הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת השפעת תימוקינון על איתות Keap-1/Nrf-2, לחץ חמצוני והתנהגות בעכברים

252 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69924

⸱

13 במרץ 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים כיצד להעריך את השפעות התימוקווינון על מסלול Keap-1/Nrf-2, סמנים ביולוגיים של לחץ חמצוני ותוצאות התנהגותיות במודל עכברוש של חשיפה תת-כרונית לדלטמטרין.

תקציר

התפתחויות אחרונות במחקר חשיפה לחומרי הדברה הגבירו את העניין באסטרטגיות הגנה מבוססות נוגדי חמצון. תימוקווינון (TQ), תרכובת ביואקטיבית שמקורה בצמחים, דווח כי מפעילה אפקטים מגנים מפני חומרים רעילים שונים. מחקר זה מתאר פרוטוקול להערכת השפעות TQ על פרמטרי לחץ חמצוני, מסלול האיתות Keap-1/Nrf-2, ותוצאות התנהגותיות בעכברים שנחשפו ל-DTM במינון נמוך. כאן, 24 זכרים בוגרים מסוג Wistar Albino (250 ± 20 גרם) חולקו באקראי לארבע קבוצות (n = 6 לקבוצה): ביקורת, TQ, DTM ו-DTM+TQ. DTM (1.28 מ"ג/ק"ג) ו-TQ (10 מ"ג/ק"ג) ניתנו תוך-קיבה במשך 30 יום. משקל הגוף נמדד לאורך כל המחקר. פעילות תנועה והתנהגות דמוית חרדה הוערכו באמצעות מבחן השדה הפתוח ביום ה-31, והתנהגות דמוית דיכאון הוערכה באמצעות מבחן השחייה הכפויה ביום ה-32. בסיום תקופת הניסוי נאספו רקמות פלזמה ומוח לניתוחים ביוכימיים, היסטופתולוגיים ומולקולריים. סמני לחץ חמצוני, כולל רמות מלנדיאלדהיד, תחמוצת חנקן כוללת, גלוטתיון וסולפידריל, נמדדו בדגימות פלזמה וקרטקס מוח. רמות הביטוי של חלבון ECH דמוי קלץ' 1 (Keap-1) ופקטור גרעיני קשור לאריתרואיד 2 (פקטור 2) (Nrf-2) נותחו באמצעות Western bloting ואימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה מספק גישה מקיפה וניתנת לשחזור לחקירת נוירוטוקסיות הנגרמת מחומרי הדברה וההשפעות המוסות של תרכובות נוגדי חמצון.

מבוא

חומרי הדברה משמשים באופן נרחב בחקלאות ובסביבות ביתיות לשליטה במזיקים; עם זאת, חשיפה כרונית למינונים נמוכים עלולה לגרום לזיהום סביבתי ולהשפעות בריאותיות שליליות הן על בני אדם והן על בעלי חיים. חשיפה כזו, במיוחד דרך מזון ומים מזוהמים, נקשרה לסיכון מוגבר להפרעות נוירולוגיות ורעילות מערכתית אחרת1.

פירתרואידים החליפו ברובם את חומרי ההדברה האורגנופוספורולוגיים בשל רגולציות מחמירות יותר על האחרונים והרעילות הנמוכה יחסית שלהם ליונקים. DTM, פירתרואיד מסוג II המכיל קבוצת α-ציאנו, הוא בין חומרי ההדברה הנפוצים ביותר בעולם ונחשב ליעיל מאוד נגד חרקים2. למרות זאת, מחקרים ניסיוניים הראו שחשיפה ל-DTM גורמת ללחץ חמצוני ולנוירוטוקסיות במודלים של בעלי חיים 3,4.

DTM הוא תרכובת ליפופילית מאוד החוצה בקלות את מחסום הדם-מוח ומפריע לתפקוד הנוירונים על ידי הארכת פתיחת תעלות נתרן עם שערי מתח. אפקט זה מוביל לירי נוירונים חוזרים, לעלייה בזרימת נתרן תוך-תאית, ולהגברת ייצור מיני חמצן תגובתיים, מה שמוביל בסופו של דבר לנזק חמצוני, דלקת ושינויים התנהגותיים, במיוחד באזורים פגיעים במוח כמו ההיפוקמפוס והקורטקס המוחי1. בהתחשב בדאגה הגוברת לגבי נוירוטוקסיות הנגרמת מחומרי הדברה, הופנתה תשומת לב גוברת לאסטרטגיות הגנה מבוססות נוגדי חמצון שמקורן במקורות טבעיים. TQ, מרכיב ביואקטיבי עיקרי בשמן האתרי Nigella sativa, דווח כבעל תכונות נוגדי חמצון, נוגדות דלקת והגנה עצבית חזקים5. מספר מחקרים הראו את השפעותיו המועילות נגד לחץ חמצוני מושרה כימית ותהליכים ניווניים נוירודגנרטיביים 5,6,7,8,9.

אחד המנגנונים העיקריים שמאחורי ההשפעות המגנות של TQ עוסק במודולציה של מסלול האיתות Keap-1/Nrf-2. מסלול זה ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על הומאוסטזיס חמצון אדום תאי על ידי ויסות ביטוי אנזימי נוגדי חמצון וניקוי רעלים. בתנאי לחץ חמצוני, דיכוי Nrf-2 בתיווך Keap-1 משתחרר, מה שמאפשר ל-Nrf-2 לעבור לגרעין ולהפעיל ביטוי גן התלוי באלמנטים בתגובת נוגדי חמצון9.

מכיוון שחשיפה ל-DTM גורמת לשינויים ברמות מולקולריות, ביוכימיות, היסטולוגיות והתנהגותיות, גישה אנליטית אחת אינה מספיקה כדי ללכוד את מלוא השפעותיו הנוירוטוקסיות. לכן, פרוטוקול זה משלב הערכות התנהגותיות, ניתוחי סמנים ביולוגיים של לחץ חמצוני, הערכה היסטופתולוגית וחקירה מולקולרית של מסלול Keap-1/Nrf-2, כדי לספק מסגרת מקיפה וניתנת לשחזור לחקר נוירוטוקסיות הנגרמת מחומרי הדברה וההשפעות המווסתות של תרכובות נוגדי חמצון כמו TQ.

ביחד, הראיות שסוכמו לעיל מדגישות את הצורך בגישה ניסיונית משולבת להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס נוירוטוקסיות הנגרמת על ידי DTM ולהערכת התערבויות הגנה פוטנציאליות. על ידי שילוב הערכות התנהגותיות עם ניתוחים ביוכימיים, היסטופתולוגיים ומולקולריים של מסלול Keap-1/Nrf-2, הפרוטוקול הנוכחי מאפשר הערכה רב-ממדית של נזק נוירוני הקשור ללחץ חמצוני. הפרשנות של ממצאי הניסוי במסגרת מכנית זו מדגישה כיצד TQ מווסת את איתות החמצון האדום, מפחיתה פגיעות ברקמה ומשפרת תוצאות התנהגותיות בהקשר של חשיפה תת-כרונית ל-DTM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים מוסדית אישרה את פרוטוקול הניסוי תחת מספר רישום 68429034/35. משך המחקר הכולל היה 32 ימים. לפני הניסויים, בעלי חיים הותאמו לתנאי מעבדה סטנדרטיים. כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם בקפדנות להנחיות מוסדיות ובינלאומיות לאתיקה של בעלי חיים. החומרים הניסיוניים המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

הערה: פסולת כימית וביולוגית הושלכה בהתאם להנחיות הבטיחות וניהול הפסולת של המוסד. חומצות, בסיסים וממסים אורגניים נאספו במיכלים נפרדים ומסומנים ונמסרו ליחידת הפסולת המסוכנת המוסדית. חומרים ביולוגיים וצרכנים מזוהמים נאספו במיכלים ביוסיכניים, עוקרו והועברו למתקן המוסדי המתאים להטמנה סופית.

1. עיצוב ניסויי

  1. קבלו 24 זכרים בוגרים של עכברי ויסטר אלבינו במשקל 250 ± 20 גרם ממעבדת ניסויים בבעלי חיים. כל עכברוש בכלוב בנפרד בטמפרטורה של 24 ± 2 מעלות צלזיוס במחזור אור/חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית לאוכל עכברוש סטנדרטי ומי ברז.
  2. חלק את בעלי החיים באקראי לארבע קבוצות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצה 1: ביקורת (C), קבוצה 2: TQ, קבוצה 3: DTM, קבוצה 4: DTM + TQ.
  3. המיס DTM (98% טוהר) בשמן תירס ונתן במינון של 1.28 מ"ג/ק"ג באמצעות גאבאז' תוך-קיבה למשך 30 יום.
  4. המיס את ה-TQ במינון של 10 מ"ג/ק"ג בשמן תירס ונתן אותו דרך תוך-קיבה למשך 30 יום. הכינו את כל תמיסות התרופות טריות מדי יום ונתנו בנפח כולל של 1 מ"ל/ק"ג.
  5. בקבוצת הטיפול המשולבת, ניתן TQ מיד לאחר DTM. נתן שמן תירס בלבד לקבוצת הביקורת כדי להתמודד עם לחץ הקשור לגאוויג'.
    הערה: מינון ה-DTM נבחר בהתבסס על ספרות קודמת כדי לגרום ללחץ חמצוני מבלי לגרום לתחלואה, והוא מתאים לכ-1/100 מ-LD501.

2. מדידת משקל גוף

  1. מדדו את משקל הגוף בימים 1, 10, 20 ו-30 של המחקר (איור 1).

3. פרמטרים התנהגותיים

  1. בצע את כל בדיקות ההתנהגות בתנאים סטנדרטיים כדי להבטיח עקביות. להקליט גם את מבחן השחייה הכפויה (FST) וגם את מבחן השדה הפתוח (OFT) באמצעות מצלמה עילית המספקת תצוגה מלאה של מכשיר הבדיקה. שמרו על תאורה של כ-100–150 לוקס. הגדר חוסר תנועה כהיעדר תנועה פעילה, למעט תנועות מינימליות הנדרשות לשמירה על יציבה ונשימה. נקה את כל אזורי הבדיקה עם 70% אתנול בין בעלי חיים כדי למנוע השפעות ריח.
  2. FST
    1. בצע FST ביום ה-32 כדי להעריך התנהגות דמוית דיכאון. ערכו מפגש קדם-מבחן של 15 דקות 24 שעות לפני מפגש הבדיקה של 5 דקות כדי להרגיל את בעלי החיים לסביבת המים ולהפחית לחץ שנגרם מחדשנות. אל תבצעו ניקוד התנהגותי במהלך המפגש לפני המבחן.
    2. הניחו את העכברים בנפרד במיכלים גליליים (קוטר: 35 ס"מ, גובה: 50 ס"מ) המכילים 30 ס"מ מים, בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הקלט את משך השחייה, הטיפוס וחוסר התנועה באמצעות מצלמת וידאו. כמת פרמטרים התנהגותיים בשניות מתוך הקלטות וידאו10.
    4. הגדר התנהגויות כך:
      חוסר תנועה: התייחסו לבעל החיים כבלתי נייד כאשר הוא נשאר צף ללא תנועות פעילות, ומאפשר תנועות מינימליות בלבד כדי לשמור על ראשו מעל המים.
      שחייה: הגדר שחייה כתנועה אופקית פעילה לאורך כל הצילינדר עם תנועות מתואמות של כל ארבע הרגליים.
      טיפוס: הגדיר טיפוס כתנועות נמרצות ומכוונות כלפי מעלה של הכפות הקדמיות נגד דופן הצילינדר בזמן שהחיה נשארת במצב אנכי.
    5. אם החיה נשארת ללא תנועה לחלוטין, יש לדרג את ההתנהגות כחוסר תנועה בהתאם לקריטריונים מוגדרים מראש.
    6. אל תפעיל גירוי חיצוני או תיקון מסלול במהלך מבחן. לאפשר לבעל החיים להתנהג בחופשיות לאורך כל תקופת 5 הדקות אלא אם נדרשת התערבות מסיבות בטיחות (למשל, סיכון לטביעה).
  3. OFT
    1. בצע OFT ביום ה-31 להערכת פעילות תנועה והתנהגות דמוית חרדה11. הקלט תנועות בודדות במשך 5 דקות בזירה בגודל 90 על 35 ס"מ, מחולקת ל-24 יחידות שוות בקווים שחורים.
    2. כמת את הפרמטרים ההתנהגותיים הבאים מתוך הקלטות וידאו על ידי חוקר עיוור להקצאת קבוצות:
      מספר המעברים עם כל ארבע הכפות (פעילות תנועה)
      הזמן שנמצא במרכז ובאזורים הפריפריאליים (התנהגות דמוית חרדה)
    3. אם בעל חיים נשאר ללא תנועה לחלוטין, רשום את ההתנהגות כחוסר תנועה והקצה אפס מעברים לתקופה זו.
    4. אל תפעיל גירוי חיצוני, שינוי מיקום או תיקון מסלול במהלך מבחן המבחן.
    5. אפשרו לבעל החיים להתנהג בחופשיות לאורך כל 5 הדקות אלא אם נדרש התערבות מטעמי בטיחות.
    6. נקה את הזירה עם 70% אתנול בין בעלי חיים כדי להעלים סימני ריח.

4. הערכת סמני לחץ חמצוני

  1. בצע את כל ההליכים ביום ה-32. הרדמו חולדות עמוקות עם זילזין תוך-שריר (5 מ"ג/ק"ג) וקטמין (45 מ"ג/ק"ג). אשר הרדמה עמוקה בהיעדר רפלקס המשיכה של הדוושה. איסוף כ-3–5 מ"ל דם באמצעות דקירה לבבית לצינורות מצופים EDA.
  2. המתת חסד מלאה באמצעות הרדמה עמוקה ואישור מוות לפני איסוף רקמות. דגימות דם בצנטריפוגה ב-3,000 x גרם למשך 10–15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. אספו בזהירות את הפלזמה מבלי להפריע לפרווה השחורה ואחסנו את האליקווטים בטמפרטורה של −80°C. נתח את המוח במהירות על הקרח. הפרדו את חצי הכדור המוחי השמאלי וההיפוקמפוס לניתוחים ביוכימיים והקפאתם במהירות בחנקן נוזלי (אחסון בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס). מקבע את ההמיספרה המוחית הימנית בפורמלין 10% ניטרלי עם בופר להערכה היסטולוגית.
  3. ניתוחי מתח חמצוני בפלזמה
    1. פרוקסידציה של שומנים בפלזמה (בדיקת TBARS)
      1. דגימות פלזמה מצנטריפוגה (3,000 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס). מערבבים 0.5 מ"ל פלזמה עם 1 מ"ל של תגובת TCA–TBA–HCl (15% חומצה טריכלורואצטית (TCA), 0.375% חומצה תיובארטורית (TBA), 0.25 N חומצה כלורית (HCl)). צנטריפוגה בעוצמה של 1,000 x g למשך 10 דקות והעברת הסופרנטנט לצינורות זכוכית. הוסף 50 מיקרוליטר של 0.02% בוטילאט הידרוקסיטולואן (BHT) כדי למנוע חמצון מלאכותי.
      2. חמם ב-100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, קרר לטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות, ומדד ספיגת סופרנטנט ב-532 ננומטר10. חישוב ריכוז MDA באמצעות חוק ביר–למברט
        ε = 1.56 ×10 5 M⁻1 ס"מ, l = 1 ס"מ ומבוטא כפלזמה nmol/mL.
    2. רמות פלזמה תיול (RSH)
      1. מערבבים 0.5 מ"ל פלזמה עם בופר Tris-HCl (100 מ"מ, pH 8.2) המכיל 1% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-2 מ"מ אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA). דגרו 5 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה (3,000 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס). השתמש בסופרנטנט לניתוח.
      2. הוסף 0.3 מ"מ 5,5′-דיתיוביס (2-חומצה ניטרובנזואית) (DTNB) ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מדוד את הספיגה ב-412 ננומטר10. מחשב את ריכוזי ה-RSH באמצעות ε = 13,600 M⁻1 ס"מ⁻1 וביטוי כפלזמה מיקרומול/ליטר.
    3. רמות NOx בפלזמה (תגובת גריס)
      1. דה-חלבון בפלזמה עם 0.3 מיליון נתרן הידרוקסיד (NaOH) ו-5% אבץ סולפט (ZnSO₄). צנטריפוגה בעוצמה של 20,000 x g למשך 5 דקות ואיסוף הסופרנטנט.
      2. הכינו תמיסות מלאי ניטראט (100, 10 ו-1 mmol/L) ויצירת עקומה סטנדרטית (1–100 מיקרומול/ליטר). טעין 100 מיקרוליטר של סופרנטנט (בארות כפולות) לתוך מיקרופלטה.
      3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של כלוריד ונדיום (III) (VCl₃), ואחריהם 50 מיקרוליטר סולפנילאמיד ו-50 מיקרוליטר N-(1-נפתיל) אתילנדיאמין. דגרו 30–45 דקות בטמפרטורת החדר ומדדו את הספיגה ב-540 ננומטר10. קבעו את ריכוזי NOx מהעקומה הסטנדרטית והביעו כפלזמה מיקרומול/ליטר.
  4. ניתוחי לחץ חמצוני ברקמה
    1. השתמש בכ-100 מ"ג של רקמת חצי הכדור המוחי השמאלי לכל הניתוחים הביוכימיים.
    2. פרוקסידציה של שומנים ברקמה (בדיקת TBARS)
      1. הומוגניזציה של רקמה (1:10 w/v) ב-10% TCA קר מאוד. הוסיפו נפח שווה של 0.67% TBA וחממו ב-100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. קר וצנטריפוגה (3,000 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס)10. מדוד את ספיגת הסופרנטנט ב-535 ננומטר. מחשב MDA באמצעות ε = 1.56 × 105 M⁻1 ס"מ⁻1 וביטוי כ-nmol/g רקמה רטובה.
    3. רמות גלוטתיון רקמתי (GSH)
      1. הומוגניזציה של רקמה ב-10% TCA (1:10 w/v) וצנטריפוגה (3,000 x גרם, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס). מערבבים 0.5 מ"ל של סופרנטנט עם 2 מ"ל תמיסת DTNB (0.4 מ"ג/מ"ל ב-1% נתרן ציטראט)10. מדוד את הספיגה ב-412 ננומטר מיד. מחשב GSH באמצעות ε = 13,600 M⁻1 ס"מ⁻1 וביטוי כמיקרומול/גרם רקמה רטובה.
    4. רמות NOx ברקמה (תגובת גריס)
      1. הומוגניזציה של רקמות במי מלח מפוזר-פוספט (PBS) (1:5 w/v) וצנטריפוגה (2,000 x גרם, 5 דקות). דה-פרוטנטנט עם 0.3 M NaOH ו-5% ZnSO₄. צנטריפוגה (3,000 x גרם, 20 דקות) ואיסוף הסופרנטנט השקוף.
      2. הכינו תקני ניטראט (1–100 מיקרומול/ליטר). טעין 100 מיקרוליטר של סופרנטנט בבארות כפולות. הוסף תגובות VCl₃ וגריס כפי שתואר לעיל. דגרו 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומדדו ספיגה ב-540 ננומטר10. קבעו ריכוזים מהעקומה הסטנדרטית והביעו אותם כרקמת מיקרומול/גרם.
        זהירות: פרוצדורות הכוללות כימיקלים מסוכנים, כולל TCA, HCl, NaOH וממסים אורגניים, בוצעו במכסה אדים כימי מוסמך. ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כגון מעילי מעבדה, כפפות עמידות לכימיקלים, משקפי מגן, וכאשר נדרש, מגני פנים, שימשו בכל הניסויים. כל הכימיקלים טופלו בהתאם להנחיות בטיחות מוסדיות ולגיליונות נתונים רלוונטיים לבטיחות חומרים (MSDS).

5. קביעת רמות Keap-1 ו-Nrf-2 באמצעות ניתוח ווסטרן בלוט

  1. חתכו את רקמת ההיפוקמפוס לחתיכות של 50 מ"ג והניחו בצינורות הומוגניזציה המכילים 500 מיקרוליטר של בופר RIPA בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז.
  2. הוסיפו כמות מתאימה של חרוזים מגנטיים והומוגניזציה ב-1,000 x גרם לשני מחזורים. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. העבר את הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים ולצנטריפוגה שוב באותם תנאים. שמור דגימות על הקרח וקבע ריכוזי חלבון.
  4. מדדו את ריכוזי החלבון באמצעות פלואורומטר עם ערכת הבדיקה של Protein BR, בהתאם להוראות היצרן.
  5. הכינו 10% ג'לים SDS–PAGE לאלקטרופורזה. כוון את ריכוז החלבון ל-30 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
  6. הוסיפו 4 פעמים בופר Laemmli ביחס של 3:1 והוסיפו 10% β-מרקפטואנול. דגימות חום ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה לזמן קצר.
  7. טעין 5 מיקרוליטר של סמן חלבון ו-30 מיקרוגרם חלבון לכל נתיב. הרץ ג'לים ב-110 וולט למשך 60–90 דקות.
  8. הפעל ממברנות PVDF ב-100% מתנול למשך 3–5 דקות, ואז מאוזן ב-1× בופר העברה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני ההעברה.
  9. יש להרכיב את ניירות הסינון והספוגים הרטובים עם בופר העברה ולהרכיב את כריך ההעברה בזהירות, כדי להבטיח הסרה מלאה של בועות האוויר. לבצע העברת חלבון באמצעות מערכת העברה רטובה במתח של 100 וולט למשך 90 דקות במתח קבוע של 4 מעלות צלזיוס.
  10. חסימת ממברנות באלבמין סרום בקר 3% (BSA) למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי. דגרו ממברנות במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-3% BSA (Keap-1 ו-Nrf-2, 1:3,000; β-אקטין, 1:1,000).
  11. שטוף ממברנות 5 פעמים במשך 5 דקות עם 1 × תמחה טריס-באפר עם 0.1% דטרגנט Tween 20 (TBS-T). דגרו עם נוגדן משני (1:15,000) למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
  12. שטיפת ממברנות כפי שתואר ודגרה עם תת-קרקע כימילומינסנציה משופרת (ECL) (למשל, מצע HRP מבוסס לומינול) לפי הוראות היצרן (ערבוב נפחים שווים של תגובת A ו-B מיד לפני השימוש). מרחו מספיק מצע כדי לכסות לחלוטין את פני הממברנה (כ-1 מ"ל לממברנה) ודגרו במשך 1–2 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. זיהוי אותות כימילומינסנטיים באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית המצוידת לזיהוי כימילומינסנציה (אין צורך באורך גל עוררות ספציפי, שכן פליטת אור נובעת מתגובת HRP–לומינול). לצלם תמונות באמצעות הגדרות חשיפה אוטומטית תוך שמירה על פסים לא רוויים. שמרו על פרמטרי חשיפה זהים לכל הדגימות באותו כתם (כתם אחד).
  14. בצע ניתוח צפיפות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה תחת פרמטרי ROI זהים, חיסור רקע ונרמול. נרמל את עוצמות הרצועות של Keap-1 ו-Nrf-2 לחלבון β-אקטין המתאים. ייצוא ערכים מנורמלים כקבצי .csv לניתוח סטטיסטי.

6. ניתוח היסטופתולוגי

  1. תקבע את ההמיספרה המוחית הימנית בפורמלין ניטרלי של 10% למשך 72 שעות. התייבש דרך סדרת אתנול מדורגת (70%–100%), הטמעת בפארפין, וחתך ב-5 מיקרון.
    השגת חתכים קורונליים במוח ברמות הקורטקס של ההיפוקמפוס והאנטורין בהתאם לקואורדינטות הסטריאוטאקסיות שהוגדרו ב-Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). השתמש בצופה האטלס האינטראקטיבי של מוח העכברים (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas כדי לאמת ולחדד מיקום אנטומי11.
  2. הכינו ארבעה חתכים קורונליים רצופים (עובי 5 מיקרון) מרקמת מוח מוטמעת בפרפין באמצעות הליכים היסטולוגיים סטנדרטיים. צבעו את החתכים בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) לפי הפרוטוקולים הקונבנציונליים12. בדקו את כל השקופיות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 200×. ודא שההערכה ההיסטולוגית מתבצעת על ידי חוקר עיוור כדי למזער הטיית צופה13.
    הערה: הליך זה הבטיח השוואה אנטומית עקבית בין קבוצות.
  3. הערכה חצי-כמותית אובדן נוירונים, בצקת תאית, פיקנוזה גרעינית, חדירה דלקתית וגודש כלי דם ב-10 שדות אקראיים בכל חלק.
  4. חשב ממוצע ציונים לכל פרמטר לכל קבוצה. קריטריוני הניקוד היו כדלקמן: 0 (אין, <5%), 1 (קל, <33%), 2 (בינוני, 33–66%), ו-3 (חמור, >66%; טבלה 1).

7. ניתוח אימונוהיסטוכימי של תגובתיות Nrf-2 ו-Keap-1 בהיפוקמפוס ובקורטקס האנטורינלי

  1. הכינו חתכים בעובי 5 מיקרון מההיפוקמפוס ומהקורטקס האנטורינלי והתקינו אותם על שקופיות זכוכית.
  2. דה-פרפין והייבש מחדש את החלקים, ואז שטוף במלח עם בופר פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר.
  3. דגרו חלקים עם 3% מי חמצן למשך 5 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. קטעי שטיפה עם PBS
  4. בצע שליפת אנטיגנים על ידי חימום השקופיות בבופר נתרן ציטראט (pH 6.0) למשך 10–15 דקות. תן למחסניות להתקרר 30 דקות, ואז לשטוף עם PBS.
  5. דגרו שוב חלקים עם 3% מי חמצן למשך 15 דקות כדי להבטיח עיכוב מלא של פרוקסידאז. שטוף חלקים עם PBS.
  6. מרח תמיסת חסימה במשך 10 דקות כדי להפחית את הקישור הלא ספציפי. דגרו את החתכים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד Nrf-2 (דילול 1:100) ו-Keap-1 (דילול 1:200). שטוף את החלקים עם PBS לאחר הדגירה.
  7. דגרו קטעים עם נוגדן משני מתאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף חלקים עם PBS.
  8. מרחו סטרפטווידין–פרוקסידאז על החלקים ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח (שמרו על לחות יחסית של 95–100% באמצעות קופסת דגירה אטומה המכילה נייר סינון רטוב). שטוף את החלקים עם PBS לאחר הדגירה.
  9. מרח כרומוגן DAB ועקוב אחרי התפתחות הצבע תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 100×. עצור את התגובה על ידי שטיפת המגלשות במי ברז.
  10. צבעי נגד את החלקים עם המטוקסילין מדולל ביחס 1:9 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף היטב עם PBS ומים מזוקקים. התקן את החלקים באמצעות מדיום התקנה קבוע.
  11. בדוק את החלקים המוכתמים תחת מיקרוסקופ אור. ללכוד פוטומיקרוגרפים בהגדלה של ×400 מ-16 שדות מייצגים בכל מקטע.
  12. כמת את האימונוריאקטיביות של Nrf-2 ו-Keap-1 באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. לתעד ולנתח את הנתונים הכמותיים להערכה סטטיסטית נוספת.
  13. לניתוח אימונוהיסטוכימי, פתח את התמונות ב-ImageJ וכייל באמצעות כלי Set Scale. המרו את כל התמונות לגווני אפור של 8 ביט כדי לאחד מדידות עוצמה. הגדר ידנית אזורי עניין (ROIs) עבור אזורים מוכתמים חיובית ואזורים סמוכים ברקע ושמורם במנהל ההשקעה.
  14. כמת את עוצמת הצביעה באמצעות דה-קונבולוציה עקבית של H-DAB, ואחריה פרמטרי סף זהים בכל הדגימות. למדוד ערך אפור ממוצע, צפיפות אופטית ואחוז שטח חיובי.
  15. לניתוח מבוסס תאים, יש לחלק תמונות עם סף מקטע באמצעות כלי Watershed, ולכמת תאים חיוביים באמצעות ניתוח חלקיקים. כל הנתונים יוצאו כקבצי .csv לניתוח סטטיסטי.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות גרסה 29.0 של SPSS. הזן נתונים גולמיים בלשונית Data View, כאשר כל שורה מייצגת בעל חיים בודד והמשתנים מוגדרים בלשונית Variable View; קבוצת הניסוי קודדה כמשתנה קטגורי (בקרה, TQ, DTM ו-DTM+TQ).
  2. הערכת נורמליות הנתונים באמצעות מבחן שפירו–וילק על ידי בחירת ניתוח > סטטיסטיקות תיאוריות > חקירה, הקצאת משתני התוצאה לרשימת התלויים וקבוצה לרשימת הגורמים, והפעלת גרפים של נורמליות עם מבחנים. למשתנים המפוזרים נורמלית, יש לבצע השוואות קבוצתיות באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) באמצעות ניתוח > השוואת ממוצעים >-ANOVA חד-כיווני, כאשר סטטיסטיקה תיאורית ומבחן לוון להומוגניות שונות המופעלים תחת אופציות.
  3. כאשר זוהה אפקט עיקרי משמעותי, יש ליישם את מבחן הפוסט-הוק של טוקי דרך תפריט הפוסט-הוק כדי לזהות הבדלים בין זוגות קבוצות. השתמשו בתוצאות הבדיקה של לוון כדי לאשר הומוגניות שונות (עמוד > 0.05).
  4. לנתוני ניקוד היסטופתולוגיים שלא עמדו בהנחות פרמטריות, יש לבצע ניתוח לא-פרמטרי באמצעות מבחן קרוסקאל–ווליס על ידי בחירת ניתוח > בדיקות לא-פרמטריות > דיאלוגים מורשת > K דגימות עצמאיות, ולאחר מכן מבחן הפוסט-הוק של דאן עם תיקון בונפרוני באמצעות מודול הבדיקה הלא-פרמטרית של דגימות עצמאיות.
  5. יצוא פלטים סטטיסטיים וטבלאות סיכום כקבצים .xls או .csv, התוצאות הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD), וערך p < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מדידות משקל גוף
משקל הגוף נרשם בימים 1, 10, 20 ו-30. חולדות בקבוצות C ו-TQ הראו עלייה הדרגתית במשקל הגוף במהלך תקופת הניסוי, ללא הבדל משמעותי בין הקבוצות ביום ה-30. לעומת זאת, חולדות שנחשפו ל-DTM הראו ירידה משמעותית במשקל הגוף בהשוואה לקבוצת הביקורת. מתן משותף של TQ הפחית את הירידה במשקל הקשורה ל-DTM. לא נצפו תמותה במהלך תקופת המחקר (איור 1).

הערכות התנהגותיות
פעילות תנועה
פעילות המנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מראה כי חשיפה תת-כרונית דרך הפה ל-DTM גורמת לשינויים התנהגותיים, ביוכימיים, מולקולריים והיסטופתולוגיים עקביים בעכברים, וכי TQ מפחיתה את ההשפעות הללו ביעילות כאשר היא ניתנת במקביל. על ידי שילוב בדיקות התנהגות סטנדרטיות עם פרופילינג של לחץ חמצוני, ניתוח ברמת מסלול של איתות Keap-1/Nrf-2, והערכה היסטופתולוגית, הפרוטוקול מספק מסגרת איתנה וניתנת לשחזור להערכת נוירוטוקסיות הנגרמת מחומרי הדברה והגנה עצבית מבוססת נוגדי חמצון.

מינון ה-DTM שנבחר (1.28 מ"ג/ק"ג/יום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה לא קיבל מימון חיצוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5,5'-דיתיוביס (2-חומצה ניטרובנזואית)תרמו סיינטיפיק   69-78-3 
צנטריפוגה עם ספסל NF048Nü ve43560
Beta_Actin תרמופישר סיינטיפיק, ארצות הברית7D2C10
פתרון BSA  פרויטנטק, ארצות הברית)66201-1-Ig
הידרוקסיטולואן בוטילאטסיגמא אולדריץ'128-37-0
Dijital Homojenizatö r דייהאן סיינטיפיקhttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
המטוקסילין– אאוסין ביו-אופטיקהW01030708
חומצה הידרוכלוריתמרק7647-01-0
תוכנת Image J NIH; וושינגטון, ארה"בhttps://imagej.net/ij/
ערכת צביעה אימונוהיסטוכימית  מערכת זיהוי נפח גדול של Lab VisionTM UltraVisionTM: אנטי-פוליוולנטיתHRP, TA-125-HL
לייקה אוטוקט 14051956472גרמניהhttps://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
crotomes/histocore-autocut/
מיקרוסקופ אור ניקון, אקליפס ני-או, 940728
N-(1-נפתיל)אתילנדיאמיןתרמו סיינטיפיק 1465-25-4
קורא מיקרופלט ננוBMG LABTECHSPECTROstar ננו
מלח ממוגן בפוספט מרקP4417
נוגדנים ראשוניים Keap-1 פרויטנטקקטגוריה מס' 10503-2-AP, 1:200
נוגדנים ראשוניים Nrf-2 פרויטנטקקטגוריה מס' 16396-1-AP, 1/100
ערכת בדיקה של חלבון קיוביט BR תרמופישר סיינטיפיק-אינויטרוגןQ33211
נתרן ציטראטמרק03-04-6132
נתרן דודציל סולפטתרמו סיינטיפיק 151-21-3
נתרן הידרוקסידמרק1310-73-2
נתרן ניטראטמרק7631-99-4
סטרפטווידין פרוקסידאז תרמו סיינטיפיק SHRP248-B
סולפנילאמידתרמו סיינטיפיק   63-74-1 
חומצה תיובארביטורית  מרק504-17-6
TQ קיימן 490-91-5
חומצה טריקרבאלילית, 99%תרמו-סיינטיקה כימיקלים  139360500
חומצה טריכלורואצטיתתרמו-סיינטיקה כימיקלים76-03-9
טריס-HClתרמו סיינטיפיק   1185-53-1 
כלוריד ונדיום(III)סיגמא אולדריץ'7718-98-1
מצע כימילומינסנטי West Pico PLUS ו-iBright 750 מערכת תרמו פישר המדעיתhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1& gad
_campaignid=16224184202& gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-& gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
תמיסת סולפט אבץמרק7733-02-0

מקורות

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western Blotting
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.