Method Article

ניתוח ספקטרלי ראמן בעזרת למידת מכונה של ננו חיישן ssDNA-SWCNT המגיב לסרוטונין לשיפור הסלקטיביות נגד דופמין

DOI:

10.3791/69925

⸱

May 15th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Convergence Engineering, Pusan National University, 2BB21+, Department of Chemistry, Pukyong National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר ניתוח ספקטרלי של רמאן של ננו-חיישן SWCNT עטוף ב-ssDNA, ומאפשר מדידה סלקטיבית משופרת של סרוטונין נגד דופמין בעזרת מודל למידת מכונה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרוטונין (5-הידרוקסיטריפטמין, 5-HT) ממלא תפקידים קריטיים בנוירומודולציה, אך שיטות גילוי עכשוויות מתקשות לספק חישה בזמן אמת של 5-HT ברגישות וסלקטיביות גבוהה. בעבר פיתחנו חיישן סרוטונין כמעט אינפרא-אדום (nIRHT), המורכב מננו-צינור פחמן חד-דופתי עטוף ב-ssDNA, שמזהה ברגישות 5-HT. עם זאת, תגובת הפלואורסצנציה של nIRHT אינה יכולה להבחין בין 5HT לדופמין (DA), מה שמגביל את יישומיו המעשיים. במחקר זה, ספקטרוסקופיית רמאן בשילוב עם למידת מכונה מתגברת על אתגר הסלקטיביות הזה. תכונות ספקטרליות ב-G-band חשפו חתימות מובחנות ל-5HT לעומת קישור DA ל-nIRHT, כאשר DA גורם לדיכוי גדול יותר של G-band. השתמשנו ברמן דיפרנציאלי (ΔRaman) לבידוד שינויים ספקטרליים ספציפיים לאנליט ואימנונו שלושה מודלים של למידת מכונה לסיווג. מודל היער האקראי עם ΔRaman השיג ביצועים מיטביים עם דיוק של 95.8%, וביצועים גבוהים משמעותית ממודלים שהשתמשו בספקטרום ראמן גולמי. גישה זו הראתה שיפור בספציפיות, עם תגובות זניחות לאצטילכולין, GABA וגלוטמט, והשיגה מגבלת גילוי של 0.1 מיקרומטר המתאימה ליישומים פיזיולוגיים. גישה מבוססת רמאן זו ממירה את חיישן הפלואורסצנציה הלא-סלקטיבי nIRHT לפלטפורמה המסוגלת להבחין בין נוירוטרנסמיטרים עמידים, תוך התמודדות עם בעיות סלקטיביות בחישה מולקולרית מבוססת צינורות פחמן חד-קיריים (SWCNT).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרוטונין (5-הידרוקסיטריפטמין, 5-HT) הוא נוירוטרנסמיטר קריטי המווסת את מצב הרוח, הקוגניציה, שינה ותיאבון, כאשר תפקוד לקוי הקשור לדיכאון, חרדה והפרעות נוירופסיכיאטריותנוספות. ניטור בזמן אמת של דינמיקת סרוטונין במערכות ביולוגיות נותר מאתגר בשל מילי-שנייה של ההעברה הסינפטית והסביבה הכימית המורכבת של רקמת עצב2. למרות התקדמות משמעותית בטכנולוגיות זיהוי נוירוטרנסמיטרים, השגת רגישות גבוהה וסלקטיביות מולקולרית לסרוטונין ממשיכה להוות אתגרים אנליטיים משמעותיים.

שיטות גילוי הסרוטונין הנוכחיות נעות מטכניקות אנליטיות מסורתיות ועד פלטפורמות ננו-חיישנים מתפתחות. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים עם גילוי אלקטרוכימי (HPLC-ED) נשארת התקן הזהב, ומגיעה למגבלות גילוי של 0.056 ננומטר עם שחזוריות מצוינת3. עם זאת, HPLC דורש הכנת דגימות נרחבת וזמני ניתוח של 15-30 דקות, מה שמונע ניטור בזמן אמת4. וולטמטריה מחזורית בסריקה מהירה (FSCV) מאפשרת רזולוציה זמנית תת-שנייה במיקרואלקטרודות סיבי פחמן, אך סובלת מלכלוך אלקטרודות וסלקטיביות מוגבלת בין נוירוטרנסמיטרים בעלי מבנה דומה 5,6. פיתוחים אחרונים בחיישני פלואורסצנט מקודדים גנטית, כולל iSeroSnFR7 ו-GRAB-5HT8, משיגים רגישות וטווח דינמי מרשימים אך דורשים שינוי גנטי ברקמות המטרה, מה שמגביל את התרגום הקליני.

חיישני ננו-צינור פחמן חד-דופתי (SWCNT) הפכו לפלטפורמות מבטיחות לזיהוי נוירוטרנסמיטרים ללא תוויות9. SWCNTs פונקציונליים ב-DNA מציגים מודולציית פלואורסצנציה קרובה לאינפרא-אדום (nIR) בעת קישור אנליטים, מה שמאפשר זיהוי בחלון השקוף לרקמה (900-1400 ננומטר)10,11. הקבוצה של לנדרי פיתחה את חיישן nIRHT באמצעות אבולוציה שיטתית של ליגנדים באמצעות העשרה מעריכית (SELEC), תוך סקר ~10 עד 10 רצפי ssDNA ייחודיים לזיהוי מבנים מגיבים לסרוטונין12. חיישן זה משיג רגישות מיקרומולרית עם שיפור פלואורסצנציה של 200% בעת קישור סרוטונין, ופועל באופן עצמאי מחמצון הדופמין או הסרוטונין. כדי לשלול הפרעות חמצוניות, המחקר הקודם שלנו אישר את יציבות תמיסות הנוירוטרנסמיטרים הללו; ניתוחי UV-Vis ו-NMR לא גילו שינויים חמצניים או היווצרות שיא חדשות בהשוואה ל-5HT12 טהור. יתרה מזאת, זמן הדגירה הקצר ותנאי ה-pH הנייטרלי במערכת נועדו למנוע היווצרות משמעותית של קינונים. באופן דומה, קבוצת Strano הייתה חלוצה בזיהוי מולקולרי בשלב הקורונה (CoPhMoRe), והוכיחה כי SWCNTs עטופים (GT)₁₅ מזהים דופמין בריכוזים של 11 ננומטר13. הקבוצה שלנו קידמה לאחרונה תחום זה באמצעות אופטימיזציה מונחית למידת מכונה, והשיגה שיפורי רגישות פי 2.5 באמצעות סינון מהיר של רצפים שעברו מוטציות שיטתיות.

למרות ההתקדמות הזו, קיימת מגבלה יסודית בחוסר הסלקטיביות בין סרוטונין לדופמין. שני הנוירוטרנסמיטרים מכילים טבעות ארומטיות ושרשראות אתילמין, השונות רק בקבוצת הידרוקסילאחת 15. חיישני SWCNT מבוססי פלואורסצנציה כיום בדרך כלל משיגים יחס סלקטיביות מתחת ל-5:1, שאינו מספק להבחין בין נוירוטרנסמיטרים משתחררים בסביבות סינפטיות16. אתגר הסלקטיביות הזה הוא קריטי במיוחד לאור העובדה שסרוטונין ודופמין לעיתים קרובות מתחברים לאזורים במוח השולטים בתגמול ומוטיבציה17.

ספקטרוסקופיית רמאן מציעה מידע כימי משלים באמצעות ניתוח מצבי רטט של קומפלקס SWCNT-analyte18. תחום ה-G (~1580 ס"מ⁻1) של SWCNTs מתפצל לרכיבי G⁺ ו-G⁻, עם תדרים רגישים לספיגה מולקולרית ולדופינג אלקטרוני19. מחקר קודם הראה כי סורפקטנטים לא קוולנטיים על SWCNT גורמים לשינויים ספקטרליים ברורים ברמן באזורG-band 20.

בעבודה זו אנו מדגימים ניתוח ספקטרלי של רמאן בסיוע למידת מכונה של חיישן nIRHT כדי להשיג סלקטיביות משופרת בין סרוטונין לדופמין. אפיינו באופן שיטתי תגובות ראמן התלויות בריכוז בין 0.01 ל-100 מיקרומון, וחשפנו טביעות אצבע ספקטרליות מובחנות לכל נוירוטרנסמיטיר. שלושה מודלים של למידת מכונה—רשת עצבית קונבולוציונית (CNN), מכונת וקטור תמיכה (SVM) ויער אקראי (RF) אומנו על מערכי נתונים ספקטרליים לסיווג זהות אנליטית. באופן קריטי, אנו מציגים עיבוד רמאן דיפרנציאלי, שמסיר אותות בסיס כדי לבודד תכונות ספציפיות לאנליט. מודל RF אופטימלי עם עיבוד DR משיג דיוק סיווג של 95.8%, מה שמייצג התקדמות משמעותית בהבחנה מולקולרית. גישה רב-מודלית זו, המשלבת רגישות לפלואורסצנציה ל-nIR עם ספציפיות כימית ראמן, מספקת מסלול למעקב סלקטיבי בזמן אמת אחרי סרוטונין בסביבות ביולוגיות מורכבות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור ננו-חיישני SWCNT nIRHT עם פונקציונלציה ssDNA

  1. שלבו 1 מ"ג של ננו-צינורות פחמן חד-דופניים (SWCNTs), 100 מיקרוליטר של 1 מ"מ E6#9 ssDNA, ו-900 מיקרוליטר של 1x מלח מפוזר-פוספט (PBS) בצינור בנפח 1.5 מ"ל.
    אזהרה: אבקת SWCNT יבשה מהווה סיכון פוטנציאלי לשאיפה. לטפל באבקה בתוך מכסה אדים כימי מוסמך ולבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל מסכה וכפפות.
  2. פזר את התערובת באמצעות סוניקטור אמבטיה למשך 5 דקות. סוניקציה של התערובת באמצעות סוניקטור קצה המצויד בגלש 3 מ"מ בעוצמה של 50% למשך 30 דקות באמבט קרח.
  3. צנטריפוגה את התמיסה הסוניקית בעוצמה של 21,500 x גרם למשך שעה אחת כדי להפיק SWCNTs לא מפוזרים. אספו בזהירות 850 מיקרוליטר מהסופרנטנט והעבירו לצינור חדש.
  4. מדדו את הספיגה של המתלה ה-SWCNT שנאסף באורך גל של 632 ננומטר. חשב את הריכוז באמצעות מקדם הכחדת SWCNT של 0.036 (mg/L)⁻1 ס"מ⁻1. אחסן את פתרון חיישן ה-nIRHT הסופי בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.

2. מדידת ספקטרום ראמן

  1. טען 90 מיקרוליטר מפיזור nIRHT של 10 מ"ג/ליטר ללוח של 96 בארים. מדדו את ספקטרום הרמן של החיישן במאגר PBS באמצעות מקור עירור לייזר של 532 ננומטר. הגדר את הספקטרום המוקלט כקו בסיס.
    אזהרה: חשוב לשמור בקפדנות על עוצמת הלייזר ב-10 מיליוואט ואורך גל של 532 ננומטר בעת בדיקת דגימות ביולוגיות חיות. עוצמות לייזר גבוהות יותר עלולות לגרום לפוטוטוקסיות חמורה ולפגוע בחיוניות התאים. לייזר 532 ננומטר בהספק של 10 מיליוואט ששימש בפרוטוקול זה הוכרז היטב כבטוח ולא הרסני לניתוח תאים חיים, תוך שמירה על אברונים רגישים21 ופעילות אלקטרופיזיולוגית של נוירוניםראשוניים 22 , תוך הבטחת קליטת אותות ראמן חזקה.
  2. יש להעלות כל תמיסת חיישן של 90 מיקרוליטר (10 מ"ג/ליטר) עם 10 מיקרוליטר של תמיסת האנליט כדי להגיע לריכוזים סופיים של 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50 ו-100 מיקרומטר. המתינו 5 דקות לאחר הוספת האנליט כדי לאפשר דגירה מספקת.
  3. מדדו את ספקטרום הרמן של הדגימות המודגמות. הכינו דגימות בשלושה עותקים לכל ריכוז וחזרו על שלבים 2.1 עד 2.2 כדי להבטיח שחזור.

3. ניתוח נתונים מבוסס למידת מכונה

  1. בנה את מערך הנתונים מתוך סך של 208 ספקטרום רמאן, הכולל 77 תגובות לדופמין (DA), 76 תגובות לסרוטונין (5HT), ו-47 תגובות קבוצת ביקורת (PBS).
  2. בצע חיסור רקע על אזור תחום ה-G של הנתונים הספקטרליים. נרמל את הנתונים שהוחסרו ברקע בהתבסס על פסגת G+.
  3. הפעילו פילטר חציוני כדי להפחית רעש בספקטרום המנורמל. בידוד שינויים ספקטרליים (ΔRaman) על ידי הפחתת ספקטרום הבקרה המנורמל מכל ספקטרום מטופל באנליט.
  4. פיתוח רשת עצבית קונבולוציונית (CNN), מודל יער אקראי (RF) ומכונת וקטור תמיכה (SVM) לסיווג הטרינרי של 5HT, DA או מערכת בקרה.
  5. חלק את כל מערך הנתונים לקבוצות אימון, אימות ובדיקות לפי יחס 6:2:2.
  6. הגדר את ארכיטקטורת ה-CNN עם שלוש שכבות קונבולוציה חד-ממדיות תוך שימוש בפונקציית הפעלה של ReLU וגודל אגירה מקסימלי של 2, ואחריהן שתי שכבות מחוברות במלואן.
  7. הגדר את ה-SVM באמצעות ליבת פונקציית בסיס רדיאלית (RBF) לסיווג לא ליניארי.
  8. הגדר את מודל ה-RF באמצעות היפרפרמטרים ברירת מחדל.
  9. לאמן את המודלים שנבנו באמצעות אימות צולב של 5-fold. חשב את מדדי הביצועים הממוצעים בכל חמשת הקיפולים כדי להבטיח עמידות סטטיסטית.
  10. בחר את המודל שמספק את הדיוק הגבוה ביותר בנתוני האימות לניתוח הסופי.
  11. העריכו את המודל הנבחר על קבוצת הבדיקה כדי לאמת את יכולת ההכללה שלו.
  12. קבעו את גבול הגילוי העקיף (LOD) על ידי הוצאה סדרתית של נתונים מקבוצת האימון שיורדים מתחת לסף ריכוז של 0.1 מיקרומטר.
  13. בדקו את המודל המאומן על כל טווח הריכוזים, כולל ריכוזים מתחת לקריטריונים, כדי לקבוע את ה-LOD הסופי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיישן הננו ה-SWCNT הפונקציונלי של E6#9 ssDNA (nIRHT), שפותח בעבר באמצעות שיטת SELEC, מדגים שיפור הפלואורסצנציה הפיך של nIR בעת קישור 5HT, ומאפשר הדמיית 5HT בזמן אמת במבחנה וב-ex vivo12. רצף E6#9 (5'-CCCCCCAGCACCACCAGACAGCACTCCCCCC-3') עוטף את SWCNTs כדי ליצור אתרי קישור ל-5HT. עם זאת, חיישן זה חסר ספציפיות: גם 5-HT וגם DA גורמים לעלייה דומה בעוצמה (איור 1B), מה שמגביל את השימושיות שלו להבחין בין DA ל-5-HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ספקטרוסקופי ראמן סיפק שיפור משמעותי בספציפיות חיישן ה-nIRHT, יכולת שלא הייתה מושגת עם תגובת הפלואורסצנציה הקונבנציונלית שלו. הבחנו כי DA גרם לדיכוי בולט יותר של תחום G⁻ (1570 ס"מ-1) בהשוואה ל-5HT. חתימות דיפרנציאליות אלו ככל הנראה נובעות מכיוונים מולקולריים שונים וגאומטריות קישור שונות על פני ה-SWCNT. באופן ספציפי, קטכול הקטכול של DA ככל הנראה יוצר אינטראקציות π-π חזקות יותר עם פני ה-SWCNT, מה שגורם להפרעה אלקטרונית גדולה יותר המתבטאת בדיכוי G⁻ מוגבר. לעומת זאת, מערכת טב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענק מחקר לשנתיים מאוניברסיטת פוסאן הלאומית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HiPCo raw  ננו-אינטגריס
iDus1.7 InGaAsאנדורDU490A-1,9
רמנטץ'ננו פוטון
ויברה סל 130סוניקס

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60, 355-366 (2009).
  2. Dankoski, E. C., Wightman, R. M. Monitoring serotonin signaling on a subsecond time scale. Front Integr Neurosci. 7, 44(2013).
  3. Zhang, X., et al. Highly sensitive assay for serotonin in microdialysates using capillary HPLC with electrochemical detection. J Chromatogr B. 844, 112-118 (2006).
  4. Huang, F., et al. Simultaneous quantification of seven hippocampal neurotransmitters in depression mice by LC–MS/MS. J Neurosci Meth. 229, 8-14 (2014).
  5. Saylor, A., et al. In vivo hippocampal serotonin dynamics in male and female mice: Determining effects of acute escitalopram using fast scan cyclic voltammetry. Front Neurosci. 13, 362(2019).
  6. Mendoza, A., Asrat, T., Liu, F., Wonnenberg, P., Zestos, A. G. Carbon Nanotube Farm Microelectrodes Promote High Temporal Measurements of Serotonin Using Fast Scan Cyclic Voltammetry. Sensors. 20, 1173(2020).
  7. Unger, E. K., et al. Directed evolution of a selective and sensitive serotonin sensor via machine learning. Cell. 183, 1986-2002 (2020).
  8. Wan, J., et al. A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics. Nat Neurosci. 24, 746-752 (2021).
  9. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136, 713-724 (2014).
  10. Gong, H., Peng, R., Liu, Z. Carbon nanotubes for biomedical imaging: The recent advances. Adv Drug Deliv Rev. 65, 1951-1963 (2013).
  11. Yaari, Z., et al. Carbon Nanotubes in Biomedicine: Properties, Methods, and Instrumentation. Handbook Carbon Nanomater. 11, 1-62 (2024).
  12. Jeong, S., et al. High-throughput evolution of near-infrared serotonin nanosensors. Sci Adv. 5, eaay3771(2019).
  13. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat Nanotechnol. 8, 959-968 (2013).
  14. Lee, D., et al. Systematic selection of high-affinity ssDNA sequences to carbon nanotubes. Adv Sci. 11, 2308915(2024).
  15. Manciu, F. S., et al. Simultaneous Detection of Dopamine and Serotonin—A Comparative Experimental and Theoretical Study of Neurotransmitter Interactions. Biosensors. 9, 3(2019).
  16. An, S., et al. Directed Evolution of Near-Infrared Serotonin Nanosensors with Machine Learning-Based Screening. Nanomaterials. 14 (3), 247(2024).
  17. Boi, L., et al. Serotonergic and dopaminergic neurons in the dorsal raphe are differentially altered in a mouse model for parkinsonism. eLife. 12, RP90278(2024).
  18. Dresselhaus, M. S., et al. Raman spectroscopy of carbon nanotubes. Phys Rep. 409, 47-99 (2005).
  19. Jorio, A., et al. G-band resonant Raman study of 62 isolated single-wall carbon nanotubes. Phys Rev B. 65, 155412(2002).
  20. Moore, V. C., et al. Individually suspended single-walled carbon nanotubes in various surfactants. Nano Lett. 3, 1379-1382 (2003).
  21. Pieczara, A., Arellano Reyes, R. A., Keyes, T. E., Dawiec, P., Baranska, M. New highly sensitive and specific Raman probe for live cell imaging of mitochondrial function. ACS Sens. 9 (2), 995-1003 (2024).
  22. Tentellino, C., et al. Electrode- and label-free assessment of electrophysiological firing rates through cytochrome c monitoring via Raman spectroscopy. ACS Sens. 10 (2), 1228-1236 (2025).
  23. Jorio, A., et al. Raman spectroscopy of carbon nanotubes. Phys Rep. 409, 47-87 (2005).
  24. Gravely, M., et al. Aggregation Reduces Subcellular Localization and Cytotoxicity of Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Appl Mater Interfaces. 14, 19168-19177 (2022).
  25. Miyaura, K., et al. Extended-conjugation ?-electron systems in carbon nanotubes. Sci Rep. 8, 8098(2018).
  26. Krasley, A. T., Chakraborty, S., Vuković, L., Beyene, A. G. Molecular Determinants of Optical Modulation in ssDNA–Carbon Nanotube Biosensors. ACS Nano. 19 (8), 7804-7820 (2025).
  27. Chakraborty, S., Krasley, A. T., Smith, C. H., Beyene, A. G., Vuković, L. Machine Learning Prediction of Analyte-Induced Fluorescence Perturbations in DNA-Functionalized Carbon Nanotubes. Nano Lett. 26 (2), 787-794 (2026).
  28. Gianni, M., Pasqualetti, M. Wiring and volume transmission: An overview of the dual modality for serotonin neurotransmission. ACS Chem Neurosci. 14 (23), 4030-4040 (2023).
  29. Mayer, S., Saxena, P., Crayen, M. A., Treue, S. Establishing in vivo brain microdialysis for comparing concentrations of a variety of cortical neurotransmitters in the awake rhesus macaque between different cognitive states. J Neurosci Meth. 415, 110361(2025).
  30. Bunin, M. A., Wightman, R. M. Quantitative Evaluation of 5-Hydroxytryptamine (Serotonin) Neuronal Release and Uptake: An Investigation of Extrasynaptic Transmission. J Neurosci. 18, 4854-4860 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Raman Spectral AnalysisMachine LearningSerotonin NanosensorDopamine SelectivitySingle Walled Carbon NanotubessDNA SWCNTNeurotransmitter DiscriminationRandom Forest ModelG Band SpectroscopyMolecular Sensing

Related Articles