cell microenvironments with spheroids and hydrogels. Polymers (Basel). 15 (9), 1925 (2023).
  37. Zuliani, C. C., da Cunha, J. B., Correa, R. F., Pinto, J. u. n. i. o. r. . E. A., d’Ávila, M. A., et al. Injectable hydrogel for delivery of MSC spheroids in cartilage regeneration. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 53 (1), 453-467 (2025).
  38. Unagolla, J. M., Jayasuriya, A. C. Hydrogel-based 3D bioprinting review. Appl Mater Today. 17, 100479 (2019).
  39. Kim, M. H., Singh, Y. P., Celik, N., Yeo, M., Rizk, E., et al. High-throughput bioprinting of spheroids. Nat Commun. 15 (1), 10083 (2024).
  40. Daly, A. C., Davidson, M. D., Burdick, J. A. Spheroid fusion within self-healing hydrogels. Nat Commun. 12 (1), 753 (2021).
  41. Prabhakaran, V., Melchels, F. P. W., Murray, L. M., Paxton, J. Z. Engineering bone tissues via spheroid fusion. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1308604 (2023).
  42. Gabriella, , et al. Probing multicellular tissue fusion of cocultured spheroids. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2103320 (2021).
  43. Kim, S., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multicellular spheroids. Adv Healthcare Mater. 9 (12), 2000608 (2020).
  44. Zhang, J., Yun, S., Du, Y., Zannettino, A., Zhang, H. Hydrogel-based preparation of cell aggregates. Appl Mater Today. 20, 100747 (2020).
  45. Khajehmohammadi, M., Azizi Tafti, R., Nikukar, H. Effect of porosity on bioprinted scaffolds. J Biomed Mater Res A. 111 (2), 245-260 (2023).
  46. Kim, M., et al. Enhanced nutrient transport in engineered cartilage constructs. Acta Biomater. 58, 1-11 (2017).
  47. Chariyev-Prinz, F., et al. MSC response to hydrostatic pressure in chondrogenesis supportive environments. J Biomech. 154, 111590 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GelMA

מאמרים קשורים