Method Article

בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה של נגיף הפטיטיס E למדידת טיטרים של נוגדנים מנטרלים

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין בדיקה סטנדרטית לנטרול וירוס עבור וירוס הפטיטיס E (HEV), וירוס RNA עם גדילי חיובי לא-ציטופתי. כאן, מתוארת בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה (FRNT) המבוססת על כימות של חלבון קפסיד ויראלי מסומן בפלואורסצנטיות להערכת יעילות נוגדני אנטי-HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת ניטרול הווירוס מודדת את פוטנציאל הנטרול של נוגדן או תערובת נוגדנים נגד הנגיף המתאים. זו טכניקה חשובה להערכת יעילות מועמדי החיסון והנוגדנים הנטרוליים שפותחו נגד הנגיף. בדיקת ניטרול הפחתת פלאק (PRNT) היא שיטה פופולרית להערכת הטיטר של נוגדנים מנטרלים ספציפיים לנגיף. עם זאת, PRNT אינו ישים במקרה של וירוסים לא-ציטופתיים. וירוס הפטיטיס E (HEV) הוא וירוס RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי, השייך למשפחת ההפווירידיים. זהו גורם מרכזי להפטיטיס ויראלי חריפה ברחבי העולם. הוא אינו מראה כל השפעה ציטופתית בתרבות תאים יונקים. חיסון נגד HEV זמין בסין. עם זאת, חיסונים או נוגדנים טיפוליים נגד HEV אינם זמינים ברוב העולם. מספר מעבדות עובדות על מועמדים לחיסון נגד ה-HEV. מבחן ניטרול למדידת יעילות חיסוני HEV יהיה כלי שימושי מאוד עבור החוקרים. כאן, אנו מתארים בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה (FRNT) להערכת טיטר הנטרול של 50% (NT50) של נוגדנים נגד HEV. HEV מנוטרל נגד HEV ORF2, או מנוטרל IgG של ארנב, שימש להדביק תאי Huh7, ואחריו צביעת אימונופלואורסצנטי של חלבון ORF2 הוויראלי. תאים חיוביים פלואורסצנטיים נמדדו ביישום ImageJ, ו-NT50 הוערך ב-2.1 x 103. שיטה זו יכולה לשמש להערכת NT50 של נוגדנים נגד HEV הנמצאים בסרא של עכברים מחוסנים, בסרא בודד שהתאושש מ-HEV, ובנוגדנים נגד HEV שיוצרו במעבדה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס הפטיטיס E (HEV) הוא וירוס RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי, השייך למשפחת ההפווירידים 1,2. בדרך כלל היא גורמת להפטיטיס חריפה מגבילה את עצמה, אך יכולה לגרום להפטיטיס כרונית אצל אנשים עם דיכוי חיסוני 3,4. נשים בהריון נמצאות בסיכון גבוה לפתח כשל כבדי חמור, כאשר שיעור התמותה עולה עד 30%5. ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח על כ-19.47 מיליון מקרים של הפטיטיס E חריפה (AHE) וכ-3450 מקרי מוות שנגרמו על ידי HEV ברחבי העולם בשנת 2021. HEV מועבר במדינות מתפתחות בעיקר דרך מזון ומים מזוהמים, בשל תברואה לקויה, בעוד שהדבקה תעסוקתית מפוזרת במדינות מפותחות קשורה לצריכת בשר נא או לא מבושלמספיק. HEV מסווג לשמונה גנוטיפים. גנוטיפ (g) 1- ו-g2- HEV מדביקים אך ורק בני אדם. ל-g3- ו-g4-HEV יש מגוון רחב של מארחים כגון אדם, ארנב, חזירים, חזירי בר ואיילים. g5- ו-g6-HEV מדביקים חזירי בר בעוד ש-g7- ו-g8-HEV מדביקים גמלים. מקרה יחיד של העברה אנושית של G7-HEV דווח במזרח התיכון באמצעות צריכת בשר גמלים וחלב 7,8. הדבקה ב-HEV נפוצה בעיקר במדינות בעלות הכנסה נמוכה עד בינונית. מספר התפרצויות מועברות במים דווחו באזורים אנדמיים בדרום ודרום-מזרח אסיה, אפריקה ומקסיקו, שנגרמו בעיקר על ידי g1 ופחות תדיר על ידי זיהום g2-HEV. מקרי זיהום ספורדיים תעסוקתיים במדינות מפותחות באירופה ובמזרח אסיה נגרמים בעיקר על ידי g3-HEV 6,7.

הגנום של HEV הוא RNA בעל 7.2 קילובייט פלוס סטרנד שמכיל מכסה 7-מתילגואנין בקצה 5′, שלושה מסגרות קריאה פתוחות (ORFs) ואחריהן קצה 3' פולי-אדנילטי. ORF1 מקודד את הפוליפרוטאין הלא-מבני, המורכב משבעה תחומים מובחנים: מתילטרנספראז (Met), תחום Y, פרוטאז ציסטאין דמוי פפיין (PCP), תחום V, מקרו-דומיין (X-דומין), הליקאז (Hel), ו-RNA פולימראז תלוי RNA (RdRp). ORF2 מקודד את חלבון הקפסיד, האחראי על הרכבת הקפסיד הוויראלי. ORF3 מקודד פוספופרוטאין הפועל כוירופורין ועוזר ביציאת וירוס9. מסגרת קריאה פתוחה נוספת, ORF4, קיימת ב-g1-HEV, שמתורגם באמצעות מנגנון בלתי תלוי בקפ, באמצעות אלמנט פנימי דמוי אתר כניסה של ריבוזום הממוקם בתוך ORF1. ביטוי ORF4 משופר על ידי תרכובות המעוררות לחץ ברשת האנדופלזמית. ORF4 הוצע לקידום הרכבת קומפלקס שכפול g1-HEV10.

למרות ש-HEV אינו משכפל ביעילות במבחנה, כמה זנים של הווירוס, שבודדו מחולי הפטיטיס E, התפשטו בהצלחה בהפטוציטים, קו תאי הריאה וקו תאים אפיתלבמעי הגס 11. עם זאת, קשה להפיץ את הווירוס בצורה חזקה בתאים המתורבתים. שיבוט cDNA זיהומי של g1-HEV (זן Sar55) שימש למחקרים במבחנה, אך עד כה לא הושגו ייצור והפצה יעילים של זני g1-HEV בתאים מתורבתים. חלק מזני g3 ו-g4-HEV גדלים טוב יותר בתאים מתורבתים12. עם זאת, הווירוס המטוהר שנוצר מתאים שעברו טרנפיקציה עם RNA הגנומי HEV של ה-p6 המונח במבחנה אינו מספיק לבדיקות מרובות. בנוסף, כל חלקיקי HEV שנוצרים בתרבות תאים הם מעטפים למעט, מה שמשפיע על ההדבקה שלהם. לעומת זאת, HEV שנמצא במזון ובמים מזוהמים אינו עטוף, והוא מדבק מאוד. HEV הקיים בצואת המטופלים אינו עטוף, והוא המקור הנפוץ לזיהום טבעי. לכן, השימוש ב-HEV מטוהר מצואה של המטופל מבטיח זיהום יעיל במערכת תרביות התאים של היונקים. המחקרים הקודמים שלנו הראו את אמינות ה-g1-HEV המטוהר בצואה של המטופל בכימות שכפול וירוס בתאי הפטומה אנושית (Huh7). וירוס מטוהר המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס שומר על זיהום במשך מספר שנים, והוא שימש במספר מחקרים עצמאיים להערכת שכפול הווירוס 10,13,14,15. מחקר זה עיצב מבחן ניטרול HEV באמצעות g1-HEV מטוהר שהתקבל ממטופל. הווירוס טוהר, מדרג, אופיין ואוחסן באליקווטים בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי בבדיקות ניטרול. מכיוון ש-HEV אינו ציטופתי, שיטת PRNT המסורתית אינה שימושית להערכת פוטנציאל הנטרול של נוגדנים אנטי-HEV לווירוס. היו מספר ניסיונות לפתח בדיקות ניטרול ל-HEV, כולל בדיקת ניטרול מבוססת ציטומטריית זרימה, בדיקת ניטרול מבוססת ערכת אנטיגן ELISA לזיהוי pORF2 המופרש לסופרנטנטים של תאים, בדיקת קישור מבוססת ELISA במבחנה, בדיקה מבוססת RT-PCR, ובדיקת ניטרול מבוססת פלואורסצנציה 16,17,18,19,20 . בדיקה מבוססת ELISA מזהה בעקיפין קישור נוגדנים להערכת ניטרול תפקודי של הנגיף, אך אינה יכולה למדוד זיהום אמיתי. השיטה המבוססת על ציטומטריית זרימה בדרך כלל מודדת את אחוז התאים הנגועים באמצעות פסאודו-וירוס. שיטת נטרול מבוססת RT-PCR מורכבת יותר מ-FRNT; לכן, הסיכוי לטעות בטיפול גבוה יותר. מצד שני, שיטת ה-FRNT המתוארת כאן מוגבלת על ידי זמינות וירוסים מדבקים בעלי טיטר גבוה ויכולות הדמיה. עם זאת, זו שיטה יעילה למדידת NT50 של נוגדנים נגד HEV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הושג אישור של ועדת האתיקה המוסדית (IEC) לאיסוף דגימת צואה מחולה נגוע ב-HEV שאושפז במחלקה לגסטרואנטרולוגיה, AIIMS, ניו דלהי. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים המשתתפים במחקר. פרטי הריאגנטים והציוד בו משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. בידוד וכימות של וירוסים

  1. בהסכמה מדעת, יש לקבל את דגימת הצואה מחולה שנדבק ב-HEV לצורך טיהור הווירוס.
  2. להחזיר את דגימת הצואה לנוזל מלח עם פוספאט (DPBS) של Dulbecco בריכוז סופי של 10% (w/v) ובצנטריפוגה ב-7800 x גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: השתמשו בכפפות בעת טיפול בדגימת צואה HEV, ונקו את אזור העבודה עם 70% אתנול לאחר העבודה (בצע את כל השלבים בתוך ארון בטיחות ביולוגית).
  3. אסוף את הסופרנטנט והעבר אותו דרך פילטר של 0.45 מיקרון.
  4. הוסף 8% PEG6000 מוכן ב-0.4 מיליון NaCl לסופרנטנט הווירוס ודוגר במשך 16 שעות בטמפרטורה של 0°C.
  5. צנטריפוגה את הדגימה בעוצמה של 18,000 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדור ל-40 מ"ל של Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco.
  7. ריכזו את המתלה לנפח של 5 מ"ל באמצעות סינון זרימה טנגנציאלית (TFF) באמצעות מחסנית ממברנה של 30 קילו-דלטון. סנן דרך פילטר של 0.2 מיקרון בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, יצר אליקווט, ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. השתמש באליקווט אחד לבידוד RNA כולל ולבצע RT-qPCR.
  8. השתמשו בדילול מרובי של פלסמיד pSK-HEV2 [וקטור pBluscript המכיל cDNA של שיבוט זיהום של g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng עד 0.000001 ng DNA/תגובה בדילול סדרתי של 10x) כדי לשרטט תקן לכימות RNA ויראלי.
  9. צייר את הגרף עם כמות ה-DNA pSK-HEV2 בציר ה-X וערכי Ct המתאימים בציר Y. הסקת ריכוז ה-RNA הוויראלי מהגרף הסטנדרטי.
  10. כמת את רמת ה-RNA הגנומי HEV מהגרף הסטנדרטי וחשב את מספר עותק הגנום של הנגיף באמצעות הנוסחה הבאה: מספר עותקים = ng*(מספר/מול) / בסיסים *(ng/g)*(g/מול בסיסים).

2. זיהום תאי Huh7 ב-g1-HEV

  1. קח בקבוק T75 שמכיל תאי Huh7. בדוק תחת מיקרוסקופ אם התאים מתחברים ובריאים.
  2. הסר את המדיה באמצעות שאיפה (בצע את כל השלבים בארון הבטיחות הביולוגית). הוסף 10 מ"ל DPBS, סובב, והסר.
  3. הוסיפו 1 מ"ל תמיסת טריפסין של 0.05%, כדי להבטיח שהיא מפוזרת באופן שווה על פני השטח.
  4. דגרו בתוך אינקובטור CO2 למשך 30–60 שניות, עד שהתאים מנותקים ב-90%.
  5. הוסף 5 מ"ל של מדיום שלם, פזר אותו באופן שווה על כל פני השטח של ה-T75, ופיפטה מספר פעמים כדי ליצור אוכלוסייה אחידה של תא יחיד, ללא אגרגטים.
  6. העבר את מתלה התא לצינור קוני של 50 מ"ל, צנטריפוגה בעוצמה של 200 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שאיפת מדיום התרבית מהצינור הקוני בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
  8. הוסיפו 5 מ"ל של מדיום שלם לצינור, ותלו את התאים לתלייה אחידה באמצעות פיפטינג עדין.
  9. קח 10 מיקרול של תליית תא והניח אותו על סלייד של מונה תאים. ספר את התאים ב-4 רבעים, חשב את הממוצע למיליטר.
  10. זרע 0.5 x 106 תאים לבאר של צלחת 6 בארות ב-2 מ"ל DMEM (בתוספת 10% FBS).
  11. למחרת, הסר מדיה, שטוף ב-1 מ"ל DPBS, והוסף 50 מיקרוליטר של וירוס g1-HEV (שווה ערך ל-4.5 ×-10עותקיגנום של g1-HEV המטוהר) במדיה ללא סרום (SFM) של 1 מ"ל.
  12. דגרו את התאים באינקובטורCO2 עם 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  13. שטפו את התאים ב-500 מיקרוליטר DPBS, ואז הוסיפו 2 מ"ל מדיום מלא (DMEM בתוספת 2% FBS).
  14. דגרו את התאים במשך 72 שעות באינקובטור עם 5%CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  15. המשך לבדיקות במורד הזרם.

3. בדיקת RT-qPCR

  1. הסר את מדיום הגידול מלוח 6 בארות (מהשלב 2.15) ושוטף את התאים עם 1 מ"ל DPBS.
  2. הוסף 1 מ"ל TRI Regain ישירות ללוח 6 בארות כדי לעבור את התאים. פיפט את הליזאט למעלה ולמטה מספר פעמים, ואז מועבר לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    הערה: תגובת TRI היא רעילה אם נשאפת, נבלעת או באה במגע עם העור. השתמש בכפפות מגן בזמן השימוש במגיב והימנע משאיפת אדים. עדיף להשתמש בתוך מכסה הכימיקלים. כל כלי פלסטיק צריכים להיות בדרגת RNAe.
  3. דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסיפו 0.2 מ"ל כלורופורם, סגרו היטב את הצינור, ואז מערבולות למשך 10–15 שניות (כלורופורם מסוכן ורעיל; מטופל עם ציוד מגן אישי מתאים). דגרו במשך 2–3 דקות.
  4. צנטריפוגה את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 12,000 × גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העבר את השלב המימי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו 0.5 מ"ל איזופרופנול לשלב המימי, וערבבו היטב על ידי הפיכת הצינור כמה פעמים.
  5. דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. צנטריפוגה ל-10 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  7. תלה מחדש את הכדור ב-1 מ"ל 75% אתנול. צנטריפוגה ל-5 דקות ב-7500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  8. ייבשו את כדור ה-RNA באוויר למשך 5–10 דקות.
  9. החזירו את הכדור למים נטולי נוקלאז (NFW) של 50 מיקרוליטר (NFW), דגרו בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ערבבו בנקישה ידנית, ומדדו את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטריה.
  10. בצע RT-qPCR חד-שלבי מבוסס פרוב TaqMan באמצעות הפריימרים הבאים:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV Probe: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; ריבונוקלאז P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP probe: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTGCGGG[BHQ1]3′.
  11. חשב כימות יחסי של RNA ב-g1-HEV באמצעות שיטת 2−ΔΔCT .

4. בדיקת אימונופלואורסצנציה (IFA)

  1. פיצל את תאי Huh7 כפי שתואר בשלבים קודמים.
  2. מניחים את כיסוי הזכוכית בדרגת מיקרוסקופיה בלוח עם 12 בארות וזרעו 0.2 ×10 תאים ו-6 תאים/באר במדיום מלא של 1 מ"ל (DMEM בתוספת 10% FBS).
  3. הדביק את התאים ב-1.8 ×-10עותקים גנומיים של g1-HEV המטוהר ב-500 מיקרו ליטר SFM. דגרו את התאים באינקובטורCO2 עם 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  4. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר DPBS.
  5. הוסף 2 מ"ל של מדיה מלאה (DMEM בתוספת 2% FBS).
  6. דגרו את התאים במשך 72 שעות באינקובטורCO2 של 5%, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר DPBS, תוך דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר בין כל שטיפה.
  8. הוסיפו 500 מיקרוליטר 4% PFA (פאראפורמלדהיד) לתאים ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: 4% PFA מזיק אם נשאפים, גורם לגירוי בעור ובעיניים, ועלול לגרום לתגובה אלרגית בעור. למען הבטיחות, יש ללבש כפפות מגן והגנה לעיניים בעת השימוש במגיב ולהימנע משאיפת אדים.
  9. שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר DPBS, שלוש פעמים למשך 5 דקות כל פעם, ודגרו ב-DPBS למשך 30 דקות.
  10. הוסף תמיסת חסימה של 250 מיקרוליטר (5% סרום עז רגיל, 0.5% BSA, 0.3% טריטון X-100 ב-DPBS) לתאים ודוגר במשך שעה בטמפרטורת החדר (RT).
  11. הסר את תמיסת החסימה, שטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר DPBS, ודגר את התאים עם 250 מיקרוליטר נוגדן ראשוני (DPBS, 0.3% טריטון X-100, 5% BSA, 0.5% סרום עזים רגיל, דילול של 1:500 של נוגדן אנטי-ORF2 או IgG ארנב), למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  12. שטוף את התאים ב-500 מיקרוליטר DPBS שלוש פעמים, במשך 5 דקות כל פעם.
  13. דגרו את התאים עם נוגדן משני (DPBS, 0.3% טריטון X-100, 5% BSA, 0.5% סרום עזים רגיל, דילול של 1:1000 של נוגדן Alexa fluor 594 אנטי-ארנב לעזים) למשך שעה אחת ב-RT.
  14. שטוף את התאים שלוש פעמים עם DPBS למשך 5 דקות כל אחד. הוסף 10 מיקרוליטר של תגובת אנטי-פייד זהב Prolong עם תמיסת DAPI (4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול) לסלייד הזכוכית. התקן את התאים המכילים כיסוי, כאשר התאים פונים לכיוון תמיסת DAPI על שקופיות זכוכית, תוך הימנעות מבועות אוויר.
  15. אוטם את הכיסוי עם צבע ציפורניים.
  16. לצלם תמונות פלואורסצנטיות במיקרוסקופ קונפוקלי עם אובייקטיב של 60x.
  17. כוון את המיקרוסקופ לוויזואליזציה ורכישת אותות פלואורסצנטיים.
  18. ראשית, למקד את הגרעינים בשקף המתאים לתאי דמה (לא נגועים) בהגדלה פי 60. כוון את מתח הסף והלייזר כך שלא יהיה אות פלואורסצנציה ברקע. בדוק את הנוגדן הבקר (IgG ארנב) ווודא שאין אות פלואורסצנציה ברקע.
  19. הדמיינו שקופיות של תאים נגועים ב-HEV מבלי לשנות את הפרמטרים הנ״ל. רכוש תמונות ברזולוציה של 1028 x 1028 פיקסלים.

5. בדיקת ניטרול הפחתת פלואורסצנציה (FRNT)

  1. ניטרול וירוסים וזיהום תאי Huh7
    1. פיצל את תאי Huh7 כפי שתואר בשלבים קודמים. הנח את הכיסוי בלוח עם 12 בארות וזרע 0.2 ×10 תאים 6 באר במדיום מלא של 1 מ"ל (DMEM + 10% FBS).
    2. למחרת, יש להכין דילול סדרתי של 10 פעמים של נוגדנים (אנטי-ORF2 ו-IgG ארנב) ב-SFM עם ריכוז התחלתי של 25 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדנים בשלבים של 1:10 עד דילולשל 1 :10 5. הנפח הסופי של הדילול צריך להיות 100 מיקרוליטר.
    3. הוסף 1.8 x 104 עותקים גנומיים המקבילים ל-g1-HEV המטוהר לכל דילול נוגדן.
    4. דגרו את תערובת הנוגדנים והווירוס ב-5% חממהCO 2 , 37°C למשך שעה אחת.
    5. הסר את צלחת 12 הבארות המכילה תאי Huh7 (שזרעו ביום הקודם) ושוטף את התאים ב-500 מיקרוליטר DPBS.
    6. הוסיפו את תערובת הנוגדנים-וירוס לתאים והניחו את הפלטה באינקובטור 5%CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    7. שטוף את התאים עם 500 מיקרוליטר DPBS.
    8. הוסיפו מדיום DMEM + 2% FBS לתאים ודגרו את הפלטה באינקובטורCO2 עם 5% בטמפרטורה של 37°C למשך 72 שעות.
    9. בצע IFA כפי שצוין בסעיף 4 (שלב 4.7 ואילך).
    10. לרכוש תמונות פלואורסצנטיות של 5 שדות אקראיים באמצעות אובייקטיב של 10x ב-1028 על 1028 פיקסלים.
    11. שמור את התמונות בפורמט JPEG/TIFF. כמת את הכתמים הפלואורסצנטיים באמצעות ניתוח ImageJ כפי שמתואר להלן.
    12. כדי לנתח את התמונה ב-ImageJ, יש להמיר את תמונת ה-RGB לתמונה של 8 ביט. לחץ על תמונה > להקליד > 8 ביט.
    13. כוון את סף התמונה. לחץ על תמונה > כוון > סף. בחר את רמת הסף התחתונה להיות 40 ואת רמת הסף העליונה ל-255.
    14. לספירה, בחרו ניתוח> ניתוח חלקיקים. בחר תוצאות תצוגה, נקה תוצאות, סיכום, החרגה בקצוות ו-ROIs מורכבים. בטל את הבחירה ב'הוסף למנהל', כולל חורים ו'שכבה'. לחץ על אוקיי, וספירת הנקודות הפלואורסצנטיות תופיע.
  2. הערכת NT50
    1. חשב את אחוז הנטרול של כל דילול באמצעות הנוסחה הבאה:
      % ניטרול= 100-[(((תאים חיוביים ל-ORF2 בדילול)⁄(תאים חיוביים ל-ORF2 בבקרת וירוס)) X 100]
    2. חשב NT50 באמצעות הנוסחה הבאה:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      כאשר D1 = דילול שבו אחוז הנטרול נמוך מ-50
      D2 = דילול שבו אחוז הנטרול מעל 50
      N1= % ניטרול מתחת ל-50
      N2= % ניטרול מעל 50
    3. חשב אנטי-לוג של Log10 NT50 באמצעות נוסחה:
      NT50= 10log10(NT50)
    4. צייר את הגרף של (ממוצע±SD) של כל השדות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום תאי Huh7 ב-g1-HEV ואפיון וירוס

ה-g1-HEV בודד מדגימת צואה באמצעות סדרת שלבים, כפי שמודגם (איור 1A). מספר עותק הגנום של ה-g1-HEV המטוהר הוערך על ידי RT-qPCR, ואחריו אחסון ב-80°- מעלות צלזיוס. לאישור זיהום וריפול, תאי Huh7 נדבקו ב-1.8 ×-10 עותקיםגנומיים של המאגר המטוהר g1-HEV במשך 72 שעות, ואחריהם RT-qPCR ו-IFA. רמה משמעותית של RNA g1-HEV זוהתה בתאים נגועים בהשוואה לתאים מזוהים (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT היא שיטה מבוססת צביעת חיסון להערכת פוטנציאל הנטרול של נוגדנים. הוא שימש להערכת ערכי NT50 עבור נוגדנים נגד מספר וירוסים, כולל נגיף דנגי (DENV), נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) ותסמונת הנשימה החריפה החמורה (SARS-CoV-2) ונגיף המוח היפני (JEV)23,24,25. בשיטה זו, הווירוס מודגר עם נוגדן בדיקה (או SERA), ואחריו זיהום של תאים מתורבתים בתערובת. תאים נגועים מורשים להיות מודגרים למשך זמן רב כדי ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק מהמועצה לסיוע מחקר בתעשיית הביוטכנולוגיה, משרד הביוטכנולוגיה, ממשלת הודו, שהוענק ל-MS, S ו-BN. המחקר במעבדת ה-MS נתמך על ידי מענק ליבה מהמכון למדעי וטכנולוגיית בריאות תרגומית. SA נתמכת על ידי משרת מדען מחקר פרויקט הממומן על ידי המועצה ההודית למחקר רפואי, ממשלת הודו. UB נתמכת על ידי מלגת מחקר בכירה ממחלקת הביוטכנולוגיה, ממשלת הודו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNACustom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells

Related Articles