Method Article

בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה של נגיף הפטיטיס E למדידת טיטרים של נוגדנים מנטרלים

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין בדיקה סטנדרטית לנטרול וירוס עבור וירוס הפטיטיס E (HEV), וירוס RNA עם גדילי חיובי לא-ציטופתי. כאן, מתוארת בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה (FRNT) המבוססת על כימות של חלבון קפסיד ויראלי מסומן בפלואורסצנטיות להערכת יעילות נוגדני אנטי-HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת ניטרול הווירוס מודדת את פוטנציאל הנטרול של נוגדן או תערובת נוגדנים נגד הנגיף המתאים. זו טכניקה חשובה להערכת יעילות מועמדי החיסון והנוגדנים הנטרוליים שפותחו נגד הנגיף. בדיקת ניטרול הפחתת פלאק (PRNT) היא שיטה פופולרית להערכת הטיטר של נוגדנים מנטרלים ספציפיים לנגיף. עם זאת, PRNT אינו ישים במקרה של וירוסים לא-ציטופתיים. וירוס הפטיטיס E (HEV) הוא וירוס RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי, השייך למשפחת ההפווירידיים. זהו גורם מרכזי להפטיטיס ויראלי חריפה ברחבי העולם. הוא אינו מראה כל השפעה ציטופתית בתרבות תאים יונקים. חיסון נגד HEV זמין בסין. עם זאת, חיסונים או נוגדנים טיפוליים נגד HEV אינם זמינים ברוב העולם. מספר מעבדות עובדות על מועמדים לחיסון נגד ה-HEV. מבחן ניטרול למדידת יעילות חיסוני HEV יהיה כלי שימושי מאוד עבור החוקרים. כאן, אנו מתארים בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה (FRNT) להערכת טיטר הנטרול של 50% (NT50) של נוגדנים נגד HEV. HEV מנוטרל נגד HEV ORF2, או מנוטרל IgG של ארנב, שימש להדביק תאי Huh7, ואחריו צביעת אימונופלואורסצנטי של חלבון ORF2 הוויראלי. תאים חיוביים פלואורסצנטיים נמדדו ביישום ImageJ, ו-NT50 הוערך ב-2.1 x 103. שיטה זו יכולה לשמש להערכת NT50 של נוגדנים נגד HEV הנמצאים בסרא של עכברים מחוסנים, בסרא בודד שהתאושש מ-HEV, ובנוגדנים נגד HEV שיוצרו במעבדה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס הפטיטיס E (HEV) הוא וירוס RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי, השייך למשפחת ההפווירידים 1,2. בדרך כלל היא גורמת להפטיטיס חריפה מגבילה את עצמה, אך יכולה לגרום להפטיטיס כרונית אצל אנשים עם דיכוי חיסוני 3,4. נשים בהריון נמצאות בסיכון גבוה לפתח כשל כבדי חמור, כאשר שיעור התמותה עולה עד 30%5. ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח על כ-19.47 מיליון מקרים של הפטיטיס E חריפה (AHE) וכ-3450 מקרי מוות שנגרמו על ידי HEV ברחבי העולם בשנת 2021. HEV מועבר במדינות מתפתחות בעיקר דרך מזון ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הושג אישור של ועדת האתיקה המוסדית (IEC) לאיסוף דגימת צואה מחולה נגוע ב-HEV שאושפז במחלקה לגסטרואנטרולוגיה, AIIMS, ניו דלהי. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים המשתתפים במחקר. פרטי הריאגנטים והציוד בו משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. בידוד וכימות של וירוסים

  1. בהסכמה מדעת, יש לקבל את דגימת הצואה מחולה שנדבק ב-HEV לצורך טיהור הווירוס.
  2. להחזיר את דגימת הצואה לנוזל מלח עם פוספאט (DPBS) של Dulbecco בריכוז סופי של 10% (w/v) ובצנטריפוגה ב-7800 x גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: השתמשו בכפפות בעת טיפול בדגימת צואה HEV, ונקו את אזור העבודה עם 70% אתנו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום תאי Huh7 ב-g1-HEV ואפיון וירוס

ה-g1-HEV בודד מדגימת צואה באמצעות סדרת שלבים, כפי שמודגם (איור 1A). מספר עותק הגנום של ה-g1-HEV המטוהר הוערך על ידי RT-qPCR, ואחריו אחסון ב-80°- מעלות צלזיוס. לאישור זיהום וריפול, תאי Huh7 נדבקו ב-1.8 ×-10 עותקיםגנומיים של המאגר המטוהר g1-HEV במשך 72 שעות, ואחריהם RT-qPCR ו-IFA. רמה משמעותית של RNA g1-HEV זוהתה בתאים נגועים בהשוואה לתאים מזוהים (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT היא שיטה מבוססת צביעת חיסון להערכת פוטנציאל הנטרול של נוגדנים. הוא שימש להערכת ערכי NT50 עבור נוגדנים נגד מספר וירוסים, כולל נגיף דנגי (DENV), נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) ותסמונת הנשימה החריפה החמורה (SARS-CoV-2) ונגיף המוח היפני (JEV)23,24,25. בשיטה זו, הווירוס מודגר עם נוגדן בדיקה (או SERA), ואחריו זיהום של תאים מתורבתים בתערובת. תאים נגועים מורשים להיות מודגרים למשך זמן רב כדי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק מהמועצה לסיוע מחקר בתעשיית הביוטכנולוגיה, משרד הביוטכנולוגיה, ממשלת הודו, שהוענק ל-MS, S ו-BN. המחקר במעבדת ה-MS נתמך על ידי מענק ליבה מהמכון למדעי וטכנולוגיית בריאות תרגומית. SA נתמכת על ידי משרת מדען מחקר פרויקט הממומן על ידי המועצה ההודית למחקר רפואי, ממשלת הודו. UB נתמכת על ידי מלגת מחקר בכירה ממחלקת הביוטכנולוגיה, ממשלת הודו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות מיקרופוגה בנפח 1.5 מ"לאקסיגןMCT-150-C
צלחת תרבית תאים עם 12 בארותקורנינג3512
מנער חממה בזווית 37 מעלותתרמו-סיינטיפיק50163013
4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדולאבקאםAB104139DAPI
צינור צנטריפוגה 50 מ"לפלקון352070
צלחת תרבית תאים בעלת 6 בארותקורנינג 3516
קמח אלקסה 594 נוגדן IgG משניתרמו-סיינטיפיקA-11012
נוגדן אנטי-ORF2ג'נסקריפטNAמסונתז בהתאמה אישית על ידי Genscript ומאופיין במעבדה שלנו14
נוגדן IgG נגד ארנביםג'נסקריפטNA
אלבומין סרום בקרהימדיהMB083BSA
מיקרוסקופ קונפוקליאולימפוסFV3000
DMEM, סוכר גבוההימדיהAL007A
סרום בקר עובריGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (ויין רסבנד ותורמים, NIH, ארה"ב)
סרום רגיל של עזהימדיהRM-10701
פאראפורמלדהידהימדיהGRN3660PFA
pH 7.4 לסליין בופר זרחןהימדיהTL1006PBS
פוליאתילןגליקול 6000סיגמה81255PEG6000
ערכת בדיקה חד-שלבית SOLIScriptסוליס ביודיין08-57-00250
תגובת TRIמרכז מחקר מולקולריTR118
טריטון X100סיגמהX100
טריפסין-אדטהGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells
Video Coming Soon

Related Articles