מדידות אוטומטיות אולטרדילוטיות של אסוציאציה עצמית לזיהוי נוגדנים בעלי תכונות תמיסה בריכוז גבוה מועדפות

סיכום

כאן, אנו מתארים התאמה בתפוקה גבוהה של מבחן יציבות קולואידית נוגדנים בקנה מידה רחב, כדי ליצור מערכי נתונים גדולים ולתמוך בתחזיות פיתוח מוכנות לבינה מלאכותית/למידת מכונה.

תקציר

אחד האתגרים המרכזיים בהנדסת נוגדנים הוא פיתוח שיטות סקר אנליטיות להערכת יציבות קולואידית, כדי להבטיח שהתרופות הביולוגיות מתאימות לניסוח ומתן בריכוז גבוה. ספקטרוסקופיית ננו-חלקיקים באינטראקציה עצמית מיוצבת מטען (CS-SINS), גרסה מותאמת של ספקטרוסקופיית ננו-חלקיקים אינטראקטיביות עצמית קונבנציונלית (AC-SINS), הותאמה כהערכת יציבות קולואידית חזקה לחיזוי התנהגות תמיסה בריכוז גבוה. שיטה זו מאפשרת קבלת החלטות קריטיות בשלבים מוקדמים של פיתוח על ידי זיהוי בעיות יציבות קולואידית לפני השקעת משאבים משמעותיים, מה שמפחית משמעותית את שיעורי היצירות במורד הזרם ומאיץ לוחות זמנים לבחירת מועמדים. מחקר זה מראה כי הבדיקה משתלבת בצורה חלקה בתהליכי גילוי קיימים וניתן לבצע אותה במקביל לבדיקות מוקדמות, בשל דרישות הדגימה המינימליות שלה, ומספקת נתונים חשובים לחיזוי התנהגות בריכוז גבוה מבלי לפגוע במאמצי אפיון אחרים. הוכח כי מדידות פיזור אור דינמי שגרתיות (DLS), בנוסף להזזת אורך גל תהודה של הפלזמון, יכולות לשפר את אמינות שיטת HTP המתוארת כאן. ביחד, צפוי כי האימות ההדדי באמצעות מדידות DLS ותוכניות ניתוח אוטומטיות יקל על בחירה אמינה של טיפולים מועמדים לנוגדנים במגוון מודליות.

מבוא

בפיתוח ובניסוח נוגדנים טיפוליים, אופלסנט וצמיגות הם שיקולים מרכזיים בפיתוח מוצר מסחרי ממוקד מטופל 1,2,3,4,5,6,7,8. באופן קלאסי, נדרשות כמויות גדולות של חלבון כדי לצפות ישירות בתכונות אלו בריכוז גבוה, מה שמונע ביעילות זיהוי אופטימלי של עופרת בשלבים הראשונים של גילוי נוגדנים, שבהם זמינות החלבון מוגבלת. זיהוי אמין של תופעות אלו הוא קריטי להערכות פיתוח, במטרה לצמצם התנהגות ירודה של תמיסה בריכוז גבוה במורד הזרם 1,2,3,4,5,6,7,8. לכן, יש עניין משמעותי בשיטות עם תפוקה גבוהה וריכוז נמוך, המנבאות התנהגות תמיסה לקויה בריכוז^גבוה 9,10,11,12,13,14,15,16. אחת השיטות הללו, kD-DLS, הוכחה כאמינה לחיזוי תכונות בריכוז גבוה אך אינה עומדת בדרישות הצריכה הנמוכה של חלבון וקצב תפוקה גבוה של תהליכי עבודה בשלבים מוקדמים^12,13.

לאחרונה, בדיקה מבוססת ננו-חלקיקי זהב בצריכה נמוכה במיוחד הידועה בשם CS-SINS הוכחה כבעלת קשר חזק עם תוצאות ניסויי kD-DLS ויעילה יחסית בחיזוי תכונות תמיסה ירודות בריכוז^{גבוה 16}. תכונות אלו הופכות את CS-SINS למועמד אידיאלי לפיתוח ככלי סינון בעל תפוקה גבוהה. מבחן CS-SINS עושה שימוש בנוגדן לכידה המשותק על פני ננו-חלקיקי זהב כדי לעגן נוגדנים מועמדים דרך אזורי ה-Fc שלהם, מה שמשאיר את זרועות הפאב נגישות לאינטראקציות עם התמיסה. קונפיגורציה זו משמעותה שאינטראקציות Fab-Fab שולטות באות האסוציאציה העצמית הנמדדת, מה שמועיל שכן מחקרים מצביעים על כך שתחומי Fab תורמים בעיקר למאפייני האסוציאציה העצמית של mAb, ככל הנראה בשל תכונות משטח אזור קובעת השלמות (CDR) 17,18,19,20,21,22,23. בסיס מכני זה הופך את CS-SINS למתאים מאוד לחיזוי סיכוני יציבות קולואידית הרלוונטיים לנוסחאות בריכוז גבוה. שיטות HTP חלופיות, כולל כרומטוגרפיית ספיחה מונו-שכבתית (SMAC), גישה מבוססת עמודה של כרומטוגרפיית הדרה בגודל (SEC) המדמה אסוציאציה עצמית עם פאזה סטציונרית גנרית, וכרומטוגרפיה עם אינטראקציה צולבת (CIC), כוללות הכנת עמודות ודרישות מדגם גדולות 17,24,25,26,27.

השיטה המתוארת כאן מפרטת התקנה מאומתת ללוח של מבחן CS-SINS ומאפשרת סקר HTP באמצעות אוטומציה וניתוח במעבדה, תוך שילוב יתרונות השיטות הקיימות תוך שיפור אמינות התוצאות. מחקר זה גם מדגים כיצד סוגי דגימות שונים מניבים תוצאות איכותיות בשל אופי העשרת האינטראקציה העצמית בבדיקה, וקובע שהשיטה אגנוסטית למקורות חלבונים. יתרה מזאת, אנו בוחנים כיצד תקשורת מוקדמת של תכונות קולואידיות לצוותי הפרויקט יכולה לתמוך עוד יותר בתכנון אסטרטגי של תרופות נוגדנים^{רב-ספציפיות} 28,29,30,31,32,33,34.

חקר תכונות התמיסה בריכוז גבוה מתבצע בדרך כלל בהמשך בקמפיינים לבחירת מועמדים רב-ספציפיים, לאחר בחירת המובילים והשלמת ההנדסה (איור 1A). חיזוי מוקדם של תכונות אלו הפך לאפשרי בשיטות כמו CS-SINS שדורשות כמה מיקרוגרם של דגימה, ובכך מנבאים סיכוני יציבות קולואידית עם מדידות מדוללות במיוחד¹⁶. הכנסת סינון פיתוח מוקדם (איור 1A), כאשר מאגר המועמדים גדול, וקמפיינים מקבילים ליצירת נתונים הן לפורמטים חד-ספציפיים והן לפורמטים רב-ספציפיים, יכולים להנחות טוב יותר את תהליך גילוי התרופות^31,32. HTP CS-SINS משתלב בפרדיגמת סינון המולקולות הקיימת במקביל לקביעת קישור ותפקוד, ובכך מוסיף לחבילת המידע מבלי להפריע או לעכב את זרימות העבודה הקיימות. בחירת מועמד מוביל עם דגש על תכונות קולואידיות מועדפות תשפיע על התקדמות הבחירה כפי שמוצג באיור 1B.

בתהליך הסינון המוקדם המוצע לפיתוח מוקדם, זיהוי העופרת מתחשב בתמונה המלאה של תכונות תרופות טובות, כולל ייצור וגישה למטופלים, ובכך מייעל את הפיתוח במורד הזרם³⁴. תכונות הריכוז הגבוה של התרופות הביולוגיות יכולות לקבוע את מסלול המתן שלהן: הזרקות תוך-ורידיות שדורשות ביקורים בבית החולים או זריקות תת-עוריות, שניתן לתת בבית, אך לעיתים דורשות מוצר בריכוז גבוה^35,36. mAbs ניתנים לפיתוח עם אסוציאציה עצמית נמוכה מנוסחים לעיתים קרובות ב->100 מ"ג/מ"ל ^5.35. אופטימיזציה של נוסחה באמצעות תוספים, כגון סוכנים מפחיתים ויסקו, יכולה להתגבר על סיכוני יציבות קולואידית עבור מועמדים רצויים עם תכונות תמיסה ירודות בשלבי פיתוח CMC^34,35. עם זאת, הדבר מציב אתגרים במורד התהליך בייצור ביופרמצבטיקה ומאריך את לוחות הזמנים^{לאישורי} תרופות מוצלחים. תוספים הידועים כמפחיתים צמיגות (כגון מלחים וחומצות אמינו) יכולים גם הם להשפיע על יציבות החלבונים, לשנות את פרופילי הפיתוחיות שהיו מוכנים קודם ולסבך את התהליך^{עוד יותר 36,37}. בנוסף, תרופות מופרזות עלולות להגביל את אוכלוסיית המטופלים בשל שיקולי אימונוגניות, חששות בטיחותיים שונים, או להשפיע על הקפדה על הטיפול, ועלולות להוביל לאתגרים חדשים בתחום הייצור 38,39,40. סטאר ואחרים פרסמו לראשונה את שיטת CS-SINS, ותיארו את שבר המסה האופטימלי של PLL ו-IgG כ-0.03 ואישרו ייצוב ננו-חלקיקים באמצעות מדידות פוטנציאל זטה לאסוציאציה עצמית של mAb בנוסחאות היסטידין¹⁶. ראוי לציין כי הוספת יותר מדי PLL יוצרת ייצוב יתר במבחן ומונעת תצפית על אינטראקציה עצמית של mAb (שיפור יציבות ננו-חלקיקי זהב באמצעות PLL מתואר באיור משלים 1). השימוש בנוסחאות היסטידין ללא מלח ממזער את הסינון האלקטרוסטטי (מאריך את אורך דבי), מה שמרחיב את טווח האינטראקציות הבין-מולקולריות, ובכך מגביר אותות אסוציאציה עצמית חלשים ומחקה התנהגות בריכוז גבוה כאשר נוגדנים קרובים זה לזה. באופן כללי, נוסחאות עם חוזק יוני נמוך מועדפות לנוסחאות בריכוז גבוה שבהן לא נצפית אסוציאציה עצמית.

פולימרים גדולים של PLL מונעים תפוסה של יותר mAbs ללכידה על פני ננו-חלקיקי הזהב, מה שמצמצם את חלון ההזזה הפלזמוני ודורש תוכנית התאמת עקומות וניתוח מתקדמים יותר לניתוח נתונים מאוחר יותר. מחקר זה השתמש בכלי פורטל אינטרנט שמסנכרן עם מסדי נתונים פנימיים. היתרון המרכזי של עלות ראשונית זו הוא הפוטנציאל לבניית נתונים ממאגר רצפים גדול שממקסם את מגוון המועמדים במורד הזרם ולהפחית צווארי בקבוק בשלבי פיתוח יקרים^יותר 34,35,36. מבחן CS-SINS שאנו מתארים כאן בולט כשיטה תואמת HTP, שהוכחה כמתאמת היטב עם בדיקות יציבות קולואידית בשלב מאוחר¹⁶. פרופיילינג בעזרת בינה מלאכותית מתבצע לעיצוב מושכל של רב-ספציפיים לתוכניות עתידיות ולהבנת התרומות האישיות של כל תחום בפורמטים מורכבים 41,42,43,44. מאמצים אלו ישפיעו יחד על מטה-אנליזות וקביעה מפורטת יותר של תכונות יציבות קולואידיות לטיפולי נוגדנים, ובכך יחסכו זמן בשלבים הראשונים של מחקר ופיתוח.

פרוטוקול

איור 2 מציג את הכנת הקונוגציה לננו-חלקיקים, איור 3 מציג את תהליך העבודה במלואו, איור 4 ממפה את תהליך האוטומציה במעבדה, ואיור 5 מכיל דיאגרמה של צינור ניתוח הנתונים. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת בופרים

הערה: שבוע 1 (הכנת דוגמאות)

1. הכינו היסטידין (10 מ"מ), pH 6.0 (דגימה ומאגר בדיקה).
   הערה: שלבים אלו מתבצעים ביום הראשון.
   1. המיס 5 מ"מ L-היסטידין מונוהידרוכלוריד מונוהידראט ו-5 מ"מ L-היסטידין במים אולטרה-טהורים. הוסיפו חומצה כלורית מטופלת תוך כדי ערבוב עד שה-pH מגיע ל-6.0, כפי שנמדד עם מד pH מכויל.
   2. סנן את התמיסה דרך פילטר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרון תחת ואקום את הסינון בבקבוק סטרילי.
   3. מדדו את המוליכות לצורך בקרת איכות וודאו קריאה של כ-500 מיקרו-שניות לס"מ.
2. הכינו אצטט אשלגן (20 מ"מ), pH 4.3 (לכידת בופר מצמיד mAb).
   1. המיס אצטט אשלגן במים אולטרה-טהורים וכיוון את ה-pH ל-4.3 עם חומצה אצטית קרחונית.
   2. סטריליזציה של התמיסה באמצעות סינון ואקום דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרון כפי שמתואר בשלב 1.1.2.
3. הכינו פולי-אל-ליזין.
   1. הכינו תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל במים אולטרה-טהורים ואחסנו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. דיאליזה של כל הדגימות (mAbs מועמדים)

הערה: בצע את השלבים הללו בימים 2–5.

1. השריה מוקדמת של 100 מיקרוליטר או 300 מיקרוליטר בהיסטידין 10 מ"מ, pH 6.0, למשך 5 דקות.
2. העבר את כל הדגימות (50–100 מיקרוליטר) לקלטות דיאליזה. טבלו את הקלטות בבופר היסטידין של 10 מ"מ, pH 6.0 (700 מ"ל לקופסה), הוסיפו מוטות ערבוב למאגרים, הניחו את המאגרים על לוחות ערבוב מגנטיים, ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו-15 דקות.
3. בצע שבעה החלפות בופר עם 10 mM היסטידין, pH 6.0, כל 2 שעות ו-15 דקות, או לבצע ארבע החלפות בופר ליליות כדי להבטיח הסרה יסודית של מלח מהדגימות.
4. לשלוף את הדגימות, להעביר אותן לבקבוקי מטריצה נקיים, ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לביצוע בדיקת CS-SINS.
5. למדוד את ריכוזי הדגימה ולרשום את מידע הפולידיפרסיות לאחר הדיאליזה. חשב את הריכוזים המתוקנים על ידי חלוקת ערכי הספיגה הגולמיים ב-280 ננומטר בספיגה ב-280 ננומטר עבור תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל.
6. הכינו את קובץ הקלט של מטפל הנוזל עם כתובות וריכוזי הבאר (μg/mL), כולל הבקרות.

3. החלפת בופר של לכידת mAb (איור 2, שלב 1)

הערה: בצע את השלבים הללו ביום הראשון של שבוע 2 (בדיקה).

1. הסר את בופר האחסון מעמודי הסרת מלח של 2 מ"ל על ידי צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-1,000 × גרם בטמפרטורת החדר. הכן שני עמודי הסרת מלח לכל 700 מיקרוליטר של mAb ללכידה הנדרש. השליכו את ה-flow-through לאחר כל שלב צנטריפוגה.
2. שטוף את העמודות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של בופר אצטט אשלגן של 20 מ"מ, pH 4.3. צנטריפוגה את העמודים במשך 2 דקות ב-1,000 × גרם בכל שטיפה.
3. הוסף 700 מיקרוליטר של לכידת mAb (נוגדן ספציפי לעז נגד אדם Fcγ) לכל עמודה ומשחרר לצינור חדש בנפח 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-1,000 × גרם.
4. אסוף את האלואט המפורק, מרח אותו על עמודת הסרת מלח מאוזנת שנייה, וצנטריפוגה לעוד 2 דקות ב-1,000 × גרם.
5. לשלב את כל הדגימות המוקלטות.
6. מדדו את ריכוז תמיסת ה-mAb לאחר דה-מלח כפי שמתואר בימים 2–5, שלב 2.5.
7. מדלל את תמיסת ה-mAb ל-0.8 מ"ג/מ"ל עם בופר אצטט אשלגן של 20 מ"מ, pH 4.3, והשאירו בצד עד השימוש.

4. הכנת מלאי עובד של פולי-אל-ליזין

1. מדלל אליקוט קטן של תמיסת פולי-אל-ליזין ל-2.66 מ"ג/מ"ל עם מים אולטרה-טהורים.

5. ריכוז ננו-חלקיקי זהב (איור 2, שלב 2)

1. הכינו 1.2 מ"ל אליקווטים של המתלים המקוריים בצינורות של 1 מ"ל או 4.8 מ"ל אליקווטים בצינורות 5 מ"ל באמצעות צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן המכילות ננו-חלקיקי זהב של 20 ננומטר. צנטריפוגה ב-21,130 × גרם למשך 6 דקות.
2. הסרת הסופרנטנטים (~1.1–1.15 מ"ל) מבלי להפריע לכדורים והעבירה לצינור קוני נפרד.
3. שלבו את הכדורים המרוכזים והנפחים השאריים בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. קבעו את נפח הננו-חלקיקים על ידי פיפטינג וכווננו את הנפח ל(מספר צינורות 1 מ"ל × 50 מיקרוליטר) או (מספר צינורות 5 מ"ל × 200 מיקרוליטר) באמצעות הסופרנאנט השמור. לדוגמה, לאחר צנטריפוגה של 10 אליקוטים של 1.2 מ"ל בצינורות של 1 מ"ל, כוונו את הנפח הסופי של הננו-חלקיקים המרוכזים ל-500 מיקרוליטר.

6. הרכבת ננו-חלקיקים

1. מערבבים היטב 1.5 מיקרוליטר של תמיסת עבודה פולי-אל-ליזין עם 48.5 מיקרוליטר של הלכידת mAb המוחלף בבופר (איור 2, שלב 3).
2. הכינו תערובת 1:1 של תמיסת הננו-חלקיקים המרוכזת משלב 5 ותמיסת פולי-L-ליזין/לכידת mAb משלב 6.1 (איור 2, שלב 4).
3. דגרו את התערובת ללילה בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) (איור 2, שלב 5).

7. התקנת לוח בדיקה עם מטפל נוזלי

הערה: בצע את השלבים האלה ביום השני.

1. אסוף את החומרים הנדרשים לבדיקה, כולל נוגדנים שעברו דיאליזה, קובץ הקלט של מטפל נוזלים המכיל ריכוזי לאחר דיאליזה, ננו-חלקיקי זהב מצומדים, קצות טיפול רובוטיים, לוחות ומאגרים (איור 3, אוטומציה מעבדתית, שלב 1). טענו מראש את הקצוות, הדגימות, הלוחות והמאגרים על הדק בהתאם לפריסה המוצגת באיור 3 (אוטומציה מעבדתית, שלב 1).
2. הוסיפו את הבקרות לבארות A12–D12 של לוח הדגימה (שתי בקרות חיוביות ושתי בקרות שליליות). השאירו את הבאר H12 ריקה לדגימת הבופר שהוכן על ידי מטפל הנוזלים.
3. פתח את שיטת CS-SINS עם מטפל נוזל והפעל את התוכנית (איור 3, אוטומציה למעבדה, שלבים 2–3). טען את קובץ הקלט של מטפל הנוזל כאשר מתבקש והזן את מספר הדגימות (איור 4A). בדוק את שני חלונות בדיקת החישוב הבאים (איור 4B,C), אשר את הערכים, והמשך בריצה.
4. נרמול הדגימות, כולל הבקרות, ל-55.5 מיקרוגרם/מ"ל בבופר היסטידין של 10 מילימטר, pH 6.0, על ידי העברתן מצינורות הדגימה של המטריצה ללוח תגובת שרשרת הפולימראז בנפח סופי של 100 מיקרו-ליטר (איור 4D, שלב 1). עקבו אחר ההתקדמות, שימו לב שאזורי הפלטות שהושלמו נראים אפורים והשלבים הפעילים מסומנים בירוק (איור 4E).
5. הכינו דילול בנפח גדול יותר של כל דגימה ב-11.1 מיקרוגרם/מ"ל במאגר היסטידין של 10 מ"מ, pH 6.0, על ידי העברת חומר מלוח תגובת שרשרת הפולימראז לבלוק באר עמוקה בנפח סופי של 200 מיקרו-ליטר (איור 4D, שלב 2).
6. אפשר למערכת לעצור אחרי שלב 2. כאשר מתבקשים, ערבבו את ננו-חלקיקי הזהב המרוכזים שהוכנו בשלב 6.3 על ידי הפיכת הצינור ופיפוטרינג למעלה ולמטה כ-10 פעמים.
   1. פזר את הננו-חלקיקים באופן שווה בין שני צינורות מיקרוצנטריפוגות פוליפרופילן והנח את הצינורות, עם פקק פתוח, במיקום המתקן המיועד על הדק (איור 4D, מודגש "AuNP"). המשיכו את הריצה ואפשרו למטפל הנוזלים לשחרר 20 מיקרו-ליטר של ננו-חלקיקים לכל באר בבלוק הבאר העמוק השני, שתי בארות בכל פעם (איור 4D, שלב 3).
7. אפשר למטפל בנוזל להעביר 192 מיקרוליטר דגימה מבלוק הבאר העמוקה המכיל דגימות של 11.1 מיקרוגרם/מ"ל (איור 4D, שלב 2) לבלוק הבאר העמוק השני ולערבב היטב. יצר מיקס מאסטר של 4× CS-SINS לכל דגימה, מה שמוביל לריכוז דגימה סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל לאחר הוספת 48 מיקרוליטר ננו-חלקיקי זהב לנפח סופי של 240 מיקרוליטר (איור 4D, שלב 3). תתחיל את טיימר הדגירה של 4 שעות בשלב הזה.
8. אפשר למטפל בנוזלים לשחרר 30 מיקרוליטר לבאר המקור ואז לזרוק 60 מיקרוליטר לשלוש מתוך ארבע הבארות בכל רבע של לוח 384 בארות כדי לייצר משולשים טכניים לכל דגימה (איור 4D, שלב 4). החזר את 30 המיקרוליטר הנותרים לפלטת המקור.
9. עקוב אחרי פריסת הדק של מטפל הנוזלים ככל שהריצה מתקדמת. צפו בקצוות המשתמשים ובבארות הדגימה המלאות משתנות מאפור בהיר לכהה בזמן אמת, בעוד שהתנועות הפעילות מסומנות בירוק (איור 4E).
10. הסר את הפלטה לאחר סיום הריצה. אטום את הפלטה עם אטם צלחת שקוף עם הדבקה מינימלית ודגר בטמפרטורת החדר למשך סך של 4 שעות. בנקודת הזמן של 3.5 שעות, יש להתחיל את תוכנית פיזור האור הדינמי כדי לאזן את התא ל-20 מעלות צלזיוס באמצעות ההגדרות המוצגות באיור המשלים 2.
11. מדדו את ספקטרום הספיגה של כל באר מ-510 עד 570 ננומטר במרווחים של 1 ננומטר (30 ננומטר בכל צד של השיא) בנקודת הזמן של 4 שעות.
12. מדדו מיד את הלוח באמצעות קורא פלטות פיזור אור דינמי בנקודת זמן של 4.5 שעות, עם ההגדרות המוצגות באיור המשלים 2.
    הערה: השתמש בקורא לוחות בעל ביצועים גבוהים למדידות ספקטרליות בגלל טווח הדינמי המוגבל. אל תשתמש בפונקציית הקריאה המהירה.

8. ניתוח נתונים (איור 5, תכנית עיבוד נתונים)

1. ייצא את הקבצים הגולמיים מפלטפורמת הספקטרופוטומטר ושמור אותם בתיקיית כונן נגישה.
2. גשו לפורטל האינטרנט של הסקריפטים המקושר לשרת הפנימי. הזן את פרמטרי הקלט הנדרשים של CS-SINS, כולל: (1) אורך גל התחלתי; (2) מיקום התיקייה של קובץ התוצאות הגולמיות; (3) סט לוחיות ומזהי מועמדות; (4) כתובות בארות בקרה חיובית ושלילית לנרמול אותן; (5) סימון הגדרת שיטה ("ידני" או "מטפל נוזל"); (6) מכשירים המשמשים לסריקה ספקטרלית ומדידות פיזור אור דינמי; (7) מזהה מחברת מעבדה אלקטרונית (ELN); (8) תאריך רכישה.
3. שלחו את הפרמטרים לפורטל האינטרנט ואשרו ששלושה קבצי אקסל נוצרו בתיקיית משנה בתיקיית תוצאות גולמיות.
4. חשב את ערכי λmax באמצעות סקריפט התאמת עקומה שמופעל על ידי פורטל האינטרנט.
5. בדוק את שני קבצי הפלט המכילים ערכי שכפול, תוצאות מנורמלות וגרפים מייצגים עבור מדידות סריקה ספקטרלית ופיזור אור דינמי.
6. השתמש בקובץ הפלט השלישי, המכיל מטא-דאטה של הבדיקה ותוצאות מנורמלות, כדי ליצור תוצאות מעבדתיות נרחבות בממשק המשתמש של מסד הנתונים. הגדר מאפייני דיווח לפי דרישות ספציפיות לקבוצה והעלאת התוצאות למסד הנתונים כדי לאפשר גישה ארגונית.

תוצאות

איור 6 מציג את התוצאות, איור משלים 3A מציג דוגמה לציון CS-SINS מדגימה מייצגת גולמית וטוהרת, איור משלים 3B מציג את השונות באות מבאר לבאר לאורך ימים שונים, איור משלים 4 מכיל את תוצאות תהליך אימות הלוח, ואיור משלים 5 מתאר את חישוב הנרמול עבור שתי קריאות CS-SINS.

חשוב לציין כי נאספו דגימות עם ריכוזים מדווחים של לפחות 55 מיקרוגם/מ"ל לאחר דיאליזה ל-10 מ"מ היסטידין, pH 6.0, לצורך היתכנות הבדיקה, שכן זהו הריכוז המינימלי של המלאי (מינימום 6 מיקרוגרם לדגימה) ויצרו מזהי ילדים חדשים. בסך הכול היו 70 דגימות מטוהרות ו-20 דגימות ביטוי גולמי, שכל אחת מהן מייצגת סוגי דגימות בנקודות בדיקה שונות לפיתוח (טוהרה בשלב אופטימיזציה של עופרת וחומר גולמי מטוהר בשלב אחד או דו-שלבי משלב זיהוי עופרת כפי שהודגש באיור 1A). חומר גולמי נוצר ממערכת ביטוי יונקים אוטומטית לחלוטין, פלטפורמת ביטוי וטיהור חלבונים (PEPP; GNF, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). הבקרות נגזרו מחומר מסחרי ואומתו בעבר כבעלי צמיגות מקסימלית או מינימלית, kD-DLS וערכי CS-SINS. אליקווטים טריים מאוחסנים בטמפרטורה של -80°C, ומשתמשים באליקווט חדש לכל מבחן.

איור 6A,B מציג את ציוני הספקטרל וה-DLS הממוצעים המוצגים לפי סוג המדגם, וגרפים העמודות מציגים פסי שגיאה (סטיית תקן) עם קודי צבע תואמים. הנרמול מחושב על ידי הסקריפט על ידי חלוקת ההפרש בין הדגימה לערכי הבקרה השליליים (חישוב מקסימום למדה לפי הסטת ספקטרלי או ממוצע Z, קוטר הידרודינמי בננומטר) בהפרש בין הבקרות (איור משלים 5). איור 6C מציג את הציונים הספקטרליים מול ציוני DLS, ומציג מתאם ברור בין הגישות האנליטיות. טבלה 1 מפרטת את המזהים, כתובות הבאר, סוג המדגם, ציוני הספקטרל וציוני DLS יחד עם סטיות התקן שלהם לצורך עיון. הסף לסיכון ליציבות קולואידלית (ללא קשר לקריאת ספקטרלית או DLS) עבור IgG מונו-ספציפי הוא כל דבר מעל ערך מנורמל של 0.35 (המסומן בקו ירוק מקווקוים באיור 6A,B), 6/70 (למעט ביקורות משוכפלות) דגימות מטוהרות קיבלו סיכון גבוה, בעוד 64/70 קיבלו ציון נמוך עבור החומר המטוהר. חשוב לציין שהיינו מצפים שהסף יגיע ליותר בפורמטים רב-ספציפיים. בדגימות הביטוי הגס, 2 מתוך 20 דגימות קיבלו ציון גבוה, בעוד 18 מתוך 20 קיבלו ציון נמוך. מבין החומרים המטוהרים שנבדקו כאן, גם ביטוי גס של אצוות הורים של תת-קבוצה נבדקו והניבו תוצאות דומות (המוצגות באיור משלים 3A), המצביעות על האופי המייצג של הבדיקה בעת הגדלת (טיהור) חלבונים מועמדים מאצווה עצמאית. למרות הגבלת גודל המדגם, מצוין כי השגיאה התקנית עלולה להיות גבוהה יותר עבור דגימות PEPP גולמיות מאשר בדגימות המטוהרות. היתרון שבביצוע CS-SINS בשלבים המאוחרים מבטיח שניתן לבצע הערכות אורתוגונליות עם בדיקות הדורשות יותר חלבון לניתוח, כגון מדידות צמיגות ו-kD-DLS, בעוד שהיתרון של ביצוע CS-SINS בסקרים מוקדמים של התפתחות מתמודד מראש עם סיכוני יציבות קולואידית, ועלול להשפיע על מאגר המועמדים המובילים הסופי (איור 1B). מועמדים גבוליים עם שגיאה גבוהה יכולים להיות מאומתים כסיכון גבוה או נמוך במבחנים בהמשך.

עקב האופי הקטן של ההזזות הפלזמוניות שזוהו, תוארה קריאה חלופית כדי להעניק ביטחון בבדיקה, מה שמרחיב את טווח הדינמיקה, מה שיכול להיות שימושי במיוחד בהיעדר קורא לוחות מתקדם לזיהוי שינויים זעירים. קריאת DLS מבחינה בין אשכולות ננו-חלקיקים לבין הסתמכות על תכונות הספקטרליות של הננו-חלקיקים; עם זאת, לשני התיאורים יש טווחי שגיאה תקניים דומים והם קטנים יחסית למדידות שלהם. נראה כי דגימות הנוטות יותר לקריאות חריגות יהיו עם שגיאות גבוהות יותר (או יהיו "מולטימודליות" ולא ידווחו תוצאה ב-DLS), אך ערכי CS-SINS בטווח העבודה של הבדיקה בעלי התפלגויות שגיאה נמוכות. כאשר משווים ערכי DLS לערכי ציון ספקטרליים, התפלגות השגיאה הדוקה יותר עבור תוצאות DLS שנלקחו מדגימות גסות מאשר עבור הציונים הספקטרליים; עם זאת, זה עשה הבדל רק עבור מועמד אחד שירד מתחת לסף כציון DLS אך לא כציון ספקטרלי. זה יכול להיות שימושי אם במעבדות יהיו מכשירים שונים זמינים.

כדי להתמקד באמינות עיבוד הנתונים והשיטה עצמה, זמני הסריקה שונו מקצה לקצה עבור הקריאות של הבקרות החיוביות והשליליות במאגר הנתונים למעלה, בנוסף למספר בקרות בינוניות ונמוכות שישמשו כנקודות ייחוס ביניים בתחילת ובסוף לוח 384 בארות. איור משלים 4 מציג את תוצאות האימות הסופי של הפלטה, ומציג הבדלים זניחים בעיקר בין הדגימות המוצבות בתחילת הפלטת לעומת סופה (איור משלים 4A,B) ומתאם גבוה בין שני ערכי הקריאה (איור משלים 4C). לבסוף, מקדם Z ו-%CV חושבו עבור הבקרות מהסריקה הספקטרלית ומסט הנתונים DLS באיור 6. מהנתונים שנוצרו עבור הביקורת והוצגו כאן, נקבע כי מדד הסריקה הספקטרלי היה Z של 0.648, עם 0.019% CV עבור הביקורת החיובית ו-0.012% עבור הביקורת השלילית. לקריאת DLS חושב גורם Z של 0.998, עם 0.025% CV עבור הביקורת החיובית ו-0.021% עבור הביקורת השלילית. בסך הכול, מקדם המתאם של ספירמן בין ערכי המדגם במבחן זה (איור 6C) חושב כחיובי חזק ב-0.829. ערכים אלו מייצגים דיוק מוצק ושחזוריות עבור שני סוגי המדידה, ולא במפתיע, אסטרטגיית זיהוי DLS החדשה והמועילה ממעלה את גורם Z, אך הסריקה הספקטרלית מספקת רצועת הפרדה מספקת לרישום תוצאות אמינות (Z > 0.5). חשוב לציין כי ציון DLS הוא קריאה אורתוגונלית שנאספת בו-זמנית בתוך זרימת העבודה של CS-SINS, ואינה דורשת הכנת דגימה נוספת. ההבדל הגדול יותר בערכים עבור ציוני DLS גולמיים מסביר שיפור בגורם Z, אך ה"ציונים" מפורשים באותה צורה כי הם מנורמלים מערכים גולמיים. יתרה מזאת, קריאות DLS לוכדות גדלים תלת-ממדיים של אשכולות ננו-חלקיקים לעומת אינדיקציות עקיפות לקרבה מהיסט פלזמוני ומידע ספקטרלי, מה שעשוי לחזק את הבנתנו את דינמיקת הבדיקה של CS-SINS. בהתחשב באופי המבוסס על הלוחות והקריטי לזמן של מבחן HTP, שאפנו להגדיל את אמינות הבדיקה באמצעות שיטות אלו.

איור 1: פרדיגמת יכולת פיתוח ואיסוף נתוני CS-SINS. (א) תהליך העבודה הטיפוסי מקמפיין גילוי ועד לבחירת מועמד מוצג עבור נוגדנים רב-ספציפיים בתרשים זה. תהליך הגילוי מוביל למועמדים חד-ספציפיים לסינון, ולאחר מכן בדיקה ממגוון חבילות נתונים כדי לצמצם את המונוספיקים המעניינים לפני המיזוג לפורמטים רב-ספציפיים. חבילות הנתונים חוזרות על עצמן או מורחבות כדי לצמצם את המועמדים המובילים עד שנבחר המועמד הטוב ביותר לפיתוח. בדיקות בקצב תפוקה נמוך מתבצעות במסלול העבודה הנוכחי כאשר נבחר לוח קטן של מולקולות (קופסאות סגולות). ניתן לבצע HTP CS-SINS בכל שלב בדרך, להוסיף נתונים חשובים ולשפר את תהליך הבחירה. (ב) התוצאה ההיפותטית של תכונות קולואידיות עבור ששת המועמדים המובילים מוצגת עבור שני מסלולים אפשריים: בחירת מועמד מוביל עם בדיקות בקצב תפוקה נמוך, ובחירת מועמד מוביל באמצעות HTP CS-SINS. מועמדים עם התנהגות פתרון שלילית מיוצגים בזוהר. בתרחיש הראשון, מחצית מהמועמדים המובילים, בהתבסס על מאפייני קישור אופטימליים ממסכי גילוי, מציגים התנהגות ריכוזית ירודה. בתרחיש השני, נכלול רק מועמד אחד עם יציבות קולואידית בינונית, מכיוון שנתוני CS-SINS נבחנו במקביל לנתוני קישור במסכי גילוי מוקדמים. בתרחיש השני, מגוון המועמדים הפוטנציאליים הרלוונטיים גבוה יותר מאשר בתרחיש הראשון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: תהליך הבדיקה של SINS. הכנת ננו-חלקיקי זהב והצמידה: (1) ה-mAb הלכידה מוחלף בבופר לאצטט אשלגן של 20 מ"מ, pH 4.3, ומדולל ל-0.8 מ"ג/מ"ל. (2) ננו-חלקיקי זהב מרוכזים מהמלאי. (3) פולי-אל-ליזין מעורבב עם הלכידה המוחלף בבופר mAb. (4) ננו-חלקיקי זהב מודגרים יחד עם פולי-אל-ליזין ותפיסת mAb, ומעורבבים היטב. (5) דגירה של קומפלקס CS-SINS ללילה בטמפרטורת החדר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: תהליך אוטומציה במעבדה. תהליך עבודה של אוטומציה במעבדה: (1) חומרים ודגימות נאספים עבור שיטת מטפל בנוזלים. דגימות דיאליזציה בהיסטידין 10 מ"מ, pH 6, נאספות בצינורות מטריצה או בלוחות 96 בארות. ריכוזי הדגימה מעוצבים לקובץ קלט של מטפל נוזלי. ננו-חלקיקי זהב מורכבים של CS-SINS המצורדים ללכידת mAb, קצות טיפול בנוזלים רובוטיים וכלי פלסטיק נאספים כהכנה להתקנת מבחן מטפל נוזלי. (2) לוח הבדיקה מוכנה על מטפל הנוזלים ומודגרת במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. 3) בסימון 4 שעות, נאספות סריקות ספקטרליות (קריאה 1) מבארות דגימות באורך של 25 דקות; לאחר סימון 4.5 שעות, פיזור אור דינמי (קריאה 2) אוסף מידע בגודל על כל אוכלוסיית באר אחידה יותר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: תוכנית טיפול נוזלי והגדרת הלוחות. (A) עם הפעלת התוכנית ואחרי שהמערכת מאתחלת, ייפתח חלון/הודעה נפרדת לבחירת קובץ הקלט עם כתובות הבאר וריכוזי הדגימה המיועדים. יש לציין את מספר הדגימות בכל פעם, אך נפח 200 מיקרוליטר (הנפח הסופי של המגבים המעורבים לפני הטבעת לוחות 384 בארים) נשאר זהה. (B) לאחר לחיצה על המשך מהחלון הקודם ב-(A), חלון שני זה יופיע כדי לאשר את הפרשנויות מקובץ הקלט משמאל ומהערכים מימין. (C) לאחר אישור הפרשנויות מ-(B), חלון שלישי מופיע עם תיבת דיאלוג שבודקת פעמיים את המתמטיקה לריכוז הדגימה לנרמול (נפח 100 מיקרוליטר) ללוח הבאר העמוק הסופי (נפח 200 מיקרוליטר). (D) פריסה זו מגיעה מתצוגת עורך המתודה של מודול תוכנת הטיפול הנוזלי. משמאל טעונים קצוות סטנדרטיים של 300 מיקרוליטר, ובמרכז הבמה טעונים קופסה אחת של 50 מיקרוליטר, ו-3 קופסאות של קצה דק בנפח 300 מיקרוליטר, התואמים לרובוטיקה לטיפול בנוזלים. שקע בופר טעון בחזית ב-10 mM היסטידין, pH 6 (הבופר שאליו הדגימות הועברו). ננו-חלקיקי הזהב מחולקים באופן שווה לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה ונטענים, ללא כיסוי, מאחורי מתקן הצינורות מימין. פלטת המטריצה עם צינורות הדגימה נטענת בגב הנשא בעמודה 10. לאחר הדגימות, מוצגים לוח הנירמול (1), לוח באר עמוק עם דגימה של 11.1 מיקרוגרם/מ"ל (2), לוח באר בעומק 200 מיקרוליטר של הדגימה המשולבת והננו-חלקיקים (3), ולוח מעוצב של 384 בארות (4). (ה) פריסת סיפון הטיפול בנוזלים מציגה את שליפת הקצוות והזרקת דגימות בזמן אמת ומסמנת את הבארות ככל שכל שלב מתקדם. כאן, כל הדגימות (תמונת 96 בארות בגב הנשא^בעמודה השלישית) מאפורות כמו גם לוח הנרמול הבא, מה שמעיד שהדגימות נוספו לפלטת הנרמול מפלטות מטריצת המקור. בירוק, אנו מציגים את ראש ה-8 ערוצים לאחר ששאיפת הבופר מהשקע ומשחררת אותו לעמודה הראשונה של לוח הנרמול בזמן הערבוב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: תכנית עיבוד נתונים. שיטת עיבוד הנתונים: (1) קבצי הנתונים הגולמיים נשלחים לשרת פנימי. (2) קבצי הנתונים נקראים ומעובדים על ידי סקריפט מותאם אישית להתאמת עקומות של סריקות ספקטרליות, לחשב את מקסימום הלמדה עבור שכפולים של CS-SINS, ולבדוק אוכלוסיות רב-מודליות באמצעות DLS. (3) הנתונים מקובצים לפי שכפולים, ואז ממוצעים ומנורמלים לבקרות מוגדרות; מפות לוחות תואמות בפורטל מסד הנתונים נאספות כדי לקשר בין התוצאות. (4) כל הנתונים מאורגנים בתבנית מוכנה להעלאה למסד הנתונים, והגרפים נוצרים אוטומטית לדיווח ELN. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: נתונים מייצגים מקריאה 1 וקריאה 2. (א) ציוני ההזזות הספקטרליים המנורמלים צוירו על ידי מזהה PPB עבור דגימות ביטוי מטוהרות, ודגימות ביקורת כאשר צוינו ומופרדו על ידי קו מקווקוים אנכי, בגרף בר כדי לקבוע התפלגות פסי שגיאה בין סוגי המדגמים. הקו האדום המוצק מציין את הגבול העליון של הבדיקה, המתאים לביקורת החיובית, בעוד שהקו הירוק המקווקד מסמן את ערך החיתוך לפרופיל מולקולה בסיכון נמוך עבור CS-SINS. (B) ציוני DLS המנורמליים צוירו על ידי מזהה PPB עבור דגימות ביטוי מטוהרות, גסות ודגימות ביקורת, כאשר הן מסומנות ומופרדות בקו מקווקו, בגרף בר כדי לקבוע את התפלגות פס השגיאה בין סוגי המדגמים. חלק מהערכים חסרים (^{כמו הערך} השני בכחול בהיר עם ציון מעל הממוצע ב-(A) בעקבות סריקות מולטימודליות מפלט DLS, שפורטל תוכנת הסקריפטים קבע כלא תקפות. הקו האדום המוצק מציין את הגבול העליון של הבדיקה, המתאים לביקורת החיובית, בעוד שהקו הירוק המקווקד מסמן את ערך החיתוך לפרופיל מולקולה בסיכון נמוך עבור CS-SINS. (ג) הציונים הממוצעים והמנורמלים עבור ערכי היסט ספקטרלי ו-DLS הושוו באמצעות גרף נקודות קורלציה, כפי שמוצג (ציוני היסט ספקטרלי מתאימים לציר Y וציר DLS מתאימים לציר X). קוד הצבעים מתואם רק עם ציוני DLS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1. ציוני יציבות קולואידית של דגימות נוגדנים שנקבעו על ידי CS-SINS. הטבלה מסכמת מזהי מדגם, כתובות באר, סיווגי מדגם, ציונים ספקטרליים מנורמלים, וציוני פיזור אור דינמי (DLS) שהושגו ממבחן CS-SINS. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

איור משלים 1: PLL שיפר את היציבות של AuNP ב-10 מילימטר בופר שלו, pH 6, עבור CS-SINS. איור זה מציג את השכבה הצמודה של mAb הבקרה השלילית הקשורה לקומפלקס CS-SINS מצופה PLL ובבקרה מופופרת בלבד, בניגוד לננו-חלקיקי זהב לא מצופים עם mAb או בופר שלילי בלבד, שיש להם שיאים בטווחים שונים לחלוטין. בכחול מוצגות הסריקות הספקטרליות האינקרמנטליות (שנלקחו במרווחים של 1 ננומטר בנקודת זמן של 4 שעות) עבור AuNP מצומד המודגר ב-10 מילימטר. הבופר שלו מעל חרוזים מצומדים שדגרו עם הבקרה השלילית (PPB-117487) בהיעדר פרה-אינקובציה של פולי-אל-ליזין. הראו באדום את הסריקות הספקטרליות האינקרמנטליות (שנלקחו בקפיצות של 1 ננומטר בנקודת זמן של 4 שעות) עבור AuNP מצומד עם דגירה של 10 מילימטר. הבופר שלו מעל חרוזים מצומדים שהודגרו עם הבקרה השלילית (PPB-117487) לאחר טרום-דגירה של פולי-אל-ליזין. מקסימום למדא מחושב עבור שני הבקרות השליליות בנוכחות PLL קרובים זה לזה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: הגדרות ל-DLS ובחירת לוחות באר לקורא הלוחות של DLS. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: ציוני CS-SINS מ-Abs המובע ב-PEPP לעומת מטוהר במורד הזרם. (A) ציוני ההזזות הספקטרליים המנורמל צוירו על ידי מזהה באר ולוחית עבור דגימות PEPP (למשל, A1PL1 = באר A1 מלוח 1) המבטא את Ab64 ומופרדים בקו מקוקו אנכי מהסט ספקטרלי מנורמל או ציוני DLS מ-Ab64 מטוהר במורד הזרם, בגרף בר כדי לקבוע התפלגות מוטות שגיאה (סטיית תקן) בין סוגי המדגם. הקו הירוק המקוקו מסמן את ערך החיתוך לפרופיל מולקולות בסיכון נמוך עבור CS-SINS. (B) סך ה-AUC וההתפלגות על פני הלוח עבור כל הדגימות בניסויים המבוצעות ב-(A) מוצגים כאן (מקודדים בצבעים לניסויים המתאימים). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 4: אימות לוחית 384 בארות מקצה לקצה של בקרות. (א) הציונים הספקטרליים הממוצעים והמנורמלים של דגימות בעמודות הראשונות של לוח 384 בארות מצוירים ומוצגים באדום, בעוד שערכים כפולים שנסרקו בסוף לוח 384 בארות מוצגים בירוק ליים. ערכי השכפול הם זה לצד זה, ונעים מהבקרה החיובית (המסומנת בסימן פלוס ליד מזהה PPB) ועד הבקרה השלילית (המסומנת בסימן מינוס ליד מזהה PPB). הערך של בקרת הבופר שהוכן על ידי תוכנית המטפל בנוזלים (בלתי תלוי בפקודת הקלט של הדגימה) מוצג בתבנית משובצת. (B) ציוני DLS ממוצעים ומנורמליים עבור דגימות בעמודות הפתיחה של לוח 384 בארות מצוירים ומוצגים באדום, בעוד ערכים כפולים שנסרקו בסוף לוח 384 בארות מוצגים בירוק ליים. ערכי השכפול הם זה לצד זה, ונעים מהבקרה החיובית (המסומנת בסימן פלוס ליד מזהה PPB) ועד הבקרה השלילית (המסומנת בסימן מינוס ליד מזהה PPB). אין ערך בקרת בופר לקריאת DLS (עקב קריאות מולטימודליות). (ג) הציונים הספקטרליים הממוצעים והמנורמלים מוצגים מול ציוני DLS בגרף נקודות קורלציה עבור דגימות הנעות מקריאות בעמודות הראשונות של לוח 384 בארות ועד סוף הפלטה. קידוד הצבע של נקודות הנתונים תואם ישירות לציוני הסריקה הספקטרלית הממוצעים המנורמלים. מכיוון שאין ערך בקרת בופר לקריאת DLS (עקב קריאות מולטימודליות), רק 6 הבקרות בשכפול משווים משני הקריאות בגרף זה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 5: החישובים לנרמול ציוני ספקטרל או DLS כדי לאפשר דיווח והפניה אוניברסלית בין משתמשים לימים. ערכי בקרה חיוביים מוגדרים לערך של 1, בעוד שהביקורת השלילית מוגדרת לערך 0, וציונים גבוהים קשורים להתנהגות קולואידלית לקויה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פרוטוקול זה מייצג מספר שינויים מרכזיים מהשיטה המקורית של CS-SINS¹⁶. חשוב לציין כי יחס PLL:IgG האופטימלי ובופ ההיסטידין נשמרו מהמחקר המקורי¹⁶. הבולט ביותר הוא שהבדיקה הותאמה לפלטפורמת הטיפול הנוזלי הרובוטי כדי לאפשר עיבוד HTP (עד 352 דגימות ביום אחד לעומת ~20), מה שהפחית את זמן העבודה ושיפר את השחזוריות באמצעות טיפול נוזלי אוטומטי. מערכת הרובוטיקה תואמת לפורמטים מבוססי לוחות, כולל חותמות לפורמטים חדשים כמו לוח 384 בארות, וסוגי כלי מעבדה שונים. התוכניות יכולות לפעול באופן עצמאי, וזרימת העבודה מקצה לקצה מספקת תצוגת נפח גבוה עם שחזור משופר בסביבה שמגבילה דגימות. מדידות DLS שולבו גם כקריאה אורתוגונלית להזזה הספקטרלית עם מקדם Z אופטימלי יותר מאשר פרשנויות הזזות ספקטרליות (0.998 לעומת 0.648), מה שמוכיח את עצמו כיקר ערך במיוחד לדגימות עם ציונים ספקטרליים גבוליים או סטיות תקן גבוהות, ומתאר את פירוש הסטת הפלזמון כדי להעצים את הטווח הדינמי הנראה מפלט קורא הלוחות בלבד. מומלץ שמעבדות ללא קוראי פלטות רב-מצבי מתקדמים יוכלו להשתמש ב-DLS כדי לבצע CS-SINS באופן אמין. כדי להתמודד עם שונות תלויה בזמן פוטנציאלית על פני לוח עם 384 בארות, בוצעה אימות מקיף של הלוחות (איור משלים 4) על ידי מיקום הבקרות הן בתחילת והן בסוף הלוח, ואישור השפעות זמן סריקה מינימליות. בנוסף, הוכח כי דגימות PEPP גולמיות מניבות תוצאות דומות לחומר מטוהר (איור 6, איור משלים 3A), מה שמרחיב את יישום השיטה לשלבים מוקדמים יותר שבהם חלבון מטוהר אינו זמין, דבר שלא דווח קודם לכן. הנתונים באיור המשלים 3 מצביעים על אמינות המדגם בין מקורות אך גם מצביעים על שונות מינימלית בבדיקות מיום ליום, שכן הנתונים נאספו ונרמלו ממאגרי נתונים שונים. באופן מדויק יותר, איור משלים 3B מציג את השטח הכולל מתחת לעקומה עבור כל הבארות מלוחות הניסוי (מקודדים בצבעים שיתאימו ללוח מאותו ניסוי באיור משלים 3A) כדי להדגים את השונות הצפויה אך המינימלית בתוך אותו ניסוי ובימים שונים עם הכנות חרוזים שונות. בשלב הגילוי המוקדם, שיטות כמו kD-DLS וגישות מבוססות עמודות (SMAC, CIC) אינן ישימות בשל דרישות צריכת דגימות גבוהות יותר ואי יכולת לעבד חומר גולמי 12,13,24,25,26,27; CS-SINS מאפשרת באופן ייחודי סקר יציבות קולואידית בשלב זה עם 6 מיקרוגרם בלבד לדגימה, שניתן לטהר בשלב אחד. לבסוף, סקריפט התאמת העקומות עודכן כדי לאפשר כיוונון עדין של שינויים מקסימום קלים של למבדה ולאפשר טיפול בקבצים משופר ודיווח אוטומטי של נתונים למסדי נתונים פנימיים.

תרחישי פתרון תקלות נפוצים כוללים: (1) סטיות תקן גבוהות בציוני ספקטרליים או DLS, לעיתים מצביעות על ערבוב לא מלא של ננו-חלקיקים (שלב 7.6) או אגרגציה של דגימה - במקרים כאלה, מומלץ לבצע בדיקת QC מול הדגימות שעברו דיאליזה על ידי DLS כדי להבטיח שלמות לאחר דיאליזה ולהשתמש בציוני ספקטרל כקריאה סטנדרטית; (2) התפלגויות DLS רב-מודליות או קריאות DLS כושלות, בדרך כלל כתוצאה מהצטברות דגימות קיימות או זיהום אבק - סינון דרך פילטרים של 0.22 מיקרון לפני דיאליזה יכול להקל על כך; (3) אי-התאמות בין ציוני הספקטרל ל-DLS, אשר נובעים בדרך כלל ממדידות DLS מעוותות (ככל הנראה בגלל פולידיפיזוריות גבוהה, שמופיעה בטווח הנורמלי-גבוה לפי ציון ספקטרלי); (4) ערכי בקרה חיוביים לא עקביים, בדרך כלל הנובעים מאחסון ננו-חלקיקים לא תקין או לכידת mAb ירודה; יש להשתמש באליקווטים טריים המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לכל בדיקה (לא לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס ליותר מכמה ימים).

חלק מהמגבלות של הבדיקה כוללות את הצורך בזמן לדיאליזציה יסודית של דגימות ולהכנת ננו-חלקיקים מצומדים חצי-ידנית ביום שלפני הבדיקה; עם זאת, זמן הדיאליזה שקול ללא קשר לגודל קבוצת המדגם. לגבי סיכוני סתימת הקצה, קצות הטיפול בנוזלים עוקבים אחרי שינויים בלחץ במהלך השאיבה, ומופיעות שגיאות רלוונטיות במהלך ההפעלה. במהלך שלב פיתוח השיטה, בדקנו קבצי לוג (וממשיכים לאחר השירות) כדי לוודא שהנפחים הצפויים מחושבים על ידי הסקריפט. פונקציות האליקיוטינג נבדקו עבור הכנות החרוזים המרוכזות ואינן צופות בעיות. אנו מכירים באופי הרגיש לזמן של הבדיקה, באופי הנשלט על ידי Fab של ההערכה, ובתפקידו כבדיקה חלופית מבלי למדוד ישירות התנהגויות קולואידיות כמו צמיגות ואופלסנטיות. עם זאת, התאמה זו מאפשרת אפיון יעיל של מאגרי נתונים גדולים יותר בשלבים מוקדמים בתהליך גילוי התרופה, ומשמשת ככלי סינון עוצמתי במקום שלא היה קיים קודם לכן.

מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה דורשים תשומת לב קפדנית כדי להבטיח תוצאות שניתן לשחזר. ראשית, התאמת pH מדויקת במהלך הכנת הבופר (שלבים 1.1.1 ו-1.2.1) חיונית, שכן סטיות מעבר ל-±0.1 pH יכולות להשפיע על יציבות ננו-חלקיקים ויעילות לכידת נוגדנים. בופר ה-pH הנמוך המשמש להכנת נוגדנים ללכידה מבטיח הצמדה מיטבית, ותנאי הבופר שצוינו היו מותאמים לייצוב מטען ותאימות נוגדנים רחבה (בדרך כלל בהקשר של נוסחה). בופר היסטידין pH 6.0 של 10 מ"מ מספק אינטראקציות אלקטרוסטטיות אופטימליות תוך שמירה על יציבות חלבון. שנית, דיאליזה יסודית עם הסרת מלח מלאה (שלב 2.3) היא קריטית; דיאליזה לא שלמה עלולה להפריע לאינטראקציות אלקטרוסטטיות במהלך הרכבת ננו-חלקיקים. שלישית, שלב ריכוז ננו-חלקיקי הזהב (שלבי פרוטוקול 5.1–5.3) חייב להתבצע בזהירות כדי למנוע הפרעה לכדור, שכן ריכוזי ננו-חלקיקים לא עקביים משפיעים ישירות על רגישות הבדיקה. רביעית, יחס PLL:capture mAb של 0.03 (שלב 4.1) מותאם לכיסוי פני שטח מקסימלי תוך שמירה על חלון הזזה פלזמוני מספק, כפי שנקבע^{קודם 16}. ביחס לדינמיקת טיפול בנוזלים, קצות חישה נוזלים שימשו לביצוע נרמול וערבוב לוחות עד שנכנסו ננו-חלקיקי זהב, שאינם נמדדים באופן אמין בתמיסה (ולכן קובעים את נפחי הזריקה לכמויות סטנדרטיות). חישה נוזלית במעלה הזרם מאפשרת לסמן בעיות של חוסר יישור בלוחות או דגימות חסרות על ידי המפעיל, בעוד ששלב ההטבעה של 384 בארות יזהה בעיות יישור Z. לבסוף, שמירה קפדנית על תזמון הדגירה של 4 שעות (שלבי פרוטוקול 7.10–7.12) וקריאה עקבית של הפלטה מתחילתו ועד סופה (ללא קשר ללוח לא שלם) היא קריטית, שכן ההזזה הפלזמונית ואשכול ננו-חלקיקים הם תופעות תלויות בזמן; עיכובים או קריאות מוקדמות עלולים להוביל לציוני CS-SINS לא מדויקים, בעוד שקריאת הפלטה המלאה מבטיחה עקביות של ציונים לאורך ימים בפורמט HTP.

ככל שהיציבות הקולואידית של נוגדנים רב-מיניים נחקרת יותר ויותר, מאגרי הנתונים הגדולים שמספקים בדיקות ביופיזיקליות HTP כמו CS-SINS עשויים להזין מודלים של AI/ML להבנה טובה יותר של השפעות קומבינטוריות על יציבות המולקולות. מחקרים הראו שככל שגיוון הרצפים גדל, הצורך במאגרי נתונים גדולים יותר גדל כדי לשפר את דיוק תוצאות AI/ML 41,42,43. התכונות והמתארים המולקולריים למונו-ספציפיים עשויים להשתנות כאשר הם מעוצבים מחדש לבי-ספציפיים או תלת-ספציפיים, תוך התחשבות בהתפלגות ואיזון המטען של כל המולקולות בניגוד לשיקולים ספציפיים לרצף או מוטיבים עבור תכונות כמו פגיעויות פירוק כימי 17,18,19,20,21,22. ראוי לציין כי תכונות מבניות כמו טלאים אלקטרוסטטיים חזויים, הידרופוביות ושטח פנים נגיש לממסים יכולים לשפר תחזיות של אגרגציה ויציבות ללא תלות במאפיינים ספציפיים לרצף, מה שהופך מספר מערכי נתונים קטנים יותר לתואמים להכנת חיזוי 17,18,19,20,21,22. הפשטות של ציון CS-SINS כהתייחסות לשיא המייצג של פרופיל ביופיזיקלי של מולקולה, הופכת את הבדיקה למתאימה לאימון מודלים של AI/ML.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	הכן ריכוז סופי של 5 mM לכל ריאגנט במים נקיים במיוחד, התאם pH ל-6.0, התאם נפח סופי עם מים נקיים במיוחד וסנן עם פילטר 0.22 μm
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	הכן פתרון מלאי של 5 מ"ג/מ"ל במים נקיים במיוחד
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 ננומטר של שינוי ספקטרלי וגודל DLS של 250-300 ננומטר עבור בקרה חיובית; שינוי ספקטרלי זניח וגודל DLS הדומה לבקרת החיץ בלבד
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	הכן ריכוז סופי של 10 מ"מ ריאגנט במים נקיים במיוחד, התאם pH ל-4.3 עם חומצת אצטית, התאם נפח סופי עם מים נקיים במיוחד וסנן עם פילטר 0.22 μm
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893