הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברוש חדש של טרומבוזה סינוס ורידי מוחית חמור שנקבע בשילוב של חצי-קשירה, כלוריד ברזל ותרומבין

330 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69961

⸱

13 בפברואר 2026

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

במאמר זה

סיכום

המודל החדש של עכברוש לקריש סינוסים ורידי מוחי חמור (CVST), שנבנה על ידי חצי-קשירה בשילוב עם כלוריד ברזל ותרומבין, יכול לחקות בצורה יעילה יותר את המנגנון הפתופיזיולוגי של CVST חמור בבני אדם.

תקציר

טרומבוזה סינוסית ורידית מוחית (CVST) היא סוג מובחן של שבץ שפוגע בעיקר בצעירים, במיוחד נשים בהריון. כ-60% מהמטופלים ב-CVST מפתחים אוטם או דימום מוחי ורידי, המוגדר כ-CVST חמור. כיום, שיטות שונות משמשות הן מקומית והן בינלאומית כדי לגרום ל-CVST במודלים של בעלי חיים. עם זאת, מודלים אלו אינם מצליחים לשחזר במלואם את המנגנונים הפתופיזיולוגיים שמאחורי CVST חמור, ובכך מגבילים את המחקר הבסיסי בנושא זה. ניתן להקים מודל עכברוש חדש של CVST חמור באמצעות חצי-ליגציה בשילוב עם כלוריד ברזל ותרומבין. חצי-קשירה הושגה על ידי מדידת זרימת הדם המוחי (CBF) באזור הרצוי (ROI) לפני ואחרי קשירת הסינוס הסגיטלי העליון (SSS) באמצעות מדם נקודות פרפוזיה (PSI). חצי-קשירה של ה-SSS יוצרת קיפאון דם בתוך הסינוס הוורידי. היישום המקומי של כלוריד ברזל על פני שטח ה-SSS מוביל לפגיעה באנדותל, בעוד שהזרקה ישירה של תרומבין לסינוס יוצרת מצב היפר-קרישה מקומי. גישה זו מחקה ביעילות את שלושת המרכיבים המרכזיים להיווצרות טרומבוזיס: סטזיס, נזק לאנדותל והיפר-קרישתיות. המודל שנוצר מציג עומס תרומבוטי משמעותי הכולל מספר סינוסים ורידיים בו-זמנית. הקרקע המושרה נשאר יציב לפחות לשבוע אחד. הצביעה של 2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC) מראה שמודל זה יכול לגרום באופן עקבי לאוטם מוחי ורידי בשטח גדול, שנמשך עד 7 ימים. מודל זה אפילו יכול לגרום להתקפים אפילפטיים בעכברים, יכולת שמודלים קודמים לא הצליחו להשיג. הפרעה במחסום הדם-מוח נצפתה באמצעות צביעת אוונס בלו (EB). לכן, מודל ה-CVST החמור שנוצר באמצעות חצי-ליגציה בשילוב עם מתן כלוריד ברזל ותרומבין משחזר בצורה מדויקת יותר את ההתקדמות הפתופיזיולוגית של CVST חמור בבני אדם, ומדגים יציבות ואמינות.

מבוא

טרומבוזה סינוסית ורידית מוחית (CVST) היא צורה מובחנת של הפרעת כלי דם מוחית השונה משבץ עורקי. היא מתרחשת בתדירות גבוהה יותר אצל צעיריםבגיל 1,2, במיוחד אצלנשים בהריון, והשכיחות שלה עולה בהתמדה בשנים האחרונות. מחקר אפידמיולוגי שנערך באוסטרליה מצביע על כך ששכיחות ה-CVST השנתית נעה בין 13.0 ל-15.7 מקרים למיליוןיחידים. בארצות הברית, שכיחות ה-CVST מציגה מגמת עלייה עם הגיל. עם זאת, גיל השיא של ההופעה אצל נשים נמוך יותר בהשוואה לגברים5. בין השנים 2021 ל-2023, 43 לכל מיליון מטופלים שביקרו במחלקות מיון בארצות הברית אובחנו עם CVST6. במסגרת קלינית, טרומבוזיס סינוסים נפוצה היא הצורה הנפוצה ביותר, ומהווה כ-57.14% מכלל המקרים. לאחר מכן מגיעים מעורבות הסינוס הסגיטלי העליון (SSS; 16.19%), הסינוס הרוחבי (11.43%) וסינוס הסיגמואידי (8.57%)4. התסמינים הקליניים העיקריים כוללים כאב ראש, שעשוי להיות מלווה באפילפסיה, הפרעות תודעה ותסמינים נוירולוגיים מוקדיים 7,8,9. עם זאת, ביטויים אלו אינם ספציפיים. כ-60% מהמטופלים עם CVST מפתחים אוטם ורידי מוחי או דימום, המסווג כ-CVST חמור10,11. למרות שהטיפול ב-CVST כולל טיפול נוגד קרישה והתערבות כירורגית, שיעור התמותה מ-CVST חמור נשאר גבוה עד 34.2%9. תמותה גבוהה זו עשויה להיות מיוחסת לעובדה שהמנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של CVST חמור עדיין אינם מובנים במלואם. מודל בעלי חיים מתאים ל-CVST חמור הוא לכן כלי ניסויי חיוני לחקירת הפתוגנזה, ההתקדמות הפתופיזיולוגית ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות12.

נכון להיום, השיטות להשראת מודלים של בעלי חיים ל-CVST ניתנות לסיווג בדרך כלל לסוגים הבאים: קשירה קבועה13,14, השראה כימית 15,16,17, גישות התערבותיות 18,19, השתלת שתלים עצמיים 20,21,22, ואלקטרוקואגולציה דו-קוטבית23,24. הקרישה שנגרמה על ידי מודלים בעלי חיים קודמים הייתה קצרה ולא הצליחה לגרום בו-זמנית למספר קרישי סינוסים ורידיים ואוטם מוחי ורידי רחב היקף. לכן, פיתוח מודל CVST חמור הכולל מספר סינוסים ורידיים בו-זמנית הפך לעדיפות דחופה. שיטת החצי-קישור בשילוב עם כלוריד ברזל ותרומבין יכולה להקים מודל עכברוש חדש ל-CVST חמור. יתרה מזאת, מודל ה-CVST החמור החדשני מדמה בצורה מדויקת יותר את התהליך הפתופיזיולוגי האנושי של CVST חמור דרך שלושה היבטים מרכזיים: עומס קרישי הסינוסים הוורידיים, אוטם מוחי ורידי, והפרעה של מחסום הדם-מוח. מודל זה רלוונטי למחקר על מנגנונים פתופיזיולוגיים ואסטרטגיות טיפול ב-CVST חמור. מודל העכברים החדשני הזה יכול לשמש בעתיד לחקר המנגנון הפתופיזיולוגי של CVST חמור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול הניסויי אושר על ידי ועדת ניסויים בבעלי חיים ורווחת בעלי חיים ניסיוניים של אוניברסיטת קפיטל מדיקל (AEEI-2020-119) בבייג'ינג, סין, ונערך בהתאם לתקנות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של המוסד.

1. הכנת בעלי חיים

  1. הקצו באופן אקראי זכרים בריאים של חולדות ספרג-דולי (SD), עם משקל גוף ממוצע של 300 ± 10 גרם, לקבוצת הניסוי או לקבוצת ניתוח המדומה. כל בעלי החיים טופלו במחזור אור/חושך מתחלף של 12 שעות עם גישה למזון ומים בחופשיות.

2. יישום PSI

  1. השתמש ב-PSI כדי לעקוב באופן רציף אחר שינויים בזרימת הדם המוחי (CBF) בתוך SSS של חולדות לאורך תהליך המידול. בחר אזור מעגלי קבוע בתוך ה-SSS כאזור העניין (ROI). על ידי מעקב אחר השינויים ב-CBF של התשואה במהלך הניתוח, יש לקבוע את השלמת חצי-קשירה והצלחת השראת קרישי דם.

3. הקמת מודל עכברוש חמור מסוג CVST

  1. הרדמו חולדות באמצעות 5% אנפלוראן, עם תערובת גזים המורכבת מ-70% תחמוצת חנקן ו-30% חמצן, המועברת באמצעות מסכת הרדמה. שמרו על ריכוז האנפלוראן בטווח של 1%-2% במהלך ההליך הניתוחי. הניחו את העכברים המורדמים במצב שכיבה כשראשיהם מקובעים בקו האמצע באמצעות מסגרת סטריאוטקסית. שמרו על טמפרטורת הגוף ב-37 ± 0.5 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך באמצעות כרית חימום תרמוסטטית.
  2. בצע חתך אורך של 1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של אזור הגולגולת של העכברוש. נתח את הרקמה התת-עורית כדי לחשוף את הגולגולת שמתחת.
  3. בהדמיה מיקרוסקופית, יש ליצור חלון גולגולתי אורך (10 על 4 מ"מ) בין הברגמה ללמדה באמצעות מקדחה דנטלית מהירה. חשפו את ה-SSS ואת הקורטקס המוחי הדו-צדדי תוך שמירה על שלמות הדורה מאטר. במהלך תהליך הקידוח בגולגולת, קרר את מקדח הקידוח ברציפות עם מלח רגיל כדי למנוע פגיעה תרמית בדורה מאטר ובקורטקס.
  4. לאחר החשיפה ל-SSS, העריכו את CBF של התשואה ב-SSS באמצעות ה-PSI, ורשמו את הנתונים המתאימים. חצי-ליגייט של ה-SSS ברוסטרלית ובזנב באמצעות 8-0 תפרי פוליאמיד תחת תצפית מיקרוסקופית.
    הערה: בעת חיבור ה-SSS, הכוח צריך להיות בינוני ולא מופרז. אחרת, לא ניתן להשיג אפקט חצי-ליגציה. רצוי שהליגציה תתבצע בהליך רציף אחד. ניסיונות קשירה חוזרים עלולים לגרום לניקוב של ה-SSS, ובכך לפגוע בהצלחת ייצור המודלים.
  5. השתמשו ב-PSI כדי להעריך את CBF של התשואה (ROI) הממוקמת במקטע הקשור של ה-SSS, ולאשר שה-CBF ירד לכ-50% מזה לפני חצי-קשירה. תעד את התוצאות באופן שיטתי.
  6. בתנאים מוגנים באור, טבלו חוט משי 3-0 באורך 7 מ"מ בכלוריד ברזל 40% והשתמשו בו לכסות את פני שטח אתר קשירת ה-SSS למשך 5 דקות. שטוף את השדה עם מי מלח רגילים לאחר הסרת חוט המשי.
  7. הזרקו 0.1 מ"ל תמיסת תרומבין (500 U/mL) לחלל הסינוס של המקטע הקשור באמצעות מיקרואינגקטור תוך דקה. חזרו על ההזרקה פעמיים נוספות ברצף, לסך מינון של 150 U. ריפלוקס של טרומבין למרחב האפידורלי לא הוביל לטרומבוזה לקויה.
    1. כדי להקל על הזרקת התרומבין ל-SSS, כופפו בעדינות את מחט המיקרו-מזרק לפני ההכנסה. התאמה זו מאפשרת שליטה טובה יותר בזווית המחט במהלך הדקירה ועוזרת למנוע חדירה לא מכוונת דרך ה-SSS.
  8. הערכו מחדש את CBF של ה-ROI באמצעות ה-PSI לאחר הזרקת תרומבין. ודא שהתוצאות מאשרות ירידה משמעותית ב-CBF לעומת זו שלאחר חצי-קשירה, מה שמעיד על השראה מוצלחת של טרומבוזיס. רשם נתונים באופן שיטתי לניתוח נוסף.
  9. אטום את חלון העצם עם שעווה עצם, ואז תפר את החתך. לאחר הניתוח, ניתן קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג) תת-עורית לכל חולדה כדי להקל על הכאב לאחר הניתוח.
  10. בקבוצת הניתוח המדומה, בצע את הקרניוטומיה בלבד, ללא התערבויות כירורגיות נוספות.

4. נטל קרישת סינוסים ורידיים ואוטם מוחי

  1. הערך את העומס של טרומבוזיס סינוס ורידי בשלוש נקודות זמן: יום אחד, יומיים ושבעה ימים לאחר הקמת המודל. להקריב חולדות ולבצע פרפוזיה לבבית עם מלח רגיל בנקודות זמן שונות.
  2. בצע קרניוטומיה כדי להעריך ויזואלית את היקף המעורבות בקריחת דם סינוסים ורידיים. לבודד את הקרישה ולעבור ניתוח כמותי. חתוך את רקמת המוח וחתך אותה לפרוסות קורונליות בעובי 2 מ"מ.
  3. טבלו את הפרוסות בתמיסה של 2% TTC ודגרו באמבט מים של 37°C למשך 20 דקות כדי להקל על הצביעה. לאחר מכן, יש להעריך חזותית את אוטם הוורידים המוחי ולכמת את נפח האוטם באמצעות תוכנת ImageJ לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר.
    נפח האנקטה = שטח האנקטה במ"מ רבוע x עובי [2 מ"מ]

5. הפרעה לחדירות מחסום דם-מוח (BBB)

  1. ביום השני לאחר הניתוח, בחרו באקראי חולדות הן מקבוצת הדגם והן מקבוצת הניתוח המדומה ונתנו זריקה תוך-ורידית של 2% Evans Blue (EB) דרך וריד הזנב.
  2. לאחר שעתיים של מתן מוצלח של הזריקה, יש להמתים את העכברים ולפרוף עם מי מלח מפוזרים בפוספט (PBS) דרך החדר השמאלי. קצור את רקמות המוח וחתוך אותן לפרוסות בעובי 2 מ"מ כדי להעריך את מידת חדירת ה-EB.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת SPSS 17.0. הצג נתוני מדידה כסטיית תקן ממוצעת ±. השתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) או במבחן t דגימות עצמאי להשוואות קבוצתיות.
  2. לניתוח משתנים רציפים שנמדדו בנקודות זמן מרובות באותה קבוצה, השתמשו במדדים חוזרים של ANOVA כדי להעריך הבדלים בין קבוצות בנקודות זמן. ערך p של פחות מ-0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תהליך המידול
איור 1A מציג את ה-SSS של העכברוש, כפי שמסומן על ידי החץ. הרוסטרל והקאודל של ה-SSS היו חצי-קשורים (איור 1B), ואחריו הוחל חוט ספוג בכלוריד ברזלי על פני השטח של אזורים קשורים (איור 1C). לאחר מכן הוזרק תרומבין למקטעים הקשורים כדי לגרום לקרישה. האזור המסומן על ידי החץ, שבו הוזרק ת'רומבין, הפך לשחור (איור 1D). המעגל הלבן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל עכברוש חדשני של CVST חמור, שנבנה על ידי חצי-קשירה בשילוב עם כלוריד ברזלי ותרומבין, לא רק מדמה קיפאון דם ופגיעה באנדותליאל, אלא גם את מצב הקרישה הגבוהה של הדם, כלומר הוא מדמה את שלושת מרכיבי היווצרות טרומבוזיס25. מה שמלהיב עוד יותר הוא שמודל העכברים שפותח בשיטה זו מסוגל להראות התקפים אפילפטיים. פרכוסים אפילפטיים מהווים ביטוי קליני בולט אצל חולי CVST, המתרחשים בכ-12% עד 31.9% מהמקרים. ראוי לציין כי מטופלים עם CVST חמור שמגיעים עם טרומבוזה ורידי קורטיקלי ואוטם מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים למכון למחלות מוח קריטיות באוניברסיטת קפיטל מדיקל על התמיכה הטכנית. מחקר זה נתמך על ידי קרן המדעים הטבעיים של בייג'ינג (מס' 7182064).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלורידסיגמא-אלדריץ'
40% כלוריד ברזל  Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., סין
אוונס בלו סיגמא-אלדריץ'
כרית חימום  הרווארד אפראטוס הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב50-7061-f, 
מקדחה שיניים מהירה  סאשין, בוסאן, דרום קוריאהStrong-207B
מד נקודות לייזר מערכת PeriCam PSI, שוודיה
מיקרוסקופCarl Zeiss, Inc., ברלין, גרמניה
תפר פוליאמיד  מפעל המיקרו-מכשירים של נינגבו צ'נגה, סין
מסגרת סטריאוטקסיתדיוויד קופף אינסטרומנטס, טוג'ונגה, קליפורניה, ארה"ב
ת'רומביןצ'אנג צ'ון ליי יונשאנג פארמה בע"מ, סין

מקורות

  1. Silvis, S. M., de Sousa, D. A., Ferro, J. M., Coutinho, J. M. Cerebral venous thrombosis. Nat Rev Neurol. 13 (9), 555-565 (2017).
  2. Ferro, J. M., Aguiar de Sousa, D. Cerebral venous thrombosis: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 19 (10), 74(2019).
  3. Kashkoush, A. I., et al. Cerebral venous sinus thrombosis in pregnancy and puerperium: A pooled, systematic review. J Clin Neurosci. 39 (5), 9-15 (2017).
  4. Devasagayam, R., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis Incidence Is Higher Than Previously Thought: A Retrospective Population-Based Study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  5. Payne, A. B., et al. Epidemiology of cerebral venous sinus thrombosis and cerebral venous sinus thrombosis with thrombocytopenia in the United States, 2018 and 2019. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12682(2022).
  6. Ruderman, A., Hogan, A., Epley, C., Courtney, D. M., Milman, B. Epidemiology of Cerebral Venous Sinus Thrombosis: 2021-2023. Cureus. 17 (10), e93654(2025).
  7. Singh, R. J., Saini, J., Varadharajan, S., Kulkarni, G. B., Veerendrakumar, M. Headache in cerebral venous sinus thrombosis revisited: exploring the role of vascular congestion and cortical vein thrombosis. Cephalalgia. 38 (3), 503-510 (2018).
  8. Mahale, R., et al. Acute seizures in cerebral venous sinus thrombosis: what predicts it. Epilepsy Res. 123 (7), 1-5 (2016).
  9. Luo, Y., Tian, X., Wang, X. Diagnosis and treatment of cerebral venous thrombosis: a review. Front Aging Neurosci. 30 (1), 102(2018).
  10. Kowoll, C. M., et al. Severe cerebral venous and sinus thrombosis: Clinical course, imaging correlates, and prognosis. Neurocritical care. 25 (3), 392-399 (2016).
  11. Stam, J., Majoie, C. B. L. M., van Delden, O. M., van Lienden, K. P., Reekers, J. A. Endovascular thrombectomy and thrombolysis for severe cerebral sinus thrombosis: A prospective study. Stroke. 39 (5), 1487-1490 (2008).
  12. Yenigün, M., Jünemann, M., Gerriets, T., Stolz, E. Sinus thrombosis: do animal models really cover the clinical syndrome. Ann Transl Med. 3 (10), 138(2015).
  13. Frerichs, K. U., et al. Cerebral sinus and venous thrombosis in rats induces long-term deficits in brain function and morphology--evidence for a cytotoxic genesis. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (2), 289-300 (1994).
  14. Li, G., et al. A new thrombosis model of the superior sagittal sinus involving cortical veins. World Neurosurg. 82 (1/2), 169-174 (2014).
  15. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  16. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306 (10), 39-49 (2015).
  17. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neurosci Lett. 662 (1), 205-212 (2018).
  18. Wang, J., et al. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats. Brain Res. 1181 (11), 118-124 (2007).
  19. Wang, J., et al. Development of a new model of transvenous thrombosis in the pig superior sagittal sinus using thrombin injection and balloon occlusion. J Neuroradiol. 37 (2), 109-115 (2010).
  20. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. J Neurosci Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  21. Bourrienne, M. C., et al. A Novel Mouse Model for Cerebral Venous Sinus Thrombosis. Transl Stroke Res. 12 (6), 1055-1066 (2021).
  22. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  23. Sakaki, T., Kakizaki, T., Takeshima, T., Miyamoto, K., Tsujimoto, S. Importance of prevention of intravenous thrombosis and preservation of the venous collateral flow in bridging vein injury during surgery: an experimental study. Surg Neurol. 44 (2), 158-162 (1995).
  24. Cokluk, C., Aydin, K., Yemisci, M., Colakoglu, S., Kaplan, S. Cortical anastomotic veins occlusion in the rat including the assessment of cerebral swelling. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 203-210 (2006).
  25. Kyrle, P. A., Eichinger, S. Deep vein thrombosis. Lancet. 365, 1163-1174 (2005).
  26. Lindgren, E., et al. Acute symptomatic seizures in cerebral venous thrombosis. Neurology. 95 (12), e1706-e1715 (2020).
  27. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  28. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  29. Duan, J., et al. Identifying Biomarkers Associated with Venous Infarction in Acute/Subacute Cerebral Venous Thrombosis. Aging Dis. 12 (1), 93-101 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CVSTTTC

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.