ריצוף טרנסקריפטום זיהה כימוקינים פתוגניים במרכז בפלאקים אטרוסקלרוטיים

סיכום

מחקר זה נועד לנתח את המנגנונים הבסיסיים של גורמים דלקתיים הקשורים לפלאקים אטרוסקלרוטיים (AP) באמצעות ריצוף RNA. התוצאות זיהו גנים מרכזיים של מרכז דלקתי CCL3, CCL4 ו-CXCL1 ב-AP. כימוקינים אלו עשויים להניע טרשת עורקים על ידי קידום הצטברות מקרופאגים M0 תוך דיכוי תאי חיסון מגנים, וחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

תקציר

רובד טרשת עורקים (AP) הוא סוג של מחלה דלקתית של הרקמה הסיבית המתגברת לאחר פגיעה בתאי אנדותל ותאי שריר חלק בדופן העורק, מה שעלול לגרום לרמות שונות של חסימת זרימת דם קרדיווסקולרית ומוחית. עם זאת, גישות טיפוליות יעילות הממוקדות בדלקת נכשלו ברובן עד כה, מה שמרמז כי עדיין נדרשות תובנות נוספות. במחקר זה נועד לנתח שינויים טרנסקריפטומיים הקשורים לגורמים דלקתיים ב-AP באמצעות ריצוף RNA (RNA-seq). RNA-seq בוצע על דגימות מחולי AP (n = 11) ואנשים בביקורת (n = 3). גנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) זוהו באמצעות Metascape, ואחריהם ניתוח העשרת מסלולי KEGG באמצעות חבילת clusterProfiler בתוכנת R, ניתוח חדירה חיסונית באמצעות CIBERSORT, ורשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) באמצעות מסד הנתונים STRING. גני Hub בתוך רשת ה-PPI זוהו באמצעות תוסף CytoHubba. בסך הכול זוהו 3713 DEGs בקבוצת AP, כולל 2097 גנים עם ויסות גבוה ו-1616 גנים עם ויסות נמוך יותר. התוצאות הראו כי DEGs מועשרים בעיקר במסלולים הקשורים למערכת החיסון ולדלקת. שלושה גורמים הקשורים לדלקת: CCL3, CCL4 ו-CXCL1 נחשבו כגנים מרכזיים בתהליך הפתולוגי של AP. ניתוח חדירת מערכת החיסון חשף מיקרוסביבה ייחודית ב-AP, שהתאפיינה בעלייה משמעותית במקרופאגי M0 לצד ירידה בתאי T CD8⁺, תאי NK מופעלים ותאי מאסט במנוחה בתוך AP. לסיכום, ממצאים פרוצדורליים אלו מתארים את הביטוי הדיפרנרלי של CCL3, CCL4 ו-CXCL1 ואת הקשר שלהם להרכב תאי חיסון משתנה ב-AP, ומדגישים את שלושת הכמוקינים כמועמדים פוטנציאליים לחקירה מכנית נוספת.

מבוא

מחלות לב וכלי דם (CVD) מהוות איום חמור על בריאות האדם ברחבי העולם¹. ככל שמגמת הזדקנות האוכלוסייה העולמית מתעצמת, גם שכיחות מחלות לב וכלי דם נמצאת בעלייה². ביניהם, רובד טרשת עורקים (AP) הוא אחד הגורמים העיקריים למחלות CVD³. AP היא מחלה דלקתית כרונית, המאופיינת בהצטברות הדרגתית של שומנים באינטימה של העורקים ובהיווצרות פלאקים⁴. AP הוא הבסיס השכיח לאירועים קרדיווסקולריים וכלי דם מוחיים, וכולל בעיקר עורקים גדולים ובינוניים, הגורמים לאיסכמיה ופציעות, והוא גורם מרכזי למחלות לב וכלי דם מוחיים^ולמוות. עקב היעדר תסמינים ברורים בשלבים המוקדמים, AP בדרך כלל מתקדם עד האבחון, מה שמוביל לשיעור תמותה גבוה⁶. הטיפול ב-AP מתמקד בגורמי הסיכון שלו, כולל גורמים ניתנים לשינוי כמו פעילות גופנית נמוכה, התנהגות יושבתית, עישון, בעיות נפשיות⁷, והשמנה וסוכרת סוג 2 עקב תזונה עתירת שומן, וכן גורמים שאינם ניתנים לשינוי כגון גנים, גיל ומין⁸. מחקרים עדכניים מצאו כי תסמונת מטבולית, הומוציסטאינמיה, היפראוריצמיה ועמידות לבלב הם גורמי סיכון חשובים להתרחשות ולהתפתחות של טרשת עורקים ^9,10.

תיאוריות הקשורות לפתוגנזה של AP כוללות בעיקר תיאוריות של חדירת שומן, דלקת, תגובה ללחץ חמצוני, זיהום ואינטראקציה בין גורמים גנטיים לסביבתיים^11,12. ביניהם, דלקת ולחץ חמצוני מוכרים כפתוגנזה המרכזית של AP ומשתתפים בכל התהליכים מההופעה ועד להתפתחות והידרדרות של AP¹³. נזק פתאומי של רובד AP לא יציב, הפעלת טסיות וטרומבוזה הם פתוגנזה חשובה לאוטם שריר הלב ולשבץ דימומי¹⁴. במחקר מתמשך נמצא כי AP מכיל לא רק שומנים אלא^{גם תאי} דלקת רבים. עישון, יתר לחץ דם, הפרעות ליפידים, היפראינסולינמיה, היפרגליקמיה, חומצת שתן גבוהה וגירויים מזיקים נוספים גורמים לתאי דם לבנים ותאי אנדותל לשחרר באופן רציף מולקולות הידבקות מסיסות וציטוקינים שונים ומעודדים מונוציטים להידבק לתאי אנדותל כלי דם. הכימוקינים המצטברים מובילים להגירה של מונוציטים למרחב התת-אנדותליאלי ומתמיינים למקרופאגים, אשר לאחר מכן מפגדטים את הליפופרוטאין המחונן והעשיר בכולסטרול (LDL) בתוך הרקמה, ובכך הופכים לתאי קצף ומתחילים את יצירת פסי הליפידים¹⁶. הנזק הפתולוגי המוקדם של AS, כלומר פסים של שומן, מורכב בעיקר ממאקרופאגים ולימפוציטים מסוג T, שהוא נגע דלקתי טיפוסי¹⁷. לכן, תאים דלקתיים שונים ותוצריהם מעורבים בהתחלה ובהתקדמות של AP¹⁸. עם זאת, הנוף הדלקתי של AP מורכב וכולל גורמים ידועים ובלתי ידועים פוטנציאליים. גישות מועמדות מסורתיות עשויות להיכשל בללכוד את כל הספקטרום הזה של מניעים דלקתיים.

כדי להתמודד עם מגבלה זו, השתמשנו בריצוף RNA (RNA-seq), שיטה טרנסקריפטומית ללא הטיה עם תפוקה גבוהה. גישה זו מתאימה במיוחד למחקרים המייצרים השערות שבהם המניעים המולקולריים המרכזיים אינם מוגדרים מראש. בניגוד לשיטות מבוססות גן מועמד או מיקרו-מערך, RNA-seq מציע טווח דינמי רחב יותר, רגישות גבוהה יותר ויכולת לזהות תמלילים חדשים ללא תכנון פרוב קודם^19,20. תכונות אלו הופכות אותו למתאים במיוחד לגילוי חתימות הקשורות לדלקת ב-AP, שם הבסיס המולקולרי נותר לא מאופיין באופן מלא.

במחקר זה, בוצע RNA-seq לניתוח המנגנונים הבסיסיים של גורמים דלקתיים הקשורים ל-AP. כלי ביואינפורמטיקה המשתמשים באלגוריתמים שונים שימשו לסינון סדרת DEGs. בהמשך, בוצעו ניתוח העשרה (WGCNA, מסלול KEGG, mcode, GSEA, ניתוח גנים מרכזי) וניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI). תוצאות מחקר זה תורמות להבנה טובה יותר של המנגנון הפתולוגי המולקולרי שמאחורי AP מונע דלקת, וממלאות תפקיד חשוב בחיפוש אחר סמנים ביולוגיים חדשים.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העם של ליאוצ'נג (מספר אישור: 2023014) ועמד בעקרונות הצהרת הלסינקי. התקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים. טפסי הסכמה מדעת נחתמו על ידי כל המטופלים או משפחותיהם.

מטופלים ודגימות

מחקר זה ניתח בדיעבד 11 מטופלים עם היצרות חמורה בעורק התרדמה שעברו אנדארקטומיה במחלקה לנוירוכירורגיה וסקולרית, בית החולים העממי ליאוצ'נג, מחוז שאנדונג, סין, מינואר 2023 עד דצמבר 2023. מטופלים אלו נרשמו כקבוצת AP. האבחון של היצרות בעורק הקרוטיד התבסס על נתוני הדמיה כגון CTA או אנגיוגרפיה מוחית. קריטריוני ההכללה לקבוצת AP היו: (1) גיל בין 50 ל-80; (2) טומוגרפיה ממוחשבת אנגיוגרפיה/חיסור דיגיטלי אישרה היצרות של עורק הקרוטיד הפנימי התוך-גולגולתי ≥70%; (3) ציון סולם רנקין שונה לפני ההתחלה ≤ 1; (4) הסכמה מדעת שהושגה מהמטופל או מנציגו המשפטי. קריטריוני ההדרה היו: (1) מחלות דלקתיות או חיסוניות; (2) נוכחות של הפרעות פסיכיאטריות; (3) נוכחות גידולים ממאירים; (4) פוטנציאל להריון, הנקה או פוריות. התאמת גיל מטופלים עם פגיעת מוח טראומטית חמורה שעברו תרומת איברים באותו בית חולים באותה תקופה נבחרו כקבוצת הביקורת (NA; שליטה נורמלית, n = 3). הנבדקים בשתי הקבוצות הותאמו מבחינת גיל, מין ומדד מסת גוף כדי לשלול גורמים מבלבלים. קריטריוני ההכללה לקבוצת הביקורת היו: (1) גיל בין 50 ל-80; (2) אין היסטוריה של מחלת עורקים כליליים, היצרות בעורק התרדמה או מחלות כלי דם מערכתיות אחרות; (3) הסכמה מדעת שהתקבלה מנציג המשפטי של המטופל. דגימות אינטימיה ופלאק נאספו מקבוצת AP במהלך אנדארטרקטומיה של קרוטיד, בעוד דגימות אינטימה אאורטית נאספו מקבוצת הביקורת לאחר תרומת איברים. רקמות כלי הדם והפלאק אוחסנו במיכלי חנקן נוזלי לבדיקות נוספות. מאפייני הבסיס של חולי AP מוצגים בטבלה 1.

הכנת דוגמאות

חילוץ ה-RNA הכולל הופק באמצעות תגובת טריזול בהתאם להוראות היצרן. ריכוז וטוהר ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop ND-2000 ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר (יחס A260/A280 בין 1.8 ל-2.0). שלמות ה-RNA הוערכה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של 2% ב-100 וולט למשך 30 דקות. ערכי שלמות ה-RNA (RIN) הושגו באמצעות הביואנלייזר Agilent 2100 (דגימות עם RIN ≥ 7.0 שימשו לניתוח במורד הזרם). כל הליכי הטיפול בדגימות וחילוץ ה-RNA בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. תגובת פסולת טריזול הושלכה בהתאם להנחיות מוסדיות לפסולת כימית מסוכנת.

רצף RNA

לאחר טיפול DNase I ב-RNA כולל, ה-mRNA הועשר באמצעות חרוזי מגנטיים של Oligo D (T) ואז פורק לחתיכות קצרות בטמפרטורה של 94°C למשך 5 דקות. קטעי ה-mRNA שנוצרו שימשו כתבנית, כאשר אוליגונוקלאוטיד אקראי שימש כפריימר. cDNA של הגדילים הראשונים סונתז באמצעות מערכת M-MuLV הפוכה של טרנסקריפטאז בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות, ולאחר מכן בוצעה פירוק RNase H של גדילי RNA. סינתזת גדיל שני בוצעה באמצעות dNTPs בתוך מערכת ה-DNA פולימראז I. ה-cDNA הדו-גדילי טוהר, הקצוות תוקנו וזנב עם בולט "A" כדי לאפשר קשירת מתאם. חרוזי AMPure XP שימשו לבחירת קטעי cDNA באורך 250-300 bp, אשר הוגברו לאחר מכן באמצעות PCR. לאחר מכן, המוצרים המוגברים טוהרו ליצירת הספרייה הסופית. ריצוף ספריות בוצע בפלטפורמת Illumina HiSeq עם אורך קריאה בקצה זוגי של 150 bp. לבקרת איכות נתונים (QC), נתונים גולמיים המכילים רצפי מתאם או בסיסים באיכות נמוכה סיננו באמצעות סקריפטים פנימיים. עקב שגיאות ריצוף שעשויות להיגרם מהמכשיר, איכות הנתונים הוערכה על ידי ניתוח התפלגות שיעורי השגיאות ברצף (שיעור השגיאה < 1% נחשב מקובל). בנוסף, נקבעה הפצת התוכן של GC. כל הליכי הריצוף בוצעו בטמפרטורת הסביבה אלא אם צוין אחרת. חומרים המכילים כימיקלים מסוכנים (כגון זיכרוני DNase I) הושלכו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית.

ספי בקרת איכות ופתרון תקלות

רק דגימות עם RIN ≥ 7.0 וספריות בגודל קטע 250–300 bp שימשו. נדרש מינימום של 14 מיליון קריאות גולמיות לכל דגימה עם Q30 ≥ 98%. תפוקת ספרייה נמוכה נפתרה על ידי הגדלת מחזורי PCR ל-18, אך 15 מחזורים הועדו כדי לשמור על שיעורי כפול מתחת ל-15%.

סינון של DEGs

הערכנו את התפלגות רמות ביטוי הגנים בין דגימות שונות. שימש מתאם בין מדגמים לרמות ביטוי גנים כדי לאמת את אמינות הניסוי ואת התאמת בחירת המדגם. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) יושם להערכת הבדלים בין קבוצות ושחזוריות בתוך הקבוצה. DEGs זוהו באמצעות מאגר נתונים מקוון של Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). DEGs הוגדרו כאלה עם |log₂(שינוי קיפול) | > 1 וערך p. < 0.05, שנחשבו מובהקים סטטיסטית. כל הניתוחים הביואינפורמטיים בוצעו באמצעות פרמטרים ברירת מחדל אלא אם צוין אחרת. כנקודת ביקורת ביניים לשחזוריות, נוצרו גרפים של PCA כדי לאשר שהדגימות מקובצות לפי קבוצה ולא לפי אצווה.

אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) של ניתוח העשרה

ניתוח KEGG (http://www.genome.jp/) הוא גישה שיטתית להערכת תפקוד הגנים לגילוי מסלולי ויסות ביולוגיים. מאמר זה קיבל לראשונה את מזהה הגן הרשמי להמרת סמלים של הגן המבדל מ-org.Hs.eg (גרסה 3.12.0). ניתוח נתיב KEGG בוצע באמצעות חבילת clusterProfiler בתוכנת R (גרסה 4.2.0). עמוד < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. תוצאה ביניים הייתה יצירת רשימה מדורגת של מסלולים מועשרים עם ספירות גנים תואמות וערכי p מותאמים.

ניתוח רשתות PPI

לבניית רשת PPI וגן מפתח המסך, נעשה שימוש במסד הנתונים STRING (גרסה 11.0, https://string-db.org/). רק אינטראקציות עם ציון מורכב מעל 0.9 נשמרו כמובהקות סטטיסטית. הרשת הוצגה ונותחה באמצעות Cytoscape (גרסה 3.10.1), כלי ביואינפורמטיקה בקוד פתוח שנועד לחקר רשתות אינטראקציה מולקולרית. גני Hub בתוך רשת PPI זוהו באמצעות תוסף CytoHubba (גרסה 0.1).

גן המרכז

20 הגנים המרכזיים המובילים נבחרו על ידי CytoHubba Plugin. אדום מציין רמות גבוהות של הגן. ניתוח ביואינפורמטיקה של גני המרכז באמצעות מאגר הנתונים המקוון של metascape (גרסה 3.5, http://metascape.org/gp/index) לניתוח 20 גני hub לפני כן. העשרת גנים זוהתה בקטגוריות האונטולוגיה הבאות: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. כל הגנים בגנום משמשים כרקע להעשרה. פריטים עם p. < 0.05, מספר מינימלי 3 ומקדם העשרה > 1.5 נבדקו.

שיטת ניתוח סטטיסטי

תוכנת SPSS 25.0 הסטטיסטית שימשה לניתוח הנתונים. נתוני הספירה הוצגו בתדירות או באחוזים, וההשוואה בין הקבוצות נבדקה באמצעות מבחן חי-ריבוע. נתוני המדידה היו תואמים לסטיית התקן הממוצעת ± ההתפלגות הנורמלית, ובדיקת T שימשה להשוואה בין קבוצות. עמוד < 0.05 נחשב להבדל משמעותי.

תוצאות

ניתוח נתוני RNA-seq של גנים דיפרנציאליים ברובד טרשת עורקים

רק דגימות עם RIN ≥ 7.0 שימשו להכנת ספרייה. כל 14 הדגימות (11 AP, 3 בביקורת) עברו את הסף הזה. כל הדגימות סודרו באצווה אחת; לכן, לא היה צורך בהתאמת אפקט אצווה. בממוצע נוצרו 16.8 מיליון קריאות גולמיות לכל מדגם; לאחר סינון איכותי, נשמרו 16.5 מיליון קריאות נקיות (98%), כאשר 91% ממופתו באופן ייחודי לגנום הייחוס האנושי (HG38). ניתוח DEGs הראה כי היו 2097 גנים עם ויסות גבוה ו-1616 גנים עם ויסות נמוך (|log2FC| >1, P <0.05) בחולים עם פלאקים של טרשת עורקים בהשוואה לביקורת בריאה (איור 1A). מפת חום של 20 הגנים המובילים המוגברים והמורדים בביטוי דיפרנציאלי הוצגה באיור 1B. ריצוף RNAseq בטרנסקריפטום חשף מתאמים לדוגמה (איור 1C). המתאם בין מודולי גנים מבוטאים יחד לפנוטיפים נותח על ידי WGCNA (איור 1D). ניתוח PCA הראה שיש הבדל מובהק בין קבוצת NA לקבוצת AP (P.< 0.05) (איור 1E).

ניתוח העשרת KEGG של גנים דיפרנציאליים

ניתוח העשרת מסלולי KEGG באמצעות חבילת clusterProfiler בתוכנת R (גרסה 4.2.0) בוצע בנפרד על גנים מובעים באופן דיפרנציאלי מוסדר ומוסדר בקבוצת המחלה (איור 2A,B). התוצאות הראו כי גנים אלו הועשרו משמעותית במסלולים הקשורים לחיסונית ודלקת כגון שושלת תאים המטופואטיים, דלקת מפרקים שגרונית, הידבקות מוקדית, איתות אינטגרין ומסלול איתות כימוקיני.

ניתוח GSEA

ניתוח GSEA הראה כי הגנים המרכזיים בקבוצת הניסוי הועשרו בעיקר בחלק העליון, מה שהראה מגמת עלייה בוויסות (איור 3A). הגנים המרכזיים בקבוצת הביקורת הועשרו בעיקר בתחתית, מה שמצביע על מגמת ירידה (איור 3B). לסיכום, הגנים הדלקתיים עברו ויסות גבוה יותר בקבוצת הניסוי (ASA) וירדו בקבוצת הביקורת (NA).

ניתוח רשתות PPI

ברשת PPI שנותחה באמצעות מסד הנתונים STRING (גרסה 11.0), צמתים החולקים את אותו מזהה אשכול נוטים להיות ממוקמים קרוב זה לזה. כפי שמוצג באיור 4A, האשכולות הללו חשפו כי הגנים המתאימים מעורבים בעיקר בוויסות הפעלת התאים, תגובה דלקתית והפעלה של התא. איור 4B הציג את אותה רשת צבועה בערכי p, כאשר אשכולות המכילים יותר גנים מציגים ערכי p משמעותיים יותר.

זיהוי גנים של Hub וניתוח חדירת תאי חיסון

נבחרו DEGs לניתוח mcode ותוצאות ניתוח שהוצגו בעיקר הקשורות לקולטני אצטילכולין (איור 5 וטבלה 2). ניתוח גנים של Hub באמצעות תוסף CytoHubba ב-Cytoscape זיהה את 20 הגנים המרכזיים של ה-Hub, שרובם היו קשורים למערכת חיסון ודלקת (איור 6A, לוח שמאל). עשרת הגנים המרכזיים של המרכז כללו את CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 ו-CCR5 (איור 6A, לוח ימין). הצטלבות גני המרכז עם גני הפאנל הדלקתי של אולינק 92 חשפה 5 גנים נפוצים, כולל CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 ו-CCL4 (איור 6B). ניתוח CIBERSORT חשף הבדלים משמעותיים בחדירת תאי החיסון בין קבוצת המחלה לבין קבוצת הביקורת הבריאה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, קבוצת המחלה הציגה שיעור גבוה משמעותית של מקרופאגים M0 (p < 0.05) (איור 6C). לעומת זאת, הפרופורציות של תאי T של CD8, תאי NK המופעלים ורוב תאי המנוחה היו נמוכים משמעותית בקבוצת המחלה (עמ' < 0.05 לכולם) (איור 6C).

ניתוח פונקציונלי של גני הציר

ניתחנו עוד את הפונקציה הביולוגית של גן Hub באמצעות מאגר מטאסקייפ, וחשפים כי גנים אלו קשורים בעיקר למסלול איתות מתווך ציטוקין ולאיתות מתווך סידן (איור 7A וטבלה 3). לאחר מכן נעשה שימוש בחתימות סוג תא להעשיר גורמי רגולציה תעתוקית של גן הhub, והראו כי גני הhub קשורים בעיקר לתאי דמוי פאנת C11 במעי הגס 24W של gao, למקרופאג' C8 של לב שמפתח את ה-cui, ולנוירוטיפים של המוח האמצעי האנושי HMGL (איור 7B). ניתוח העשרת מחלות במאגר הנתונים של DisGeNET הראה כי גני ההאב קשורים לנגיעת עור, זיהומי וירוס אפשטיין-באר ודלקת מוח קרציה-בום (איור 7C). ניתוח העשרת מאפייני רקמות במאגר PaGenBase הראה כי גני הhub הועשרו בעיקר בטחול, בדם ובריאות (איור 7D). בנוסף, ניתוח מסד הנתונים של TRRUST חשף כי RELA ו-NFKB1 הם גורמי השעתוק העיקריים המווסתים את גני המרכז (איור 7E).

זמינות נתונים:

מטריצת הספירה המעובדת מסופקת כקבצים משלימים (קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). כל שאר הנתונים מוצגים במלואם במאמר. נתוני ריצוף גולמיים זמינים מהמחבר המתאים לפי בקשה סבירה.

איור 1: ניתוח DEGs. (א) פלאקים בריאים ופלאקים אטרוסקלרוטיים, מפת הרי געש גנטיים דיפרנציאליים, 2097, ירידה בוויסות 1616 (|log2FC| > 1, P.< 0.05). (B) מפת חום של 20 הגנים המובילים המובעים בהבעה דיפרנציאלית עם ויצויים גבוהים ומורדים. (ג) ניתוח קורלציה לדגימה. (ד) קורלציה בין מודולי גנים מבוטאים יחד לפנוטיפים נותחה על ידי WGCNA. (ה) ניתוח PCA (קבוצת NA הייתה שונה באופן מובהק מקבוצת AP). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: ניתוח KEGG. ניתוח העשרת מסלולי KEGG בוצע בנפרד על גנים מופרזים (A) ומופחתת (B) שהביעו ביטוי שונה בקבוצת המחלה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: ניתוח GSEA. (א) ניתוח GSEA הראה כי הגנים המרכזיים בקבוצת הניסוי הועשרו בעיקר בחלק העליון, מה שהראה מגמת עלייה ברגולציה. (B) בקבוצת הביקורת, הגנים המרכזיים הועשרו בעיקר בתחתית והראו מגמת ירידה. לסיכום, הגנים הדלקתיים היו מוגברים בקבוצת הניסוי (AP) וירדו בקבוצת הביקורת (NA). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: דיאגרמת רשת PPI. (A) צבוע לפי מזהה אשכול, כאשר צמתים החולקים את אותו מזהה אשכול בדרך כלל קרובים זה לזה. (B) צביעה עם ערכי P, כאשר פריטים המכילים יותר גנים בעלי ערכי P משמעותיים יותר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: ניתוח mcode של DEGs. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור.

איור 6: ניתוח גנים של ה-Hub. (א) 20 הגנים המרכזיים (פאנל שמאל) ועשרת הגנים המרכזיים (הפאנל הימני) שהושגו בשיטת חישוב דרגות באמצעות תוסף CytoHubba ב-Cytoscape, אשר בעיקר קשורים למערכת חיסון ודלקת. (B) חיתוך גני hub וגנים של לוח דלקת olink 92 זיהה 5 גני חיתוכים. (C) אלגוריתם CIBERSORT שימש להשוואת שפע החדירה של 22 תת-קבוצות תאי חיסון בין קבוצות AP ו-NA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: ניתוח ביואינפורמטיקה של גני האב. (א) הערות פונקציונליות של גני hub באמצעות מסד הנתונים Metascape. (ב) ניתוח העשרה של רגולטורים שעתוקיים הקשורים לגנים של hub בהתבסס על חתימות סוג תאים. (ג) ניתוח העשרת מחלות של גני המרכז שבוצע באמצעות מאגר הנתונים DisGeNET. (ד) דפוסי ביטוי ספציפיים לרקמה של גני המרכז שזוהו באמצעות מאגר PaGenBase. (ה) רשת רגולציה שעתוקית של גני המרכז שנותחה באמצעות מאגר TRRUST. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

MCODE	לך	תיאור	יומן10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	קולטני ניקוטין אצטילכולין חדירים מאוד לסידן	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פרה-סינפטיים	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים חדירים מאוד לסידן	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	תעלות אשלגן בדומיין טנדם	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	ייצוב פוטנציאל ממברנה	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	שלב 4 - פוטנציאל ממברנה במנוחה	-9.7

טבלה 1: מאפייני הבסיס של חולי AP

MCODE	לך	תיאור	יומן10(P)
MCODE_1	GO:0030322	קולטני ניקוטין אצטילכולין חדירים מאוד לסידן	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פרה-סינפטיים	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים חדירים מאוד לסידן	-16.7

טבלה 2: ניתוח העשרת MCODE של DEGs.

MCODE	לך	תיאור	יומן10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	קולטני ניקוטין אצטילכולין חדירים מאוד לסידן	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פרה-סינפטיים	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים חדירים מאוד לסידן	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	תעלות אשלגן בדומיין טנדם	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	ייצוב פוטנציאל ממברנה	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	שלב 4 - פוטנציאל ממברנה במנוחה	-9.7

טבלה 3: ניתוח העשרת MCODE של גן ה-hub.

קובץ משלים 1: בקרה (n=3) ביטוי גן.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: מטופלים (n=10) גן הטבלה המרכזי.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

עם ההעמקה המתמשכת של המחקר על AP, ציטוקינים חדשים מתגלים כל הזמן ב-AP, ודלקת הפכה לגורם חשוב ביצירה ובהתפתחות של AS^21,22. הפעלת האלבומין עלולה לנתק את הקשר בין תאי האנדותל למטריצה הפנימית הווסקולרית ולעודד את קילוף תאי האנדותל מהאינטימה הווסקולרית. פציעה וסקולרית אינטימלית שנגרמה^23,24. דלקת גורמת לשינוי חמצוני ב-LDL-C, וה-LDL-C המותאם מוביל בתורו לתהליך הדלקתי באינטימה של העורק, ובכך מאיץ את היווצרות AP²⁵. פלאקים לא יציבים עלולים בסופו של דבר להיקרע ולגרום ל-ACS בשימוש בגורמים פנימיים וחיצוניים²⁶. במהלך קרע פלאק, מקרופאגים, תאי שריר חלק וסקולריים (VSMC) ולימפוציטים מפרישים גורמים דלקתיים כגון אינטרלוקין-1 (IL-1), IL-6, גורם הידבקות בין-כלי דם-1, ופקטור היצמדות בין-תאי-1. במקביל, הביטוי של אינטגרין לויקוציטים (CD11b/CD18), קולטן במונוציטים וגרנולוציטים, עולה^ב-27,28. עם זאת, המנגנון המולקולרי של הדלקת שמוביל להיווצרות AP עדיין לא נחקר לעומק.

הופעה והתפתחות של AP הנגרמים מדלקת הם תהליך מורכב של פעולה רב-גורמית, שינוי רב-גנטי ומחלה רב-שלבית, במיוחד הקשורה באופן הדוק לביטוי חריג של גנים רבים. במחקר זה, ניתוח RNA-Seq וביואינפורמטיקה חשפו כי בין רקמות ביקורת בריאות ל-AP, תרשים הרי הגעש של DEGs הראה 2097 גנים עם ויסות גבוה ו-1616 גנים עם ויסות נמוך יותר. ניתוח העשרת KEGG נוסף של DEGs הראה כי ה-DEGs מועשרים בעיקר במסלולים הקשורים למערכת החיסון והדלקת. ניתוח הגנים של Hub זיהה את עשרת הגנים המובילים של ה-hub הכוללים את CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 ו-CCR5. החיתוך בין גני הhub עם גני הפאנל הדלקתי olink 92 חשף 5 גנים נפוצים, כולל CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 ו-CCL4. תוצאות אלו מצביעות על כך שגורמים הקשורים לדלקת CCL3, CCL4 ו-CXCL1 עשויים למלא תפקיד מרכזי בתהליך הפתולוגי של AP. ניתוח חדירת מערכת החיסון חשף מיקרוסביבה ייחודית המאופיינת בעלייה משמעותית במקרופאגי M0 לצד ירידה בתאי CD8⁺ T, תאי NK מופעלים ותאי פיטום במנוחה בתוך פלאקים.

מקרופאגי M0 מייצגים מאגר לא מחושב שיכול להפנים בקלות LDL מחומצן ולהתמיין לתאי קצף, אירוע סימן ההיכר באתרוגנזה^{מוקדמת 29}. השיעור הגבוה של מקרופאגים M0 שנצפה בקבוצת המחלה מצביע על הצטברות של תאי קדם אלו בתוך מיקרו-סביבת הפלאק. CCL4, המיוצר בעיקר על ידי מאקרופאגים פעילים ותאי T, משמש כגירוי מתמשך שתומך בהפעלת המקרופאגים דרך מסלול האיתות NFκB, מקדם ביטוי מולקולות היצמדות, ומשרה מטריצת מטלופרוטאנז-2 ו-9, ובכך מקל על המעבר של מקרופאגים M0 למצב פרו-אתרגני ופוגע ישירות ביציבות הפלאק³⁰. האחוז המופחת של תאי CD8⁺ T עשוי לשקף דיכוי מתווך CCL3 של תת-קבוצות תאי T מגוננים. קומיסארוב ואח' הראו כי נדידת תאי T לפלאקים אטרוסקלרוטיים אנושיים מתרחשת בעיקר דרך ציר CCR5-CCL3³¹. יתרה מזאת, דורינג ואח^' גילו מסלול לא קנוני שבו CCL17 מסמן דרך CCR8 כדי לעורר ביטוי CCL3, מה שמדכא התמיינות רגולטורית של תאי T; אבלציה גנטית של CCL3 בתאי T CD4⁺ הגבירה את מספר ה-Treg של FoxP3⁺ והגבילה את טרשת העורקים, בעוד מתן CCL3 החריף את המחלה והגביל את התמיינות ה-Treg. שינוי זה ככל הנראה מפחית את מספר תאי ה-T הרגולטוריים המגינים של CD8⁺ תוך קידום תאי T אפקטוריים פתוגניים, מה שמוביל לירידה נטו ביחס תאי CD8⁺ T שנצפתה בניתוח שלנו. הירידה בתאי NK מופעלים ותאי מאסט במנוחה ככל הנראה משקפת שינויים במצב ההפעלה ולא אובדן מוחלט של אוכלוסיות אלו. בונקורסי ואח^' דיווחו כי פלאקים תסמינים בפרושים התרדמים מציגים חדירה מוגברת של תאי NK וייצור IFN-γ, מה שמקשר ישירות את הפעלת תאי ה-NK לאי-יציבות קלינית של רובד. לגבי תאי מאסט, Wezel ואח^' הראו כי כימוקינים המשתחררים מתאי מאסט מופעלים, במיוחד CXCL1, מעוררים גיוס נויטרופילים דרך ציר CXCL1/CXCR2, ובכך מחמירים את התגובה הדלקתית המתמשכת ומקדמים התקדמות וחוסר יציבות של הפלאק. לכן, האחוז הנמוך יותר של תאי NK מופעלים ותאי מאסט במנוחה משקף ככל הנראה את ההפעלה, הדגרנולציה או התשישות שלהם בתוך סביבת הפלאק הדלקתי, ולא דלדול מספרי אמיתי.

ישנם מספר מגבלות למחקר זה. ראשית, מחקר זה מבוסס אך ורק על רצף טרנסקריפטומים ומוגבל על ידי גודל המדגם הקטן. מעבר לגודל המדגם המוגבל, יש לציין מספר מגבלות טכניות של פרוטוקול RNA-seq. RNA-seq בכמויות מסתירות הטרוגניות תאית; נדרשות גישות חד-תאיות לפתרון ביטוי ספציפי לסוג תא של CCL3, CCL4 ו-CXCL1. דה-קונבולוציה חישובית חיסונית (CIBERSORT) מספקת הערכות בלבד, לא מדידות ישירות. שפע ה-RNA אינו תמיד קשור לרמות חלבון; נדרש אימות אורתוגונלי. מחקרים עתידיים צריכים להתמודד עם מגבלות אלו באמצעות טרנסקריפטומיקה חד-תאית, קוהורטות גדולות ועצמאיות, ואימות חלבונים אורתוגונלי.

לסיכום, הממצאים הנוכחיים הדגישו את התפקיד החשוב של גורמים דלקתיים בתהליך הפתופיזיולוגי של AP. בנוסף, זיהינו את גני המרכז CCL3, CCL4 ו-CXCL1, שעשויים ליצור רשת כימוקינים מתואמת שמניעה טרשת עורקים על ידי קידום הצטברות מקרופאג' M0, דיכוי תת-קבוצות תאי T מגן ושינוי מצבי ההפעלה של תאי NK ותאי מאסט. בסך הכול, ממצאים אלו מדגישים את שלושת הכימוקינים כרגולטורים קריטיים של מיקרו-סביבת החיסון של הפלאק ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טריזול	Invitrogen	15596026CN	חילוץ RNA
ספקטרופוטומטר Nanodrop ND-2000	תרמו פישר סיינטיפיק	ND2000	זיהוי ריכוזי RNA
אנלייזר ביולוגי Agilent 2100	אג'ילנט	G2939BA	בקרת איכות RNA
Illumina HiSeq TM 2000	אילומינה	HiSeq 2000	רצף טרנסקריפטום
חרוזים מגנטיים של Oligo D (T)	ניו אינגלנד ביולאבס	S1550S	העשרת RNA