Method Article

מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד

DOI:

10.3791/69853

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר סימון נוגדן יחיד (SAL) לפתרון הארגון המרחבי בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה. על ידי ניצול אינטראקציות מצטברות בין נוגדנים לאפיטופים ברמת המולקולה היחידה, SAL ממברנה (mSAL) ממפה התפלגות אפיטופים מקומיות תוך כדי לכידת התנהגות קשירת נוגדנים בסביבה התאית הטבעית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממברנת הפלזמה מגדירה את צורת התא ומשמשת כממשק שמנהל את התקשורת הבין-תאית. חלבוני ממברנה מהווים קטגוריה עיקרית של מטרות טיפוליות; לכן, סופר-רזולוציה של ממברנת התא דרך החלבונים המרכיבים אותה טומנת בחובה הבטחה רבה בקידום ביולוגיית התא וטיפולי נוגדנים. בהקשר זה, מיקרוסקופיית לוקליזציה חד-מולקולית (SMLM) מאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של ארגוני חלבונים על מבנים ביולוגיים. למרות חשיבותו, יישום SMLM על חלבוני ממברנת פלזמה מציב אתגרים ייחודיים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה יעילה באמצעות תיוג נוגדן יחיד (SAL) בזמן-לאפס, הנקראת SAL ממברנה (mSAL). אנו מספקים הוראות מפורטות שלב אחר שלב, כולל אופטימיזציה של ריכוז הנוגדנים, צפיפות עוצמת הלייזר, משך מרווחי האור, שחזור תמונה וניתוח אשכולות מבוססי צפיפות, כדי לפענח את התפלגות חלבוני הממברנה בקנה מידה ננומטרי ומורפולוגיית הממברנה. אנו משתמשים בחלבון הטטראספנין CD81 כמודל חלבון ממברנה כדי להדגים את היכולת של mSAL הן על תאי יונק דבקים והן על תאי יונק מתלוננים. בנוסף לסופר-רזולוציה של ממברנת התא וההתפלגות של חלבוני ממברנה, הטכניקה שלנו מאפשרת חקירת הפרמקודינמיקה של נוגדנים טיפוליים הפועלים עם מטרות הממברנה שלהם בסביבת הממברנה הטבעית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממברנת הפלזמה מכילה מגוון רחב של חלבונים המווסתים את ניידות התאים, ההידבקות, החישה ותקשורת בין-תאית. הבנת ההתפלגות בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה חשובה, שכן תפקוד החלבונים לעיתים קרובות נשלט לא רק על ידי רמות הביטוי אלא גם על ידי הארגון המרחבי שלהם על הממברנה 1,2. ראוי לציין כי נוגדנים טיפוליים רבים מכוונים לחלבוני ממברנה 3,4, מה שהופך מחקרים בקנה מידה ננומטרי לחיוניים להבנת האופן שבו אינטראקציות נוגדנים מושפעות מארגון חלבוני הממברנה המקומי. עם זאת, מיפוי מדויק של התפלגות חלבוני ממברנה, פרופיל מולקולה בודדת ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש בקווי התאים המקובלים Jurkat E6.1 ו-U2OS ואינו כולל חומרים ראשוניים של בני אדם או בעלי חיים חיים.

1. זריעה/נחיתה של תאים וקיבוע

הערה: הכנת הדגימה מתבצעת לפי פרוטוקולי צביעה סטנדרטיים באימונופלואורסצנציה (IF), המותאמים לשימור הארגון התת-תאי של חלבוני ממברנת הפלזמה בין סוגי תאים שונים. אם קיים פרוטוקול אימונוסיינינג מבוסס עבור המטרה הרצויה, המשתמשים יכולים לעקוב אחר הפרוטוקול הזה עד לשלב חסימת הדגימה 1.2.14. סימון נוגדן יחיד (SAL) מתבסס על זיהוי מצטבר של נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית כאשר הם נקשרים לאנטיגן שלהם ברמת המולקולה היחידה. נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית המדולל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת mSAL המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת ויזואליזציה של אירועי קישור נוגדנים בודדים ליעדי חלבוני ממברנת הפלזמה המתאימים, ויוצרת מפה סופר-רזולוציה של התפלגות חלבוני ממברנה. CD81 משמש כאן כדוגמה מייצגת, אם כי הגישה ניתנת להתאמה קלה לחלבוני ממברנה אחרים.

קיבוע תאי ג'ורקט T עם מרווח מספק בין התאים מבטיח נגישות לאפיטופ הממברנה על ידי נוגדנים ומשטח זכוכית כדי להתייצב פידוציאלים (איור 1A). בנוסף, טכניקות פיפטינג יכולות להשפיע ישירות על שי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארגון חלבוני ממברנת הפלזמה ממלא תפקיד חיוני בוויסות תפקוד התא. טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונבנציונליות מוגבלות על ידי מגבלת הדיפרקציה של האור, מה שמסתיר את הארגון בקנה מידה ננומטרי שלהן. SMLM מתגברת על מגבלה זו על ידי השגת רזולוציות מרחביות של 10-20 ננומטר47, המאפשרת אפיון של הרכבות הננומטריות שלהם 10,48,49. ארטיפקטים של אשכולות ב-SMLM נובעים מזיהוי חוזר של אותו פלוא.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R35GM146786 ומהפקולטה למדעי הרוח והמדעים, אוניברסיטת אילינוי שיקגו. התוכן נמצא באחריות המחברים בלבד ואינו בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדן אנטי-CD81 אלקסה פלואר 488תרמו פישר סיינטיפיקMA5-44132נוגדן הדמיה
צנטריפוגה על ספסלאפנדורף5424
אלבומין סרום בקרמיליפורסיגמאA7906-100G
זכוכית כיסוי עם תאים, 8 בארותסלביסC8-1-N
מדיה DMEMתרמו פישר סיינטיפיק11960069
המלח המוגבר של פוספט של דולבקותרמו פישר סיינטיפיק14190-144
סרום בקר עוברימיליפורסיגמאF0926-500ML
גלוטראלדהיד, 10%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים16120
קולואידים זהב, 100 ננומטרטד פלה15711 ומינוס; 20סמן פידוציאלי
שמן טבילה  מעבדות קרג'יל16245
מיקרוסקופ הפוך  מצויד במודול TIRFניקון אינסטרומנטסאקליפס Ti2-Eמיקרוסקופ
קו התאים Jurkat E6.1מיליפורסיגמא88042803-1VLתאי תלייה
שיגור לייזר, קו 6אוקססיוסL6CC-CS8-1511לייזר עירור
ליפופקטמין 2000תרמו פישר סיינטיפיק11668019תגובת טרנספקציה
צינור מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"ל VWR89000-028
תוכנת הדמיית מיקרוסקופיהניקון אינסטרומנטסמחקר מתקדם של NIS-Elementsתוכנת זיהוי תמונה
מטרה, 100x/1.49 CFI APO TIRF ניקון אינסטרומנטסMRD01991מטרת מיקרוסקופ
פאראפורמלדהיד, 16%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140-122אנטיביוטיקה
תמיסת פולי-אל-ליזין, 0.01% מיליפורסיגמאP4707-50ML
מצלמת פריים 95B sCMOSפתרונות טלדיין ויז'ן01-פריים-95B-R-M-16-Cמצלמה
מדיה RPMI 1640תרמו פישר סיינטיפיק11875-093מדיה לתאי תלייה
אזיד נתרןתרמו פישר סיינטיפיק19038-1000
בורוהידריד נתרןמיליפורסיגמא213462-25G
בקבוקי תרבות T25תרמו פישר סיינטיפיק169900
מיקרוספירות TetraSpeckסמן פידוציאלי
צלחת תרבית רקמות, 100 מ"מ קורנינג353003
קו התאים של U2OSATCCHTB-96תאים דביקים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationMembrane ProteinsSingle Antibody LabelingPlasma MembraneSuper Resolution MicroscopyCD81 ProteinDensity Based ClusteringAntibody BindingDrift CorrectionTherapeutic Antibodies

Related Articles