פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת של שכבת ליפידים מישורית (planar lipid bilayer) מסוג Montal–Mueller ממוזערת עם הגברה אינטגרלית, לצורך ביצוע הקלטות יציבות של תעלה בודדת. השיטה מודגמת באמצעות הרכבה מחדש (reconstitution) של תעלת K2P סינתטית ומסומנת כדי לתקף את ביצועי המערכת.
מאמר שיטה
אלקטרופיזיולוגיה של תעלה בודדת באמצעות מערכת שכבת ליפידים מישורית ממוזערת מסוג Montal–Mueller להקלטה של תעלת K2P סינתטית
במאמר זה
סיכום
תקציר
שחזור תפקודי של תעלות יונים לתוך שכבות ליפידיות מישוריות (planar lipid bilayers) מספק אסטרטגיה לבחינת פעילות תעלות ברמת המולקולה הבודדת. עם זאת, מערכות bilayer קונבנציונליות מסוג Montal–Mueller דורשות בדרך כלל מערכי ניסוי מסורבלים, הרכבה ידנית של התא ונפחי הקלטה גדולים יחסית, אשר מגבירים את צריכת הריאגנטים ועשויים להוסיף מקורות נוספים של רעש חשמלי עקב חיווט מורחב וראשים חיצוניים (external headstages). כאן, אנו מציגים פלטפורמת bilayer ממוזערת ומוכנה לשימוש (BLMchipMM) המשולבת עם מגבר קומפקטי המאפשר הקלטות יציבות של תעלה בודדת עם צריכת ריאגנטים מופחתת ותפעול פשוט יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת זו לביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות של תעלה בודדת. באמצעות מערכת זו, שחזרנו תעלת K2P סינתטית (ancTREK1) והשתמשנו בה כחלבון בדיקה להוכחת היתכנות כדי לתקף את השחזור וההקלטה של תעלה בודדת. הקלטות של תעלה בודדת מראות קשר בין זרם למתח בתמיסות K+ סימטריות נטולות Mg2+, עם ערכי מוליכות העולים בקנה אחד עם אלו שדווחו עבור תעלות TREK1. השחזור המוצלח של תעלה דמוית K2P זו מדגים את התועלת של מערכת זו לניתוח תעלות בודדות בממברנות מלאכותיות.
מבוא
שחזור של תעלות יונים לתוך ממברנות שכבת ליפידים מלאכותיות, הידועות גם כממברנות ליפידיות שחורות (BLMs), הוא אחת הטכניקות המבוססות לביצוע אפיון אלקטרופיזיולוגי של תעלות יונים ברמת המולקולה הבודדת1. היתרונות של BLMs נובעים מהמבנה שלהן. למעשה, שכבת ליפידים מישורית (PLB) נוצרת בתוך נקב במשטח לא פולרי, המפרידה בין שני תמיסות נוזליות. כך, על ידי חיקוי של ממברנה ביולוגית, היא מאפשרת הקלטה של פעילות תעלות יונים תחת תנאים מבוקרים מאוד, כולל הרכב הליפידים בממברנה וריכוזי אלקטרוליטים או תרכובות כימיות, תוך שהיא נשארת נגישה משני הצדדים. נגישות זו מאפשרת גם להחדיר תעלות יונים באופן ישיר, למשל מתמיסה מיצלארית או באמצעות היתוך מונחה ליפוזומים2,3.
מערכת הממברנה המלאכותית הראשונה שתוארה נוצרה באמצעות טכניקת הצביעה4, שבה טיפה של ליפידים המומסים בממס אורגני לא נדיף נמרחת על פתח קטן באמצעות מברשת צבע. הוספת תמיסה מימית לשני צדי הפתח מובילה לאחר מכן ליצירה ספונטנית של דו-שכבה ליפידית. עם זאת, חיסרון משמעותי של שיטה זו הוא 잔שאיות של עקבות ממס, העלולים להשפיע על תכונות הממברנה. כדי להפחית את כמות הממס האורגני השארי בתוך דו-שכבות ליפידיות, פותחה שיטת הקיפול5, המאפשרת יצירה של BLMs "נטולי ממס". בגישה זו, תמיסת ליפידים בממס נדיף נפרסת על פני השטח של המים כדי ליצור שתי שכבות יחידות (monolayers), ובעל ידי העלאה הדרגתית של מפלס הפאזה המימית מעל הפתח, שכבות ליפידיות אלו מתקפלות מעל הפתח כדי ליצור דו-שכבה. עם זאת, למרות שה-BLM המתקבל מוגדר כנטול ממס, יצירה מוצלחת של הדו-שכבה דורשת טיפול מקדים של הפתח בשכבה דקה של ממס לא נדיף. הרכיב המרכזי הדרוש לניסויים אלו מורכב מתא הקלטה עם שני תאי מימיים (המכונים בדרך כלל cis ו-trans) המופרדים על ידי מחיצה ליפופילית עם פתח קטן (בקוטר של 50–250 µm) (איור 1). אלקטרודות כסף/כלוריד כסף (Ag/AgCl) מוכנסות לכל תא. כאשר הן טבולות בתמיסת האלקטרוליט, אלקטרודות אלו יוצרות את החיבור האלקטרוכימי בין הדו-שכבה הליפידית למכשיר ההקלטה. האחרון מורכב ממגבר voltage-clamp, המאפשר בקרה מדויקת של הפוטנציאל הטרנס-ממברנלי ומדידה סימולטנית של הזרמים היוניים העוברים דרך חלבונים יוצרי נקבים המשובצים בממברנה.
איור 1: סכימה של מערך אלקטרופיזיולוגיה של שכבת ליפידים מישורית (PLB). סכימה של הרכיבים החיוניים הנדרשים לניסויי PLB. תא ההקלטה מורכב משני תאים מימיים (cis ו-trans) המופרדים על ידי מחיצה ליפופילית המכילה פתח שבו נוצרת שכבת ליפידים. אלקטרודות כסף/כלוריד כסף (Ag/AgCl) טבולות בתמיסת האלקטרוליט בכל תא. אלקטרודה אחת מחילה גירויי מתח (למשל, גלי סינוס, ריבוע או משולש), בעוד שהשנייה, המחוברת להארקה, מחוברת לממיר זרם למתח המהופך זרם יוני לאות מתח פרופורציונלי. האות מוגבר, מסונן במידת הצורך, מומר לערכים דיגיטליים ומוקלט לצורך ניטור וניתוח בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
שיטות נוספות הוכשרו ליצירת BLMs. בין אלה, גישה נפוצה מורכבת מיצירת שכבות ליפידיות כפולות התלויות על קצה של פיפטת patch-clamp. בהתאם לכך, שיטת ה-tip-dip6 מאפשרת יצירה של שכבה ליפידית כפולה תלויה ללא ממס על פתח של מיקרופיפטת זכוכית בעלת קוטר של ~4 µm, וזאת על ידי טבילה חוזרת של הקצה דרך שכבה ליפידית אחת (monolayer) בממשק האוויר–מים, ובכך לכידת עלה בודד (leaflet) בכל מעבר. טכניקת ה-patch-clamp שימשה גם למדידות של תעלות בודדות בשכבות ליפידיות כפולות. לדוגמה, בשיטת ה-punch-out7, נעשה שימוש בפיפטת זכוכית בעלת קוטר שבין 10 ל-80 µm כדי לבצע patch לממברנה גדולה שנמרחה במקור על פתח בתא הקלטה. לחלופין, שיטת ה-liposome-patch כוללת שימוש בvezicle בגודל ננו עד מיקרו שנוצרה מראש כ-BLM ללא ממס8,9. בפרט, וזיקולות אונילמלאריות ענקיות (giant unilamellar vesicles) שימשו באופן נרחב להקלטות של תעלות בודדות באמצעות תצורות patch-clamp שונות, כולל מצבי cell-attached ו-excised patch10,11.
מספר פלטפורמות פותחו גם לצורך יצירה מקבילה ואוטומטית של שכבות דו-שכבתיות מרובות. גישה אחת כזו היא טכניקת שכבה דו-שכבתית בממשק טיפות (DIB)12, שבה טיפות מימיות מונחות בתוך תערובת של ליפידים וממס. בשיטה זו, מונו-שכבות של ליפידים מתרכבות באופן ספונטני סביב הטיפות, ויצירת השכבה הדו-שכבתית מתרחשת כאשר שתי טיפות באות במגע. במערכים מסוימים, ניתן ליצור DIBs על גבי הידרוגלים כדי לשפר את יציבות הממברנה13. גישה חלופית המבוססת על יצירת DIB בקצה של פיפטת זכוכית היא שיטת השכבה הדו-שכבתית בבועת מגע (CBB)14, שבה בועות מימיות מוחדרות לתוך פאזה של שמן באמצעות שתי מיקרו-פיפטות. בדומה לגישת ה-DIB, שכבה דו-שכבתית של ליפידים נוצרת באופן ספונטני כאשר שתי בועות מצופות ליפידים מובאות למגע. פלטפורמה נוספת מיוצגת על ידי מערכות BLM במערכים, המורכבות ממערכים של נקבים מוגדרים היטב במימדי מיקרו עד ננו, המסודרים בתבנית של רשת. במערכות אלו, ניתן ליצור שכבות דו-שכבתיות של ליפידים תלויים באופן ידני — באמצעות טכניקות צביעה או קיפול, או באמצעות קרע של וסיקולות ליפוזומיות15,16,17 — או באופן אוטומטי על ידי הזרקה רציפה של תמיסות ליפידים ובופר כאשר הן משולבות עם מבני ערוצים מיקרו-פלואידיים18,19.
אף שפותחו שיטות רבות ליצירת BLMs ללא ממסים, בעבודה זו אנו מתמקדים בשיטת הקיפול המיושמת בתוך פלטפורמה ממוזערת ואינטגרטיבית כדי לחקור התנהגות של ערוץ בודד של חלבוני ממברנה המוטמעים בשכבת ליפידים מלאכותית. הניסויים בוצעו באמצעות מערכת ה-Elements, המורכבת משני רכיבים: ה-Elements Nanopore Reader (מגבר eNPR) וה-BLMchipMM (איור 2A ו-איור 2B). הראשון הוא מגבר voltage-clamp קומפקטי בעל רעש נמוך המפשט את סביבת העבודה על ידי יצירת יחידה מלאה ועצמאית, ובכך מבטל את הצורך בהתקנים חיצוניים נוספים. ה-BLMchipMM היא מערכת ממוזערת ומורכבת מראש שתוכננה עבור טכניקת Montal–Mueller ומשמשת כממשק הניסויי. היא מורכבת מתא הקלטה שקוף העשוי פולימתילמתאקרילט (PMMA) המשולב עם לוח מעגלים מודפס (PCB), הכולל שני תושבתים שתוכננו להכיל חוטי Ag/AgCl המשמשים כאלקטרודות לחיבור ישיר למגבר. מבנה הליבה של התא מורכב ממחיצת פוליאימיד האטومة בין שני רכיבי PMMA שקופים. המחיצה בעובי 50 µm, למעט באזור מרכזי קטן (3.78 mm2), שבו העובי מופחת ל-25 µm כדי להקל על יצירת השכבה הכפולה. במרכזו של אזור דק זה, נוצרת מפתח מדורג באמצעות קידוח בלייזר, אשר משפר את היציבות המכנית של שכבת הליפידים20,21. ארבעה קטרי מפתח (50, 75, 100, ו-140 µm) זמינים, מה שמאפשר כוונון של קיבול הממברנה (טבלה 1). כל רכיב PMMA כולל חלל בצורת C בנפח של 110 µL, היוצר שני תאי נוזלים משני צידי מחיצת הפוליאימיד להחזקת תמיסת האלקטרוליט. שני תעלות נוזלים אלכסוניות קדוחות בכל בלוק PMMA בצדדים מנוגדים: תעלה אחת משמשת להחדרת אלקטרודת Ag/AgCl, בעוד שהשנייה מאפשרת התאמה ידנית של מפלס הבאפר בתוך המאגר באמצעות פיפטה.
איור 2: מערכת Elements Nanopore Reader ו-BLMchipMM משולבת. (A) תצלום המראה את ה-BLMchipMM מוכנס לתוך החריץ הייעודי של המגבר ב-Elements Nanopore Reader (eNPR). (B) ייצוג סכימטי של רכיבי ה-BLMchipMM, הכולל את תא ההקלטה העשוי פולימתילמתאקרילט (PMMA), את המחיצה (septum) מפוליאימיד המכילה את הפתח המיקרוסקופי, ואת לוח המעגלים המודפס (PCB) עם תושבות לאלקטרודות Ag/AgCl וחריץ ליישור התא. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| קוטר החור (µm) | 50 | 75 | 100 | 140 |
| עובי החור (µm) | 25 | 25 | 25 | 25 |
| קיבול ממברנה טיפוסי (pF) | 20–40 | 40–60 | 60–90 | 90–140 |
טבלה 1: מאפיינים של פורמטים זמינים של מפתח ה-BLMchipMM.קוטר החור, עובי המחיצה באזור המפתח, וערכי קיבול ממברנה טיפוסיים עבור מכשירי BLMchipMM עם מפתחים של 50, 75, 100 ו-140 µm. ערכי קיבול הממברנה מוצגים עבור bilayer-ים שנוצרו מליפידים מסוג 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
בדרך כלל, תאי הקלטה המשמשים במעבדות הם יחידות מתוכנתות באופן עצמאי (homemade) או מכשירים הזמינים מסחרית. במקרה הראשון, בניית המערכת כרוכה בהרכבת רכיבים שונים ובפיתוח שיטה מהימנה ליצירת הפתח במחיצה (septum), דבר שעלול להגביל את הנגישות עבור מעבדות רבות. גם כאשר נעשה שימוש במכשירים מסחריים, הם דורשים לעיתים קרובות אינטגרציה ידנית של רכיבים מרובים לפני כל ניסוי. לעומת זאת, ה-BLMchipMM מגיע מורכב מראש ואינו דורש פירוק בין ניסויים לצורך נהלי ניקיון שגרתיים. ניתן לשטוף ולהשתמש באותה יחידה עבור מספר ניסויים מבלי לפגוע באיכות יצירת הממברנה, בתנאי שהממסים שנעשה בהם שימוש תואמים לחומרי המכשיר. דבר זה מפחית שונות התלויה במשתמש וממזער את הסיכון לדליפות הקשור לאלמנטים של איטום ידני. השימוש באלקטרודות חוטי כסף חיצוניות, הניתנות להחלפה ולחידוש, מאריך עוד יותר את חיי השמישות של המערכת, במיוחד תחת תנאי ניסוי המאיצים את התכלת האלקטרודות.
יתרה מכך, התקנים המיוצרים באופן ביתי מתאפיינים לרוב בנפחי תאים גדולים, דבר המגדיל את כמות הרכיבים הביולוגיים והכימיים הנדרשים לניסויים. לעומת זאת, המיניאטוריזציה של ה-BLMchipMM מאפשרת מזעור של נפחי הניסוי, ובכך מפחיתה באופן משמעותי את צריכת הרכיבים, החלבונים ותרכובים אחרים. דבר זה הוא בעל יתרון מיוחד בעבודה עם חלבוני ממברנה שקשה לבטא או בעלי תנובה נמוכה, או כאשר העלות הגבוהה של סינתזת תרכובות הבדיקה מעלה את העלות הכוללת של הניסויים. חשוב לציין כי ה-BLMchipMM מאפשר יצירת שכבות דומיניות (bilayers) במינימום ממס ותומך בתצורות ממברנה אסימטריות, שבהן כל עלה (leaflet) יכול להיות מורכב מזני ליפידים שונים5,22, ובכך מקל על חקר תפקודי חלבוני ממברנה תחת תנאים מבוקרים.
באופן מסורתי, מדידות זרם מבוצעות באמצעות מגברים שתוכננו לניסויי patch-clamp, אשר דורשים לעיתים קרובות חיבור לממיר דיגיטלי (digitizer) נפרד לצורך רכישת נתונים ובקרה באמצעות ממשקים גרפיים. מערכות אלו אינן רק מגושמות ויקרות, אלא כרוכות לעיתים קרובות בהליכי הגדרה שאינם אינטואיטיביים עבור משתמשים שאינם מומחים. בנוסף, בשל גודלו של תא ההקלטה והתכנון של מגברים סטנדרטיים — שבדרך כלל חסרה בהם מיגון מובנה להגנה על כניסת ה-headstage מפני הפרעות אלקטרוסטטיות — השימוש בכלוב פאראדיי חיצוני הוא לרוב הכרחי. האיכות וההארקה של כלוב כזה עשויות להשפיע באופן משמעותי על ביצועי הרעש של המערכת. ה-BLMchipMM, כאשר הוא משמש עם מגבר משולב קומפקטי, מפשט תצורה זו על ידי צמצום הצורך ברכיבים חיצוניים. הדיגיטציה של האות מתבצעת בתוך המכשיר, ומארז המערכת מספק מיגון המפחית את הרגישות להפרעות אלקטרומגנטיות סביבתיות.
כדי להדגים את ישימותה של פלטפורמה זו, נעשה שימוש בתעלה מסוג K2P, ה-ancTREK1, שהיא חבר אבני (ancestral) של תת-משפחת ה-TREK שנגזרה באופן חישובי (איור משלים 1), כחלבון בדיקה לאימות של שחזור מוצלח והקלטה של תעלה בודדת. תעלות K2P יוצרות תעלות דליפת אשלגן דימריות המווסתות את פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה ואת העירור התאי, כאשר תעלות TREK מייצגות תת-משפחה מאופיינת היטב.
פרוטוקול
מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים, חומרים ממקור אנושי או חיות ניסוי. כתוצאה מכך, לא נדרש אישור אתי בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות.
1. הכנת מערך האלקטרופיזיולוגיה
- כיול המכשיר
מכיוון שהמערכת מוגדרת במפעל, כיול רשמי אינו נדרש, אך יש לוודא את תקינות פעולת המערכת לפני יצירת הממברנה.- מדדו את התנגדות הכניסה בתנאי מעגל פתוח (כלומר, ללא ה-BLMchipMM מוכנס). ההתנגדות הנמדדת צריכה להיות ≥1 TΩ, מה שמאשר את תקינות כניסת המגבר.
- אששו את תגובת המערכת באמצעות תא מודל המכיל נגד של 1 GΩ. ההתנגדות הנמדדת צריכה להיות 1 GΩ בסטייה של ±30%, בהתאם לטולרנס של הנגד המשולב.
- מדדו את רעש הבסיס בתנאי מעגל פתוח במתח קבוע (0 mV). רעש ה-RMS צריך להיות ≤300 fA בקצב דגימה של 10 kHz ורוחב פס של 5 kHz, מה שמאשר ביצועי מערכת עם רעש נמוך.
- הכנת אלקטרודות Ag/AgCl
- בשימוש ראשון, שטפו את חוטי הכסף באתנול ובמים מזוקקים פעמיים.
- עבור חוטים שהיו בשימוש קודם, השתמשו בנייר זכוכית בעל גרעין עדין במיוחד כדי להסיר את שכבת ה-Ag/AgCl הישנה מפני השטח של החוט, עד שפני השטח ייראו ככסף בהיר ואחיד עם ברק מתכתי נקי ללא שאריות נראות. לאחר מכן שטפו באתנול ובמים מזוקקים פעמיים.
- בצעו כלורציה לחלק הקצבי של חוטי הכסף על ידי השרייתם בנתרן היפוכלוריט (NaOCl) בריכוז 1%–5% (איור 3A) עד שיהפכו לאפור בהיר, בדרך כלל למשך 15–30 דקות. עקבו אחר החוטים שעברו כלורציה לאורך זמן כדי לזהות התדרדרות במהלך השימוש, המתבטאת בשינוי צבע, בסטיה של זרם הבסיס, או בשניהם.
הערה: ניתן לבצע כלורציה באמצעות אקונומיקה ביתית רגילה (1%–5% NaOCl).
זהירות: אין לבצע כלורציה לחוטים לאורך כל אורכם. השאירו את החלק הקצבי שנכנס לשקע ה-PCB ללא כלורציה כדי להבטיח חיבור חשמלי תקין.
זהירות: השקעים שעל ה-PCB מיועדים לחוטי כסף בקוטר של 0.5 mm. קוטרים אחרים עלולים שלא להתאים כראוי או להוביל לחיבורים לא יציבים.
- הרכבת ה-BLMchipMM
- הכניסו את החלק הקצבי שאינו שעבר כלורציה של שני חוטי הכסף לשקעי ה-PCB. השתמשו בפינצטה במידת הצורך כדי למקם אותם נכונה (איור 3B).
- מקמו את הקצוות שעברו כלורציה של החוטים בתוך הערוצים הפלואידיים שנקדחו ברכיב ה-PMMA (איור 3C).
- סובבו בעדינות את ה-BLMchipMM והרכיבו אותו על ה-PCB על ידי התאמת השן התחתונה של תא ההקלטה מ-PMMA לחריץ הייעודי (איור 3D).
- בדקו את מיקום החוטים וודאו שהם מגיעים לקצה הערוצים הפלואידיים. במידת הצורך, דחפו בעדינות את החוטים עד שקצותיהם יופיעו בתחתית התאים (איור 3E).
זהירות: מקמו את החוטים קרוב ככל האפשר לרכיב ה-PMMA. כיפוף מוגזב עלול לגרום למגע עם מכסה המגבר, מה שיוביל לקצר חשמלי ורוויית אות.
- הכנת ליפידים ותמיסת הקלטה
- הכינו 100 µL של תמיסת הקסדקן 1% (v/v) ב-100% n-hexane לטיפול מקדמי של פתח הספטום. אחסנו תמיסה זו ב-−20°C למשך עד שבוע.
- השביו 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) ליפידים ב-100% n-pentane לריכוז סופי של 15 mg/mL. אחסנו תמיסה זו ב-−20°C למשך עד 24 שעות.
- הכינו את תמיסת ההקלטה האלקטרוליטית בטמפרטורת החדר (RT; 20°C–25°C) על ידי ערבוב של 3 mL של תמיסת מקור KCl בריכוז 1 M עם 150 µL של תמיסת מקור 1 M של 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (pH 7.4 המותאם עם KOH באמצעות מד pH). הוסיפו מים מזוקקים פעמיים עד לנפח סופי של 15 mL. אחסנו את התמיסה ב-4°C למשך עד שבוע (טבלה 2).
איור 3הרכבת התקן ה-BLMchipMM. (A) כלורור של חוטי Ag באמצעות השריה במלבין. (B) הכנסת חוטי Ag לשקעי ה-PCB. (C) מיקום של חוטי Ag בתוך תעלים מיקרופלואידיים. (ד׳(הנחת תא ההקלטה על גבי ה-PCB.)ה) אימות מיקום תקין של האלקטרודות בתוך התעלות הפלואידיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| ריאגנט | ריכוז סופי | נפח |
| מים מזוקקים פעמיים | — | להשלים ל-15 mL |
| Potassium chloride (KCl) (1 M) | 200 mM | 3 mL |
| HEPES pH 7.4 (KOH) (1 M) | 10 mM | 150 µL |
טבלה 2: תמיסת רישום אלקטרוליטית. הרכב התמיסה האלקטרוליטית המשמשת לרישומים של PLB, כולל ריכוזי ריאגנטים ונפחי הכנה. הנפח הסופי מותאם ל-15 mL באמצעות מים מזוקקים פעמיים. יש לסנן את תמיסת הרישום באמצעות מסנן מזרק של 0.2 µm לפני השימוש.
הערה: סננו את תמיסת ההקלטה באמצעות מסנן מזרק של 0.2 µm לפני השימוש. ליפידים מסוג DPhPC עשויים להיות מסופקים כאבקה יבשה או מומסים בכלורופורם. אחסנו את שתי הצורות בטמפרטורה של −20°C בבקבוקוני זכוכית אטומים תחת גז אינרטי כדי למנוע חמצון. אפשרו לאבקה היבשה להגיע לשיווי משקל בטמפרטורת החדר (RT) לפני הפתיחה. הכינו תמיסות טריות מאבקה יבשה והשתמשו בהן בתוך 24 h. במידה והשתמשתם במלאי בכלורופורם, האדפו את הממס לחלוטין תחת חנקן לפני השספנסיה מחדש, שכן שאריות של כלורופורם עלולות לערער את יציבות הממברנה.
2. יצירת PLB בשיטת Montal–Mueller
השלבים הבאים מתארים יצירה של ממברנה מלאכותית באמצעות שיטת הקיפול, המכונה גם טכניקת Montal–Mueller5 (איור 4). גישה זו כוללת טיפול מקדים בפתח המחיצה (septum aperture) באמצעות שכבה דקה של 1% (v/v) hexadecane ב-n-hexane, השקעת תמיסת ליפידים ליצירת מונו-שכבות בממשק האוויר-מים, וקיפול של המונו-שכבות מעל הפתח ככל שגובה תמיסת האלקטרוליט מועלה באופן רצף בתאי התא.
איור 4: יצירת PLBs באמצעות שיטת Montal–Mueller. (A>) טיפול מקדים של הפתח ב-1% hexadecane ב-n-hexane ומילוי התאים עד לגובה הפתח. (B>) יצירת שכבות מונומולקולריות של ליפידים בממשק אוויר-מים. (C> ו-D>) העלאה הדרגתית של מפלס הבופר בכל תא, המובילה לקיפול השכבות המונומולקולריות וליצירת דו-שכבה ליפידית נטולת ממס על פני הפתח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
- יצירת הממברנה
- בצעו טיפול מקדים בפתח המחיצה (septum aperture) באמצעות תמיסת hexadecane בריכוז 1% (v/v) ב-n-hexane בעזרת קצה פ pipette. מרחו כ-2 µL לכל צד (איור 4A).
- המתינו עד שהממס יתאדה במשך 5 דקות בטמפרטורה של 23°C–25°C ובלחות יחСית של 45%–50%.
- החדירו את ה-BLMchipMM המורכב אל המגבר.
- חברו את המגבר למחשב באמצעות כבל USB ופתחו את תוכנת הרכישה.
- הגדירו את טווח הזרם ל-2 nA והפעילו את כלי הערכת ה-RC כדי לנטר את קיבול הממברנה ואת התנגדותה.
הערה: הגדרות הערכת ה-RC מוגדרות כברירת מחדל אך ניתן להתאימן במידת הצורך. - מלאו כל תא ב-30 ± 2 µL של תמיסת הקלטה עד לשוליים התחתונים של הפתח (איור 4A).
זהירות: אין לאפשר לתמיסת ההקלטה להרטיב את האזור שסביב הפתח. - פזרו 2.5 ± 0.1 µL של תמיסת ליפידים בטיפות על פני השטח של הפאזה המימית בכל תא (איור 4B).
- המתינו עד שהממס יתאדה במשך 2 דקות.
- הניחו קצה של pipette בתחתית של תא אחד בזווית של כ-90° והוסיפו 80 ± 2 µL של תמיסת הקלטה. חזרו על הפעולה עבור התא השני (איור 4C ו-איור 4D).
הערה: זמני התאיידות הממס מתייחסים לתנאים של 23°C–25°C, אוויר סטטי ולחות יחСית של 45%–50%. - סגרו את מכסה כלוב פאראדיי ונטרו את אות הזרם. ערכי התנגדות ממברנה מעל 200 GΩ מעידים על יצירה מוצלחת של השכבה הכפולה ועל שלמות טובה של הממברנה.
הערה: יצירה מוצלחת של הממברנה באה לידי ביטוי באות זרם של גל מרובע המתנודד סביב אפס, עם אמפליטודה הפרופורציונלית לקיבול הממברנה (איור 5A).
איור 5: ניטור היווצרות הממברנה באמצעות ממשק תוכנת הרכישה. (A) עקב מייצג המראה היווצרות מוצלחת של ממברנה. גל מתח משולש (100 mV שיא-לשיא, 10 Hz) מייצר זרם קיבולי בצורת גל ריבועי, הפרופורציונלי לקיבול הממברנה (~45 pF). (B) עקב מייצג המעיד על היעדר היווצרות ממברנה, המאופיין ברוויה של אות הזרם. (C) אות קיבולי המתאים לקיבול סטטי כאשר השכבה הכפולה אינה נוצרת, למשל כאשר הפתח חשוף. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
הערה: אות המקפיץ בין גבולות טווח הזרם מעיד על כשל בממברנה (איור 5B).
הערה: רעש ה-RMS עולה עם קיבול הממברנה ולפיכך עם גודל הפתח. טווחי רעש טיפוסיים שנמדדו בתנאי מתח קבוע (0 mV), בקצב דגימה של 5 kHz ורוחב פס של 2.5 kHz, הם: 0.48–2.00 pA (50 µm); 0.74–2.62 pA (75 µm); 1.00–3.52 pA (100 µm); ו-1.59–5.27 pA (140 µm).
הערה: הורדה והעלאה של מפלס התמיסה המגבה (buffer) במדור אחד עשויות לקדם את היווצרות הממברנה אם הניסיונות הראשוניים נכשלו.
הערה: במידת הצורך, יש להפעיל בועת אוויר מעל הפתח למשך ~5 s באמצעות טיפ של פיפט כדי להקל על היווצרות השכבה הכפולה.
הערה: הורדת מפלס התמימות (buffer) מתחת למפתח או השארת בועת אוויר עלולים ליצור אות התואם לקבלות שגויה (איור 5C). אם הפלט דומה ל-איור 5B, ייתכן שהטיפול המקדים לא היה יעיל. יש להחיל מחדש את תמיסת הטיפול המקדים ואת הליפידים, או לנקות את המכשיר ולחזור על הפרוצדורה.
אזהרה: בצעו פיצוי להס desplazamiento מתח רק בהיעדרה של ממбраנה. אם קיימת ממбраנה, קרעו אותה באמצעות פונקציית ה-ZAP לפני ביצוע הפיצוי.
הערה: ניתן לבצע את הניסויים על שולחן מעבדה סטנדרטי; עם זאת, ניתן להשתמש בשולחן נגד רעידות במידת הצורך.
3. ניקוי ה-BLMchipMM
- הסר את תא ההקלטה מה-PCB.
- שטוף את שני התאים ואת תעלות הזרימה ב-100% isopropyl alcohol (IPA).
זהירות: אין לחרוג מדקת חשיפה אחת ל-IPA.
זהירות: אין להשתמש באצטון או ב-100% ethanol, כיוון שמאותם ממסים עלולים לפגוע בחומר האיטום של התא.
הערה: ודא את התאימות של ממסים נוספים ל-PMMA לפני השימוש. - שטוף היטב במים מזוקקים פעמיים (double-distilled water).
- ייבש את תא ההקלטה לחלוטין באמצעות זרם עדין של אוויר דחוס, עד שלא יישארו טיפות מים נראות לעין.
הערה: בחן את התא תחת זככית מגדלת מוארת כדי לוודא שלא נותרו שכבות שומניות.
הערה: ודא שהתא נקי ויבש לחלוטין לפני תחילת ניסוי חדש.
4. ביטוי וניקוי של תעלת היונים הסינתטית (ancTREK1)
- הכנת קונסטרוקט הביטוי
השלבים הבאים מתארים אסטרטגיות שיクלון, ביטוי הטרולוגי בתאי Freestyle-293F וניקוי של חלבון ancTREK1.
בנה את וקטור הביטוי באמצעות הגברה ב-PCR, עיכול באנזימי הגבלה, ליגציה והחדרה (טרנספורמציה) לתאי Escherichia coli בעלי כשירות כימית23,24בטא את רצף ה-ancTREK1 (איור משלים 1) באמצעות וקטור יונקים המכיל תג GFP בקצה ה-C ותג His₈ תג, המאפשר זיהוי מבוסס פלואורסצנציה25,26 וזיכוך בזיקה בשני שלבים באמצעות ניקל–ניטרילוטריאצטית חומצה (Ni2⁺(שרף NTA-)27,28,29 שבשלב הבא נעשה שימוש בשרף נוגדוני-ננו (nanobody resin) נגד GFP30,31,32. - הגברה של DNA של ancTREK1 באמצעות PCR
- דללו את הפריימרים ל-PCR ואת תבנית ה-DNA לריכוזים סופיים של 10 µM ו-~20 ננוגרם/µL באמצעות מים סטריליים מזוקקים פעמיים.
- יש להמיס את כל הרכיבים על קרח.
- הכינו 50 µL תגובת PCR המכילה 10 µL מתוך 5× בופר, 2.5 µL של כל אחד 10 µM פריימר, 2 µL של תבנית DNA, 1 µL של 10 mM dNTPs, 0.5 µL של DNA polymerase בעל נאמנות גבוהה (high-fidelity), ומים מזוקקים פעמיים סטריליים להשלמת הנפח (טבלה 3ערבב בעדינות וסבב קצר במערבל צנטריפוגלי.
- בצע PCR בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית ב- 98°C למשך 3 דקות; 30 מחזורים של 98°C למשך 30 שניות, 68°C במשך 30 שניות, ו- 72°C למשך 30 שניות; הארכה סופית ב- 72°C במשך 3 דקות (טבלה 4).
- הרץ את תוצר ה-PCR על ג'ל אגרוזה בריכוז 1% (משקל/נפח) ב-1× בבופר TAE במתח של 60 V למשך 90 דקות, וגזור את הפס המתאים.
הערה: טהרו את תוצרי ה-PCR באמצעות שיטת מיצוי מג'ל (gel extraction), מדדו את ריכוז ה-DNA באורך גל של 260 ננומטר, ואחסנו את תוצרי ה-PCR המטוהרים בטמפרטורה של −20°C במידת הצורך.
- ביצוע עיכול רסטריקציה
- הכינו תגובות עיכול המכילות 2 µg של תוצר PCR ו- 2 µg של DNA פלסמי במבחנות נפרדות. הוסף 5 µL מתוך 10× בופר, 0.5 µL EcoRI ו- 0.5 µL אנזימי הגבלה NotI, והבאה ל- 50 µL עם מים מזוקקים פעמיים (טבלה 5).
- ערבבו בעדינות והדגרירו ב- 37°C במשך 3 שעות.
- בצעו אינאקטיבציה תרמית של אנזימים ב- 65°C למשך 20 דקות.
- הוסף 1 µL פוספטאז אלקלי (alkaline phosphatase) לעיכול הווקטור ולהדגרה ב- 37°C למשך שעה אחת.
- הריצו את תוצרי העיכול על ג'ל אגרוז בריכוז 1% וחלצו את הפסים הרצויים.
הערה: טהרו מקטעי DNA באמצעות שיטות טיהור מתאימות ואחסנו את ה-DNA המטוהר בטמפרטורה של −20°C במידת הצורך.
- ביצוע ליגציה וטרנספורמציה
- הכן/כיני 20 µL תגובת ליגציה המכילה וקטור ואינסרט (יחס מולרי של 3:1), 2 µL 10× בופר ליגאז, ו- 1 µL אנזים ליגאז (טבלה 6).
- דגרו בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת.
- הפשיר תאי E. coli בעלי כשירות כימית (competent cells) על קרח.
- הוסף 5 µL של תערובת הליגציה ל- 50 µL של תאים ולהדגיר בקרח למשך 20 דקות.
- הלם תרמי ב- 42°C למשך דקה אחת, ולאחר מכן להחזיר לקרח למשך 2 דקות.
- הוסף 450 µL מצע LB והדגרה ב- 37°C עם ניעור למשך שעה אחת.
- סבב בצנטריפוגה במהירות של 3,000 × במשך דקה אחת, ושנית את המשקע ב- 50 µL.
- זריעה על אגר סלקטיבי ודגירה למשך לילה ב- 37°C.
הערה: יש לאשר את הצלחת השבט באמצעות ריצוף.
- טרנספקציית תאי HEK293F
- זריעה של 250 מ"ל תאי 293F בריכוז 0.5 × 106 תאים/מ"ל במצע תליה נטול סרום והדגירה ב- 37°C עם 6% CO₂.
- הכן 250 µg של DNA בנפח סופי של 3 מ"ל של מצע עם ריכוז סרום מופחת.
- הכן 750 µg של פוליאתילן-אימין (PEI) במים בריכוז של 1 מג'/מ"ל, כוון את ה-pH ל-6.9–7.1 באמצעות NaOH, סנן את התמיסה באמצעות פילטר סטרילי, והשלם את הנפח הסופי ל-3 מ"ל באמצעות מצע עם סרום מופחת.
- שלבו את תמיסאות ה-DNA וה-PEI, ערבבו בעדינות, והדגרימו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הוסיפו את התערובת לתאים באופן מדורג (טיפה אחר טיפה).
- הוסיפו נתרבוטיראט (sodium butyrate) לריכוז סופי של 10 mM לאחר 4 שעות.
- קצור את התאים לאחר 48 שעות באמצעות סנטריפוגציה ב-500 × ב-g למשך 15 דקות.
- שמרו את משקעי התאים ב-−80°C.
- המסת חלבוני ממברנה
- הפשיר על קרח משקעי תאים מ-100 מ"ל של תרבית HEK293.
- שחזר את משקע התאים (cell pellet) בבופר ליזיס ביחס של 1:10 (משקל/נפח) (טבלה 7).
הוסיפו דטרגנט עד לריכוזים סופיים של 1% n-dodecyl-β-D-מלטוסיד (DDM) ו-0.1% כולסטריל המיסוסינאט (CHS). - דגרו עם סיבוב ב- 4°C למשך שעתיים.
- סבב בצנטריפוגה במהירות של 100,000 × g למשך שעה אחת ב- 4°C.
- אסוף את העלייה.
זהירות: בצע את כל השלבים ב- 4°C תוך שימוש בתמיספי ריכוז (בופרים) שקוללו מראש.
- בצע טיהור באמצעות IMAC
- מארז 500 µL של Ni2⁺שרף NTA לתוך עמודת כבידה.
- השג את שיווי המשקל של השרף באמצעות שני נפחי עמודה (CVs) של בופר שיווי משקל (טבלה 8).
- העמס את הדגימה והדגר עם ערבוב עדין במהירות של 10 rpm ו- 4°C למשך 3 שעות.
- הציבו את העמודה בצורה אנכית ואספו את הנוזל שעבר דרכה (flowthrough) באמצעות זרימה בכבידה.
- שטפו את שרף המטריצה (resin) עם 10 נפחי עמודה (CVs) של בופר שטיפה המכיל 30 mM imidazole.
- בצע אלוציה של החלבון באמצעות 10 נפחי עמודה (CVs) של בופר אלוציה המכיל 300 mM imidazole.
הערה: נתוח את הפראקציות באמצעות SDS-PAGE (איור 6). שמרו את פראקציות ה-flowthrough והשטיפה לצורך אנליזה. אחסנו את החלבון ב- 4°C במידת הצורך, למשך הלילה
- בצע טיהור באמצעות נוגדן נגד GFP
- ארוז 1 מ"ל של שרף anti-GFP בעמודת כבידה.
- השג את שיווי המשקל של שרף הניקוי באמצעות 2 נפחי עמודה (CVs) של בופר 1 (טבלה 9העבירו את האלוואט (eluate) מה-IMAC והדגירו עם ערבוב עדין במהירות של 10 סבבים לדקה (rpm) ו- 4°C למשך 3 שעות.
- מקמו את העמודה באופן אנכי ואספו את התסנן (flowthrough) באמצעות זרימה בכבידה.
- שטוף את השרף באופן רציף ב-10 נפחי עמודה (CVs) של באפר 1, 10 נפחי עמודה של באפר 2 ו-10 נפחי עמודה של באפר 1.
- דללו את הפרוטאז HRV-3C ב-2 מ"ל של Buffer 1 ביחס של 1:50 בין הפרוטאז לחלבון.
- הוסיפו לשרף את Buffer 1 בתוספת פרוטאז HRV-3C, ערבבו בעדינות והדגירו למשך לילה ב- 4°C במצב סטטי אנכי.
- אספו את החלבון המנוקה (cleaved protein) מתוך פראקציית האלוציה.
- רכז את הדגימה באמצעות מרכז צנטריפוגי עם סף חיתוך (cutoff) של 50 kDa במהירות של 3,000 × ג' ו- 4°C עד לנפח סופי של בערך 500 µL הושג.
הערה: יש לנתח את הפראקציות באמצעות SDS-PAGE (איור 7). יש לתing the protein באופן מחזורי במהלך הריכוז כדי למנוע אגרגציה. יש לאחסן את החלבון המטוהר בטמפרטורה של −80°C לאחר הקפאה מהירה. בערך 60 µg ניתן להפיק חלבון מ-100 מ"ל תרבית.
איור 6: טיהור של ancTREK1 באמצעות כרומטוגרפיית זיקה למיוני מתכת מקובעים (IMAC). ניתוח של פראקציות אלוציה מ-IMAC באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם דטרגנט סודיום דודציל סולפט (SDS-PAGE) וגילוי פלואורסצנטי. נתיב M: סממן למשקל מולקולרי. נתיב a: פראקציית אלוציה מ-IMAC המראה את ancTREK1 מסומן בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (חץ צהוב). GFP חופשי הנובע מאוטוקליבג' (autocleavage) מסומן ב-(*eGFP). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: טיהור של ancTREK1 באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של נוגדן ננו (nanobody) נגד GFP. ניתוח SDS-PAGE של פראקציות ששטפו, צבועות ב-Coomassie Blue. נתיב M: סמן משקל מולקולרי. נתיב a: פראקציית שטיפה של anti-GFP המראה נוכחות של פרוטאוז 3C. נתיב b: ancTREK1 מטוהר לאחר ריכוז. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ריאגנט | נפח לתגובה של 50 µL | ריכוז סופי |
| מים מזוקקים פעמיים | להשלים עד 50 µL | — |
| 5× PhusionTM GC buffer | 10 µL | 1× |
| dNTPs (10 mM כל אחד) | 1 µL | 200 µM כל אחד |
| פריימר קדמי (10 µM) | 2.5 µL | 0.5 µM |
| פריימר אחורי (10 µM) | 2.5 µL | 0.5 µM |
| DNA תבנית (20 ng/µL) | 2 µL | 0.8 ng/µL |
| PhusionTM High-Fidelity DNA polymerase | 0.5 µL | 0.02 U/µL |
טבלה 3: הגדרת תגובת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) להגברה של ancTREK1. הרכב ריאגנטים, נפחים וריכוזים סופיים ששימשו להגברת PCR של רצף ה-DNA של ancTREK1 באמצעות מערכת DNA polymerase בעלת נאמנות גבוהה (high-fidelity).
| שלב | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| דנטורציה ראשונית | 98°C | 3 min | 1 |
| דנטורציה | 98°C | 30 s | 30 |
| היברידיזציה (Annealing) | 68°C | 30 s | 30 |
| הארכה | 72°C | 30 s | 30 |
| הארכה סופית | 72°C | 3 min | 1 |
| שימור | 12°C | שימור | — |
טבלה 4: תנאי מחזורי PCR להגברה של ancTREK1. פרמטרי מחזור תרמי ששימשו להגברת רצף ה-DNA של ancTREK1, כולל שלבי דנטורציה, אינוילציה (annealing), הארכה והארכה סופית.
| רכיב | עיכול המקטע (50 µL) | עיכול ודה-פוספורילציה של וקטור (50 µL) |
| מים מזוקקים כפולים (ddH2O)₂O | אל 50 µL | אל 50 µL |
| 10× בופר אדום של ANZA | 5 µL | 5 µL |
| דנ"א | תוצר PCR של ancTREK1 (2 µg) | DNA של וקטור pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 (2 µg) |
| אנזה™ EcoRI | 0.5 µL | 0.5 µL |
| Anza™ NotI | 0.5 µL | 0.5 µL |
| אנזה™ אלקלין פוספטאז | — | 1 µL |
טבלה 5: עיכול של המקטע המוכנס (insert) והווקטור באמצעות אנזימי הגבלה עבור שיבוט של ancTREK1. תנאי תגובה לעיכול של תוצר ה-PCR של ancTREK1 ושל ווקטור הביטוי באמצעות האנזימים EcoRI ו-NotI. עיכול הווקטור כולל שלב דה-פוספורילציה נוסף באמצעות פוספטאז אלקלי למניעת ליוגציה עצמית.
| רכיב | כמות (20 µL תגובה) |
| מים מזוקקים כפולים (ddH2O)₂O | אל 20 µL |
| 10× בופר T4 DNA Ligase | 2 µL |
| DNA מוחדר של ancTREK1 (843 bp) | 10 ng |
| DNA של וקטור pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 (7673 bp) | 30 ng |
| T4 DNA Ligase | 1 µL |
טבלה 6: תנאי ליגציה של וקטור-מקטע עבור שיבוט ancTREK1. תערובת תגובה עבור ליגציה של מקטע ancTREK1 אל תוך וקטור הביטוי pEG BacMam ביחס מולרי של 1:3 באמצעות T4 DNA ligase.
| רכיב | ריכוז סופי | כמות (עד 5 מ"ל) |
| מים מזוקקים כפולים (ddH2O)₂O | — | עד 5 מ"ל |
| KCl (1 M) | 200 mM | 1 מ"ל |
| Tris-HCl pH 8 (1 M) | 20 mM | 100 µL |
| MgCl₂₂ (100 mM) | 1 mM | 50 µL |
| מעכב הפרוטאז PMSF (100 mM) | 1 mM | 50 µL |
| מעכב הפרוטיאז Leupeptin (1 mg/mL) | 1 µg/mL | 5 µL |
| מעכב הפרוטאוז אפרוטינין (1 מג/מ"ל) | 1 µg/mL | 5 µL |
| מעכב הפרוטאז Pepstatin A (1 mg/mL) | 1 µg/mL | 5 µL |
| DNase I (50 mg/mL) | 25 µg/mL | 2.5 µL |
| n-דודציל-β-D-maltoside (DDM, 10%) | 1% | 500 µL |
| כולסטריל המיסוקסינאט (CHS, 2%) | 0.10% | 250 µL |
טבלה 7: הרכב של תמיסת ליזיס לחילוץ חלבון ממברנה. פורמולציה של תמיסת ליזיס המשמשת להמסה של חלבונים ממברנתיים, הכוללת מלחים, חומרי חיץ, מעכבי פרוטאז, נוקלאז וחומרי שטח. הערה: יש להכין את התמיסות טרי לפני השימוש.
| בופר שיווי משקל (נפח כולל 10 mL) | ||
| מרכיב | ריכוז סופי | כמות |
| ddH₂O | — | עד ל-10 mL |
| KCl (1 M) | 200 mM | 2 mL |
| Tris-HCl pH 8 (1 M) | 20 mM | 200 µL |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%) | 0.05% | 50 µL |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%) | 0.01% | 50 µL |
| בופר שטיפה (נפח כולל 10 mL) | ||
| מרכיב | ריכוז סופי | כמות |
| ddH₂O | — | עד ל-10 mL |
| KCl (1 M) | 200 mM | 2 mL |
| Tris-HCl pH 8 (1 M) | 20 mM | 200 µL |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%) | 0.05% | 50 µL |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%) | 0.01% | 50 µL |
| Imidazole pH 8 (5 M) | 30 mM | 60 µL |
| בופר אלוציה (נפח כולל 10 mL) | ||
| מרכיב | ריכוז סופי | כמות |
| ddH₂O | — | עד ל-10 mL |
| KCl (1 M) | 200 mM | 2 mL |
| Tris-HCl pH 8 (1 M) | 20 mM | 200 µL |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%) | 0.05% | 50 µL |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%) | 0.01% | 50 µL |
| Imidazole pH 8 (5 M) | 300 mM | 600 µL |
טבלה 8: הרכבי באפרי IMAC לניקוי ancTREK1. פורמולציות של באפרי שיווי משקל, שטיפה ואלוציה ששימשו לניקוי ancTREK1 באמצעות כרומטוגרפיית זיקה למטען מתכתי נייד. הערה: ניתן לשמור את התמיסות בטמפרטורה של 4°C למשך שישה חודשים.
| בופר 1 (נפח כולל 10 מ"ל) | ||
| רכיב | ריכוז סופי | כמות |
| מים מזוקקים כפולים (ddH2O)₂O | — | ל-10 מ"ל |
| KCl (1 M) | 200 mM | 2 מ"ל |
| Tris-HCl pH 8 (1 M) | 20 mM | 200 µL |
| n-דודציל-β-D-מלטוסיד (DDM, 10%) | 0.05% | 50 µL |
| כולסטריל המיסוקצינאט (CHS, 2%) | 0.01% | 50 µL |
| בופר 2 (נפח כולל של 10 מ"ל) | ||
| רכיב | ריכוז סופי | כמות |
| מים מזוקקים כפולים₂O | — | ל-10 מ"ל |
| KCl (1 M) | 500 mM | 5 מ"ל |
| Tris-HCl pH 8 (1 M) | 20 mM | 200 µL |
| n-דודציל-β-D-מלטוזיד (DDM, 10%) | 0.05% | 50 µL |
| כולסטריל המיסוצינאט (CHS, 2%) | 0.01% | 50 µL |
טבלה 9: הרכבי באפרים לכרומטוגרפיית זיקה של נוגדן-ננו anti-GFP. פורמולציות של באפרים המשמשים לניקוי של ancTREK1 באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של נוגדן-ננו anti-GFP. הערה: ניתן לשמור את התמיסות בטמפרטורה של 4°C למשך עד שישה חודשים.
5. תיעוד פעילות תעלות יונים
- הערכת איכות הממברנה
- סגרו את מכסה כלוב פאראדיי.
- הפעילו גל מתח משולש (100 mV, 10 Hz) כדי להעריך את קיבול הממברנה.
- הפעילו מדרגות מתח (במרווחים של ±20 mV עד ±200 mV) כדי להעריך את התנגדות הממברנה.
- נטרו את ערכי הזרם והרעש.
הערה: השתמשו בקצב דגימה של 5 kHz ובסינון מעבר נמוך של 2.5 kHz, אלא אם נדרש אחרת.
- הקלטת פעילות ancTREK1
- דללו את חלבון ancTREK1 בתמיסת ההקלטה לריכוז של ~2 µg/mL.
הערה: במהלך הדילול, בצעו דילולוים ביניים ב-Buffer 1 לפי הצורך, כדי לשמור על ריכוז הדטרגנט מעל ריכוז המיסלה הקריטי (CMC) לפני הדילול הסופי לתמיסת ההקלטה. - הוסיפו 1 µL של תמיסת חלבון מדוללת לתא ה-cis סמוך לפתח המחיצה.
הערה: פוטנציאל הממברנה מוגדר כ-Vcis − Vtrans. אוריינטציית התעלות לא נקבעה באופן ישיר במחקר זה; לפיכך, ההקלטות מתוארות ביחס לפולריות המתח המופעל ולא לפי צד הממברנה שיוחסה להן. - הפעילו מדרגות מתח במרווחים של ±20 mV עד ±120 mV.
- נטרו אירועי השחלה של תעלות.
הערה: השחלת תעלות מסומנת על ידי מעברי זרם בדידוקים בין מצבים סגורים ופתוחים. אם לא התרחשה השחלה, הוסיפו חלבון נוסף או צרו מחדש את הממברנה. אם הושחלו תעלות מרובות, קרעו את הממברנה והפחיתו את ריכוז החלבון.
- דללו את חלבון ancTREK1 בתמיסת ההקלטה לריכוז של ~2 µg/mL.
תוצאות
מאפייני זרם-מתח (I–V) של ממברנות PLB
הטבע ההידרופובי האינהרנטי של ממברנות דו-שכבתיות הופך אותן לבלתי חדירות למינים טעונים. עם זאת, יישום של שדה חשמלי חיצוני יכול להשרות היווצרות של נקבים זמניים בגודל ננומטרי, ובכך להשפיע על חדירות הממברנה ועל המוליכות שלה33. כדי להעריך את האיכות של דו-שכבות מלאכותיות שנוצרו מליפידים מסוג 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, נבחנו קיבול הממברנה, ההתנגדות ומאפייני I–V בהעדר חלבונים מושבצים. סדרה של מדרגות מתח בטווח שבין ±20 ל-±200 mV (במרווחים של ±20 mV) הופעלה, והזרמים הטרנס-ממברנליים שהתקבלו נרשמו. הנתונים נדגמו בתדר של 5 kHz ועברו סינון מעביר-נמוך ב-2.5 kHz.
קיבוליות הממברנה (Cm) וההתנגדות של הממברנה (Rm) מייצגות פרמטרים מרכזיים להערכת איכות השכבה הכפולה. ניתן לתאר את ה-PLB באמצעות מעגל שווה-ערך של נגד-קבל (RC), שבו הממברנה מתנהגת כקבל במקביל לנגד34. הרכיב הקיבולי משקף את יכולתה של הממברנה לאגור מטען, בעוד שהרכיב ההתנגדותי משקף את חדירות היונים. הפעלת גל מתח משולש יוצרת תגובת זרם קיבולי בצורת ריבוע, אשר פרופורציונלית לקיבוליות הממברנה על פי:
(1)
כאן, Cm הוא קיבול הממברנה, V הוא המתח המוחל, ו-t הוא הזמן. לאחר היווצרות הממברנה, ערכי הקיבול עשויים לעלות עם הזמן עקב התדקקות הדרגתית של השכבה הכפולה35. בהתחשב בממברנה כקבל לוחות מקבילים, הקיבול קשור לשטח הממברנה ולעוביה לפי:
(2)
כאן, εlipids הוא קבוע הדיאלקטריות של ליבת הליפידים (~2), ε0 היא המבצעיות של הוואקום, A הוא שטח הממברנה, ו-d הוא עובי הממברנה36,37.
התנגדות הממברנה נקבעה באמצעות חוק אוהם33:
(3)
כאן, V הוא המתח המופעל ו-Rm הוא התנגדות הממברנה. בהיעדר תעלות יונים, זרם הממברנה נותר קרוב ל-0 pA, מה שמתאים לערכי התנגדות בטווח הגיגה-אוהם (GΩ)33.
קשר ה-I–V הראה התנהגות לינארית (אומית) בין 0 ל-±200 mV עבור התקני BLMchipMM עם מפתח של 75 ו-100 µm. התאמה לינארית של הנתונים הניבה ערכי התנגדות של ממברנה של 847 ± 16 GΩ (n = 6) עבור מפתח של 75 µm (איור 8A, עיגולים) ו-980 ± 32 GΩ (n = 7) עבור מפתח של 100 µm (איור 8A, ריבועים). ערכי רעש RMS, שנמדדו על פני מקטעים של 3 s של עקומה הזרם, היו 3.1 ± 2 pA (n = 7) עבור מפתח של 100 µm ו-2.6 ± 0.1 pA (n = 6) עבור מפתח של 75 µm. יציבות הממברנה הוערכה על ידי מדידת התנגדות במרווחי זמן של כ-2 min לאורך משך זמן כולל של 1 h (איור 8B). ממברנות שנוצרו היטב נותרו יציבות בעקביות למשך יותר מ-1 h, דבר המספיק עבור רוב הניסויים האלקטרופיזיולוגיים. ממברנות עמדו בדרך כלל בפוטנציאלים מופעלים עד ±200 mV ללא סימני חוסר יציבות, בעוד שפריצה התרחשה בין ±220 ל-±300 mV, תלוי בשכבה הכפולה הספציפית. ממברנות נחשבו כמתאימות להחדרת חלבונים כאשר ערכי הקיבול היו בטווח של 40 עד 60 pF עבור מפתחים של 75 µm ובין 60 ל-90 pF עבור מפתחים של 100 µm, עם ערכי זרם של ≤0.5 pA ב-100 mV.
איור 8: אפיון חשמלי של PLBs. (A) קשרי זרם-מתח (I–V) של שכבות כפולות שנוצרו בפתחים של 75 µm ו-100 µm, המראים התנהגות ליניארית (אומית) בין ±200 mV. רגרסיה ליניארית מניבה ערכי התנגדות של ממברנה של 847 ± 16 GΩ (n = 6) ו-980 ± 32 GΩ (n = 7), בהתאמה. (B) יציבות הממברנה הוערכה על ידי ניטור ההתנגדות במשך 1 h במרווחי זמן של 2 min. הממברנות נשארות יציבות עד ±200 mV ונקרעות במתחים שבין ±220 ל-±300 mV. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
אפיון ראשוני של התנהגות ערוץ בודד של ancTREK1
ancTREK1 סינתטי טוהר ושוחזר אל תוך PLBs, ופעילות של תעלה בודדת נוטרה באמצעות פרוטוקולי מדרגות מתח שנעו בין −120 ל-120 mV בגידולים של 20 mV. הקלטות של תעלה בודדת (איור 9A ו-איור 9B) חשפו את התנהגות הריצוד (flickering) האופיינית לתעלות K2P38. ב-80 mV, אמפליטודת הזרם הממוצעת הייתה 13.02 ± 0.78 pA (n = 5), בעוד שב-−80 mV עלתה אמפליטודת הזרם ל-−18.72 ± 0.25 pA (n = 5) (איור 9C). קשר ה-I–V שהתקבל הראה זרמי תעלה בודדת מדידים הן בפוטנציאלים חיוביים והן בשליליים בתנאים סימטריים של 200 mM אשלגן ללא Mg2+ (איור 9D). מכיוון שאמפליטודות הזרם נאמדו מתוך היסטוגרמות של כל הנקודות (all-point histograms) של הקלטות שנרכשו ב-5 kHz ועברו סינון מעביר נמוך (low-pass filtered) ב-2.5 kHz, קשר I–V זה מוצג כהוכחה תיאורית של העיקרון (proof-of-principle) ולא כמאפיין ביופיזיexhaustive מקיף.
איור 9פעילות ערוץ בודד של ancTREK1 סינתטי. (A ו- B) רישומים מייצגים של זרם תעלה בודדת שנרשמו ב-80 mV וב-80- mV, בהתאמה. קווים מקווקווים מציינים את רמת התעלה הסגורה. (C) היסטוגרמות אמפליטודה של כל הנקודות עבור פוטנציאלים חיוביים (שמאל) ושליליים (ימין). (ד'קשר I-V של ancTREK1 תחת תנאי אסימטריה של 200 mM אשלגן (K+)+תנאים ללא קטיונים דו-ערכיים. העקומה מותאמת באמצעות פולינום מסדר רביעי, וערכי המוליכות נגזרים מהשיפוע ב- ±80 mV. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.
אף על פי ש-ancTREK1 חסר אזורים מורחבים בקצות ה-N וה-C בהשוואה לתעלות TREK1 של יונקים, הוא נשאר פעיל תפקודית לאחר רקונוסטיטוציה. בניגוד ל-TREK1 של יונקים, המציג מצבי מוליכות גבוהה ונמוכה (132 ± 5 pS ו-41 ± 5 pS בפוטנציאלים חיוביים, בהתאמה)39, ancTREK1 הציג רק את מצב המוליכות הגבוהה. המוליכות של תעלה בודדת בפוטנציאלים חיוביים הייתה 112.8 ± 10.8 pS (80 mV, n = 5), ממצא העולה בקנה אחד עם ערכים שדווחו עבור תעלות TREK (בין 85–130 pS בתנאי אשלגן סימטריים)38,39,40,41. בפוטנציאלים שליליים, המוליכות עלתה ל-205.6 ± 2.05 pS (−80 mV, n = 5), בהתאם להתנהגות TREK1 שדווחה בעבר39. באופן בולט, ancTREK1 הציג הסתברות פתיחה מנורמלת (NPo) גבוהה יותר בהשוואה למדידות של TREK1 שהתבצעו באמצעות תצורות patch excised42. הקשר בין NPo למתח הראה פעילות מוגברת של התעלה בפוטנציאלים חיוביים, והגיעה ל-0.78 ± 0.02 (n = 5) ב-80 mV. לעומת זאת, ה-NPo ירדה בפוטנציאלים שליליים, עם ערכים של 0.53 ± 0.04 ב-−80 mV ו-0.28 ± 0.03 ב-−120 mV (איור 10).
איור 10: ניתוח תלות במתח של פעילות ערוץ בודד של ancTREK1. הסתברות פתיחה מנורמלת (NPo) כפונקציה של פוטנציאל הממברנה (שמאלה) והשוואה של NPo ב-80 mV וב-−80 mV (ימינה), המראה על עלייה בפתיחת הערוץ בפוטנציאלים חיוביים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1. רצף חומצות האמינו של תעלת האשלגן בעלת שני דומייני נקב (K2P) הקדמונית הסינתטית (ancTREK1). רצף חומצות האמינו המלא של ancTREK1 המשמש להקלטות אלקטרופיזיולוגיות. הרצף שוחזר באמצעות הסקת רצף קדמוני מתוך מאגר נתונים מובחר של בני משפחת TREK/TRAAK, הכולל רצפים אורתולוגיים שנאספו ממאגרי המידע UniProt ו-NCBI, סוננו למניעים (motifs) של נקב שמורים, שורטטו ואושרה בעזרת פילוגנטיקה של סבירות מקסימלית.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
במחקר זה, השתמשנו בטכניקת ה-PLB כדי להעריך את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תעלת K2P סינתטית ברמת המולקולה הבודדת. מבין מודלי השכבות השומניות המישוריות השונים המתוארים בספרות המדעית, התמקדנו ביצירת BLMs, שאתם נצבעות מעל פתח שקוטרו נע בין 50 ל-140 µm, שנקדח על פני שטח אנכי לא פולרי המפריד בין שני תאים מימיים. תצורה זו מאפשרת סימולציה של סביבת קרום התא תוך שמירה על שליטה בפרמטרים ניסיוניים, כולל הכנת קרום השומנים והרכב האלקטרוליט (למשל, עוצמה יונית ו-pH)3. שחזרנו BLMs באמצעות שיטת Montal–Mueller (קיפול)5, שבה הקרום מתגבש באופן ספונטני כאשר שתי שכבות שומנים בודדות (monolayers), שהופצו קודם לכן בממשק האוויר-מים של שני התמיסות המימיות, מתאחדות מעל הפתח על ידי העלאת מפלס המים.
הפרוטוקול המוצג כאן ליצירת ממברנה הוא אינטואיטיבי מאוד; עם זאת, מספר שלבים קריטיים משפיעים רבות על הצלחת הניסוי. כדי להבטיח חיבור חשמלי תקין בין ה-BLMchipMM לבין המגבר, חיוני למנוע כלורציה של קצוות חוטי ה-Ag/AgCl המוחדרים לשקעי ה-PCB. במהלך הרכבת ה-BLMchipMM, מיקום לא נכון של החוטים עלול להוביל למגע עם מארז המגבר, מה שיגרום לקצרים ורוויית אות. הליך הקדם-טיפול בפתח (aperture) הוא גורם קריטי נוסף: הפעלת כוח מופרז במהלך יישום תמיסת הקדם-טיפול עלולה לפגוע במחיצת הפוליאימיד, בעוד שטיפול לא נכון בתמיסת האלקטרוליט — ובמיוחד השריה של אזור הפתח — עלול לפגוע ביצירת הממברנה. יתרה מכך, ניקוי קפדני של תא ההקלטה של ה-BLMchipMM חיוני לשחזוריות התוצאות. שימוש ב-100% isopropyl alcohol, ולאחריו שטיפה יסודית וייבוש מלא, מבטיח ששאריות לא יפריעו לניסויים הבאים.
ניתן לבצע מספר שינויים בפרוטוקול. בעוד שהכלורציה באמצעות השריה במלבן מהווה גישה מעשית ונפוצה, ניתן להשתמש גם בשיטות חלופיות כגון ציפוי אלקטרולי43. באופן דומה, ניתן לבצע וריאציות בקדם-טיפול ובהכנת השומנים. תמיסות קדם-טיפול סטנדרטיות מורכבות בדרך כלל מאלקאנים בעלי שרשרת ארוכה המומסים בממיסים פחמימניים נדיפים36; למרות שתמיסת hexadecane בריכוז 1% ב-n-hexane נמצאת בשימוש נפוץ, ייתכן שממיסים אחרים יהיו מתאימים. ניתן להתאים גם את הרכב השומנים בהתאם לדרישות הניסוייות. בעוד ששומני DPhPC מספקים יציבות ממבריאן אופטימלית, ניתן להשתמש בתערובות שומנים חלופיות, כולל הרכבים טבעיים או סינתטיים36. יתרון מרכזי של שכבות שומן דו-שכבתיות אנכיות הנוצרות באמצעות שיטת הקיפול הוא היכולת לייצר ממברנות אסימטריות, שבהן כל עלה מורכב מסוגי שומנים שונים5,22, תכונה הידועה כמשפיעה על תפקוד חלבוני ממברנה.
פתרון בעיות ביצירת ממברנה כולל בדרך כלל התאמות של מפלסי הפאזה המימית. אם יצירת הממברנה אינה מתרחשת בתחילה, הורדה והעלאה חוזרות של מפלס הבאפר בתא אחד יכולות להקל על הרכבת השכבה הכפולה. במקרה של כישלון, הפעלת בועת אוויר מעל הפתח עשויה לקדם את התפלגות הליפידים ואת יצירת הממברנה. כישלון מתמשך מעיד בדרך כלל על בעיות הקשורות לקדם-טיפול או לזיהום, ובמקרה זה מומלץ לנקות את תא ההקלטה ולהפעיל מחדש את הניסוי.
המרכיבים המרכזיים של מערך זה כוללים את המגבר הקומפקטי eNPR 100 kHz ואת ה-BLMchipMM. המגבר הוא מערכת voltage-clamp קומפקטית עם רעש נמוך המבטלת את הצורך במכשירים חיצוניים נוספים, כולל כלובי פאראדיי חיצוניים, שכן מעטפת המגבר עצמה מספקת סיכוך אלקטרומגנטי יעיל. ה-BLMchipMM הוא תא הקלטה ממוזער ומורכב מראש, המשולב עם PCB לחיבור ישיר למגבר. הוא מורכב משני תאים בצורת C המופרדים על ידי מחיצת פוליאימיד עם פתח קוני שנקדח בלייזר, שם נוצרת הממברנה המלאכותית. הממדים המצומצמים של המערכת, עם נפחי תאים של כ-110 µL, מפחיתים משמעותית את צריכת הרכיבים ומקטינים את הקיבוליות העצמית, ובכך משפרים את איכות האות. בנוסף, ניתן להשתמש במכשיר מספר פעמים ללא פירוקו, ככל שנשמרים נהלי ניקוי נאותים, דבר המפחית את השונות ומשפר את השחזוריות הניסוית.
למרות יתרונות אלו, יש לקחת בחשבון מספר מגבלות. המערך הנוכחי אינו כולל מודולים משולבים לבקרת טמפרטורה, לחץ או פרפוזיה. דווח כי מתיחות ממברנה פנימית משפיעה על תעלות מכנו-סנסוריות כגון TREK144,45,46; עם זאת, המערך הנוכחי אינו כולל מניפולציה מבוקרת של מתיחות הממברנה, ולא הוסקו כאן מסקנות מכניסטיות. באופן כללי, פלטפורמה זו מספקת מערכת חזקה ונגישה להקלטת פעילות של תעלות יונים בממברנות מלאכותיות. במחקר זה, חקרנו את תעלת ה-K2P הסינתטית ancTREK1, תעלה אבקודית שנגזרה באופן חישובי של תת-משפחת TREK. הנתונים שהוקלטו מדגימים כי ancTREK1 מטוהר, אשר שוחזר לתוך PLBs, מציג התנהגות של תעלה בודדת העולה בקשריה עם תכונות מוליכות דמויות-TREK1 שדווחו בעבר. בתנאים סימטריים של 200 mM אשלגן ללא Mg2+, התעלה מציגה קשר I–V מדיד, עם ערכי אמפליטודה של כ-13 pA ב-80 mV ו-−19 pA ב-−80 mV. בנוסף, ancTREK1 מציגה את מצב המוליכות הגבוהה האופייני הנצפה בתעלות TREK1, עם מוליכות גבוהה יותר בפוטנציאלים שליליים (~205.6 pS) בהשוואה לפוטנציאלים חיוביים (~112.8 pS). באופן בולט, ancTREK1 מראה NPo מוגבר בפוטנציאלים חיוביים (0.78 ב-80 mV) ו-NPo מופחת בפוטנציאלים שליליים (0.53 ב-−80 mV ו-0.28 ב-−120 mV), דבר השונה מתצפיות בתצורות patch excised42. ממצאים אלו תומכים בשימוש במערכת זו להקלטת תעלות בודדות כהוכחת היתכנות (proof-of-principle) של חלבונים ממברנתיים משוחזרים.
גילויים
F.T. ו-A.P. הם המנכ"ל ועובד ב-Elements S.r.l., בהתאמה. כל שאר המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו מודים ל-Sofia Diletta Guzzeloni על העזרה בהליך הטרנספקציה של התאים. אנו מלאי הכרת תודה לעובדי Elements, ד"ר Leon Juarez וד"ר Michelangelo Paci. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית של אוניברסיטת פאביה (University of Pavia), איטליה, במסגרת יוזמת Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), על ידי קרן Cariplo (#2019-1809) ועל ידי תוכנית המחקר PNRR CN00000013 "המרכז הלאומי ל-HPC, Big Data ומחשוב קוונטי" עבור M.L.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | יצירת שכבות ליפידיות מלאכותיות דו-שכבתיות |
| 2-פרופנול (≥99.5%) | Honeywell | 24137-5L | ניקוי התקן BLMchipMM |
| אגרוז | Fisher BioReagents | BP160-500 | הכנת ג'לים של אגרוז |
| מערכת אלקטרופורזה אופקית בג'ל אגרוז | BTLabSystems | BT102 | הפרדה של מקטעי DNA |
| אמפיסילין | Fisher BioReagents | BP1760-25 | בחירת חיידקים שעברו טרנספורמציה |
| שרף Sepharose עם נוגדן ננו (nanobody) אנטי-GFP (הכנה עצמית) | — | — | טיהור במבוסס זיקה (Affinity purification) של חלבונים המסומנים ב-GFP |
| פספטאז אלקלי של Anza | Invitrogen | IVGN2208 | דה-פוספורילציה של וקטור |
| Anza EcoRI | Invitrogen | IVGN0116 | עיכול רסטריקציה |
| Anza NotI | Invitrogen | IVGN0014 | עיכול רסטריקציה |
| בופר Anza Red (10×) | Invitrogen | IVGN2008 | בופר לעיכול רסטריקציה |
| מעכב הפרוטאז אפרוטינין | Fisher Scientific | 15996008 | מניעת פירוק חלבונים |
| צנטריפוגה לשולחן מעבדה | Eppendorf | EP5420000164 | שיקוע תאי (pelleting) והכנת דגימות |
| BLMchipMM | Elements s.r.l. | — | היווצרות של שכבות ליפידיות מישוריות |
| כולסטריל המיסוקצינאט (CHS) | Anatrace | CH210 | ייצוב של חלבוני ממברנה |
| קומיסי כחול זוהר (Coomassie Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | 1125530025 | צביעת חלבונים |
| מלבין ביתי נפוץ | — | — | כלורין של חוטי Ag |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | הפחתת צמיגות הליזאט |
| מים מזוקקים פעמיים | — | — | הכנת בופרים (תמיסות עיכוב) ותמיסות |
| אתנול (טהור, 99.9%) | Girelli Alcool s.r.l. | — | ניקוי חוטי Ag/AgCl |
| אתידיום ברומיד | Sigma-Aldrich | 1116080030 | צביעת DNA |
| נייר זכוכית בעל גרעיניות עדינה מאוד | — | — | הסרת ציפוי Ag/AgCl מחוטים |
| מגבר eNPR 100 kHz | Elements s.r.l. | — | הקלטות אלקטרופיזיולוגיות |
| ערכה לניקוי ג'ל (Gel-Out kit) להוצאת DNA מאגרקוזה | A&ביוטכנולוגיה | 023-250 | טיהור DNA |
| סולם DNA של 1 kb מבית GeneRuler | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | סולם ייחוס לגודל DNA |
| סגנון חופשי™ 293-F | Thermo Fisher Scientific | R79007 | ביטוי של חלבון ancTREK1 |
| HEPES (≥99.5%) | Sigma-Aldrich | H3375-500G | חומר בופר |
| הקסדקאן (≥99%) | Sigma-Aldrich | H6703-100ML | טיפול מקדים של המפתח (Aperture) |
| הקסאן (≥99%) | Sigma-Aldrich | 139386-100ML | ממס ליפידים |
| ביתי 5× צבע טעינה ל-DNA | — | — | הכנת דגימת DNA |
| ביתי 6× בופר Laemmli SDS (מסייע לחמצון/reducing) | — | — | הכנת דגימות חלבון |
| תמיסת הסרת צבע ביתית | — | — | הסרת צבע מג'לים של SDS-PAGE |
| פרוטאז HRV-3C להכנה עצמית | — | — | שבירה של חלבוני היתוך |
| בופר הרצה ל-SDS-PAGE בהכנה ביתית (10×) | — | — | בופר אלקטרופורזה ל-SDS-PAGE |
| אימידזול | Alfa Aesar | A10221 | אלוציה של חלבונים בעלי תג His |
| עמודי טיהור בתוך-סדרה (In-batch) | — | — | תהליכי עבודה לניקוי חלבונים |
| אינקובטור עם ניעור Innova44 | New Brunswick Innova | M1282 | גידול תרביות תאים |
| KCl | Honeywell | 31248-1KG | הכנת אלקטרוליט ובופר |
| ציר LB (Lennox) | Condalab | 1231 | תרבית חיידקים |
| מעכב הפרוטאז Leupeptin | Thermo Scientific | 78435 | מניעת פירוק חלבונים |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט | Acros Organics | 447700010 | רכיב באפר (Buffer component) |
| ספקטרופוטומטר Nanodrop | DeNovix | DS-11 | כימות DNA וחלבון |
| n-דודציל-β-D-מלטוסיד (DDM) | NeoBiotech | NB-19-0056-25G | המסה של חלבוני ממברנה |
| שרף Ni Sepharose High Performance | Cytiva | 17526801 | טיהור באמצעות IMAC |
| מחשב נייד | — | — | בקרת מכשירים ורכישת נתונים |
| אולטרסנטריפוגה Optima LE-80K | Beckman | 365668 | בידוד פראקציית ממברנה |
| פנטאן (≥99%) | Sigma-Aldrich | 236705-100ML | ממיס ליפידים |
| מעכב הפרוטאוז פפסטטין A | Thermo Scientific | 78436 | מניעת פירוק חלבונים |
| בופר Phusion GC (5×) | Thermo Fisher Scientific | F519 | בופר PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | הגברה באמצעות PCR |
| מעכב הפרוטאז PMSF | Thermo Scientific | 36978 | הגנה על חלבונים במהלך ליזיס |
| פוליאתילנימין (PEI) | מדעי הקליניקה | 24765-100 | ריאגנט טרנספקציה |
| ג'ל Tris-Glycine מוכן מראש מבית ProteinEle (4–20%) | TransGen Biotech | DG101-01-V2 | הפרדת חלבונים |
| מערכת אלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE | Bio-Rad | 1658002FC | אלקטרופורזה של חלבונים |
| נתרן בוטיראט | Fisher Scientific | A11079 | מגביר של ביטוי חלבונים |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | ליגציה של DNA |
| בופר T4 DNA ligase (10×) | Thermo Fisher Scientific | B69 | תמיסת ליוגציה (Ligation buffer) |
| מכשיר תגובה בשרשרת עם מחזוריות תרמית (Mastercycler Nexus) | Eppendorf | 6331000025 | הגברה באמצעות PCR |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | הכנת תמיסות בופר |
| אגר Tryptone SOYA עם לציטין ופוליסורבט 80 | HiMedia | M449-5KG | זריעת חיידקים בצלחות פטרי |
| שני חטילי Ag | Elements s.r.l. | — | אלקטרודות לאלקטרופיזיולוגיה |
| מרכז סינון אולטרה-צנטריפוגי (סף חיתוך של 50 kDa) | Merck Amicon | UFC8050 | ריכוז חלבון |
| וקטור ביטוי pEG BacMam | Addgene | 160687 | ביטוי חלבונים |
| כבל USB | — | — | החיבור בין המגבר למחשב |
מקורות
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr Protoc Pharmacol. 11 (1), (2000).
- Polak, A., Mulej, B., Kramar, P. System for measuring planar lipid bilayer properties. J Membr Biol. 245 (10), 625-632 (2012).
- Zakharian, E. Recording of ion channel activity in planar lipid bilayer experiments. Methods Mol Biol. 998, 109-118 (2013).
- Mueller, P., Rudin, D., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (12), 3561-3566 (1972).
- Coronado, R., Latorre, R. Phospholipid bilayers made from monolayers on patch-clamp pipettes. Biophys J. 43 (2), 231-236 (1983).
- Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophys J. 41 (2), 119-133 (1983).
- Tank, D. W., Miller, C., Webb, W. W. Isolated-patch recording from liposomes containing functionally reconstituted chloride channels from Torpedo electroplax. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7749-7753 (1982).
- Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Lett. 224 (1), 172-176 (1987).
- Varnier, A., et al. A simple method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. J Membr Biol. 233, 85-92 (2010).
- Garten, M., et al. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Anal Chem. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. J Am Chem Soc. 129 (51), 16042-16047 (2007).
- Iwamoto, M., Oiki, S. Contact bubble bilayers with flush drainage. Sci Rep. 5, 9110 (2015).
- Han, X., et al. Nanopore arrays for stable and functional free-standing lipid bilayers. Adv Mater. 19 (24), 4466-4470 (2007).
- Miyata, R., et al. Parallel recordings of transmembrane hERG channel currents based on solvent-free lipid bilayer microarray. Micromachines. 12 (1), 98 (2021).
- Kresak, S., Hianik, T., Naumann, R. L. C. Giga-seal solvent-free bilayer lipid membranes: from single nanopores to nanopore arrays. Soft Matter. 5 (20), 4021 (2009).
- Suzuki, H., Pioufle, B. L., Takeuchi, S. Ninety-six-well planar lipid bilayer chip for ion channel recording fabricated by hybrid stereolithography. Biomed Microdevices. 11, 17-22 (2009).
- Zagnoni, M., Sandison, M. E., Morgan, H. Microfluidic array platform for simultaneous lipid bilayer membrane formation. Biosens Bioelectron. 24 (5), 1235-1240 (2009).
- Baker, C. A., Bright, L. K., Aspinwall, C. A. Photolithographic fabrication of microapertures with well-defined, three-dimensional geometries for suspended lipid membrane studies. Anal Chem. 85 (19), 9078-9086 (2013).
- Tadaki, D., et al. Mechanically stable solvent-free lipid bilayers in nano- and micro-tapered apertures for reconstitution of cell-free synthesized hERG channels. Sci Rep. 7 (1), 17736 (2017).
- Collins, M. D., Keller, S. L. Tuning lipid mixtures to induce or suppress domain formation across leaflets of unsupported asymmetric bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 124-128 (2008).
- Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W., Helling, R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (11), 3240-3244 (1973).
- Hoseini, S., Sauer, M. G. Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering. J Biol Eng. 9 (1), 2 (2015).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Hochuli, E., Dobeli, H., Schacher, A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr A. 411, 177-184 (1987).
- Hochuli, E., et al. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Biotechnology (N Y). 6 (11), 1321-1325 (1988).
- Kirchhofer, A., et al. Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 17 (1), 133-138 (2010).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Lee, H., Lolicato, M., Arrigoni, C., Minor, D. L. Production of K2P2.1 (TREK-1) for structural studies. Methods Enzymol. 653, 151-188 (2021).
- Kramar, P., Miklavcic, D., Kotulska, M., Lebar, A. M. Voltage- and current-clamp methods for determination of planar lipid bilayer properties. Adv Planar Lipid Bilayers Liposomes. 11, 29-69 (2010).
- Golowasch, J., Nadim, F. Capacitance, membrane. Encyclopedia of Computational Neuroscience. , (2014).
- Niles, W. D., Levis, R. A., Cohen, F. S. Planar bilayer membranes made from phospholipid monolayers form by a thinning process. Biophys J. 53 (3), 327-335 (1988).
- Gutsmann, T., et al. Protein reconstitution into freestanding planar lipid membranes for electrophysiological characterization. Nat Protoc. 10 (1), 188-198 (2015).
- White, S. H. A study of lipid bilayer membrane stability using precise measurements of specific capacitance. Biophys J. 10 (12), 1127-1148 (1970).
- Bockenhauer, D., Zilberberg, N., Goldstein, S. A. N. KCNK2: reversible conversion of a hippocampal potassium leak into a voltage-dependent channel. Nat Neurosci. 4 (5), 486-491 (2001).
- Li, X. T., et al. The stretch-activated potassium channel TREK-1 in rat cardiac ventricular muscle. Cardiovasc Res. 69 (1), 86-97 (2006).
- Honoré, E., Maingret, F., Lazdunski, M., Patel, A. J. An intracellular proton sensor commands lipid- and mechano-gating of the K+ channel TREK-1. EMBO J. 21 (12), 2968-2976 (2002).
- Patel, A. J., et al. A mammalian two pore domain mechano-gated S-like K+ channel. EMBO J. 17 (15), 4283-4290 (1998).
- Maingret, F., Honore, E., Lazdunski, M., Patel, A. J. Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K+ channel. Biochem Biophys Res Commun. 292 (2), 339-346 (2002).
- Lemtiri-Chlieh, F., Ali, R. Characterization of heterologously expressed transporter genes by patch- and voltage-clamp methods: application to cyclic nucleotide-dependent responses. Methods Mol Biol. 1016, 67-93 (2013).
- Opsahl, L. R., Webb, W. W. Lipid-glass adhesion in giga-sealed patch-clamped membranes. Biophys J. 66 (1), 75-79 (1994).
- Perez-Mitta, G., MacKinnon, R. Freestanding lipid bilayer tensiometer for the study of mechanosensitive ion channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (12), e2221541120 (2023).
- Sorum, B., et al. Tension activation of mechanosensitive two-pore domain K+ channels TRAAK, TREK-1, and TREK-2. Nat Commun. 15 (1), 3142 (2024).
הדפסות חוזרות והרשאות
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב