הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

20 במרץ 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר סימון נוגדן יחיד (SAL) לפתרון הארגון המרחבי בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה. על ידי ניצול אינטראקציות מצטברות בין נוגדנים לאפיטופים ברמת המולקולה היחידה, SAL ממברנה (mSAL) ממפה התפלגות אפיטופים מקומיות תוך כדי לכידת התנהגות קשירת נוגדנים בסביבה התאית הטבעית.

תקציר

ממברנת הפלזמה מגדירה את צורת התא ומשמשת כממשק שמנהל את התקשורת הבין-תאית. חלבוני ממברנה מהווים קטגוריה עיקרית של מטרות טיפוליות; לכן, סופר-רזולוציה של ממברנת התא דרך החלבונים המרכיבים אותה טומנת בחובה הבטחה רבה בקידום ביולוגיית התא וטיפולי נוגדנים. בהקשר זה, מיקרוסקופיית לוקליזציה חד-מולקולית (SMLM) מאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של ארגוני חלבונים על מבנים ביולוגיים. למרות חשיבותו, יישום SMLM על חלבוני ממברנת פלזמה מציב אתגרים ייחודיים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה יעילה באמצעות תיוג נוגדן יחיד (SAL) בזמן-לאפס, הנקראת SAL ממברנה (mSAL). אנו מספקים הוראות מפורטות שלב אחר שלב, כולל אופטימיזציה של ריכוז הנוגדנים, צפיפות עוצמת הלייזר, משך מרווחי האור, שחזור תמונה וניתוח אשכולות מבוססי צפיפות, כדי לפענח את התפלגות חלבוני הממברנה בקנה מידה ננומטרי ומורפולוגיית הממברנה. אנו משתמשים בחלבון הטטראספנין CD81 כמודל חלבון ממברנה כדי להדגים את היכולת של mSAL הן על תאי יונק דבקים והן על תאי יונק מתלוננים. בנוסף לסופר-רזולוציה של ממברנת התא וההתפלגות של חלבוני ממברנה, הטכניקה שלנו מאפשרת חקירת הפרמקודינמיקה של נוגדנים טיפוליים הפועלים עם מטרות הממברנה שלהם בסביבת הממברנה הטבעית.

מבוא

ממברנת הפלזמה מכילה מגוון רחב של חלבונים המווסתים את ניידות התאים, ההידבקות, החישה ותקשורת בין-תאית. הבנת ההתפלגות בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה חשובה, שכן תפקוד החלבונים לעיתים קרובות נשלט לא רק על ידי רמות הביטוי אלא גם על ידי הארגון המרחבי שלהם על הממברנה 1,2. ראוי לציין כי נוגדנים טיפוליים רבים מכוונים לחלבוני ממברנה 3,4, מה שהופך מחקרים בקנה מידה ננומטרי לחיוניים להבנת האופן שבו אינטראקציות נוגדנים מושפעות מארגון חלבוני הממברנה המקומי. עם זאת, מיפוי מדויק של התפלגות חלבוני ממברנה, פרופיל מולקולה בודדת של שפעם, וניטור בזמן אמת של האינטראקציות הדינמיות שלהם עם שותפי הקישור נותרו מאתגרים.

טכניקות נפוצות במיקרוסקופ לוקליזציה חד-מולקולית (SMLM), כגון מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)5,6 והצטברות נקודות מבוססות DNA להדמיה בטופוגרפיה בקנה מידה ננומטרי (DNA-PAINT)7, משתמשות בצבוע אימונופלואורסצנטי (IF) לתיוג דגימה. הם השיגו רזולוציות צדדיות של ~ 10 ננומטר וסיפקו תובנות נרחבות לגבי ארגון בקנה מידה ננומטרי ממברנה טיפולית, כולל קולטני פקטור גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2)8,9, CD2010, קולטני תאי T 11,12,13, ליגנד מוות מתוכנת 114, קולטני תאי B 15,16,17, ו-CD1917.18. לדוגמה,מחקרי STORM המשתמשים בנוגדן מונוקלונלי טרסטוזומאב לזיהוי ישיר של HER2, קולטן מרכזי המעורב בסרטן השד, חשפו מצבי קיבוץ מובחנים בקרב מטופלות חיוביים ל-HER28, בעוד נוגדנים טיפוליים שונים הוכחו כמווסתים את אשכולות HER29. DNA-PAINT בשילוב עם מיקרוסקופיית יריעת אור סריג הבהיר את המצבים האוליגומריים ופרופילי האינטראקציה של CD20 בתאי B עם נוגדנים מונוקלונליים טיפוליים ריטוקסימאב, אופאטומאב ואובינוטוזומאב10. למרות ש-SMLM קונבנציונלי מספק תובנות חשובות על ארגון בקנה מידה ננומטר, הפוטנציאל המלא שלו מוגבל על ידי גישות צביעת IF מסורתיות. איכות תמונת SMLM תלויה בצביעת IF, אשר בתורו נשלטת על ידי הספציפיות והזיקה של נוגדן הסימון. SMLM מסורתי משתמש בנוגדנים בעלי זיקה גבוהה שבדרך כלל משיגים צביעת IF ואיכות תמונה משופרות. עם זאת, רוב הנוגדנים הטיפוליים מתקשרים עם קולטני ממברנה של תאים חיים בעלי זיקה בינונית כדי למזער תופעות לוואי לא מטרה19. לדוגמה, מעורבים תאי T דו-ספציפיים (TCEs) מציגים זיקה נמוכה יותר ל-CD3, מה שמונע הפנמת TCR 20,21,22. אינטראקציות כאלה אינן ניתנות ללכידה מדויקת באמצעות טכניקות IF קונבנציונליות.

בעבר פיתחנו אסטרטגיה שמנצלת ישירות אינטראקציות בין נוגדנים לאפיטופים בין מולקולה אחת, הנקראת תיוג נוגדן יחיד (SAL). SAL מאפשר מיפוי צפיפות גבוהה של אינטראקציות בין נוגדנים לאפיטופים תוך שמירה על שיווי משקל קשירה טבעיים23. בעוד שדיווחנו בעבר על פרוטוקול לחלבונים תוך-תאי של שלד ומיטוכונדריה24, SAL על חלבוני ממברנה לא הוכח. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תהליך עבודה שלב אחר שלב ליישום SAL על חלבוני ממברנה, כפי שהודגם באמצעות סימון הטטראספנין CD81, מועמד מדווח כמטרה טיפולית 25,26,27,28, הן בתאים מתלים והן בתאים דביקים. באמצעות נוגדנים אנטי-CD81 מסומנים פלואורסצנטית, כדי לבדוק ישירות את ההתפלגות המרחבית של CD81 על תאי U2OS ו-Jurkat T, אנו מדגימים את יישום מחקרי ננו בקנה מידה SAL של חלבוני ממברנה. קראנו לאסטרטגיה זו SAL ממברנה (mSAL). לבסוף, אנו מתארים אסטרטגיה מבוססת אשכולות להפחתת גילויי מולקולה בודדת מבודדים מחוץ לתא.

בעיקרון, SAL משתמש בתיוג מולקולה בודדת בזמן-לאפס כדי ללכוד אינטראקציות בין נוגדנים לאפיטופים בודדים, ודקונבולוציה של משדר יחיד יוצרת תמונה ברזולוציה גבוהה המבוססת על SMLM. על ידי התאמת ריכוז הנוגדנים ובחירת מרווח אי-הארה (NII) מתאים בין פריימים עוקבים, SAL מתאים את קצב הופעת הנוגדן לקצב זיהוי של מולקולה אחת, ומאפשר מיקום של מולקולה בודדת. SAL דורש NIIs ארוכים יותר בשל קינטיקת הקישור האיטית של נוגדנים, שמאריכה את משך רכישת התמונה (~3-17 שעות). SAL מתאים במיוחד ליישומים הדורשים מיפוי מדויק בקנה מידה ננומטרי של אפיטופים והערכת דינמיקת אינטראקציה בין נוגדנים לאפיטופים בודדים. למרות קצב התפוקה הנמוך שלו, SAL מציע תובנות ייחודיות לארגון אפיטופים ולמעורבות נוגדנים בתנאים כמעט פיזיולוגיים, מה שהופך אותו לחשוב במיוחד לאפיון נוגדנים טיפוליים במקום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה משתמש בקווי התאים המקובלים Jurkat E6.1 ו-U2OS ואינו כולל חומרים ראשוניים של בני אדם או בעלי חיים חיים.

1. זריעה/נחיתה של תאים וקיבוע

הערה: הכנת הדגימה מתבצעת לפי פרוטוקולי צביעה סטנדרטיים באימונופלואורסצנציה (IF), המותאמים לשימור הארגון התת-תאי של חלבוני ממברנת הפלזמה בין סוגי תאים שונים. אם קיים פרוטוקול אימונוסיינינג מבוסס עבור המטרה הרצויה, המשתמשים יכולים לעקוב אחר הפרוטוקול הזה עד לשלב חסימת הדגימה 1.2.14. סימון נוגדן יחיד (SAL) מתבסס על זיהוי מצטבר של נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית כאשר הם נקשרים לאנטיגן שלהם ברמת המולקולה היחידה. נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית המדוללים בבופר הדמיה מתווספים לדגימות בשלב המיקרוסקופ, וסימון פלואורסצנטי מתבצע באופן דינמי ככל שתהליך התמונה מתקדם. לא מתבצעת תיוג פלואורסצנטי במהלך שלב הכנת הדגימה.

  1. הכינו תאים דבקים, כמו קו התאים U2OS, כפי שמתואר בפרוטוקול24 שפורסם בעבר.
  2. מתלים תאים
    1. לשמור על תאי T של ג'ורקט בצפיפות של 1 x 10,5 עד 10x 10, 6 תאים/מ"ל ב-10 מ"ל של מדיום RPMI מלא (RPMI 1640 בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח בתוספת 5%CO2.
      הערה: 10 מ"ל מדיה מלאה המומלצים חלים על בקבוקי T25; המשתמשים צריכים להגדיל את הנפח בהתאם כאשר משתמשים בכלי תרביות שונים.
    2. הכינו את משטח הזכוכית על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תמיסת פולי-אל-ליזין (PLL) של 0.01% לבארות המיועדות לשימוש בזכוכית כיסוי עם 8 תאים. דגירה בלילה בטמפרטורה של 4°C או למשך שעתיים ב-37°C.
    3. סופרים את התאים מהתרבית באמצעות המוסיטומטר, ואז העבירו 3.5 על 10תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: ייתכן שיש צורך בכוונון את מספר התאים כדי להשיג פיזור טוב של תאים בודדים. טווח זריעה של 30,000-60,000 תאי ג'ורקט T משיג צפיפות אידיאלית שבה תאים בודדים מופרדים בבירור זה מזה מבלי להיות מפוזרים מדי. ייתכן שיהיה צורך להתאים את ספירת התאים לסוג תא חדש.
    4. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 3 דקות כדי לקבל כדור תא. להשליך את הסופרנטנט ולהחזיר את כדור התא ל-200 מיקרו-ליטר של מלח דולבקקו (DPBS) מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). הכדור התא שיתקבל יהיה נראה כמשקע קטן ולבן בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה.
      הערה: יש להיפטר מפסולת ביו-מסוכנת בהתאם להנחיות המוסד ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.
    5. שאיפת תמיסת ה-PLL מזכוכית כיסוי עם תאים מוכנה (שלב 1.2.2). אם הדגירה של ה-PLL מתבצעת במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, יש לחמם מראש את זכוכית הכיסוי עם 8 הקידוחים ל-37 מעלות צלזיוס לפני ששואף את התמיסה.
    6. תוסיף את מתלה התא מהשלב 1.2.4. אל הבאר המצופה ב-PLL. דגרו באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תוספת של 5%CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפני השטח. ערבבו היטב את תליית התא לפני הציפוי ופיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק גושים ולהבטיח פיזור אחיד ברחבי הבאר.
    7. בדוק את חיבור התאים למשטח הזכוכית באמצעות מיקרוסקופ אור. בהגדלה של פי 10, למקד את המיקרוסקופ בתחתית זכוכית המכסה.
      הערה: טפיחה עדינה על זכוכית הכיסוי הפנימית תוך כדי התבוננות תחת מיקרוסקופ עשויה לסייע בהערכת האם התאים נצמדו לפני השטח או עדיין צפים.
    8. הכינו 200 מיקרוליטר של בופר קיבוע (4% פאראפורמלדהיד ו-0.1% גלוטראלדהיד ב-DPBS) וחממו אותו מראש ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
      הערה: בופר הקיבוע המסופק מותאם ל-CD81 ומתאים בדרך כלל לשימור חלבוני ממברנה. למטרות חלבון ממברנה חדשות, ייתכן שיש צורך בכוונון את הרכב הבופר להשגת שימור מיטבי. מומלץ למשתמשים לעיין בספרות לתנאי קיבוע המותאמים למטרות חדשות.
      אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ומסרטן. גלוטראלדהיד הוא רעיל ומאכיל. יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול בחומר זה. במקרה של מגע עור, שטפו מיד את האזור הפגוע היטב בסבון ומים. השליכו את התגובה בהתאם להנחיות המוסד של המשתמש ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.
    9. שאיפת ה-DPBS מכל באר דגימה (מהשלב 1.2.6) באמצעות מיקרופיפטה.
      הערה: חשוב לבצע את כל שלבי החלפת התמיסה באיטיות כדי למנוע הסרת תאים מזכוכית הכיסוי. יש להיפטר מהפסולת הביולוגית המסוכנת בהתאם להנחיות המוסד של המשתמש ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.
    10. הוסיפו 200 מיקרול של בופר קיבוע מחומם מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפינה של הבאר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      אזהרה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ומסרטן. גלוטראלדהיד הוא רעיל ומאכיל. לבשו ציוד מגן מתאים בעת טיפול בחומרים אלו. במקרה של מגע עור, שטפו מיד את האזור הפגוע היטב בסבון ומים. השליכו את התגובה בהתאם להנחיות המוסד של המשתמש ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.
    11. שטוף את התאים הקבועים 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר DPBS. דלג על שלב זה אם אתה ממשיך עם שלב 1.2.12.
    12. אופציונלי: הסר לאט את תמיסת הקיבוע והוסיף 200 מיקרוליטר של בורוהידריד נתרן טרי של 0.1% ב-DPBS, ואז דגר בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות. דלג על שלב זה והמשך לשלב 1.2.14 אם אינך משתמש בהפחתת בורוהידריד נתרן.
      הערה: ההפחתה עם נתרן בורוהידריד מסייעת בכיבוי אוטופלואורסצנציה שנוצר על ידי גלוטראלדהיד ומנטרלת אלדהידים שלא מגיבים. שחרור גז המימן כתוצאה מנתרן בורוהידריד שמגיב עם התמיסה המימית יתבטא בשחרור בועות. אם לא נצפים שחרור גז המימן, יש להשתמש בתמיסה טרייה של בורוהידריד נתרן (נתרן בורוהידריד).
      אזהרה: נתרן בורוהידריד הוא רעיל ומאכיל. ללבוש ציוד מגן מתאים בעת טיפול בתגובת זו. במקרה של מגע עור, שטפו מיד את האזור הפגוע היטב בסבון ומים. השליכו את התגובה בהתאם להנחיות המוסד של המשתמש ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.
    13. שאבו את תמיסת בורוהידריד הנתרן מכל באר, ואז שטפו שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר DPBS.
    14. הכינו 200 מיקרוליטר מבופר החסימה והוסיפו לבאר. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. אל תשתמשו במגיב פרמיאביליזציה (למשל, TritonX-100, סאפונין), שכן הוא עלול להסיר חלבוני ממברנה. פרוטוקול SAL ממברנה (mSAL) שהוצג כאן עבור CD81 לא כלל שלב חסימה.
      הערה: מומלץ להשתמש בבופר חוסם המכיל 5% (עם v) אלבומין סרום בקרי (BSA) ב-DPBS עבור mSAL עם מטרות חדשות. כאשר משתמשים בנוגדנים משניים, הסרום המתאים משמש לחסימה. לדוגמה, סרום עזים של 10% (v/v) ב-DPBS כאשר משתמשים בנוגדן משני של מארח עז. אם קיימים מתכון לאחסון חסימה ופרוטוקול למטרה, המשתמשים יכולים לעקוב אחרי הפרוטוקול הזה. הבופר החסימה יכול להיות מושלם, באופן אופציונלי, בנוגדנים בקרה איזוטיפיים או נוגדנים שמקורם בסרום כדי להפחית קשרים מחוץ למטרה של נוגדנים23,24. יש לכלול תגובת פרמיאביליזציה בבופר החסימה רק אם הנוגדן מכוון לאפיטופ תוך-תאי של חלבון הממברנה.
    15. עבור mSAL עם נוגדנים ראשוניים מצומדים בצבע, יש להמשיך ישירות לשלב 1.2.20.
    16. הכינו 150 מיקרוליטר מתמיסת צביעת נוגדנים ראשונית (נוגדן בריכוז הרצוי מדולל בבופר החסימה). דלג על שלב זה עבור mSAL עם נוגדנים ראשוניים מצומדים בצבע.
      הערה: לצביעת נוגדנים ראשונית, עיין בגיליון הנתונים של הספק לקבלת מצבים מומלצים. אם אין מידע על ריכוז, התחל עם 4 מיקרוגרם/מ"ל (27 ננומטר) עבור IgGבאורך מלא 23,24.
    17. החלף את הבופר החוסם בתמיסת הנוגדן הראשית. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה בתא לח. דלג על שלב זה עבור mSAL עם נוגדנים ראשוניים מצומדים בצבע.
    18. שטוף את הדגימה פעמיים עם 400 מיקרוליטר DPBS. הוסף 200 מיקרוליטר של בופר חסימה לבאר.
    19. אופציונלי: החלף את בופר החסימה ב-200 מיקרוליטר של בופר לאחר קיבוע (4% פאראפורמלדהיד) ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: פוסט-קיבסציה מסייעת לשמור על חסימת הדגימה עבור SAL23,24. עם זאת, שלב זה צריך להישמט אם הוא מפחית את הנגישות לאפיטופים. כדי להעריך את השפעת הפוסט-קיבוע על זיהוי אפיטופים באמצעות נוגדנים, לבצע צביעת אימונופלואורסצנציה סטנדרטית עם ובלי פוסט-קיבוע ולהשוות את איכות הצביעה.
    20. אופציונלי: שטוף את הדוגמה פעמיים עם DPBS.
    21. הוסף 200 מיקרוליטר DPBS לכל באר וכסה את התא בשכבה שקופה כדי למנוע אידוי. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C עד חודש אחד. אם מבצעים mSAL מיד לאחר שלב 1.2.14, או 1.2.19 ללא קיבוע פוסט, שמרו את הדגימה בבופר החסימה והתקדמו ישירות לשלב 2.2.
      הערה: שמירת הדגימה ב-DPBS עם תוספת של 5 מ"מ מ' נתרן אזיד תמנע צמיחת חיידקים במהלך האחסון.
      אזהרה: נתרן אזיד הוא רעיל מאוד ועלול להיות קטלני אם נצרך. ללבוש ציוד מגן מתאים בעת טיפול בתגובת זו. במקרה של מגע עור, שטפו מיד את האזור הפגוע היטב בסבון ומים. השליכו את התגובה בהתאם להנחיות המוסד של המשתמש ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.

2. רכישת תמונות

הערה: הליך ההדמיה הן לתאים דבקים והן לתאים תלויים דומה ומתבצע באמצעות מיקרוסקופיה של פלואורסצנציה פנימית מלאה (TIRF). עם זאת, תנאי ההדמיה צריכים להיות מותאמים לכל סוג תא.

  1. אפשר לדגימות המאוחסנות (בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) להגיע לטמפרטורת החדר לפני ההדמיה כדי למנוע עיבוי על הזכוכית. דלג על שלב זה אם אתה ממשיך ישירות להדמיה לאחר הכנת הדגימה.
  2. הפעלת מערכת המיקרוסקופ: מיקרוסקופ, מצלמת sCMOS, יחידת לייזר ומחשב עם תוכנת רכישת התמונה. אפשר למערכת המיקרוסקופ להתייצב למשך 5-10 דקות לאחר ההפעלה, כדי לאפשר לרכיבי המערכת להגיע לטמפרטורות פעולה ולמזער סטייה תרמית.
    הערה: ניתן לבצע mSAL באמצעות כל הגדרת מיקרוסקופ TIRF ותוכנה תואמת. הפעל את המערכת לפי הוראות הכלי.
  3. מרחו שמן טבילה על אובייקטיב TIRF (למשל, 100x/1.49) והתקינו את זכוכית הכיסוי המחוברת על שלב המיקרוסקופ.
    הערה: אם המטרה מצוידת בקולר תיקון, ודא שהיא מכוונת לעובי הנכון של זכוכית הכיסוי ב-23 מעלות צלזיוס. הזכוכית הכיסוי ששימשה במחקר זה הייתה בעובי של 0.13-0.17 מ"מ.
  4. אם מצוידים, הפעילו את מערכת המיקוד המושלם (PFS), ואז הרימו בזהירות את המטרה אל זכוכית הכיסוי והביאו את הדגימה לפוקוס.
  5. הכינו קולואידים של זהב כסמנים פידוציאליים (דילול של 1:2 במים טהורים במיוחד). סוניקציה של הקולואידים של הזהב לפני הדילול למשך 3 דקות כדי לפזר את האגרגטים.
  6. שואף בעדינות את בופר האחסון (DPBS או בופר חסימה) מבאר הדגימה והוסיף 200 מיקרוליטר מתמיסת קולואיד זהב לדגימה. דגרו דקה אחת והסירו את התמיסה.
  7. השתמשו בהארה בשדות בהיר כדי לוודא שכמות מספקת של קולואידים זהב הושקעו לפני ששאיפת התמיסה. צפיפות אידיאלית מורכבת מ-5 עד 10 קולואידים של זהב בתוך אזור העניין המיועד (ROI).
    הערה: לחילופין, מיקרוספירות פלואורסצנטיות (ראו טבלת חומרים) יכולות לשמש בדילול של 1:1,000 ב-DPBS.
  8. שטפו פעם אחת עם 500 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד כדי להסיר עודפי קולואידים זהב, ואז מוסיפים 200 מיקרוליטר של DPBS.
  9. בתוכנת ההדמיה, יש ליצור את התצורה האופטית לפלואורופור (של גלאי הנוגדנים), כולל הדיכרואי המתאים, אורך גל ההתעוררות של הלייזר, צפיפות ההספק, זמן אינטגרציית המצלמה, מסנן פליטה וקישור פיקסלים למצלמה (אם רלוונטי). גודל פיקסל של 150-160 ננומטר מומלץ להשגת רזולוציה מיטבית.
  10. צור קונפיגורציה אופטית לשלב הלבנת פוטו. מומלץ להשתמש בעוצמת לייזר של 380 וואט/ס"מ2 ומעלה עם זמן אינטגרציה של 1 שנייה.
    הערה: פוטו-הלבנה במהלך הרכישה מסייעת למזער חפיפה בין אירועי קשירת נוגדנים פלואורסצנטיים בודדים. האור שנאסף יכול להיות מונחה דרך מסנן פליטה עם אורך גל שאינו תואם כדי להימנע מרוויה במצלמה.
  11. כוון את זווית הלייזר כדי לקבוע תאורת TIRF. באמצעות תאורת שדות בהירים, זהה תא ל-mSAL. ודא שלפחות 5 קולואידים של זהב נראים בתוך ה-ROI כדי לתקן את סטיית השלב במהלך שחזור התמונה. אשר אוטופלואורסצנציה מהקולואידים הזהובים בצפיפות הכוח של הלייזר בהדמיה.
  12. הגדר את פרמטרי ההדמיה: מרווח אי-הארה (NII), מספר הפריימים, ותדירות שלב הפוטוליצ'ינג (אם נדרש) בתוכנת רכישת התמונה. עבור mSAL של CD81 על U2OS ותאי Jurkat T עם נוגדן CD81, ההגדרות האופטימליות היו NII של 5 שניות, 2,000 פריימים בסך הכל, ושלב הלבנה פוטוגרפית בכל פריים חמישי.
    הערה: פרמטרים אלו חייבים להיות מותאמים לכל חלבון מעניין, הנוגדן המשמש ל-mSAL ולסוג התא. עיין בשלב 3 לפרטים נוספים על אופטימיזציה. מספר המסגרות האופטימלי עשוי להשתנות בין מטרת הנוגדן לסוג התא. למערכות יעד חדשות, מומלץ ללכוד 2,000-3,000 פריימים כנקודת התחלה. NII מאריכים את משך רכישת התמונה. לדוגמה, רכישת mSAL של 3,000 פריימים עם NII של 20 שניות גורמת ל-~17 שעות של זמן רכישה.
  13. הכינו את בופר ההדמיה על ידי דילול נוגדן CD81 לריכוז של 1 מיקרוגרם/מ"ל ב-200 מיקרוליטר עם 5% BSA (ללא וירט) ב-DPBS. עבור mSAL של CD81, הריכוז הסופי של נוגדנים היה 0.5 ננומטר לתאי T של ג'ורקט ו-2 ננומטר לתאי U2OS.
    הערה: ריכוז הנוגדנים תלוי בשפע הסובסטרט המקומי ובזיקה של הנוגדן. חשוב לאופטימיזציה של ריכוזי הנוגדנים לכל מטרה חלבון, לכל נוגדן המשמש להדמיה, ולכל סוג תא. עיין בשלב 3.1 לפרטים נוספים על אופטימיזציה.
  14. הוסף את בופר ההדמיה המוכן לבאר והתחל ברכישה.

3. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה

הערה: פרמטרי ההדמיה של mSAL מושפעים מביטוי החלבון, הארגון המקומי שלו ובחירת הנוגדן המשמש להדמיה. המטרה של אופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה היא לזהות את ריכוז הנוגדנים וה-NII שמייצרים אירועים חד-מולקולריים מפוזרים במרחב תוך שמירה על צפיפויות גבוהות מספיק כדי למקסם את דגימת האפיטופים.

  1. ריכוז נוגדנים
    1. מדלל את הנוגדן ל-0.5 ננומטר לתאי ג'ורקט ו-2 ננומטר לתאי U2OS ב-200 מיקרוליטר של 5% BSA ב-DPBS והוסף את תמיסת הנוגדן לבאר. לסימון אופטימלי של נוגדן יחיד, יש להשתמש בריכוז נוגדנים בקבוע או קרוב לקבוע הפרידה בשיווי המשקל (Kd); אם Kd אינו ידוע, מומלץ להתחיל מ-1 ננומטר.
    2. השתמש בפונקציית הצפייה החיה בתוכנת ההדמיה המוגדרת ל-mSAL למעקב אחר קשירת נוגדנים.
    3. כוון את זווית ה-TIRF ופרמטרי ההדמיה כדי להשיג יחס אות לרעש (SNR) של ≥ 3.
      הערה: זווית TIRF אופטימלית משפרת את ה-SNR על ידי הגבלת פלואורסצנציה מחוץ למוקד כתוצאה מפיזור נוגדנים בבופר ההדמיה. ניתן להשתמש בצפיפות הספק לייזר של 100-200 וואט/סמ"ר וזמן אינטגרציה של 50 מילישניות במצלמה בהתחלה. אם ה-SNR נמוך, הגדילו בהדרגה את עוצמת הלייזר ו/או את זמן האינטגרציה של המצלמה ועקוב אחרי השינויים ב-SNR עד שיגיעו לערך האופטימלי.
    4. הגדר את פרמטרי ההדמיה בתוכנת רכישת התמונה כדי לקבל לפחות רכישת 10 פריימים עם NII של 5 שניות (ראו שלב 2.12).
      הערה: מומלץ להתחלה NII של 5 שניות. יש לבצע סריקת NII כדי לזהות את ה-NII האופטימלי למערכת נוגדנים-מטרה חדשה (שלב 3.2).
    5. התחילו את הרכישה. העריך את הדלילות של מיקומי מולקולה בודדת של הסרט המוקלט.
      הערה: שלבים מפורטים להשגת צפיפות הלוקליזציה מתוארים בפרסום קודם24. צפיפות מיקום מולקולה בודדת בין 0.02 ל-0.15 אירועים למיקרומטר2 נמצאה כאופטימלית ל-mSAL.
    6. אם נצפו מספר אירועי קישור נוגדנים חופפים מיד לאחר הוספת בופר ההדמיה או מצטברים לוקאליזציות של מולקולה בודדת עם הזמן ככל שההקלטה מתקדמת, יש לבטל את הרכישה. הפחיתו את ריכוז הנוגדנים פי 2 וחזרו על הרכישה על דגימה חדשה. חזור על תהליך זה של הפחתת ריכוז הנוגדנים פי 2 והערכת מספר האירועים ליחידת שטח עד להשגת צפיפות אירועי מיקום מולקולה בודדת הרצויה.
      הערה: אירועים חופפים מתבטאים כמספר פונקטות גדולות שהופכות לבהירות או גדולות יותר עם קישור נוגדן חדש בתוך גבול הדיפרקציה של הנוגדן הראשון.
    7. אם צפיפות האירוע דלילה, הגדילו פי שניים את ריכוז הנוגדנים בבופר ההדמיה וחזרו על האיסוף על דגימה חדשה. חזרו על תהליך זה של העלאת ריכוז הנוגדנים פי 2 והערכת מספר אירועי הקישור ליחידת שטח עד להשגת צפיפות אירועי המיקום הרצויה של מולקולה בודדת.
      הערה: מומלץ להשתמש בדגימה חדשה בכל ניסוי אופטימיזציה של ריכוז כדי למנוע הפרעות אפשריות של נוגדנים קשורים מראש בהערכות צפיפות לוקליזציה עתידיות.
  2. אופטימיזציה של NII
    1. הגדר את פרמטרי ההדמיה בתוכנת רכישת התמונה כדי לקבל רכישת 50 פריימים (ראו שלב 2.12). הגדר את ה-NII ל-0 (ללא עיכוב).
    2. הכינו את בופר ההדמיה לריכוז הנוגדנים האופטימלי משלב 3.1 והוסיפו אותו לבאר הדגימה. התחילו את הרכישה.
    3. חזרו על שלבים 3.2.1-3.2.2, תוך התאמת NII ל-1, 3, 5, 10 או 20 שניות. בצע כל רכישה על דגימה חדשה.
    4. הערך את הצפיפות והדלילות של לוקליזציות מולקולריות בודדות של הסרט המוקלט (ראו שלבים 3.1.5-3.1.7). ה-NII הנמוך ביותר עם צפיפות אירועי מולקולה בודדת אופטימלית נקבע כ-NII האופטימלי.
      הערה: ייתכן שיש צורך לאופטימיזציה נוספת של ריכוז הנוגדנים כדי להשיג צפיפות מיקום אופטימלית של מולקולה בודדת עבור ה-NII המתאים. עיין בשלב 3.1. דיווחים קודמים מראים כי NII ארוכים יותר (10-20 שניות) היו סלקטיביים יותר כלפי אירועי קישור בצפיפות גבוהה יותר, אך הארכת ה-NII מעבר ל-20 שניות לא הביאה לשיפור נוסף 23,24. אם מתרחשים אירועי קישור חופפים במרחב ככל שתהליך קבלת התמונה, יש להכניס שלב הלבנת פוטו-בליצה במרווחים מספיקים להסרת פלואורסצנציה מנוגדנים קשורים. לדוגמה, אם אירועים חופפים מופיעים במסגרת החמישית, יש להפעיל פוטובלינינג בכל פריים חמישי. הופעת אירועים חופפים במרחב מתוארת בהערה של שלב 3.1.6.

4. ניתוח נתונים

הערה: שחזור תמונות mSAL משתמש בתוכנת NIH החינמית, Fiji29, עם תוסף ThunderSTORM30 . גרסת פיג'י v1.54r וגרסת ThunderSTORM 1.3 שימשו בפרוטוקול זה. ניתוח תמונה מפורט תואר בפרוטוקול קודם 24. בחלק זה אנו מתארים את תהליך הניתוח המשמש במיוחד עבור mSAL. הניתוח שהוצג בפרוטוקול זה השתמש במצלמת Prime95B sCMOS (מספר סידורי A18B203004) עם פוטואלקטרונים ל-A/D של 0.98, ורמת בסיס מצלמה של 100. גודל הפיקסל של התמונה מוגדר ל-147 ננומטר.

  1. הגדר את הפרמטרים לשחזור בחלון ניתוח הריצה. הפרמטרים המשמשים לשחזור תמונות mSAL של CD81 מתוארים להלן. פונקציית התצוגה המקדימה צריכה לשמש להערכת אירועי הקישור של מולקולה בודדת שזוהו במסגרת הנבחרת לפני ביצוע הניתוח המלא.
    סינון תמונות:
    מסנן: מסנן גל (B-spline)
    סדר B-Spline: 2
    סולם B-Spline: 4
    מיקום מקורב של מולקולות:
    שיטה: מקסימום מקומי
    סף עוצמת שיא: std(Wave.F1)
    קישוריות: 8 שכונות
    לוקליזציה תת-פיקסלית של מולקולות:
    שיטה: PSF: גאוסיאן משולב
    רדיוס התאמה [px]: 2
    שיטת התאמה: סבירות מקסימלית
    סיגמא התחלתי [px]: 0.75
    ניתוח התאמה רב-משדרת: לא נבחר
    המחשה של התוצאות:
    שיטה: גאוסיאני מנורמל
    הגדלה: 7.3
    תדירות עדכון [פריימיים]: 50
    אי-ודאות רוחבית: 20
    הערה: פרמטרי הסינון המקדים משמשים לשיפור זיהוי משדר יחיד ברקע. הם משמשים כנקודות התחלה אך צריכים להיות מותאמים לכל מערך נתונים. פרמטרי שיטת המיקום והגילוי המשוערים משמשים לאירועי קישור של מולקולה בודדת. שימוש במקסימום עוצמה מקומית עם קישוריות 8-שכונות הוכח כמספק ביצועים אמינים31. שיטת גאוס המשולבת עם התאמת סבירות מקסימלית נבחרה, שכן היא בשימוש נרחב ומספקת קירוב אמין של פונקציית הפיזור הנקודתי (PSF) ביישומי הדמיה של מולקולה בודדת 32,33,34,35. שיטת ההמחשה המשמשת בפרוטוקול זה היא גאוסית מנורמלת. משתמשים יכולים לבחור את שיטת ההמחשה המתאימה ביותר לנתונים שלהם. ההגדלה הוגדרה כך שתניב גודל פיקסל משוחזר של 20 ננומטר, המתאים לדיוק המקומי הצפוי שניתן להשיג באמצעות תיוג מבוסס נוגדנים, כאשר שגיאת הקישור היא בסדר גודל ~10 ננומטר. מקדם ההגדלה 7.3 חושב על ידי חלוקת גודל הפיקסל המוגבל בדיפרקציה בגודל הפיקסל המשוחזר הרצוי (147 ננומטר / 20 ננומטר = 7.3). תדירות העדכון קובעת באיזו תדירות התמונה המשודרת מתרעננת במהלך העיבוד, אך היא אינה משפיעה על התוצאה הסופית. אי-הוודאות הצידית מוגדרת ל-20 (אך לא כפויה) כך שהשחזור ישלב את אי-הוודאויות של הלוקליזציה המחושבת. לפרטים נוספים על אפשרויות זמינות, עיינו במדריך המשתמש ThunderSTORM30 או לחצו על סימן השאלה ליד שדה הקלט.
  2. התחל את ניתוח ThunderSTORM עם סיגמא התחלתי של 1.6 פיקסלים ורדיוס התאמה של 3. לחדד את הפרמטרים לפי הצורך. לא נעשה שימוש בהתאמת רב-משדרת, שכן צפיפויות האירועים נשמרו ללא חפיפה בתמונות המוגבלות בדיפרקציה.
  3. לחץ על אישור כדי להריץ את השחזור. לאחר השלמה, חלון התוצאות ייפתח אוטומטית.
  4. השתמש בפונקציית ההיסטוגרמה Plot כדי למצוא את סיגמת השיא (Peak sigma). המרו ערך זה (nm) לפיקסלים על ידי חלוקה בגודל הפיקסל הגולמי של הנתונים, ואז הריצו מחדש את ניתוח ThunderSTORM באמצעות הערך החדש לסיגמא ההתחלתי ורדיוס ההתאמה שמוגדר למספר שלם הקרוב ל-3x סיגמא התחלתי30.
  5. קבע את תיקון ההסטה באמצעות הסמן הפידוציאלי הנבחר24.
  6. בצע שחזור תמונה על כל שדה הראייה ומיישם את תיקון הסטייה המחושב.
  7. לעיבוד לאחר התמונה, לחצו על לשונית הסינון בחלון התוצאות. הפעילו מסננים כדי להסיר אירועים לא מקומיים היטב. בתוצאות המוצגות עבור CD81, אירועים עם סיגמא מעל 200 ננומטר ואי-ודאות גבוהה מ-20 ננומטר הוסרו. השתמשו בפונקציית היסטוגרם Plot כדי לבחון את התפלגות הסיגמא ולקבוע חיתוך מתאים.
    הערה: מיקומים חד-מולקוליים עם ערכי סיגמא גדולים נובעים בדרך כלל מפלואורופורים עמומים עם ספירת פוטונים נמוכה או מפליטים חופפים. לוקליזציות עם אי-ודאות מעל 20 ננומטר הוסרו גם הן, שכן אי-ודאות העולה על גודל הפיקסל הסופי מצביעה על דיוק לוקליזציה נמוך. להנחיות נוספות על פרמטרי סינון, עיינו במדריך המשתמש ThunderSTORM30.
  8. שמור את טבלת התוצאות עם נתוני לוקליזציה של מולקולה בודדת לניתוחים במורד הזרם על ידי בחירת ייצוא. הקובץ המיוצא יהיה בפורמט קובץ .csv וייקרא mSAL.csv בפרוטוקול זה. שמור את התמונה הגאוסית המנורמלת שמתקבלת.

5. ניתוח אשכולות

הערה: במהלך חקירת אפיטופים, נוגדנים מתקשרים עם מטרותיהם המיועדות (אינטראקציות ספציפיות) וכן עם מולקולות מחוץ למטרה (אינטראקציות לא ספציפיות). מכיוון ש-mSAL מתבסס על זיהוי מצטבר של אירועי קישור בין נוגדנים לאנטיגן בודדים, אינטראקציות לא ספציפיות מסוימות תורמות בהכרח לתמונה המשוקמת. אינטראקציות נוגדנים-אפיטופים מציגות טביעות אצבע קינטיות מובחנות, שיכולות, בעיקרון, להבחין בין קשר ספציפי לבלתי ספציפי, כאשר אירועים ספציפיים ולא ספציפיים מובחנים לפי צפיפויות האינטראקציה המקומית שלהם, ולא לפי שהייה של מולקולה בודדתכפול 36. כאן, מתוארת אשכולות מרחבית מבוססת צפיפות של יישומים עם ניתוח רעש (DBSCAN)37 להסרת אירועים בצפיפות נמוכה, תוך שמירה על אירועים בצפיפות גבוהה שסביר יותר שישקפו קישור נוגדנים ספציפי. בנוסף, אשכולות מבוססי צפיפות יכולים לספק תובנות כמותיות על ארגון מרחבי בקנה מידה ננומטרי של חלבונים, במיוחד כאלה הידועים כמאורגנים באופן טבעי לאשכולים, כמו CD81 למיקרודומיינים מועשרים בטטראספנין 38,39,40,41,42. ניתוח ה-DBSCAN שסופק בוצע באמצעות MATLAB 2025a. למשתמשים ללא גישה ל-MATLAB, מומלץ לבצע ניתוחי DBSCAN דומים עם אלטרנטיבות קוד פתוח כמו Python או R 43,44,45. הקוד המשמש בפרוטוקול זה ניתן לקבל מ: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. הרצת הקוד
    1. הורידו את קובץ MATLAB מהקישור של GitHub למעלה.
    2. התחל את MATLAB ופתח את הקוד. בשורות 37 ו-38, קבעו את מספר הנקודות המינימלי (minPTS) ואת אפסילון עבור פרמטרי האשכול. הפרמטרים הבאים נוצלו:
      תאי T של ג'ורקט:
      minPTS: 7
      אפסילון: 60
      תאי U2OS:
      minPTS: 7
      אפסילון: 80
      הערה: ראו שלב 5.2 לפרטים נוספים על אופטימיזציה של פרמטרים אלו.
    3. הגדר את נתיב הקבצים בתוכנת MATLAB לתיקייה שמכילה את קובץ mSAL.csv המשוחזר.
    4. הרץ את הקוד על ידי לחיצה על Run. הקוד יזמין את המשתמש לבחור קובץ. בחר את קובץ mSAL.csv ולחץ על פתיחה.
    5. הנתונים המקבצים נשמרים אוטומטית בתיקייה בשם MATLAB Data בנתיב הקבצים המוגדר בתוך הקוד. פתח את הקובץ הזה ב-ThunderSTORM על ידי לחיצה על Plugins > ThunderSTORM > תוצאות ייבוא/ייצוא > ייבוא.
    6. שמור את תמונת המיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה בודדת שמתקבלת.
  2. אופטימיזציה של קלטי האשכולות
    הערה: שני פרמטרי הקלט לאלגוריתם DBSCAN הם minPTS ו-epsilon. אפסילון מגדיר את הרדיוס סביב נקודה כדי לקבוע את שכנותה, בעוד ש-minPTS מגדיר את המספר המינימלי של נקודות בתוך אותה שכונה הנדרש ליצירת אזור צפוף. נקודות שמקיימות דרישת צפיפות זו מסווגות כנקודות ליבה, והשכונות שלהן מתווספות רקורסיבית לאשכול. נקודות שאינן עומדות בדרישת הצפיפות אך נמצאות בסביבת נקודת ליבה מסומנות כנקודות גבול, בעוד שכל הנקודות הנותרות נחשבות לנקודות רעש.
    1. הרץ את הניתוח באמצעות הקלטים שתוארו לעיל (שלב 5.1.2) כנקודת התחלה. בחר ערך minPTS שהוא גבוה ממספר לוקאליזציות הרעש אך נמוך ממספר הלוקליזציות בתא. לאחר בחירת minPTS, כוון את אפסילון כך שניתן יהיה ללכוד את מספר הלוקליזציות הזה בתוך רדיוס השכונה עבור אזורים מייצגים בתא.
      הערה: minPTS ו-epsilon ניתנים להתאמה באופן עצמאי זה מזה. גישה מעשית לבחירת פרמטרים אלו היא תחילה לבחון את תרשים הפיזור של נקודות רעש מחוץ לתא ולהשוות אותן למספר המיקומים שנצפו באזורים בגודל דומה בתא.
    2. העריכו את החלון המסומן באיור 2 המציג את הנתונים המקובלים. אם הנתונים שומרים על אשכולות על התא המכיל את הפנוטיפ הצפוי עם מינימום מיקומים מחוץ לתא, קלטי האשכול מספקים.
      הערה: הנתונים המקבצים צריכים לשמור על מבנה הנתונים שנאספו באמצעות mSAL. אם האשכולות נראים קטנים, ממוקמים רק לאזורים בעלי צפיפות גבוהה מאוד של הנתונים המקוריים, ומוציאים מספר משמעותי של אירועי קישור הקשורים לפנוטיפ הצפוי, פרמטרי הקיבוץ עלולים להיות מגבילים מדי. אם הקשר הלא-ספציפי מחוץ לתא לא מצטמצם מספיק באשכולות גדולים, פרמטרי האשכולות עלולים להיות כוללניים מדי.
    3. אם פרמטרי האשכול מגבילים מדי, הפחיתו את minPTS והגדלו את ה-epsilon כדי לכלול יותר נקודות בנתונים המקובלים. אם פרמטרי האשכול כוללים מדי, הגדילו את minPTS והורדו את אפסילון.
    4. אחרי שכווננת את minPTS ו-epsilon, הרץ שוב את הקוד. חזור על השלבים 5.2.2-5.2.3 עד להשגת קיבוץ מיטבי.

6. אימות קשירת נוגדנים למטרה

הערה: עבור חלבוני ממברנה שאין להם מורפולוגיה מוגדרת היטב, אימות דיוק המבנים הפותרים יכול להיות מאתגר. כדי לאמת את הספציפיות של הנוגדנים, המשתמשים עשויים לבטא מיזוג חלבון פלואורסצנטי (FP) של חלבון המטרה. כבדיקה ראשונית, ניתן לבצע צביעת אימונופלואורסצנציה קונבנציונלית על תאים המבטאים את מיזוג ה-FP. לאימות מדויק יותר בעת הערכת נוגדנים חדשים, ניתן לבצע mSAL על התאים המבטאים את FP כדי לאשר שאירועי קישור מקומיים תואמים למטרה המסומנת פלואורסצנטית. כאן, מתואר כדוגמה פרוטוקול להעברת תאי U2OS עם CD81-mStayGold, המאפשר אישור שמיקומי mSAL של CD81 תואמים ל-CD81 המסומן ב-FP על פני התא. משתמשים יכולים להחליף כל חלבון פלואורסצנטי מתאים, בתנאי שהפליטה שלו אינה חופפת לערוץ הפלואורסצנציה של הנוגדן המאומת.

  1. תאי U2OS זרעים בתא 8 בארות מחליקים וגדלים ל-~70% קונגפלונס. לשמור תאים ב-200 מיקרוליטר של מדיום גדילה מלא (DMEM בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
  2. שלבו 100 ng של מבנה ה-DNA המקודד את החלבון עם מדווח פלואורסצנטי עם 5 מיקרוליטר של ליפופקטמין 2000. מערבולת ל-30 שניות ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: מחקר זה השתמש ב-CD81 מאוחד ל-mStayGold. טכניקות שיבוט מולקולרי סטנדרטיות שימשו ליצירת פלסמידים של DNA, אף על פי שהן אינן מתוארות בפרוטוקול זה. יחס ה-DNA: ליפופקטמין המסופק מותאם לתאים שהוזרעו במחסני תא עם 8 בארות וייתכן שיידרש התאמה בהתאם להוראות היצרן לפורמטים אחרים של דגם.
  3. הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת DNA/ליפופקטמין לתאים. דגר את מחסנית התא למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם תוספת של 5%CO2 בסביבה לחה.
  4. החליפו את המדיה במדיה שהתחממה מראש עם צמיחה מלאה. דגרו במשך > 8 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תוספת של 5%CO2 בסביבה לחה כדי לאפשר רמות ביטוי חלבון שניתן לזהות.
  5. הערך את רמות ביטוי הפלואורסצנציה בתאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה או מדלם. מומלץ לבצע יעילות טרנספקציה של ≥-30%. אם רמות הביטוי הפלואורסצנטי אינן אופטימליות, יש לייעל את יחס ה-DNA:ליפופקטמין בהתאם להנחיות היצרן.
    הערה: תאים מבטאים זמנית צריכים לשמש לאימות נוגדנים בתוך 24-48 שעות לאחר ההעברה.
  6. כדי לתקן את התאים, אנא עקבו אחרי שלבים 1.2.8-1.2.13.
  7. אחסן את הדגימות הקבועות ב-200 מיקרוליטר DPBS עם 5 mM נתרן אזיד עד שמוכנות להדמיה. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4°C עד חודש אחד.
    אזהרה: נתרן אזיד הוא רעיל מאוד ועלול להיות קטלני אם נצרך. ללבוש ציוד מגן מתאים בעת טיפול בתגובת זו. במקרה של מגע עור, שטפו מיד את האזור הפגוע היטב בסבון ומים. השליכו את התגובה בהתאם להנחיות המוסד של המשתמש ולכל התקנות המקומיות, המדינתיות והפדרליות החלות.
  8. עקבו אחרי שלבים 2.1-2.12 כדי להגדיר את המיקרוסקופ ולהרכיב את הדגימה. זיהוי תא שמבטא את החלבון המעניין באמצעות אות הפלואורסצנציה.
  9. לשם השוואה, צלם תמונת TIRF של התא. אם משתמשים בחלבון פלואורסצנטי באותו ערוץ הדמיה כמו נוגדן mSAL, יש לבצע פוטו-הלבנה של החלבון הפלואורסצנטי. כדי לבצע פוטובלינק של החלבון, יש להשתמש בעוצמת הלייזר המקסימלית למשך >-10 דקות עד שלא נצפה אות.
  10. הוסיפו את בופר ההדמיה המוכן לבאר והתחילו להדמיה. הניתוח צריך להתבצע כפי שתואר קודם (שלב 4).
  11. פתח גם את התמונה המשוחזרת וגם את תמונת ה-TIRF של החלבון הפלואורסצנטי שנרכש לפני רכישת ה-mSAL. הערכו מיקומי קישור נוגדני mSAL על ידי השוואת המראה והמיקום של החלבון המובע, המוצג בתמונת TIRF המוגבלת לעקיפה, לתמונה של mSAL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טכניקת mSAL המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת ויזואליזציה של אירועי קישור נוגדנים בודדים ליעדי חלבוני ממברנת הפלזמה המתאימים, ויוצרת מפה סופר-רזולוציה של התפלגות חלבוני ממברנה. CD81 משמש כאן כדוגמה מייצגת, אם כי הגישה ניתנת להתאמה קלה לחלבוני ממברנה אחרים.

קיבוע תאי ג'ורקט T עם מרווח מספק בין התאים מבטיח נגישות לאפיטופ הממברנה על ידי נוגדנים ומשטח זכוכית כדי להתייצב פידוציאלים (איור 1A). בנוסף, טכניקות פיפטינג יכולות להשפיע ישירות על שי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ארגון חלבוני ממברנת הפלזמה ממלא תפקיד חיוני בוויסות תפקוד התא. טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונבנציונליות מוגבלות על ידי מגבלת הדיפרקציה של האור, מה שמסתיר את הארגון בקנה מידה ננומטרי שלהן. SMLM מתגברת על מגבלה זו על ידי השגת רזולוציות מרחביות של 10-20 ננומטר47, המאפשרת אפיון של הרכבות הננומטריות שלהם 10,48,49. ארטיפקטים של אשכולות ב-SMLM נובעים מזיהוי חוזר של אותו פלוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

המחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R35GM146786 ומהפקולטה למדעי הרוח והמדעים, אוניברסיטת אילינוי שיקגו. התוכן נמצא באחריות המחברים בלבד ואינו בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן אנטי-CD81 אלקסה פלואר 488תרמו פישר סיינטיפיקMA5-44132נוגדן הדמיה
צנטריפוגה על ספסלאפנדורף5424
אלבומין סרום בקרמיליפורסיגמאA7906-100G
זכוכית כיסוי עם תאים, 8 בארותסלביסC8-1-N
מדיה DMEMתרמו פישר סיינטיפיק11960069
המלח המוגבר של פוספט של דולבקותרמו פישר סיינטיפיק14190-144
סרום בקר עוברימיליפורסיגמאF0926-500ML
גלוטראלדהיד, 10%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים16120
קולואידים זהב, 100 ננומטרטד פלה15711 ומינוס; 20סמן פידוציאלי
שמן טבילה  מעבדות קרג'יל16245
מיקרוסקופ הפוך  מצויד במודול TIRFניקון אינסטרומנטסאקליפס Ti2-Eמיקרוסקופ
קו התאים Jurkat E6.1מיליפורסיגמא88042803-1VLתאי תלייה
שיגור לייזר, קו 6אוקססיוסL6CC-CS8-1511לייזר עירור
ליפופקטמין 2000תרמו פישר סיינטיפיק11668019תגובת טרנספקציה
צינור מיקרוצנטריפוגה, 1.5 מ"ל VWR89000-028
תוכנת הדמיית מיקרוסקופיהניקון אינסטרומנטסמחקר מתקדם של NIS-Elementsתוכנת זיהוי תמונה
מטרה, 100x/1.49 CFI APO TIRF ניקון אינסטרומנטסMRD01991מטרת מיקרוסקופ
פאראפורמלדהיד, 16%מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים15710
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140-122אנטיביוטיקה
תמיסת פולי-אל-ליזין, 0.01% מיליפורסיגמאP4707-50ML
מצלמת פריים 95B sCMOSפתרונות טלדיין ויז'ן01-פריים-95B-R-M-16-Cמצלמה
מדיה RPMI 1640תרמו פישר סיינטיפיק11875-093מדיה לתאי תלייה
אזיד נתרןתרמו פישר סיינטיפיק19038-1000
בורוהידריד נתרןמיליפורסיגמא213462-25G
בקבוקי תרבות T25תרמו פישר סיינטיפיק169900
מיקרוספירות TetraSpeckסמן פידוציאלי
צלחת תרבית רקמות, 100 מ"מ קורנינג353003
קו התאים של U2OSATCCHTB-96תאים דביקים

מקורות

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קרום התאמיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה (Super Resolution Microscopy)חלבון CD81אשכולהם מבוסס צפיפותקישור נוגדניםתיקון סחףנוגדנים טיפוליים
מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.