מאמר מחקר

זיהוי חישובי של פורין נוקלאוזיד פוספורילאז וקולטן אסטרוגן 1 כסמנים ביולוגיים של פגיעת כבד הנגרמת על ידי אצטמינופן

DOI:

10.3791/69887

⸱

6 בפברואר 2026

 , 
1School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Integrative Chinese and Western Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מנתחים חישובית את טוקסיקולוגיה ברשת ונתונים טרנסקריפטומיים כדי לזהות סמנים ביולוגיים של פגיעת כבד הנגרמת על ידי אצטמינופן, וחושפים את קולטני אסטרוגן 1 ופיורין נוקלאוזיד פוספורילאז כמטרות אבחנתיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעת כבד הנגרמת על ידי אצטמינופן היא דאגה משמעותית לבריאות הציבור, אך חסרים סמנים ביולוגיים מוקדמים אמינים. מחקר זה נועד לזהות סמנים ביולוגיים מועמדים לרעילות כבד הנגרמת על ידי אצטמינופן באמצעות גישה חישובית המשלבת טוקסיקולוגיה ברשת, טרנסקריפטומיקה ולמידת מכונה. חזו מטרות פוטנציאליות לאצטמינופן באמצעות פלטפורמות מקוונות, והניבו 140 מועמדים. גנים הקשורים לרעילות כבד (n = 657) נאספו מ-GeneCards, וזוהו 38 גנים חופפים. גנים שהובאו באופן שונה מתוך מערך הנתונים GSE74000 (n = 1,978) נותחו. בוצע העשרה פונקציונלית לזיהוי מסלולים רלוונטיים. מודל יער אקראי נתן עדיפות ל-20 גנים של תכונות, ועגינה מולקולרית העריכה זיקות קישור לאצטמינופן. DEGs היו קשורים בעיקר לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ולביוגנזה של ריבוזום. העשרה פונקציונלית הדגישה את המטבוליזם הזנוביוטי ומסלולי לחץ חמצוני. קולטן אסטרוגן 1 ופורין נוקלאוזיד פוספורילאז היו גנים מובילים בתכונות התכונה, שהראו הבדלים משמעותיים בביטוי ואינטראקציות עגינה חזקות עם אצטמינופן. פרוטוקול חישובי זה חוזה באופן שיטתי סמנים ביולוגיים מועמדים לפגיעת כבד הנגרמת על ידי אצטמינופן, ומספק תובנות מולקולריות ומועמדים לאימות ניסוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אצטמינופן (APAP) הוא נודד חום ומשכיך כאבים שניתן באופן נרחב, אך צריכה מופרזת עלולה להוביל לרעילות כבד חמורה ואולי לכשל כבד 1,2. הנזק לכבד צפוי להתרחש לאחר המטבוליזם של התרופה, והמטבוליט הרעיל הבא הוא N-אצטיל-p-בנזוקינון אימין (NAPQI), שגורם ללחץ חמצוני מיטוכונדריאלי, שינוי בנשימה המיטוכונדריאלית ולמעבר חדירות מיטוכונדריאלית, שגורם בסופו של דבר למוות נמק ולא אפופטוטישל הפטוציטים 3,4. מנת יתר של APAP נותרה הגורם המוביל לאי ספיקת כבד חריפה (ALF) במדינות רבות. נתונים אפידמיולוגיים מראים כי רעילות APAP אחראית לכמעט 50% ממקרי ALF בארצות הברית ואחראית לאלפי אשפוזים דחופים מדי שנה. מגמות דומות דווחו ברחבי העולם, כאשר רעסיות כבד הקשורה ל-APAP מהווה חלק עיקרי במקרי פגיעות כבד (DILI) שנגרמו על ידי תרופות(DILI) 5,6. תחלואה גבוהה, הסיכון להשתלת כבד והעומס הרפואי המשמעותי מדגישים את הצורך הדחוף בסמנים ביולוגיים משופרים ובהבנה מכנית של נזק כבד שנגרם על ידי APAP. באופן ספציפי, APAP נספג ועובר בעיקר מטבוליזם בכבד דרך גלוקורונידציה וסולפציה, ויוצר קונוגטים מסיסים במים המופרשים בשתן. חלק קטן (10-15%) עובר הידרוקסילציה בתיווך ציטוכרום P450 (CYP450) (באמצעות אנזימים כמו CYP1A2, CYP2E1 ו-CYP3A4) ליצירת ה-NAPQI הביניים הריאקטיביים, שנקשר לגלוטתיון ומופרש דרך מרה 7,8. עקב הקיבולת המוגבלת של מסלולי גלוקורונידציה וסולפטציה, מינון מופרז מוביל לעלייה ביצירת NAPQI, ובמקביל מפחית את מאגרי הגלוטתיון הכבדיים9. כאשר הגלוטתיון מתרוקן לרמות קריטיות, NAPQI מתחיל להיקשר באופן קוולנטי למקרומולקולות תאיות, ופוגע בהפטוציטים10. רעילות הקשורה למנת יתר של APAP עולה, עם הערכה של 50,000-80,000 ביקורים במחלקות מיון מדי שנה בארצות הבריתבלבד, 11. מכיוון שלחץ חמצוני ותפקוד לקוי של מיטוכונדריה הם מרכזיים לרעילות כבד הנגרמת על ידי APAP, חוסר ויסות של ESR1 עשוי להשפיע בעקיפין על הישרדות הפצטי הכבד ותגובות דלקתיות במהלך פגיעת APAP. רעילות APAP גורמת ללחץ מטבולי והפעלה דלקתית בהפטוציטים. שינויים בביטוי PNP עשויים לשקף שינוי במטבוליזם של הנוקלאוטידים ותגובות הקשורות למערכת החיסון במהלך נזק כבד שנגרם על ידי APAP.

דיווחים מוקדמים על רעלת כבד הנגרמת על ידי APAP התמקדו בעיקר בתסמינים קליניים ובשינויים פתולוגיים בכבד ובכליות, וסיפקו בסיס למחקרים מאוחרים יותר על מנגנוני מוות תאים ודלקת ברעילות APAP12,13. פריצת דרך מרכזית הייתה זיהוי אמינוטרנספראזים בסרום (כגון ALT ו-AST) כסמנים ביולוגיים לפגיעות כבד. עם הופעת מודלים של תרביות תאים וכלים ביואינפורמטיים, המחקר הנוכחי על טוקסיות כבד ב-APAP התרחב לכלול סמנים ביולוגיים אבחוניים, פרוגנוסטיים ומכניים 14,15,16. עם זאת, השגת דגימות סרום או פלזמה מספקות מחוללי מנת יתר של APAP, במיוחד לא שורדים, נותרת אתגר17. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף לבחון סמנים ביולוגיים אבחנתיים, פרוגנוסטיים ומכניים חדשים באמצעות גישות חדשניות לחקר טוב יותר של רעילות כבד הנגרמת על ידי APAP.

טוקסיקולוגיה ברשתות היא תחום מתפתח שבונה מודלים של רשת לניתוח נתונים טוקסיקולוגיים ממאגרי מידע מורכבים18,19. הוא מסייע לאפיין את רעילות החומרים, לחשוף מנגנונים ולחזות יעדים מרכזיים20,21. כיום, טוקסיקולוגיה ברשתות מוכרת באופן נרחב ככלי חשוב במחקר מדעי. לדוגמה, טנגג'יאו קו ועמיתיו שילבו טוקסיקולוגיה רשת עם טרנסקריפטומיקה כדי לזהות מנגנונים נוירוטוקסיים חדשים של 2,2',4,4'-טטרברומודיפניל אתר (חומר מעכב בעירה נפוץ) והסמנים הביולוגיים הפוטנציאליים שלו. מחקרים עדכניים מדגישים גם את חשיבות הגישה הזו בהערכת רעילות המוצרים הטבעיים23. עם זאת, פרדיגמת המחקר החדשנית הזו טרם יושמה כדי לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של רעילות כבד הנגרמת על ידי APAP ולזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים הקשורים לרעילות שלה.

IntelliGenes פותח כצינור למידת מכונה לגילוי ביומרקרים רב-גנומיים24. היא משלבת שיטות סטטיסטיות עם למידת מכונה, כדי לחשב ציוני I-Gene וליצירת פרופילי סמנים ביולוגיים מותאמים אישית. התוצאות מראות דיוק משופר בחיזוי תכונות מורכבות ובאפשרות תובנות מותאמות אישית למחלה. המגבלות כוללות תלות באיכות הנתונים, אימות מוגבל באוכלוסיות מגוונות, וצורך בבדיקות קליניות רחבות יותר.

הדגש הוא שסמני הביוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) הנוכחיים אינם מספקים, ולהציע אורגנואידים שמקורם במטופל (PDOs) כפלטפורמות פונקציונליות להתפתחות סמנים ביולוגיים25. הוא מעריך פנוטיפינג תרופתיים מבוסס PDO, מידול כימו-עמידות, מערכות קו-קולטורה, ופרופיל פרוטאומי/מטבולומי. ממצאים מראים ש-PDOs לוכדים טוב יותר את הביולוגיה הרלוונטית לטיפול, אך מגבלות כוללות שונות טכנית, שכפול מיקרו-סביבתי מוגבל, זמני תרבית ארוכים ואתגרים באינטגרציה קלינית שגרתית26,27.

מטרת המחקר הייתה להעריך שיטות פרוטאומיות אנליטיות ואת תפקיד הביואינפורמטיקה בזיהוי סמנים ביולוגיים28. הוא העריך כיצד כלים חישוביים מסייעים בפרשנות נתונים ובחן טכניקות ניתוח חלבונים מבוססות טרשת נפוצה. התוצאות הדגימו שיפור בגילוי סמנים ביולוגיים ומטרות טיפול חדשות, אך גם הבהירו כי זיהוי חלבונים בעלי שפע נמוך מאוד נותר מאתגר, ובכך הפחיתו את הרגישות של טכניקות פרוטאומיות קיימות. למרות שמספר סמנים ביולוגיים אבחנתיים, מכניים ותחזיתיים לטקסיות כבד הנגרמת על ידי APAP הוכחו היטב, סמנים אלו משקפים בעיקר פגיעה תאית כבדית או תפקוד לקוי של מיטוכונדריה לאחר שהתרחשה רעילות29,30. לעומת זאת, המחקר הנוכחי נועד לזהות רגולטורים טרנסקריפטומיים שעשויים לווסת את הרגישות או את תגובת המארח לחשיפה ל-APAP. לכן, ESR1 ו-PNP נחקרו כסמנים רגולטוריים חקרניים ולא כסמנים אבחנתיים קלאסיים.

כדי להתמודד עם המגבלות הטמונות במתודולוגיות הנוכחיות – במיוחד השונות התרבותית של PDOs וסוגיות הרגישות של פרוטאומיקה – מחקר זה עושה שימוש במסגרת חישובית משולבת הכוללת טוקסיקולוגיה ברשת, טרנסקריפטומיקה, למידת מכונה ועגינה מולקולרית. אסטרטגיה רב-שכבתית זו עוקפת את הצורך בקוהורטות גדולות או מערכות ניסוי מורכבות על ידי ניצול חיזוי חישובי ואימות צולב רב-אומי. ההיגיון בגישה הקומבינטורית הזו הוא שכל טכניקה מחזקת את האחרות למזער חיוביים שגויים: טוקסיקולוגיה ברשתות מספקת תחילה חיזוי ברמת המערכת של מטרות ומסלולים רעילים הקשורים ל-APAP; ניתוח טרנסקריפטומי מאשר לאחר מכן אילו מהגנים החזויים הללו באמת אינם מוסדרים במהלך הרעלת כבד; אלגוריתמים של למידת מכונה מעדיפים את הסמנים הביולוגיים המועמדים המידעיים ביותר מתוך מאגר הביטחון הגבוה הזה; ולבסוף, עגינה מולקולרית מספקת תמיכה מכנית בכך שהיא מאשרת את היתכנות האינטראקציות הישירות בין APAP לבין מטרות החלבון שזוהו.

יחד, צעדים אלו יוצרים צינור קוהרנטי ומבוסס ראיות לחיזוי סמנים ביולוגיים. שילוב זה של ארבע האסטרטגיות הללו ממזער תחזיות חיוביות שגויות ומגביר את הביטחון במציאת ESR1 ו-PNP כמטרות חזקות בהרעילות כבד הנגרמת על ידי APAP. במחקר זה, יהיה צורך שיהיו GSE74000 מאגרי נתוני ביטוי גנים בעלי עוצמה סטטיסטית טובה, לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים של כל מצב עם מטא-דאטה מלאים. קבצי הביטוי הגולמיים יצטרכו לעבור עיבוד סטנדרטי, הכולל תיקון רקע, נרמול (נרמול קוונטילי וכו'), וסינון גנים בעלי ביטוי נמוך. R שימש לביצוע כל הניתוחים באמצעות חבילות כמו limma וכלים חיצוניים כמו GeneCards ו-Cytoscape, שמאפשרים בניית רשת. למרות שהצינור מסייע בתעדוף סמנים ביולוגיים בהתבסס על ניתוח שיטתי, התוצאות מוגבלות על ידי איכות מאגר הנתונים, השפעות אצווה והיעדר אימות ניסויי ואימות בחיים , מה שעשוי להשפיע על הכללותיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שיטה חישובית להגדרת סמנים ביולוגיים אפשריים לנזק כבד שנגרם מאצטמינופן, תוך ניצול טוקסיקולוגיה ברשת, טרנסקריפטומיקה, למידת מכונה ועגינה מולקולרית (איור 1). הפרוטוקול מיועד לחוקרים שיש להם גישה לכלי ביואינפורמטיקה, מערכי נתונים טרנסקריפטומיים ותוכנות עגינה מולקולרית.

הליך

שלב 1: זיהוי מטרות אצטמינופן
שלפו את ייצוג SMILES של אצטמינופן (APAP) מ-PubChem. השתמשו בפלטפורמות מקוונות (ChEMBL, SwissTargetPrediction, STITCH, SEA) כדי לחזות מטרות מולקולריות פוטנציאליות של APAP. אינטגרציה והסרת שכפולים מהיעדים החזויים ליצירת רשימה של 140 יעדי APAP בעלות ביטחון גבוה.

שלב 2: זיהוי יעדי הרעלת כבד
שלפו גנים הקשורים לרעילות כבד ממאגר GeneCards. הרכיבו והסרו את הרשימה כדי ליצור סט לא מיותר של 657 גנים הקשורים לרעילות כבד. זיהוי גנים חופפים בין מטרות APAP לגנים הקשורים לרעילות כבד באמצעות דיאגרמת ון.

שלב 3: עיבוד נתונים טרנסקריפטומי
הורד את מערך הנתונים GSE74000 מ-GEO. עיבוד מוקדם של נתוני ביטוי גולמיים באמצעות DESeq2: הסרת גנים בעלי ביטוי נמוך, נרמול באמצעות גורמי גודל, ויישום טרנספורמציה מייצבת שונות (VST). בצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות Limma ו-DESeq2, עם ספי ערך p מותאם < 0.05 ו-|log2FC| > 1.

שלב 4: ניתוח העשרה פונקציונלית
העלאת גנים חופפים ל-STRING עבור ניתוחי אונטולוגיית גנים (GO), מסלול KEGG, ביטוי רקמות וניתוחי קורלציה של מחלות. המחישו תוצאות העשרה פונקציונלית באמצעות גרפים בועות ומפות חום.

שלב 5: למידת מכונה לבחירת גנים לתכונות
יש ליישם מסווג יער אקראי (n_estimators=500, max_depth=10) כדי לתת עדיפות לגנים של תכונות מהגנים החופפים של APAP ושל הפטוטוקסיטיות. העריך את ביצועי המודל באמצעות ציוני שגיאה מחוץ לתיק (OOB) וציוני חשיבות תכונה. בחרו את 20 הגנים המובילים לפיצ'רים לניתוח נוסף.

שלב 6: עגינה מולקולרית
שלפו את מבנה APAP (CID 1983) מ-PubChem וקולטני חלבון (ESR1: מזהה PDB 1SJ0, PNP: PDB ID 1V2H) מ-PDB. הכינו קבצי ליגנד וקולטנים: המרו לפורמט PDB, הוסיפו מימן קוטבי, הקצו מטענים, ושמרו כקבצי PDBQT. הגדר את רשת העגינה ב-AutoDock Tools, המכסה את האתר הפעיל של החלבון. בצע עגינה מולקולרית באמצעות AutoDock Vina, עם הגדרת מיצוי ל-8, ונתח זיקות ואינטראקציות קשירה. המחישו תוצאות עגינה באמצעות PyMOL לניתוח קונפורמציות קישור ואינטראקציות מפתח.

שלב 7: ניתוח סטטיסטי
קבעו מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחני t והתאימו ערכי p להשוואות מרובות באמצעות שיטת בנג'מיני-הוכברג31. המחישו אסוציאציות מובהקות סטטיסטית באמצעות מפות חום וגרפים של פיזור.

חומרים ושיטות

זיהוי מטרות אצטמינופן
כדי לזהות מטרות מולקולריות פוטנציאליות של APAP, תחילה שחזרנו את הייצוג של SMILES ממאגר PubChem. לאחר מכן השתמשנו במספר פלטפורמות מקוונות, כולל Chemical European Molecular Biology Laboratory (ChemBL)32, Swiss Target Prediction33, כלי החיפוש לאינטראקציה בין כימיקלים ומטרות (STITCH)34, ו-Similarity ensemble approach (SEA)35, כדי לחזות את היעדים האפשריים. לאחר שאינטגרנו את התוצאות מהכלים הללו, בחרנו סט של יעדי ביטחון גבוה עבור APAP. טבלה 1 מגדירה קטגוריות גנים מרכזיות במחקר זה, ומבהירה את תפקידן בניתוח נתונים ובפרשנות ביולוגית. שימוש עקבי במונחים אלו מבטיח תקשורת ברורה של התוצאות שלנו.

זיהוי מטרות הרעלת כבד
גנים פוטנציאליים הקשורים לרעילות כבד נאספו ממאגר GeneCards. כל הגנים שזוהו נאספו, כפילויות הוסרו, ונוצרה רשימה לא מיותרת לניתוחים במורד הזרם. מערך הנתונים GSE74000 הורד ממאגר GEO ב-15 במרץ 2024. נתוני ביטוי גולמיים עובדו ונרמלו באמצעות חבילת לימה (נרמול קונטילי). ניתוח ביטויים דיפרנציאליים בוצע באמצעות מידול ליניארי עם התכווצות אמפירית של בייס. גנים שעמדו בערך p מותאם < 0.05 (Benjamini-Hochberg FDR) ו-|log₂FC| >-1 נחשבו משמעותיים. המחשה של DEGs בוצעה באמצעות גרפים של הרי געש ומפות חום שנוצרו באמצעות ggplot2.

קדם-עיבוד נתונים
נתוני ספירה גולמיים עובדו מראש באמצעות DESeq2. גנים בעלי ביטוי נמוך הוסרו באמצעות סף גילוי CPM >1 לפחות ב-70% מהדגימות. נירמול גודל ספרייה בוצע באמצעות גורמי גודל DESeq2, כפי שמוגדר במשוואה (1):

משוואה 1(1)

כאשר פקטור גודל היחס החציוני מסומן ב-sj. כדי לייצב יחסי ממוצע-שונות, נעשה שימוש בטרנספורמציה מייצבת שונות (VST) במשוואה (2):

משוואה 2(2)

DEGs זוהו באמצעות מבחן וולד עם תיקון בנג'מיני-הוכברג, תוך התחשבות בגנים משמעותיים אם משתמשים בהם במשוואה (3):

משוואה 3(3)

קבוצת ה-DEG שמקורה ב-DESeq2 הוגדרה כמשוואה (4):

משוואה 4(4)

קבוצה זו (X) שימשה באסטרטגיית הקונצנזוס יחד עם Limma Trend (Y) ו-Limma Voom (Z).

בניית רשת PPI
דיאגרמות ון שימשו לזיהוי גנים משותפים בין APAP ליעדי הרעלת כבד. הגנים החופפים הועלו לאחר מכן למסד הנתונים של כלי החיפוש לשחזור גנים/חלבונים אינטראקטיביים (STRING) לבניית רשתות PPI.

ניתוח העשרה פונקציונלית רב-ממדית
ראשית ערכנו אונטולוגיה גנטית (GO), אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG), ביטוי רקמות וניתוחים פונקציונליים הקשורים למחלות של גנים חופפים ל-APAP ולרעסיות כבד באמצעות אתר STRING. לאחר מכן ביצענו ניתוחי העשרת GO, KEGG וניתוח העשרת סט גנים (GSEA) (REACTOME) של הגנים המבדלים לרעילות כבד באמצעות כלי Sendo Academic Tools.

ניתוח יער אקראי
יישמנו למידת מכונה כדי לזהות את 20 הגנים המובילים של התכונות מהגנים החופפים של APAP והגני ההפטוטוקסיות בנתוני טרנסקריפטום הכבד שנגרמו על ידי APAP. יושם מסווג יער אקראי, עם 500 עצים (n_estimators=500), עומק עץ מרבי של 10 (max_depth=10), מינימום 2 דגימות הנדרשות לפיצול צומת (min_samples_split=2), וקריטריון זיהום גיני (קריטריון='ג'יני')36. ביצועי המודל הוערכו באמצעות שגיאת Out-of-Bag (OOB), שבה ערך קרוב ל-0 מצביע על דיוק חיזוי גבוה יותר. ציוני חשיבות התכונות חושבו והוצגו על בסיס ניתוח יער אקראי כדי לדרג את תרומת כל גן, כפי שמופיע במשוואה (5).

משוואה 5(5)

N היה המספר הכולל של הדגימות, yi היה 1(·) פונקציית אינדיקטור, 1 אם המצב נכון ו-0 אחרת; משוואה 6 הייתה התווית החזויה של דגימה III תוך שימוש רק בעצים שבהם III לא נכללה באימון.

ביטוי שונה של גנים מאופיינים
הבדלי הביטוי של גנים תכונה בנתוני הטרנסקריפטומיה הוצגו באמצעות גרפים של כינור. סמנים ביולוגיים שהראו הבדלים מובהקים סטטיסטית זוהו כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים של רעלת כבד הנגרמת על ידי APAP לצורך חקירה נוספת.

עגינה מולקולרית
תרכובות מולקולות קטנות (CID 1983) נאספו ממאגר PubChem, וקולטני חלבון ESR1 ו-PNP (מזהים PDB 1SJ0 ו-1V2H) הורדו מבנק נתוני החלבונים. מבני הליגנד הוסבו לפורמט PDB באמצעות OpenBabel ועובדו מראש בכלי אוטודוק על ידי הוספת מימנים פולאריים, הקצאת מטעני גסטייגר, הגדרת קשרים ניתנים לסיבוב ושמירה בפורמט PDBQT. קולטני חלבון הוכנו באמצעות PyMOL על ידי הסרת מולקולות מים וליגנדים מתגבשים במשותף, ולאחר מכן הוספת מימנים קוטביים והקצאת מטעני קולמן באמצעות AutoDock Tools, ונשמרו כקבצי PDBQT.

בעגינה מולקולרית, תוכנת AutoDock שימשה להגדרת רשת העגינה המכסה את האתר הפעיל של חלבון37. תיבת הרשת הייתה ממוקמת במרכז הקואורדינטות (x = XX·XX, y = YY· YY,z = ZZ· ZZ) עם מידות של 40 × 40 × 40 Å ומרווח רשת של 0.375 Å, מה שמבטיח כיסוי מלא של כיס הכריכה. AutoDock Vina שימש לחישוב מצבי קישור בין ליגנדים לחלבון וזיקות קשר, כאשר פרמטר המיצוי נקבע ל-8, ותשעת תנוחות הקשירה העליונות נוצרו לכל ליגנד.

אימות פרוטוקול העגינה בוצע על ידי חיבור מחדש של הליגנד המתגבש לאתר הפעיל, מה שהניב ערך RMSD של < 2.0 Å, מה שאישר את אמינות הליך העגינה. תוצאות העגינה הוצגו באמצעות PyMOL לניתוח קונפורמציות קישור ואינטראקציות מפתח, כולל קשרי מימן.

סימולציות עגינה חזו כי תרכובת X משתלבת באתר הקישור של חלבון Y, ויוצרת קשרי מימן פוטנציאליים ומגעים הידרופוביים, עם אנרגיית קישור חזויה של -8.5 קקלורי/מול.

פתרון תקלות ושינויים אפשריים
כדי לשפר את החוסן והשחזור של תהליך העבודה המוצע, יש לציין מספר שיקולים לפתרון תקלות ושינויים אפשריים. אם מזוהה מספר בלתי צפוי נמוך של גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs), מומלץ למשתמשים לאמת את הליך הנרמל, לאשר תיוג קבוצתי מדויק, ולשקול לכוון את שינוי ה-|log2 סף תוך שמירה על שליטה מתאימה בשיעור גילוי שגוי (FDR). לעומת זאת, אם מתקבל מספר מופרז של DEGs, יישום חיתוך FDR מחמיר יותר או סינון גנים בעלי שונות נמוכה לפני ניתוח ביטוי דיפרנציאלי עשוי לשפר את הספציפיות.

השפעות אצווה עשויות להשפיע על דפוסי אשכולות בניתוחים חקרניים כגון ניתוח רכיב עיקרי (PCA). אם הדגימות מקובצות בעיקר לפי אצווה ולא לפי תנאי ביולוגי, יש ליישם שיטות תיקון אצווה (למשל, גישות אמפיריות של בייז כמו ComBat), ויש להעריך מחדש את מטא-דאטה של המדגם בקפידה לצורך עקביות.

בבחירת תכונות מבוססת יער אקראי, שיעורי שגיאה גבוהים ב-Out-of-Bag (OOB) או דירוגי תכונות לא יציבים עשויים להעיד על תצורת מודל לא אופטימלית. במקרים כאלה, הגדלת מספר העצים, כיוונון פרמטר mtry או ביצוע ריצות מודל חוזרות עם בחירת תכונות קונצנזוס יכולים לשפר את יציבות המודל ואת אמינות החיזוי. בנוסף, ניתן להשתמש באסטרטגיות אימות הדדיות להערכת עמידות המודל לעומק.

כדי לחזק את האמינות, המשתמשים יכולים לחזור על הניתוח באמצעות ספי DEG חלופיים או הגדרות פרמטר למידת מכונה ולהשוות את עקביות הגנים המזוהים. ניתוחי רגישות כאלה מסייעים להבטיח שהממצאים המרכזיים אינם מונעים על ידי בחירת פרמטרים ספציפית ותומכים בשחזור תהליך העבודה במאגרי נתונים טרנסקריפטומיים דומים.

ניתוחים סטטיסטיים
המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן t, כאשר ערכי p דווחו להשוואה. הוערכו מתאמים סטטיסטיים בין רמות ביטוי גנים לפנוטיפים הקשורים לרעילות כבד באמצעות מקדמי קורלציה של פירסון וספירמן, בהתאם לנורמליות הנתונים. ערכי P הותאמו עבור השוואות מרובות באמצעות שיטת בנג'מיני-הוכברג. אסוציאציות משמעותיות הוצגו באמצעות מפות חום וגרפי פיזור, שסיפקו הערכה מעמיקה של הקשרים הטרנסקריפטומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי גנים חופפים ל-APAP ולרעסיות כבד והניתוח הפונקציונלי שלהם
כדי לקבוע מטרות מולקולריות פוטנציאליות של APAP ולחקור את תפקידן הביולוגי, נוצרו תחזיות באמצעות ארבעה כלים חישוביים: ChEMBL, SwissTargetPrediction, STITCH ו-SEA. לאחר הסרת רשומות כפולות ואינטגרציה של תוצאות חופפות, הורכבה רשימה לא מיותרת של 140 יעדים מועמדים. בנוסף, 657 גנים הקשורים לרעילות כבד הופקו ממאגר GeneCards. על ידי חיתוך 140 יעדי APAP עם 657 גני הרעלת כבד, זיהינו 38 גנים חופפים (איור 2A). 38 הגנים החופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

APAP הוא תרופה משככת כאבים ונוגדת חום הנרשמים לעיתים קרובות; עם זאת, צריכה מופרזת עלולה לגרום לרעילות כבד משמעותית, שלעיתים מובילה לכשל כבד חריפה38. למרות התקדמות בהבהרת המנגנונים הפתופיזיולוגיים של פגיעות כבד הנגרמות על ידי APAP, עדיין קיימת מחסור בסמנים ביולוגיים אמינים לאבחון מדויק, פרוגנוזה וחקירה מכנית. לכן, יש צורך דחוף לזהות סמנים ביולוגיים חדשים פוטנציאליים וגישות לחקור העמיק את טוקסיות הכבד הנגרמת על ידי APAP. במחקר זה חקרנו את המנגנונים הבסיסיים של רעילו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לאוניברסיטת טיאנג'ין לרפואה סינית מסורתית על התמיכה המוסדית. אנו מביעים את תודתנו למפתחים של מסדי נתונים ציבוריים (GeneCards, PubChem, STRING) וכלים בקוד פתוח שאפשרו מחקר זה. תודה מיוחדת לעמיתים מבית הספר לחומרים סיניים לרפואה רפואית ומהפקולטה לרפואה סינית ומערבית אינטגרטיבית על הדיונים והסיוע הטכני החשוב. אנו גם מודים לתורמים למאגר הנתונים GSE74000 על כך שהנתונים שלהם הפכו לזמינים לציבור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסדי נתונים ומסדי נתונים שרתי אינטרנט
מיתרhttps://cn.string-db.org/בניית רשת PPI; העשרה פונקציונלית
כלי אקדמיה של סנדוhttps://www.xiantaozi.com/ניתוח העשרת GO, KEGG ו-GSEA
PubChemhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/שליפת מבנים כימיים (APAP)
ג'ינקארדסhttps://www.genecards.org/שליפת גנים הקשורים לרעילות כבד
מאגר הנתונים GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/שליפת מערכי נתונים טרנסקריפטומיים (GSE74000)
ChEMBLhttps://www.ebi.ac.uk/chembl/חיזוי יעדים
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/חיזוי יעדים
סטיץ'http://stitch.embl.de/חיזוי אינטראקציה
SEAhttp://sea.bkslab.org/גישת אנסמבל דמיון לחיזוי מטרות
מאגר נתוני חלבונים (PDB)https://www.rcsb.org/שחזור מבנה חלבון (ESR1, PNP)
<חזק>תוכנה
R (גרסה 4.x.x)https://www.r-project.org/ניתוח סטטיסטי ועיבוד נתונים
AutoDock Tools / Vinahttp://autodock.scripps.edu/הכנה וסימולציה של עגינה מולקולרית
PyMOLhttps://pymol.org/הדמיית מבנים מולקולריים
ציטוסקייףhttps://cytoscape.org/ויזואליזציה של רשת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aminoshariae, A., Khan, A. Acetaminophen: old drug, new issues. J Endod. 41 (5), 588-593 (2015).
  2. Bertolini, A., et al. Paracetamol: new vistas of an old drug. CNS Drug Rev. 12 (3-4), 250-275 (2006).
  3. Hayward, K. L., Powell, E. E., Irvine, K. M., Martin, J. H. Can paracetamol (acetaminophen) be administered to patients with liver impairment. Br J Clin Pharmacol. 81 (2), 210-222 (2016).
  4. Lee, W. M. Acetaminophen (APAP) hepatotoxicity: isn't it time for APAP to go away. J Hepatol. 67 (6), 1324-1331 (2017).
  5. Li, X., Ni, J., Chen, L. Advances in the study of acetaminophen-induced liver injury. Front Pharmacol. 14, 1239395(2023).
  6. Li, R., et al. Underlying mechanisms and treatment of acetaminopheninduced liver injury (review). Mol Med Rep. 31 (4), 106(2025).
  7. Black, M. Acetaminophen hepatotoxicity. Annu Rev Med. 35, 577-593 (1984).
  8. Lai, Y., Zhong, X. B. Special section on mechanisms of drug metabolism in acetaminophen-induced hepatotoxicity: editorial. Drug Metab Dispos. 52 (8), 704-706 (2024).
  9. Jaeschke, H., et al. Recommendations for the use of the acetaminophen hepatotoxicity model for mechanistic studies and how to avoid common pitfalls. Acta Pharm Sin B. 11 (12), 3740-3755 (2021).
  10. Ameer, B., Greenblatt, D. J. Acetaminophen. Ann Intern Med. 87 (2), 202-209 (1977).
  11. Blieden, M., Paramore, L. C., Shah, D., Ben-Joseph, R. A perspective on the epidemiology of acetaminophen exposure and toxicity in the United States. Expert Rev Clin Pharmacol. 7 (3), 341-348 (2014).
  12. Vitols, S. Paracetamol hepatotoxicity at therapeutic doses. J Intern Med. 253 (2), 95-98 (2003).
  13. Hinson, J. A., Pohl, L. R., Monks, T. J., Gillette, J. R. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. Life Sci. 29 (2), 107-116 (1981).
  14. Monte, A. A., et al. Genetic variants associated with ALT elevation from therapeutic acetaminophen. Clin Toxicol (Phila). 60 (11), 1198-1204 (2022).
  15. Zhang, C. J., et al. A human liver organoid screening platform for DILI risk prediction. J Hepatol. 78 (5), 998-1006 (2023).
  16. McGill, M. R., Jaeschke, H. Mechanistic biomarkers in acetaminophen-induced hepatotoxicity and acute liver failure: from preclinical models to patients. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (7), 1005-1017 (2014).
  17. Zhou, Y., et al. Rapid and non-invasive analysis of paracetamol overdose using paper arrow-mass spectrometry: a prospective observational study. BMC Med. 22 (1), 553(2024).
  18. Panagiotou, G., Taboureau, O. The impact of network biology in pharmacology and toxicology. SAR QSAR Environ Res. 23 (3-4), 221-235 (2012).
  19. Lan, Y., Peng, Q., Fu, B., Liu, H. Effective analysis of thyroid toxicity and mechanisms of acetyltributyl citrate using network toxicology, molecular docking, and machine learning strategies. Toxicology. 511, 154029(2025).
  20. Guan, T., et al. Probing the potential mechanism of permethrin exposure on Alzheimer's disease through enantiomer-specific network toxicology, multi-spectroscopic, and docking approaches. Chemosphere. 369, 143786(2024).
  21. Zheng, Q., Peng, Q., Shen, J., Liu, H. Efficient analysis of toxicity and mechanisms of acetyl tributyl citrate on aging with network toxicology and molecular docking strategy. Toxicology. 510, 154009(2025).
  22. Qu, T., et al. Integration of network toxicology and transcriptomics reveals the novel neurotoxic mechanisms of 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether. J Hazard Mater. 486, 136999(2025).
  23. Ran, Q., et al. Integrated bioinformatics and multi-omics to investigate the mechanism of Rhododendron molle Flos-induced hepatotoxicity. J Ethnopharmacol. 341, 119308(2025).
  24. DeGroat, W., et al. Intelligenes: a novel machine learning pipeline for biomarker discovery and predictive analysis using multi-genomic profiles. Bioinformatics. 39 (12), btad755(2023).
  25. Chew, C. A., et al. Functional precision in pancreatic cancer: redefining biomarkers with patient-derived organoids. Int J Mol Sci. 26 (18), 9083(2025).
  26. Hu, J. W., Pan, Y. Z., Zhang, X. X., Li, J. T., Jin, Y. Applications and challenges of patient-derived organoids in hepatobiliary and pancreatic cancers. World J Gastroenterol. 31 (20), 106747(2025).
  27. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  28. Diouf, O., Soumboundou, M., Sall, C. Proteomics analysis techniques and bioinformatics approaches for biomarkers discovery. Int J Biol Chem Sci. 17 (7), 2943-2957 (2024).
  29. McGill, M. R., Jaeschke, H. Metabolism and disposition of acetaminophen: recent advances in relation to hepatotoxicity and diagnosis. Pharm Res. 30 (9), 2174-2187 (2013).
  30. Jaeschke, H., Ramachandran, A. Acetaminophen hepatotoxicity: paradigm for understanding mechanisms of drug-induced liver injury. Annu Rev Pathol. 19, 453-478 (2024).
  31. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Res. 49 (W1), W388-W396 (2021).
  32. Zdrazil, B., et al. The ChEMBL database in 2023: a drug discovery platform spanning multiple bioactivity data types and time periods. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1180-D1192 (2024).
  33. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W357-W364 (2019).
  34. Szklarczyk, D., et al. STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D380-D384 (2016).
  35. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nat Biotechnol. 25 (2), 197-206 (2007).
  36. Nematzadeh, S., Kiani, F., Torkamanian-Afshar, M., Aydin, N. Tuning hyperparameters of machine learning algorithms and deep neural networks using metaheuristics: a bioinformatics study on biomedical and biological cases. Comput Biol Chem. 97, 107619(2022).
  37. Li, S., et al. Immunomodulatory peptides from sturgeon cartilage: isolation, identification, molecular docking and effects on RAW264.7 cells. Food Chem X. 24, 101863(2024).
  38. Chidiac, A. S., Buckley, N. A., Noghrehchi, F., Cairns, R. Paracetamol (acetaminophen) overdose and hepatotoxicity: mechanism, treatment, prevention measures, and estimates of burden of disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 19 (5), 297-317 (2023).
  39. Nowotka, M. M., et al. Using ChEMBL web services for building applications and data processing workflows relevant to drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 12 (8), 757-767 (2017).
  40. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 47 (W1), 357-364 (2019).
  41. Kuhn, M., et al. STITCH 2: an interaction network database for small molecules and proteins. Nucleic Acids Res. 38 (Database issue), D552-D556 (2010).
  42. Josephy, D. P. The molecular toxicology of acetaminophen. Drug Metab Rev. 37 (4), 581-594 (2005).
  43. Pogosian, L. G., Nersesova, L. S., Gazariants, M. G., Mkrtchian, Z. S., Akopian, Z. I. Some inhibitors of purine nucleoside phosphorylase. Biomed Khim. 57 (5), 526-534 (2011).
  44. Walker, P. L., et al. Purine nucleoside phosphorylase deficiency: a mutation update. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 30 (12), 1243-1247 (2011).
  45. Skácel, J., et al. synthesis, biological evaluation, and crystallographic study of novel purine nucleoside phosphorylase inhibitors. J Med Chem. 66 (10), 6652-6681 (2023).
  46. Zhao, X., et al. a natural steroid saponin, shows remarkable protective effect against acetaminophen-induced liver damage in vitro and in vivo. Toxicol Lett. 214 (1), 69-80 (2012).
  47. Arao, Y., Korach, K. S. The physiological role of estrogen receptor functional domains. Essays Biochem. 65 (6), 867-875 (2021).
  48. Chen, P., Li, B., Ou-Yang, L. Role of estrogen receptors in health and disease. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 839005(2022).
  49. Höllein, A., et al. The combination of WGS and RNA-seq is superior to conventional diagnostic tests in multiple myeloma: ready for prime time. Cancer Genet. 242, 15-24 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים