Method Article

ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השעתוק, RNA מתפתח מתחיל להזיווג בסיסים כאשר הוא יוצא מפולימראזות RNA (Pols). זיווג הבסיסים הזה מאפשר יצירת מבני RNA המשפיעים באופן קריטי על ביטוי גנים ברמת עיבוד, תרגום ויציבות RNA. שיטות מבוססות לחקר מבנה משני של RNA מוגבלות לתמלילים בוגרים, בעוד שמעט מאוד ידוע על מצבי קיפול. יתרה מזאת, השפע הנמוך יחסית (< 1%) והאופי החולף של RNA מתהוות מסבכים את הבידוד והאפיון שלו. Co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq) מנצל רצף שעתוק עם ביוטין-NTP ודימתיל סולפט (DMS) כדי לרכוש בו-זמנית את מיקום ה-Pol ואת מצב הזיווג הבסיסי של תמלולים מתחילים. ב-Saccharomyces cerevisiae, CoSTseq מספק את הרצף והמידע המבני בסמוך לקצה 3' של RNA מתחילים, שהועתקו על ידי אחד משלושת ה-RNA Pols. במהלך ריצת השעתוק, הביוטין-NTP המשולב באתר הפעיל למעשה עוצר את הפול. לאחר מכן, טיפול בנוקלאוטידים A, C ו-U לא מזווגים עם מתילטים ב-DMS. העשרת ביוטין וסינתזת cDNA באמצעות טרנסקריפטאז הפוך עם החלפת תבנית מאפשרת ריצוף בקצה זוג וחישוב תגובתיות DMS כפונקציה של מיקום Pol. CoSTseq מתבצע בקלות לצד חקירת DMS (DMS-MaPseq), מה שמאפשר גם ללכוד את התמלול המבוגר המקופל. כאן מוצג פרוטוקול מפורט עבור CoSTseq ו-DMS-MaPseq מקבילים, הכולל ריצה של שעתוק, הכנת ספרייה וניתוח נתונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA יכול להתקפל למבנים משניים ושלישוניים בשל זיווג בסיסים בתוך מולקולות RNA, ומבנים אלו יכולים להיות מושפעים עוד יותר מחלבונים הפועלים כמלווה להנחיית קיפול ה-RNA1. מבנה ה-RNA יכול להיות דינמי מאוד, כאשר RNA תאיים יכולים להתאים למגוון מבנים המוגדרים על ידי הנוף התרמודינמי וליצור אנסמבלים של קונפורמציות RNA אפשריות2. שינויים קונפורמציה דינמיים עשויים להשפיע על ויסות הגנים והביטוי 3,4. לעומת זאת, RNA יכול גם לאמץ מבנים מועדפים מאוד הקשורים ישירות לתפקודו, כגון tRNA, RNA גרעיני קטן ו-rRNA. בעוד שדוגמאות אלו מדגישות RNA בוגרים בעלי תפקידים רגולטוריים חזקים, שלבי עיבוד RNA אאוקריוטיים מתרחשים לעיתים קרובות במקביל לשעתוק, כולל חיתוך קדם-mRNA, חיתוך בקצה 3' ושינוי RNA. באופן דומה, קיפול RNA יכול להתרחש לפני הבשלה של התעתול, כפי שנדון במקום אחר5.

בעוד שרצף ה-RNA יכול לקודד מבנה משני, קביעה מדויקת דורשת לעיתים קרובות אימות ניסיוני במבחנה או ב-vivo. הופעת טכניקות שינוי כימי ספציפיות למבנה כמו DMS-MaPseq (פרופיל מוטציות דימתיל סולפט עם ריצוף) סללה את הדרך לקביעת מבנה RNA משני תאים חיים6. DMS מוכנס לתאים ובמיוחד מתילציה של פאות הבסיס של ווטסון-קריק של אדנוזין, ציטוזין, ובמידה פחותה גם אורידין, שנגישים רק כאשר אינם מזווגים. לאחר שינוי על ידי DMS, ניתן להשתמש בטרנסקריפטאז הפוך בעל דיוק גבוה ופרוססיבי מאוד, כמו Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase (TGIRT)7, כדי לקודד מחדש בסיסים מותאמים כמוטציות בספריית ה-cDNA הסופית שהוכנה. מוטציות אלו יכולות לשמש להסיק את נגישות ה-RNA ברמת הנוקלאוטידים. למרות שמדובר בטכניקה עוצמתית, DMS-MaPseq ושיטות קשורות שימשו בעיקר לחקר RNA בוגר שכבר מקופל לחלוטין6.

פותחו מספר שיטות לחקר ויסות ועיבוד RNA מתהווה. ריצוף ריצה גלובלי (GROseq) פותח כדי להתגבר על מגבלות RNA-seq, המאפשר מדידה יציבה של רמות RNA בתאים וכך מספק מידע שממוצע את תהליכי השעתוק, עיבוד ה-RNA וההתדרדרות המשפיעים על רמות ה-RNA. GROseq השתמש בברומורידין לריצה גרעינית, שבה RNA פולימראז (Pol) יכול להוסיף נוקלאוטידים ל-RNA המתהוות ברזולוציה של עשרות בסיסים8. ריצוף מדויק של ריצה (PROseq) נבנה על שיטה זו למיפוי RNA Pols על RNA מתהוות ברזולוציית זוגות בסיס, באמצעות שימוש בביוטין-NTPs. כאן, מתווסף NTP ביוטינילטי במקום שבו פול זוהה לאחרונה בקצה 3' של ה-RNA9 החדש.

לאחרונה, שרפן ואחרים פיתחו והשתמשו במעקב מבנה Co-transcriptional (CoSTseq), שמנצל ומתאים את ריצת הביוטין ובדיקת DMS כדי לאפשר קביעת מבנה RNA של תעתיקים מתחילים ב-S. cerevisiae10. CoSTseq מאפשר לקבוע את מבנה ה-RNA המשני במהלך שעתוק פעיל; פרוטוקול זה מפרט כיצד ריצה גרעינית משולבת עם בדיקת DMS במהלך ניסויי CoSTseq. בהינתן ש-CoSTseq דורש טיפול זהיר במהלך הכנת הדגימה, וכן תשומת לב קפדנית לאיכות הנתונים בעת ניתוח CoSTseq, פרוטוקול זה מפרט שיטות עבודה מומלצות ליצירת ספריות מתאימות לריצוף זוג בפלטפורמת Illumina. פרוטוקול CoSTseq מניב בו-זמנית RNA בוגר וחדש, כאשר האחרון ניתן לנתח כמערך נתונים DMS-MaPseq כדי לאפשר השוואה קפדנית בין RNA בוגר (איור 1). ניסיונית, נדרשת גישה לחומרים הנדרשים לתחזוקת תרביות שמרים ולביצוע בדיקות גרעיניות ובדיקות DMS, כפי שמפורט בפרוטוקול למטה. תפוקת ה-RNA הראשונית היא קריטית להצלחת הכנת ספריית CoSTseq וניתוח נתונים; לכן, תנאי צמיחה שנקבעו על ידי חממות ומדיות צמיחה מתאימים הם קריטיים להשגת חומר התחלתי מספק. לבסוף, כדי לבצע ניתוח חישובי של נתוני CoSTseq, גישה לאשכול HPC (HPC) היא אידיאלית.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה של הכנת ספריית CoSTseq ו-DMS-MaPseq מאותה דגימה ביולוגית. (א) חדירות של דופן תאי השמרים וממברנת הגרעין עם סרקוסיל מאפשרת שילוב ביוטין-NTP בקצה ה-3' של RNA המתהווה במהלך תגובת ריצה גרעינית. (B) מתילטים של DMS יוצרים שאריות A ו-C לא מזווגות (לפעמים U) על RNA צעיר ובשל בתא החדיר, ו-RNA כולל מתקבל באמצעות הפקת פנול/כלורופורם. RNA מתהוות מטוהר מה-RNA הכולל על ידי חרוזים מגנטיים מצומדים על ידי סטרפטווידין; הפקת טריזול משחררת את ה-RNA המתהווה מהחרוזים. במקביל, הסופרנטנט החרוזי המכיל mRNA פוליאדנילטים יכול להיות משוקע ב-EtOH; מחומר זה, ניתן לבודד mRNA באמצעות משיכת חרוזים אוליגו(dT). mRNA פולי A+ מפורקים לפני הכנת הספרייה. (ג) טרנסקריפטאז הפוך עם החלפת תבנית משמש ליצירת cDNA בנפרד מ-RNA מתחילי או בוגר, ואחריו ליגציה של מתאמי 5' ו-3' להכנסתN7 UMI וברקודים (ראו איור 2 לפרטים על CoSTseq). יש לשים לב שלבי השעתוק ההפוך של DMS-MaPseq ו-CoSTseq ישתמשו במתאמי הטרודופלקס מובחנים עם חריגות משלימות לביוטין-NTP המשמשים ב-CoSTseq ו-N oversurrounded המשמשות ב-DMS-MaPseq. מחזורי PCR מינימליים משמשים להגברה כדי להגביל הטיה בספרייה, ובחירת גודל מופעלת להסרת דימרים מהתאם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לפני שמתחילים, ודאו שכל המאגרים המפורטים בטבלה 1 מוכנים. כל החומרים צריכים להיות מוכנים במים נטולי נוקלאז. מומלץ עיקור מסנן של מאגרים כאשר משתמשים בכימיקלים/מגיבים בדרגת ביולוגיה שאינה מולקולרית להכנת בופר. לסעיפים 1 עד 4, הכינו מראש את הדברים הבאים:

1. הכנת חומרים ותגובות

  1. הכינו תמיסה של 10% סרקוסיל (v/v) לפחות יום אחד מראש כדי לאפשר מספיק זמן להמסה מלאה. סטריליזציה של התמיסה ההומוגנית עם פילטר של 0.22 מיקרון. ביום הניסוי, השתמש ב-10% סרקוסיל להכנת תמיסה של 0.5% סרקוסיל, והשאר על קרח עד השימוש.
  2. אולטרה-צנטריפוגות לפני קירור ל-4 מעלות צלזיוס. במכסה האדים, כוון את התרמומיקסר ל-30 מעלות צלזיוס וחמם מראש כמות של 2.5x Structure probing buffer. התרמומיקסר הזה ישמש לטיפול ב-DMS בהמשך.
  3. במכסה האדים, כוון בלוק חום ל-65 מעלות צלזיוס וחמם 650 מיקרוליטר פנול חומצי: כלורופורם בכל תגובה לצורך הפקת RNA.
  4. מערבבים DTT עם בופר שעתוק של 2.5x לריכוז סופי של 2 מילימטר. הכינו וקיררו מראש את תמיסות הקירור והשטיפה לשימוש מיידי לאחר טיפול ה-DMS (ראו טבלה 1).
  5. Aliquot 40 מיקרוליטר של 20% SDS לצינורות לפירוק שמרים לפני חילוץ RNA. הכינו תמיסת כלוריד אבץ (ZnCl2) בעובי 100 מ"מ ועקר את הסינון לפני השימוש.
  6. ליצור זני שמרים של מחיקה, דלדול או נכנס שעשויים להידרש כדי לענות על שאלות מחקר ספציפיות לגבי זיווג בסיסי RNA מתהווה, בהשוואה לזן הפראי של שמרים מתפתחים. תמיד החיה מחדש את הזנים על ידי סטרינג על צלחת אגר שמרים מתאימה (YPD, נשירה או צלחות אנטיביוטיקה). התחל תרבית נוזלית ממושבה אחת יום לפני תחילת הניסוי. להוראות נוספות על גדילה ומניפולציה של זני שמרים, אנא עיינו ב-Schärfen ואח', 2025.

2. הכנת תאי שמרים ל-CoSTseq

  1. הקמת טרום-תרבות: גידול זן S. cerevisiae BY4741 ב-50 מ"ל מדיום YPAD עד שהתאים מגיעים לשלב לוגריתמי באמצע (צפיפות אופטית (OD) ב-600 ננומטר = 0.6) ב-30°C עם רעידות ב-200 סל"ד. אם צריך, דילל את התרבית ל-OD 0.2-0.3 ותן לשמרים להגיע ל-0.6 OD.
  2. קצירת שמרים: לאסוף ולסובב 1.8 OD (~3 מ"ל) של תרבית שמרים ב-2,500 x גרם למשך 3 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס). זרוק את הסופרנטנט במיכל פסולת. שטיפו כדורי שטיפה על ידי השעיית 10 מ"ל של מלח פוספאט קר (PBS). סובב שוב ב-2,500 x g למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשאירו את כדור השמרים על קרח.
  3. חדירות תאי שמרים: החזירו בזהירות את כדור השמרים ב-10 מ"ל סרקוסיל קר של 0.5%. השתמש בפיפטור P1000 לתליית התאים מחדש והימנע מיצירת בועות. דגרו על קרח במשך 20 דקות כדי לקדם חדירה. גלגל את תאי השמרים החדירים בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. החזירו את תאי השמרים החדירים ב-100 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.

הערה: למרות שסימון DMS אינו דורש חדירות דופן התא, תגובת ריצה גרעינית דורשת חדירות כדי שנוקלאוטידים ביוטיניליים יגיעו לאתר השעתוק. זה מושג באמצעות טיפול בסרקוזיל, החודר הן לדופן תאי השמרים והן לממברנה הגרעינית שלו. יתרה מזאת, טיפול בסרקוסיל מקל על הבדיקה על ידי מניעת אירועי התחלת שעתוק חדשים והסרת גורמי הארכה שליליים מפול II וכרומטין11,12. לטפל בעדינות בדגימות ולשמור על מהירות צנטריפוגלית נמוכה (400 x גרם) כדי למנוע קרע תאים ולקדם שילוב מוצלח של ביוטין בתמלילים מתארכים13.

3. הפצצות גרעיניות וחקירת DMS

הערה: ריצה גרעינית עם ביוטין-NTP יוצרת מכשול סטרי שעוצר את RNA Pols באתר פעיל ומספק ידית ביוטין להעשרה סלקטיבית של RNA מתחיל. בהתאם לרזולוציה הרצויה, ניתן לבצע ריצה גרעינית באמצעות אחד, שניים או כל ארבעת הריבונוקלאוטידים הביוטינילטים9. לצורך יעילות כלכלית, זרימת העבודה המתוארת כאן עושה שימוש רק בנוקלאוטיד ביוטינילטיבי אחד (כלומר, ביוטין-CTP).

  1. הקמת תגובת הריצה הגרעינית
    1. הכינו פתרון עבודה של בופר שעתוק 2.5x עם DTT של 5 mM שנוספו לאחרונה ובופ חקירת מבנה של 2.5x לפני חימום ל-30 מעלות צלזיוס (ראו טבלה 1).
    2. בצינור נקי של 2 מ"ל, יש להוסיף 120 מיקרוליטר של בופר שעתוק 2.5x, 3.75 מיקרוליטר של 10 מ"מ ATP, 3.75 מיקרוליטר של 10 מ"מ מ"ר GTP, 3.75 מיקרוליטר של 10 מ"מ מ״ר UTP, 7.5 מיקרוליטר של 1 מ״מ ביו-CTP, 15 מיקרוליטר של 10% סרקוזיל, והביא את הנפח ל-200 מיקרוליטר עם 46.25 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
    3. הוסיפו 100 מיקרולטר של תאים לצינור ודגרו בתרמומיקסר על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות עם ניעור ב-500 סל"ד.
      הערה: שלב זה רגיש מאוד לזמן. נסה להגביל את מספר הדגימות כדי לייצר נתונים אמינים. מומלץ להאזין לתזמון בין דגימות לעקביות.
  2. טיפול ב-DMS: לאחר סיום הדגירה, הוסף במהירות 200 מיקרוליטר של בופר מבנה מחומם מראש 2.5x ו-25 מיקרוליטר של תגובת DMS לצינור בו-זמנית. מערבולת בעדינות בשני פעימות והמשיכו לדגור על התרמומיקסר במשך 4 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור ב-500 סל"ד. תפזר 30 שניות בין דגימות כדי להיות עקבי.
    הערה: בדיקת DMS היא תגובה מיידית המאפשרת רזולוציה זמנית גבוההשל 14 של מצב זיווג בסיסי RNA. כדי למנוע שינוי רציף ב-DMS, חשוב לכבות במהירות את סימון ה-DMS באמצעות חומר המפזר החזק β מרקפטואתנול. יתרה מזאת, כל DMS שנותר יפגע בהתאוששות RNA בעת ההוצאה. הוספת אלכוהול איזואמיל רווי במים לפני הצנטריפוגה יכולה להסיר שארית DMS בלתי מסיסה בכדור התא15. השלב הזה רגיש מאוד לזמן. חשוב לעבוד עם מספר מוגבל של דגימות כדי לייצר נתונים אמינים.
    אזהרה: DMS הוא נוזל רעיל מאוד, חסר צבע, עם ריח קל דמוי בצל. נדרשים אמצעי זהירות קיצוניים בעת עבודה עם DMS. מגע ישיר ו/או שאיפה של אדים עלולים לגרום לנמק בעיניים, בפה ובדרכי הנשימה, כולל נזק חמור לאיברים. השתמש במשקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות מתאימות. כפפה כפולה מתי שאפשר והחלפת כפפות מיד עם חשיפה או אחרי השימוש ב-DMS. בצע שלבים עם DMS מתחת למכסה אדים. השתמש במיכלי פסולת ייעודיים לטיפול ב-DMS.
  3. כיבוי וכיבוש
    1. הכינו בופר לעצירה ושטיפה מראש כפי שמצוין בטבלה 1 והניחו על הקרח עד השימוש. עצור את המתילציה של DMS על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר עצירה.
    2. סובב את הדגימות המסומנות ב-DMS למשך 5 דקות בעוצמה של 3,500 x גרם בצנטריפוגה מקוררת מראש. השליכו את הפסולת למיכל פסולת מתאים.
    3. הוסף 1 מ"ל של בופר שטיפה לפלט ותשהה מחדש. חזור על שלב 3.3.2. המשיכו מיד להפקת RNA. אל תקפיאו את כדור השמרים.
  4. הפקת פנול כלורופורם
    1. החזירו את השמרים המסומנים על ידי DMS ב-600 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA, ואז העבירו את ההשעיה לצינורות המכילים 40 מיקרוליטר של 20% SDS. דגרו ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עם ניעור ב-950 סל"ד.
    2. הוסף 650 מיקרוליטר חומצה מחוממת מראש פנול:כלורופורם לליזאט השמרים והמשך לחמם על התרמומיקסר למשך 2 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-950 סל"ד. תן לדגימות לעמוד על הקרח במשך 5 דקות.
      הערה: בינתיים, החלף את בלוק החום או התרמומיקסר לטמפרטורת החדר (RT).
    3. צנטריפוגה ב-20,000 x g למשך 3 דקות ב-RT.
    4. העבר את השכבה העליונה לצינור חדש והוסיף 650 מיקרוליטר כלורופורם. מערבולת לרגע. צנטריפוגה שוב ואסוף את השכבה העליונה בצינור חדש המכיל 700 מיקרו-ליטר איזופרופנול.
    5. הפוך לערבוב ודגרה במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך 30 דקות, כדי לאפשר ל-RNA לשקוע. צנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 45 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט. שטפו את הכדור ב-750 מיקרוליטר של 75% אתנול (EtOH).
      הערה: זו נקודת עצירה/הפסקה בפרוטוקול. ניתן להשאיר את הדגימות ב-75% EtOH בלילה בטמפרטורה של -80°C.
    6. סובב 3 דקות בעוצמה של 20,000 x g וזרוק את הסופרנטנט. ייבשו באוויר את כדור ה-RNA והמיס אותו ב-81 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. כמת את תפוקת ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר שמוגדר לאורך גל של 260 ננומטר. מרחים 1 מיקרו ליטר מהמתלים המחודשים הנ״ל למדידה. לדלל את דגימת ה-RNA במידת הצורך. לפחות 80 מיקרוגרם RNA כולל צריכים להיות נוכחים כדי להתקדם לשלב הבא.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לאחסן RNA המסומן על ידי DMS בטמפרטורה של מינוס 80°C למשך עד שבועיים.

4. RNA מתהוות (CoSTseq)

הערה: סך ה-RNA שהתקבל מההפנול: חילוץ כלורופורם מכיל RNA בוגרים מסומנים ב-DMS וכן RNA ביוטינילציה מתויגים על ידי DMS מכל שלושת הפולימראזים. כדי לטהר את ה-RNA המתהוות מתוך רנ"א מלא, השלבים הבאים ישתמשו בחרוזי סטרפטווידין להעשיר את ה-RNA הביוטינילציה הצעירה. עקב הזיקה החזקה של ביוטין לסטרפטווידין (Kd = 10-14 - 10-15 M), מתבצעות שתי הפקות RNA רצופות (ראו טבלת חומרים) כדי להוציא את ה-RNA מחרוזי הסטרפטווידין. שימו לב שפחות מ-1% מה-RNA של השמרים הוא RNA מתחיל, בהתאם למצב הגידול16.

  1. משיכת ביוטין
    1. הכנת חרוזי מגנטיות של סטרפטווידין
      1. הכינו את בופר השטיפה A ואת בופר השטיפה הראשונה B כפי שמוצג בטבלה 1 להרכב. הומוגניזציה של חרוזי סטרפטווידין מגנטיים על ידי מערבולת (וורטקס). השגת 44 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים הומוגניים לכל דגימה של 80 מיקרוגרם RNA כולל.
        הערה: הגדילו את הגודל על ידי הכפלת הנפח במספר הדגימות.
      2. הנח את החרוזים המגנטיים על מתקן המגנטי והסר את תמיסת האחסון. החזירו את החרוזים המגנטיים ב-1 מ"ל של בופר קדם-שטיפה A.
      3. דגרו במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מגנטיזציה והסר את הסופרנטנט. חזור על הכביסה. שטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של בופר שטיפה מוקדם B. מגנטיז והסר את הסופרנאנט, והמשיך במהירות לשלב הקישור והכביסה.
    2. כריכה וכביסה
      1. הכינו את בופר הקישור 2x, 1x בופר קשירה, מלח גבוה ומלח נמוך כפי שמוצג בטבלה 1.
      2. החזיר את החרוזים השטופים מראש על ידי הוספת פי שניים הנפח המקורי (88 מיקרוליטר) של בופר קישור כפול. העבר 80 מיקרוליטר של חרוזים לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל המכיל 80 מיקרוליטר של דגימת RNA ביוטינילית.
      3. סובב את תערובת הדגימה של החרוזים על סיבוב למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. אסוף את ה-RNA הבוגר המכיל את הזרימה דרך דרך שלב מגנטי (המשך לשלב המשקעים).
      4. שטוף את קומפלקס ה-RNA שנולד עם 500 מיקרוליטר של בופר מלח גבוה פעמיים. בצע שטיפה אחת עם 500 מיקרוליטר של קישור 1x ואחריה שטיפה אחת עם 500 מיקרוליטר של בופר מלח נמוך.
  2. שחרור באמצעות חילוץ RNA
    1. חממו תרמומיקסר ל-60 מעלות צלזיוס. קרר צנטריפוגה שיכולה להגיע למהירות של 20,000 x g עד 4 °C.
    2. הוסף 300 מיקרוליטר של תגובת RNA (ראו טבלת חומרים) למתחם RNA שנוצר מהחרוז והשעה מחדש. דגרו על תרמומיקסר למשך 5 דקות ומכוונים ל-60 מעלות צלזיוס.
    3. הוסיפו 60 מיקרוליטר כלורופורם, מערבולת, ודגרו 3 דקות ב-RT. סובבו ב-14,000 x גרם למשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש.
    4. העבר את הפאזה המימית העליונה לצינור איסוף חדש (~180 מיקרוליטר). השליכו את השלב האורגני, והשאירו את החרוזים ואת השלב המימי שנותר.
    5. חזור על החילוץ כדי להגיע לנפח סופי של 360 מיקרוליטר פאזה מימית בצינור האיסוף.
    6. הוסיפו 360 מיקרוליטר כלורופורם לצינור האיסוף ולמערבולת לזמן קצר. סובב ב-14,000 x g במשך 5 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש.
    7. העבר (כ-350 מיקרוליטר) מהשכבה העליונה לצינור חדש. השקיעו את ה-RNA על ידי הוספת 900 מיקרוליטר של EtOH מוחלט ו-1 מיקרוליטר של משקע משותף.
    8. מערבולת לזמן קצר ומאפשרת למשקעים להתרחש בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך 20 דקות או מינוס 80 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
    9. בצנטריפוגה המקוררת מראש, צנטריפוגה בעוצמה של 20,000 x g למשך 20 דקות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    10. שטפו את הכדור עם 750 מיקרוליטר של 75% EtOH, ואחר כך בצנטריפוגה קרה נוספת ב-20,000 x גרם למשך 5 דקות.
    11. ייבשו את הכדור כדי להסיר שארית EtOH למשך 10 דקות. המיס את כדור ה-RNA ב-3.75 מיקרוליטר שלH2O.
      הערה: טחינת נקודות של ה-RNA המוחלף ואחריה חקירה עם סטרפטווידין-HRP היא השיטה היעילה ביותר להערכת משיכת הביוטין. עם זאת, גישה זו צורכת כמות משמעותית מחומר הדגימה, ומשאירה חומר לא מספק להכנת הספרייה.
  3. השקעה של סופרנטנט
    1. השקיעו את הסופרנטנט המכיל RNA בוגרים על ידי הוספת 2.5-3 נפחי EtOH. אפשרו למקם משקעים בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך שעה.
    2. בצנטריפוגה מקוררת מראש, סובבו במשך 45 דקות בעוצמה של 20,000 x g. שאפו בזהירות את הסופרנטנט.
    3. שטוף את כדור ה-RNA עם 0.5 מ"ל של 75% EtOH. ייבשו והמסו את הכדור ב-50 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. הנח את הצינור על בלוק חום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי לשפר את המסה של כדור ה-RNA.
    4. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר לשלבים הבאים.

5. RNA בוגר (DMS-MaPseq)

  1. בחירת פולי A
    הערה: ה-RNA הבוגר הפוליאדנילי מטוהר באמצעות לכידת אפיניות מבוססת חרוזים מסוג oligo(dT). פרוטוקול זה מותאם לשימוש בערכת Dynabeads mRNA DIRECT טיהור (ראו טבלת חומרים). כהכנה ראשונית, חממו 1 מ"ל מים נטולי נוקלאז ל-80 מעלות צלזיוס לצורך שחרור ומכוון את בלוק החום ל-70 מעלות צלזיוס.
    1. הכנת RNA למשיכה בפולי A: העבר 50 מיקרוגרם של RNA ששקע והעלה אותו לנפח סופי של 300 מיקרוליטר עם מים ללא נוקלאז. חממו את ה-RNA בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות כדי לשבש מבנים משניים והניחו אותו על הקרח מיד. ערבבו את ה-RNA עם 300 מיקרוליטר של בופר ליזיס/קישור ומערבולת לזמן קצר.
    2. הכנת חרוזים מגנטיים: הביאו את החרוזים המגנטיים למצב השהייה על ידי מערבולת למשך לפחות 30 שניות. העבר 100 מיקרוליטר של חרוזים תלויים לכל דגימה לצינור סטרילי בנפח 1.5 מ"ל. מגנטיז כדי להשליך את בופר האחסון. שטוף את החרוזים המגנטיים בנפח שווה של בופר ליזיס/קשירה, מגנטיז, וזרוק את הסופרנאנט.
    3. כריכה וכביסה
      1. הוסיפו את 100 מיקרוליטר של חרוזים שנשטפו מראש ל-600 מיקרוליטר של RNA דגימה מוכנה. סובב ברצף על רוטטור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. אספו את החרוזים על ידי הנחתם על מתקן מגנטי והשליכו את הזרימה. שטוף את החרוזים עם 600 מיקרוליטר של בופר כביסה A. פיפט לערבוב.
      3. אסוף את החרוזים שוב כדי להשליך את השטיפה. שטפו את החרוזים עם 300 מיקרוליטר של בופר כביסה B. פיפט לערבוב.
      4. אסוף את החרוזים שוב כדי להשליך את השטיפה. מערבבים את החרוזים עם 90 מיקרוליטר מים חמים (80 מעלות צלזיוס) ומאפשרים קישור על ידי הוספת 90 מיקרוליטר של ליזיס/בופר קישור. חזור על שלב 5.1.3.1-5.1.3.3.
    4. שחרור: החזירו את החרוזים למים חמים (80 מעלות צלזיוס) ללא נוקלאז ב-30 מיקרו ליטר (80 מעלות צלזיוס). דגרו בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס עד 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. חשוף את החרוזים לשדה מגנטי במהירות ואספו את ה-eluate לצינור ללא RNase. חזור על ההסרה ואסף את ה-RNA המשוחרר.
  2. פיצול
    הערה: ניתן להשיג פיצול של mRNA באמצעים אנזימטיים או כימיים. כאן, כלוריד אבץ וחום משמשים לפירוק. בניגוד לאנזימים שדורשים רצף מסוים או אלמנטים מבניים, יוני אבץ פועלים כחומצת לואיס כדי להפעיל את החמצן בגודל 2' (נוקלאופיל) ולפצוע את עמוד השדרה של הפוספודיסטר. כתוצאה מכך, נוצרים אסטר פוספט מחזורי בקוטר 5' OH ו-2',3' על גדילי RNA17.
    1. חממו את התרמחזור עם טמפרטורת הבלוק על 94 מעלות צלזיוס וטמפרטורת מכסה ל-105 מעלות צלזיוס. הניחו 54 מיקרול mRNA שנשפך לתוך צינור PCR.
    2. הוסיפו 6 מיקרוליטר של תמיסת כלוריד אבץ 100 מ"מ (ריכוז סופי של 10 מ"מ), מערבולת למשך 2 שניות, ומיד דגרו בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך 55 שניות על התרמחזור המחומם מראש.
    3. בסיום הדגירה, כיבוי תגובת השבר ב-6.6 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי של 50 מ"מ), מעלה ומטה את הפיפטה לערבוב, ומניחים במהירות את הצינורות על קרח. העבר את התכולה לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל.
    4. לאפשר השקיעה של mRNA מפורקים עם תוספת של 150 מיקרו-ליטר איזופרופנול, 15 מיקרוליטר של 3 מ' נתרן אצטט, pH 5.2, ו-1 מיקרוליטר של קו-משקע.
    5. שים ב-20 מעלות צלזיוס ל-30 דקות. סובב ב-20,000 x גרם במשך 45 דקות בצנטריפוגה מקוררת מראש. שטפו את הכדור עם 75% EtOH והמסו אותו ב-15 מיקרו-ליטר מים ללא נוקלאז.
  3. טיפול ב-PNK
    הערה: פירוק כימי עם ZnCl2 יוצר קצוות 5' ו-3' שאינם מתאימים לקישור17. לכן, לאחר הפיצול הכימי, ה-RNA נחשפים לטיפול בפולינוקלאוטיד קינאז (PNK), שמזרחן את ה-5' OH ודפוספורילאט קצות פוספט באורך 3' , שניתן לקשר אותם למתאם18.
    1. הוסף 1 מיקרוליטר מעכב ריבונוקלאז, 2 מיקרוליטר של 10x PNK בופר, ו-2 מיקרוליטר T4 PNK. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. עצרו את התגובה על ידי הוספת 30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז, 50 מיקרוליטר של בופר קישור RNA, ו-50 מיקרוליטר של EtOH.
    2. השתמשו בשיטת טיהור RNA מבוססת עמודת ספין להסרת מזהמים וריכוז ה-RNA. ניתן לעשות זאת באמצעות ערכה מסחרית זמינה (ערכת RNA Clean and Concentrator, ראו טבלת חומרים). בקיצור, מערבבים שני נפחים של בופר קשירת RNA עם נפח אחד של דגימה, ערבבו נפח שווה של התערובת הזו עם 100% EtOH, וטענו על עמודת הסיבוב עם צינור איסוף טרי. סובב את הדגימה הזו והשליך את הזרימה. שטפו את עמודת הסיבוב עם 700 מיקרוליטר של בופר שטיפת RNA ופעם אחת עם 400 מיקרוליטר של בופר שטיפת RNA. זרוק את הזרימה דרך. סובבו את העמוד הריק למשך דקה אחת כדי להבטיח הסרה מלאה של בופר הכביסה.
    3. שחרר את ה-RNA ב-10 מיקרוליטר מים חמים ללא נוקלאז.
      הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגציה ב-10,000 - 16,000 x g ב-RT למשך 30 שניות.

6. תגובת תעתיק הפוכה באמצעות החלפת תבניות

הערה: ה-RNA המתפתח ממשיכת ביוטין (שלב 4.2) ו-mRNA מפורק לאחר טיפול ב-PNK (שלב 5.3) עוברים את השלבים הבאים להכנת ספרייה (ראו איור 1 ואיור 2). בקצרה, יוכנה דופלקס התחלתי לתבנית RNA סינתטית/DNA פריימר (מתאם R2 RNA/DNA heteroduplex) שעליו ניתן לבצע החלפת תבנית. הטרודופלקס זה מספק רצף משלים קצר שמאפשר החלפת תבנית באמצעות טרנסקריפטאז הפוך (RT) להחלפת גדיליים, כלומר כאשר ה-RT משנה את הגדילים מה-RNA לפריימר ה-DNA, וכך מאפשר סינתזת cDNA חלקה מה-RNA לרצף המתאם. כאן נעשה שימוש ב-Induro reverse transcriptase, שנבדק ואופטימיזם עבור פרוטוקול זה. תמלולים הפוכים אחרים עם החלפת תבניות יכולים לשמש להכנת ספריית CoSTseq במידת הצורך, אך דורשים אופטימיזציה מצד המשתמש.

  1. רצפי מתאם הטרודופלקס DNA/RNA
    הערה: מתאמי ההטרודופלקס DNA/RNA המשמשים לשעתוק הפוך של דגימת DMS-MaPseq זהים לאלו המפורטים ב-Xu ואחרים. 7 ושהוזכרו על ידי שרפן ואחרים.
    1. עבור מתאם ההטרודופלקס DNA/RNA שישמש לשעתוק הפוך של דגימת CoSTseq, השתמש במתאם עם 'G' באזור הבליטה. זה יאפשר ל-G ללכוד את הביוטין-C בקצה 3' של ה-RNA. אם משתמשים ב-NTP ביוטינילציה שונה, ערכו את פריימר ה-DNA ההטרו-דופלקס כך שיהיה הנוקלאוטיד הזוגי המתאים כגלגול (ראו טבלה 2).
    2. עבור מתאם DMS-MaPseq, ודא שיש N overbel יחיד, בהתחשב בכך שהקצה של 3' יהיה אקראי לאחר פיצול. לסקירה של שלבי ההכנה הבאים לספרייה, ראו איור 2.
  2. הכנת שילוב DNA/RNA להחלפת תבניות: הכינו 1 מיקרומום של פריימרים R2 RNA ו-R2R בבופר המורכב מ-10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ו-1 mM EDTA. דגרו את תערובת הפריימר בטמפרטורה של 82 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואז קררו ל-25 מעלות צלזיוס בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה. עלי את התערובת ומקפיאים לשימוש מאוחר יותר.
  3. תמלול הפוך בהחלפת תבניות
    1. הוסיפו את המגבים הבאים ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר: 2 מיקרוליטר של בופר תגובה 5x, 1 מיקרוליטר של 1 מיקרומו dna/RNA הטרודופלקס (השתמשו בהטרודופלקס המכיל בליטה יחידה של G לדגימת CoSTseq; השתמשו בהטרודופלקס המכיל חטיפת N אקראית לדגימת DMS-MaPseq), 0.5 מיקרוליטר אנזים, 0.5 מיקרוליטר מעכב RNase, 3.75 מיקרוליטר דגימת RNA (או הוסף מים להשגת נפח כולל של 7.75 מיקרוליטר).
    2. דגרו את התערובת הזו (בלי dNTPs) למשך 30 דקות ב-RT. לאחר מכן הוסף 1.25 מיקרוליטר של 10 מ"מ dNTP לתגובה ומיישם את תנאי המחזור הבאים בתרמחזור: 25 מעלות צלזיוס ל-10 דקות, 42 מעלות ל-10 דקות, 50 מעלות ל-10 דקות, 55 מעלות ל-10 דקות, 60 מעלות ל-30 דקות, 65 מעלות צלזיוס ל-20 דקות, 75 מעלות צלזיוס ל-15 דקות.
    3. הוסיפו 1 מיקרוליטר של RNase H ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. טיהור תגובת ה-PCR באמצעות שיטת טיהור DNA מבוססת עמודה להסרת פריימרים, נוקלאוטידים ואנזימים שנותרו. יצא בנפח סופי של 20 מיקרוליטר.

figure-protocol-1
איור 2: ייצוג סכמטי מפורט של הכנת ספריית CoSTseq. RNA מתהום הנושא קצה 3' ביוטינילציה מודגר עם מתאם החלפת תבנית המכיל בליטה G שמשלים את הביוטין-CTP. עבור RNA בוגר מפוצל (DMS-MaPseq), משתמשים במתאם עם N-overbolt (ראו איור 1). סינתזת cDNA מתבצעת באמצעות טרנסקריפטאז הפוך מאוד מעבד, כגון טרנסקריפטאז הפוך של קבוצה II של אינטרון (TGIRT), ואחריו טיפול ב-RNase H לפירוק גדיל ה-RNA. בהמשך, ליגאזות 5' של App DNA/RNA מקשר את קצה ה-5' (rApp) של הקישורN7 UMI ל-3' OH של ה-cDNA חד-גדילי. מתאם N7 UMI כולל קצה חסום בקוטר 3′, שמונע קשירה עצמית בין המתאמים. לבסוף, הגברת PCR מתבצעת באמצעות פריימרים הכוללים אזורים חופפים ובליטות 5 רגל הנושאות ברקודים ייחודיים של Illumina i5 ו-i7 לכל דגימה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

7. קישור מתאם 5' להכנת ספריות cDNA סופיות לריצוף תגיות בקצה זווג

  1. הכנת מתאם בקצה 5 רגל
    1. אדנילט את המתאם בקצה 5' באמצעות תגובה מבוססת ליגאזות RNA (למשל, ליגס MTH RNA, המופיע בטבלת החומרים) עם רכיבי התגובה הבאים: 8 מיקרוליטר של בופר תגובה אדנילציה של 10x 5'-DNA, 8 מיקרוליטר של 1 mM ATP, 100 מיקרומולן DNA R1R (זהו פריימר TruSeq המכיל מזהה מולקולרי ייחודי או UMI), 8 מיקרוליטר של ליגס RNA Mth, 52 מיקרו ליטר מים ללא נוקלאז.
      הערה: לפרטים הנוגעים לעיצוב מתאם N7 UMI, ראו טבלה 2 ואיור 2.
    2. דגרו את התגובה הזו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה, ואז בטמפרטורה של 85 מעלות למשך 5 דקות. המשיכו לטהר את המוצר באמצעות משקעים של EtOH או באמצעות שיטת ניקוי DNA מבוססת עמודת סיבוב סיליקה-ממברנה לבידוד cDNA, בהתאם להוראות היצרן.
    3. בהשקעה ב-EtOH, ניתן להשקיע DNA בטמפרטורה של -20°C (מינימום 20 דקות) באמצעות אצטט נתרן (pH 5.2) בריכוז סופי של 0.3 מ' ו-2x2.5 של 95%-100% EtOH קר. צנטריפוגה את התגובה המונעת מ-EtOH במשך 15 דקות במהירות מקסימלית בצנטריפוגה מקוררת מראש (4°C), שטפו את הכדור ב-70% EtOH, צנטריפוגה מחדש, וייבשו את הכדור באוויר. החזיר (או שחרר, אם משתמשים בעמוד סיבוב) את הכדור ב-40 מיקרו ליטר של מים ללא נוקלאז. אחסן בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך.
  2. קשירת מתאם 5'
    1. לנפח תגובה יחיד של 20 מיקרוליטר, הוסף את הרכיבים הבאים ל-10 מיקרו-ליטר של cDNA: 2 מיקרוליטר של 10x NE Buffer 1, 2 מיקרוליטר של 50 mM MnCl2, 2 מיקרוליטר של 5' AppDNA/RNA ליגאז, 4 מיקרוליטר של 10 מיקרומום (100 ng/μL) של המתאם האדניליטיבי משלב 7.1.
    2. דגרו את התגובה הזו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ואז 3 דקות בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס. נקה את התגובה באמצעות ערכת טיהור minElute PCR ונפח סופי של 20 מיקרוליטר מים ללא נוקליאז.
  3. הגברה מינימלית של PCR של ספריות cDNA עם בדיקת פיילוט
    1. לפני הממשיך, יש להכין מלאי של 10 מיקרומום של פריימרים אינדקסים המכילים ברקודים ייחודיים. כל מדגם CoSTseq או DMS-MaPseq ייחודי צריך לכלול ברקוד ייחודי לניתוח חלק במורד הזרם. ראו רצפי פריימרים בטבלה 2. הפריימרים המכילים ברקוד קדימה ואחורה יכולים להיות משולבים בתערובת 1:1 ומאוחסנים כמיקס ברקוד.
    2. באמצעות 2 מיקרוליטר של מוצר PCR מהשלב 7.2, יש להוסיף 2.5 מיקרוליטר של בופר PCR באיכות גבוהה (למשל, בופר HiFi מסחרי), 0.375 מיקרוליטר של dNTP (10 מילימטר), 0.75 מיקרוליטר של פרה-מיקס ברקודינג (או 0.375 מיקרוליטר של פריימרים ייחודיים של ברקודינג i5 ו-i7), 0.25 מיקרוליטר של פולימראז DNA חם באיכות גבוהה (למשל, אנזים Hot Start מסחרי של HiFi), 6.625 מיקרול מים ללא נוקלאז.
    3. דגרו תגובה זו ב-95 מעלות צלזיוס, וחזרו על [15 ש' 98 מעלות צלזיוס, 30 ש' 62 מעלות צלזיוס, 30 ש' 72 מעלות צלזיוס] במשך 23 מחזורים, וסיים בדקה אחת של דגירה בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס. הרץ על ג'ל אגרוז 1% כדי להחליט על מספר המחזור האופטימלי.
      הערה: כדי לבדוק תנאי מחזור נמוכים, ניתן להכין דגימה בסוף מחזור נמוך יותר (למשל, סוף 15 או 16 מחזורים) ולהריץ אותה על ג'ל אגרוז כדי להשוות את עוצמת טביחת ספריית ה-cDNA על ג'ל אגרוז לאורך מחזורים.
  4. PCR סופי להגברת ספרייה
    1. באמצעות 18 מיקרוליטר של מוצר PCR מהשלב 7.2, הוסיפו את הדברים הבאים מערכת KAPA HiFi PCR: 22.5 מיקרוליטר של בופר PCR באיכות גבוהה, 3.375 מיקרוליטר dNTP (10 מ״מ), 6.75 מיקרוליטר של פרה-מיקס ברקודינג (או 3.375 מיקרוליטר של פריימרים ייחודיים של ברקודינג i5 ו-i7), 2.25 מיקרוליטר פולימראז DNA חם באיכות גבוהה, ו-59.625 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
    2. דגרו תגובה זו ב-95 מעלות צלזיוס, וחזרו על [15 שניות 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות 62 מעלות צלזיוס, 30 שניות 72 מעלות צלזיוס] עבור מספר המחזורים שנקבעו בשלב 7.3. לסיים עם דגירה של דקה אחת בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס.
  5. בחירת גודל
    1. בצע בחירת גודל על מוצר ה-PCR באמצעות טיהור פרמגנטי מבוסס חרוזים (למשל, AMPure XP או מקביל). יש להשתמש ב-1.3 פעמים נפח החרוזים (למשל, לתגובה PCR של 50 מיקרוליטר, השתמש ב-65 מיקרוליטר של תערובת חרוזים) וערבב היטב עד לאחידות. תן לחרוזים לקשור את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: יחס הדגימה לחרוזים זה ביחס 1:1.3x מאפשר הסרת דימרים של מתאם פריימר ומבטיח שחלקי DNA שנשמרו יהיו קטנים מ-150 bp ולא גדולים מ-800 bp.
    2. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים והמשיך לשטוף אותם עם 80% EtOH לפי פרוטוקול היצרן.
    3. מבצע את התוצר הסופי ב-11 מיקרוליטר. הרץ 1 מיקרוליטר על ג'ל אגרוז לאימות ספריות. הגישו את המוצר הסופי לריצוף.

8. ניתוח נתונים

הערה: חבילת CoSTseq המלאה וקוד הניתוח זמינים ב-GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), וזרימת העבודה לניתוח מוצגת באיור 3. צינור זה תוכנן לטפל גם בנתוני ריצוף CoSTseq וגם ב-DMS-MaPseq. CoSTseq משתמשת ב-Snakemake, תהליך עבודה ביואינפורמטי שמקביל ניתוח בקלות על ידי אופטימיזציה של מספר ליבות המעבד הזמינות19. זרימת העבודה מוגדרת על ידי קובץ נחש, שמורכב מקבוצה של חוקים שקובעים את הניתוחים שיופעלו. אין צורך לשנות את קובץ ה-Snakefile הזמין בעת התקנת חבילת GitHub.

  1. כוון את קובץ ההגדרה (קובץ .yaml) עם מסלולי הקובץ הנכונים למקום שבו הנתונים הגולמיים מאוחסנים. בהגדרות אלו צריך להיות נתיב לרצפי המתאמים ולשמות הדגימות הנלווים. שנו את קובץ הקונפיגורציה כדי להריץ ניתוחים ספציפיים שהוגדרו ב-Snakefile.
  2. כדי להתחיל בניתוח, הורד קריאות סופיות זוויות גולמיות בפורמט fastq.gz. קריאות תהליך באמצעות fastp20 כדי לקצר רצפי מתאם ומסנן איכות לקריאות עם ציוני Phred של לפחות 20. יישר את הקריאות הללו לגנום הייחוס באמצעות STAR21 ליצירת קבצי BAM.
  3. כאישור נוסף, המחישו את קבצי ה-BAM שנוצרו לאחר הרצת צינור ניתוח CoSTseq בדפדפן Integrated Genome Viewer (IGV). באמצעות IGV, קבצי BAM אמורים להיות ניתנים לפרשנות בקלות כדי להראות קריאות לאורך כל חלקי הגנים הרלוונטיים, מה שמעיד שקריאות מייצגות RNA מתחילה. כמצופה, קריאות RNA בוגרות צריכות להראות כיסוי מינימלי באזורים אינטרוניים, בהתחשב בכך שקריאות אלו צפויות להיות נגזרות מתמלילים בוגרים וסביר להניח שמחוברים ביעילות.
  4. השתמש בפלט fastp (קובץ .html שניתן לפתוח בדפדפן) עבור אחוז משוער של קריאות כפולות. שימו לב שקריאות CoSTseq עשויות להיות כפולות מאוד, מה שמדגיש את הקריטיות של השלב הבא.
  5. באמצעות UMICollapse22, קריאות דה-כפולות כדי לקרוס קריאות עם UMIs ויישורים זהים, מה שמאפשר שימור קריאות ייחודיות בלבד והפחתת הטיית PCR. הקבצים המתקבלים צריכים להיות נקיים מקריאות כפולות ובפורמט BAM, שבו קריאות המתיישרות ל-rRNA יופרדו מאלו הקשורות לגנים שלא-rRNA.
  6. לרכיב המרכזי האחרון של צינור CoSTseq המודולרי, השתמש במימוש מותאם אישית בפייתון כדי לחשב את ספירת המוטציות וכיסוי קריאה על כל נוקלאוטיד. הפונקציות המתארות מימוש זה נמצאות בקוד המקור ב-GitHub, וקובץ ה-Snakefile מפרט את הקלט, הפלט, הפרמטרים והפונקציות ליצירת הנתונים המאוחסנים בפורמט .pkl.
    הערה: ישנם מגוון רחב של ניתוחים נוספים שניתן לבצע באמצעות צינור ניתוח CoSTseq, אם כי פרמטרים עשויים לדרוש אופטימיזציה לצרכי ניתוח מותאמים אישית. שיטה חשובה שהותאמה ל-CoSTseq היא HDProbe, חבילת R המאפשרת השוואות כלל-גנומיות של קצבי מוטציה10. בקצרה, HDProbe דורשת נתונים מכל השכפולים ויכולה לסווג באופן שיטתי הבדלים משמעותיים בשיעורי מוטציה בהשוואה לקבוצת הביקורת. סוגי ניתוחים נוספים שעשויים לרצות לבצע כוללים חיזוי מבנה בהתבסס על תגובתיות DMS ניסיונית. ניתן לבצע זאת באמצעות חבילת RNAstructure23.

figure-protocol-2
איור 3: שלבי הניתוח והפלטים הצפויים של צינור ניתוח CoSTseq המודולרי. שלבי ניתוח, המצביעים על שימוש מומלץ בכלים קיימים בנוסף לצינור ניתוח CoSTseq המוכן לשימוש עם קבצי הפלט הצפויים והתוכן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מציג את התוצאות בפועל שנוצרו על ידי יישום זרימת העבודה והניתוח של CoSTseq, כפי שמתואר בפרוטוקול זה. ראשית, סעיף זה מתאר תוצאות צפויות לאחר הערכת איכות של הכנות מוצלחות בספרייה לפני ואחרי הריצוף. לפני ריצוף, חוקרים יכולים להשתמש בניתוח PCR ו-TapeStation כדי לאשר את נוכחות ה-RNA לאחר העשרת ביוטין. דבר זה מצביע על בידוד מוצלח של RNA מתהוות במהלך הכנת ספריית CoSTseq. הערכת איכות הנתונים לאחר ריצוף, לדוגמה, באמצעות בדיקה ויזואלית של כיסוי הקריאה ולאחר מכן באמצעות ניתוח מותאם מבוסס פיי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA מתחיל להתקפל קו-טרנסרפציה עקב קינטיקה מהירה יותר של זיווג בסיסים לעומת קצב הסינתזה 24,25,26,27. הידע הנוכחי שלנו על קיפול RNA מתחיל מגיע ממחקרים חד-מולקוליים של RNA פרוקריוטי, חקירת חוץ-גופה, או בגישות סילקו. בפרוטוקול זה מוצג תהליך עבודה מפורט של CoSTseq; טכניקה זו מאפשרת זיהוי בתוך ה-vivo של קיפול קו-טרנספריפסיונלי של תעתיקים מת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד"ר SK Boopathy Jegathambal על הקידוד ולחברי מעבדת Neugebauer, במיוחד P. Bech, על הדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01GM112766 ל-KMN) ומלגת קדם-דוקטורט מהאגודה האמריקאית ללב (908949 ל-LS). LPS נתמכה על ידי מענק הכשרה של NIH 5T32GM14943803. LRAB נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מהאגודה האמריקאית ללב (26POST1569544). איסוף הנתונים במרכז ייל לניתוח גנומי נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר 1S10OD03036301A1. עבודה זו היא באחריות המחברים בלבד ואינה בהכרח מייצגת את הדעות הרשמיות של ה-NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10mM ATPInvitrogen18330019
10mM ביוטין-11-CTPמדעי הביולוגיה של ינהNU-831-BIOX
10mM GTPInvitrogen18332015
10mM UTPInvitrogen18333013
10X NEBuffer 1ניו אינגלנד ביולאבסB7001Sבשימוש בשלב 7.2.1
10X מלח מפוזר עם מאגר זרחן (PBS)גיבקו70011-044
20% SDSRPI L23100-500
פנול חומצי: כלורופורם אמביוןAM9722
חרוזי AMPure XP לבחירת גודלבקמן קולטר A63880משמש לבחירת גודל בשלב 7.5.1
בקטו פפטוןגיבקו211677
תמצית שמרי בקטוגיבקו212750
ביסיןסיגמא אולדריץ'B3876-100G
כלורופורםסיגמא אולדריץ'319988
D-(+)-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G5767-500G
דיפקו אגרBD DIFCO214010
דימתיל סולפטסיגמא אולדריץ'D186309-5ML
Dynabeads & Trade; חרוזי MyOne Streptavidin C1  Invitrogen65001משמש למשיכת ביוטין בסעיף 4.1
Dynabeads & Trade; mRNA DIRECT™ ערכת טיהורInvitrogen61011משמש לבחירת Poly A בסעיף 5.1
EDTA, pH 8, 0.5Mסיגמא אולדריץ'  03690-100ML
אתנולסיגמא אולדריץ'E7023-500ML
גליקובלוInvitrogenAM9516קו-פרספיטנט בשימוש בשלבים 4.2.7 ו-5.2.4
Induro®   טרנסקריפטאז הפוךניו אינגלנד ביולאבסM0681Sאנזים RT בשימוש בשלב 6.3.1
אלכוהול איזואמילסיגמא אולדריץ'  W205710-1KG-K
איזופרופנולJT-בייקר9084-05-01
ערכת PCR של KAPA HiFi HotStart    רוש07958889001DNA באיכות גבוהה Pol שימש ב-7.3.2 ו-7.4.1 לתגובות PCR
כלוריד מגנזיוםסיגמא אולדריץ'SLCM2154
ערכת טיהור PCR MinEluteקיאגן28004משמש לניקוי DNA בשלבים 6.3.3 ו-7.2.2
ליגאס ה-RNA ה-Mthניו אינגלנד ביולאבסM2611A
אוליגו קלין & מתרכזמחקר זימוD4060מומלץ לניקוי DNA של אוליגו בשלב 7.1.2
אשלגן אצטט סיגמא אולדריץ'236497-500G
כלוריד אשלגןJT בייקר3040-01
אשלגן הידרוקסידאוונטור6984-04-01
RNA Clean & מרוכז-5מחקר זימוR1014ערכת ניקוי RNA ששימשה בשלב 5.3.2 לאחר טיפול PNK
RNaseOUT™ מעכב ריבונוקלאז רקומביננטיתרמו פישר סיינטיפיק10777019מעכב RNase ששימש בשלב 5.3.1 במהלך טיפול ב-PNK
סרקוסילIBI ScientificIB07080
נתרן אצטטאיכות ביולוגית351-035-721
כלוריד נתרןסיגמא אולדריץ'S5150-1L
נתרן הידרוקסיד מקרון7708-10
SUPERase&MIDDOT; In&Trade; מעכב RNase (20 U/μ L)תרמו פישר סיינטיפיקAM2696מעכב RNase בשימוש בשלב 6.3.1
קינאז פולינוקלאוטידי T4ניו אינגלנד ביולאבסM0201S
תרמוסטביל 5' ליגאז DNA/RNA של אפליקציהניו אינגלנד ביולאבסM0319L
טריס-HCl, pH 7.4, 1Mתרמו-סיינטיפיקJ60202. K2
טריטון X-100טקנובהT1105
טריזול וטרייד; ריאגנטInvitrogen15596-026לגבי שחרור RNA מתחיל בסעיף 4.2; המכונה גם "תגובת RNA" בסעיף 4
β-מרקפטואנולסיגמא אולדריץ'M6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural and biophysical dissection of RNA conformational ensembles. Current Opinion in Structural Biology. 88, (2024).
  3. Bose, R., Saleem, I., Mustoe, A. M. Causes, functions, and therapeutic possibilities of RNA secondary structure ensembles and alternative states. Cell Chemical Biology. 31 (1), 17-35 (2024).
  4. Rapakko, J., Scaravilli, M., Änkö, M. L. Interplay between RNA-protein interactions and RNA structures in gene regulation. FEBS Open Bio. , (2025).
  5. Rodgers, M., Woodson, S. A. A roadmap for rRNA folding and assembly during transcription. Trends in biochemical sciences. 46 (11), 889-901 (2021).
  6. Tomezsko, P., Swaminathan, H., Rouskin, S. DMS-MaPseq for Genome-Wide or Targeted RNA Structure Probing In Vitro. Methods in Molecular Biology. 2254, 219-238 (2021).
  7. Xu, H., Douglas, C. W., Lambowitz, A. M. Improved TGIRT-seq methods for comprehensive transcriptome profiling with decreased adapter dimer formation and bias correction. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  8. Lopes, R., Agami, R., Korkmaz, G. GROseq, A Tool for Identification of Transcripts Regulating Gene Expression. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1543, 45-55 (2017).
  9. Mahat, D. B., et al. Base-Pair Resolution Genome-Wide Mapping Of Active RNA polymerases using Precision Nuclear Run-On (PROseq). Nature protocols. 11 (8), 1455-1476 (2016).
  10. Schärfen, L., Vock, I. W., Simon, M. D., Neugebauer, K. M. Rapid folding of nascent RNA regulates eukaryotic RNA biogenesis. Molecular Cell. 85 (8), 1561-1574 (2025).
  11. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Functional steps in transcription initiation and reinitiation from the major late promoter in a HeLa nuclear extract. Journal of Biological Chemistry. 262 (8), 3452-3461 (1987).
  12. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Separation and partial characterization of three functional steps in transcription initiation by human RNA polymerase II. Journal of Biological Chemistry. 260 (13), 8163-8172 (1985).
  13. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), 75-82 (2017).
  14. Tijerina, P., Mohr, S., Russell, R. DMS foot-printing of structured RNAs and RNA-protein complexes. Nature Protocols. 2 (10), 2608-2623 (2007).
  15. Liebig, A., Waldsich, C. W. Probing RNA structure within living cells. Methods in enzymology. 468, 219-238 (2009).
  16. Pelechano, V., Chávez, S., Pérez-Ortín, J. E. A Complete Set of Nascent Transcription Rates for Yeast Genes. PLOS ONE. 5 (11), (2010).
  17. Wery, M., Descrimes, M., Thermes, C., Gautheret, D., Morillon, A. Zinc-mediated RNA fragmentation allows robust transcript reassembly upon whole transcriptome RNA-Seq. Methods. 63 (1), 25-31 (2013).
  18. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. The EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  19. Köster, J., Rahmann, S. Snakemake a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  20. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. fastp: an ultrafast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics (Oxford, England). 34 (17), i884-i890 (2018).
  21. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (1), 15-21 (2013).
  22. Liu, D. Algorithms for efficiently collapsing reads with Unique Molecular Identifiers. PeerJ. 7, (2019).
  23. Spasic, A., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C., Mathews, D. H. Modeling RNA secondary structure folding ensembles using SHAPE mapping data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 314-323 (2018).
  24. Saldi, T., Fong, N., Bentley, D. L. Transcription elongation rate affects nascent histone pre-mRNA folding and 3′ end processing. Genes & Development. 32 (3-4), 297-308 (2018).
  25. Pan, T., Artsimovitch, I., Fang, X., Landick, R., Sosnick, T. R. Folding of a large ribozyme during transcription and the effect of the elongation factor NusA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (17), 9545-9550 (1999).
  26. Heilman-Miller, S. L., Woodson, S. A. Effect of transcription on folding of the Tetrahymena ribozyme. RNA. 9 (6), 722-733 (2003).
  27. Yu, A. M., et al. Computationally reconstructing co-transcriptional RNA folding from experimental data reveals rearrangement of nonnative folding intermediates. Molecular Cell. 81 (4), 870-883 (2021).
  28. Yu, G., et al. Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect. Nature communications. 14 (1), (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles