Method Article

ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השעתוק, RNA מתפתח מתחיל להזיווג בסיסים כאשר הוא יוצא מפולימראזות RNA (Pols). זיווג הבסיסים הזה מאפשר יצירת מבני RNA המשפיעים באופן קריטי על ביטוי גנים ברמת עיבוד, תרגום ויציבות RNA. שיטות מבוססות לחקר מבנה משני של RNA מוגבלות לתמלילים בוגרים, בעוד שמעט מאוד ידוע על מצבי קיפול. יתרה מזאת, השפע הנמוך יחסית (< 1%) והאופי החולף של RNA מתהוות מסבכים את הבידוד והאפיון שלו. Co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq) מנצל רצף שעתוק עם ביוטין-NTP ודימתיל סולפט (DMS) כדי לרכוש בו-זמנית את מיקום ה-Pol ואת מצב הזיווג הבסיסי של תמלולים מתחילים. ב-Saccharomyces cerevisiae, CoSTseq מספק את הרצף והמידע המבני בסמוך לקצה 3' של RNA מתחילים, שהועתקו על ידי אחד משלושת ה-RNA Pols. במהלך ריצת השעתוק, הביוטין-NTP המשולב באתר הפעיל למעשה עוצר את הפול. לאחר מכן, טיפול בנוקלאוטידים A, C ו-U לא מזווגים עם מתילטים ב-DMS. העשרת ביוטין וסינתזת cDNA באמצעות טרנסקריפטאז הפוך עם החלפת תבנית מאפשרת ריצוף בקצה זוג וחישוב תגובתיות DMS כפונקציה של מיקום Pol. CoSTseq מתבצע בקלות לצד חקירת DMS (DMS-MaPseq), מה שמאפשר גם ללכוד את התמלול המבוגר המקופל. כאן מוצג פרוטוקול מפורט עבור CoSTseq ו-DMS-MaPseq מקבילים, הכולל ריצה של שעתוק, הכנת ספרייה וניתוח נתונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA יכול להתקפל למבנים משניים ושלישוניים בשל זיווג בסיסים בתוך מולקולות RNA, ומבנים אלו יכולים להיות מושפעים עוד יותר מחלבונים הפועלים כמלווה להנחיית קיפול ה-RNA1. מבנה ה-RNA יכול להיות דינמי מאוד, כאשר RNA תאיים יכולים להתאים למגוון מבנים המוגדרים על ידי הנוף התרמודינמי וליצור אנסמבלים של קונפורמציות RNA אפשריות2. שינויים קונפורמציה דינמיים עשויים להשפיע על ויסות הגנים והביטוי 3,4. לעומת זאת, RNA יכול גם לאמץ מבנים מועדפים מאוד הקשורים ישירות לתפקודו, כגון tRNA, RNA גרעיני קטן ו-rRNA. בעוד שדוגמאות אלו מדגישות RNA בוגרים בעלי תפ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לפני שמתחילים, ודאו שכל המאגרים המפורטים בטבלה 1 מוכנים. כל החומרים צריכים להיות מוכנים במים נטולי נוקלאז. מומלץ עיקור מסנן של מאגרים כאשר משתמשים בכימיקלים/מגיבים בדרגת ביולוגיה שאינה מולקולרית להכנת בופר. לסעיפים 1 עד 4, הכינו מראש את הדברים הבאים:

1. הכנת חומרים ותגובות

  1. הכינו תמיסה של 10% סרקוסיל (v/v) לפחות יום אחד מראש כדי לאפשר מספיק זמן להמסה מלאה. סטריליזציה של התמיסה ההומוגנית עם פילטר של 0.22 מיקרון. ביום הניסוי, השתמש ב-10% סרקוסיל להכנת תמיסה של 0.5% סרקוסיל, והשאר על קרח עד השימוש.
  2. אולטרה-צנטריפוגות לפני קירור ל-4 מעלות צלזיוס. במכס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מציג את התוצאות בפועל שנוצרו על ידי יישום זרימת העבודה והניתוח של CoSTseq, כפי שמתואר בפרוטוקול זה. ראשית, סעיף זה מתאר תוצאות צפויות לאחר הערכת איכות של הכנות מוצלחות בספרייה לפני ואחרי הריצוף. לפני ריצוף, חוקרים יכולים להשתמש בניתוח PCR ו-TapeStation כדי לאשר את נוכחות ה-RNA לאחר העשרת ביוטין. דבר זה מצביע על בידוד מוצלח של RNA מתהוות במהלך הכנת ספריית CoSTseq. הערכת איכות הנתונים לאחר ריצוף, לדוגמה, באמצעות בדיקה ויזואלית של כיסוי הקריאה ולאחר מכן באמצעות ניתוח מותאם מבוסס פיי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA מתחיל להתקפל קו-טרנסרפציה עקב קינטיקה מהירה יותר של זיווג בסיסים לעומת קצב הסינתזה 24,25,26,27. הידע הנוכחי שלנו על קיפול RNA מתחיל מגיע ממחקרים חד-מולקוליים של RNA פרוקריוטי, חקירת חוץ-גופה, או בגישות סילקו. בפרוטוקול זה מוצג תהליך עבודה מפורט של CoSTseq; טכניקה זו מאפשרת זיהוי בתוך ה-vivo של קיפול קו-טרנספריפסיונלי של תעתיקים מת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד"ר SK Boopathy Jegathambal על הקידוד ולחברי מעבדת Neugebauer, במיוחד P. Bech, על הדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01GM112766 ל-KMN) ומלגת קדם-דוקטורט מהאגודה האמריקאית ללב (908949 ל-LS). LPS נתמכה על ידי מענק הכשרה של NIH 5T32GM14943803. LRAB נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מהאגודה האמריקאית ללב (26POST1569544). איסוף הנתונים במרכז ייל לניתוח גנומי נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר 1S10OD03036301A1. עבודה זו היא באחריות המחברים בלבד ואינה בהכרח מייצגת את הדעות הרשמיות של ה-NIH.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10mM ATPInvitrogen18330019
10mM ביוטין-11-CTPמדעי הביולוגיה של ינהNU-831-BIOX
10mM GTPInvitrogen18332015
10mM UTPInvitrogen18333013
10X NEBuffer 1ניו אינגלנד ביולאבסB7001Sבשימוש בשלב 7.2.1
10X מלח מפוזר עם מאגר זרחן (PBS)גיבקו70011-044
20% SDSRPI L23100-500
פנול חומצי: כלורופורם אמביוןAM9722
חרוזי AMPure XP לבחירת גודלבקמן קולטר A63880משמש לבחירת גודל בשלב 7.5.1
בקטו פפטוןגיבקו211677
תמצית שמרי בקטוגיבקו212750
ביסיןסיגמא אולדריץ'B3876-100G
כלורופורםסיגמא אולדריץ'319988
D-(+)-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G5767-500G
דיפקו אגרBD DIFCO214010
דימתיל סולפטסיגמא אולדריץ'D186309-5ML
Dynabeads & Trade; חרוזי MyOne Streptavidin C1  Invitrogen65001משמש למשיכת ביוטין בסעיף 4.1
Dynabeads & Trade; mRNA DIRECT™ ערכת טיהורInvitrogen61011משמש לבחירת Poly A בסעיף 5.1
EDTA, pH 8, 0.5Mסיגמא אולדריץ'  03690-100ML
אתנולסיגמא אולדריץ'E7023-500ML
גליקובלוInvitrogenAM9516קו-פרספיטנט בשימוש בשלבים 4.2.7 ו-5.2.4
Induro®   טרנסקריפטאז הפוךניו אינגלנד ביולאבסM0681Sאנזים RT בשימוש בשלב 6.3.1
אלכוהול איזואמילסיגמא אולדריץ'  W205710-1KG-K
איזופרופנולJT-בייקר9084-05-01
ערכת PCR של KAPA HiFi HotStart    רוש07958889001DNA באיכות גבוהה Pol שימש ב-7.3.2 ו-7.4.1 לתגובות PCR
כלוריד מגנזיוםסיגמא אולדריץ'SLCM2154
ערכת טיהור PCR MinEluteקיאגן28004משמש לניקוי DNA בשלבים 6.3.3 ו-7.2.2
ליגאס ה-RNA ה-Mthניו אינגלנד ביולאבסM2611A
אוליגו קלין & מתרכזמחקר זימוD4060מומלץ לניקוי DNA של אוליגו בשלב 7.1.2
אשלגן אצטט סיגמא אולדריץ'236497-500G
כלוריד אשלגןJT בייקר3040-01
אשלגן הידרוקסידאוונטור6984-04-01
RNA Clean & מרוכז-5מחקר זימוR1014ערכת ניקוי RNA ששימשה בשלב 5.3.2 לאחר טיפול PNK
RNaseOUT™ מעכב ריבונוקלאז רקומביננטיתרמו פישר סיינטיפיק10777019מעכב RNase ששימש בשלב 5.3.1 במהלך טיפול ב-PNK
סרקוסילIBI ScientificIB07080
נתרן אצטטאיכות ביולוגית351-035-721
כלוריד נתרןסיגמא אולדריץ'S5150-1L
נתרן הידרוקסיד מקרון7708-10
SUPERase&MIDDOT; In&Trade; מעכב RNase (20 U/μ L)תרמו פישר סיינטיפיקAM2696מעכב RNase בשימוש בשלב 6.3.1
קינאז פולינוקלאוטידי T4ניו אינגלנד ביולאבסM0201S
תרמוסטביל 5' ליגאז DNA/RNA של אפליקציהניו אינגלנד ביולאבסM0319L
טריס-HCl, pH 7.4, 1Mתרמו-סיינטיפיקJ60202. K2
טריטון X-100טקנובהT1105
טריזול וטרייד; ריאגנטInvitrogen15596-026לגבי שחרור RNA מתחיל בסעיף 4.2; המכונה גם "תגובת RNA" בסעיף 4
β-מרקפטואנולסיגמא אולדריץ'M6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles