קריוסקטציה של שתלים ביוקומפטיביים סינתטיים באמצעות שרף ריפוי ב-UV לשיפור ניתוח אימונופלואורסצנציה

סיכום

עבודה זו מציגה פרוטוקול קריו-סקציה המשתמש בייצוב שרף הניתן לריפוי UV כדי לשמור על שלמות ממשק השתל-רקמה תוך שמירה על נגישות האנטיגן, ומאפשר ניתוח אימונופלואורסצנציה אמין ברזולוציה גבוהה של שתלים פולימריים סינתטיים.

תקציר

הערכה היסטולוגית של שתלים סינתטיים וביוקומפטיביים מציבה אתגרים טכניים משמעותיים בשל אי התאמה בין שיטות עיבוד רקמות קונבנציונליות לבין התכונות הפיזיקוכימיות של חומרים אלו. גישות עכשוויות המשתמשות בהטמעת שרף מלא מספקות שימור מבני מספק אך פוגעות קשות בנגישות האפיטופים, ובכך מגבילות יישומים איממונוהיסטוכימיים חיוניים לאפיון תגובות חיסוניות של המארח. לעומת זאת, הטמעת פרפינים קונבנציונלית מציגה הידבקות לקויה לסובסטרטים סינתטיים ומגבילה את בחירת הנוגדנים לפרופיל אימונולוגי מקיף. פרוטוקולי הקריוסגרציה הסטנדרטיים משפרים תאימות איממונוהיסטוכימית על ידי שיפור שימור האנטיגן; עם זאת, שיטות אלו לעיתים קרובות גורמות לחוסר שלמות מבנית של דגימות המכילות שתל, מה שפוגע בהערכה מורפולוגית ובאיכות החיתוך. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פותח פרוטוקול עיבוד חדשני הכולל שרף שניתן לריפוי ב-UV לייצוב סלקטיבי של מבני רקמת שתל לפני הקרוגה. שיטה זו עושה שימוש בשרף פוטופולימריזביל כדי לספק תמיכה מכנית תוך שמירה על נגישות אפיטופים ודטרמיננטים אנטיגניים, שלרוב נפגעים על ידי פולימריזציה מלאה של שרף. הפרוטוקול מאפשר יצירת חתכים איכותיים בעובי אופטימלי להערכת אימונופלואורסצנציה, ומשיג שימור מבני טוב יותר בהשוואה לחתך קפוא סטנדרטי, ללא קישור צולב נרחב שמגביל את חדירת הנוגדנים בדגימות מוטמעות בשרף קונבנציונלי. גישה זו מייצגת פתרון מעשי וחסכוני לעיבוד היסטולוגי של שתלים סינתטיים, ומציעה יכולות אנליטיות משופרות להערכת תאימות ביולוגית ומקלה על אפיון מפורט של תגובות חיסוניות מקומיות בממשקי שתל-רקמה.

מבוא

מיקרוסקופ אימונופלואורסצנציה הוא טכניקה אנליטית חיונית במחקר רפואה רגנרטיבית, המסייעת להמחשת ארכיטקטורת הרקמה והרכב התאים באמצעות נוגדנים מצומדים בפלואורופור. שיטה זו משלבת את הספציפיות המולקולרית של זיהוי אימונוכימי עם הרגישות והגמישות של זיהוי פלואורסצנציה, ומאפשרת תצפית מפורטת על התפלגויות המטרות התאיות בתוך מיקרו-סביבות הרקמה שלהן. גישות אימונופלואורסצנציה כוללות אסטרטגיות תיוג ישירות ועקיפות, כאשר פרוטוקולי אימונופלואורסצנציה עקיפים מספקים הגברה מוגברת של אותות באמצעות מערכות נוגדנים משניות המקושרות לפלואורופורים מגוונים החוצים את הספקטרום הנראה והקרוב באינפרא אדום¹. היכולת המובנית של המתודולוגיה לזהות רב-מטרות בו-זמנית באמצעות הפרדה ספקטרלית מאפשרת אפיון פנוטיפי מקיף של אוכלוסיות תאיות הטרוגניות והקשרים המרחביים שלהן בתוך מיקרוסביבות רקמות מורכבות².

היכולות הטכניות של מיקרוסקופ אימונופלואורסצנציה חורגות מעבר ללוקליזציה קונבנציונלית של חלבונים וכוללות יישומים אנליטיים כמותיים, כולל מדידות עוצמת פלואורסצנציה, ניתוחי קולוקליזציה והערכות התפלגות מרחביות הקריטיות להבנת תפקוד התאים וארגון הרקמות³. בהקשר של מחקר תאימות ביולוגית של שתלים, ניתוח אימונופלואורסצנציה מספק תובנות קריטיות לגבי תגובות חיסוניות של המארח, כולל תגובות גופים זרים, מפלים דלקתיים ותהליכי אינטגרציה של רקמות שקובעים את קבלת או דחיית השתל ברמות התאית והמולקולרית⁴.

יישום מוצלח של פרוטוקולי אימונופלואורסצנציה דורש התייחסות זהירה לשיטות עיבוד רקמות השומרות על שלמות מורפולוגית תוך שמירה על אות פלואורסצנטי ומזעור אוטופלואורסצנציה ברקע. בחירת מדיה משובצת מסורתית תלויה בסוג הרקמה, בדרישות האנליטיות בהמשך הזרם, ובאנטיגנים הספציפיים הרלוונטיים. לגבי חומרים סינתטיים ושתלים, הספרות הנוכחית ממליצה בעיקר על הטמעת דומה מלאה לשמירה על יציבות מבנית במהלך פרוצדורות חתך⁵. עם זאת, גישה זו מציבה מגבלות משמעותיות בשל הצורך באולטרה-מיקרוטומים ולהבים מיוחדים לחתך בלוקי שרף פולימריזציים, המייצגים השקעה משמעותית בציוד ובמומחיות טכנית. הטמעת פרפין, תוך שהיא מספקת תמיכה מבנית מספקת לחתכים, מביאה שינויים קונפורמציה לדטרמיננטים אנטיגניים במהלך קיבוע ועיבוד באמצעות ייבוש נרחב, הקשחה כימית וחדירה לממסים אורגניים שיכולים לפרק חלבונים ולהסתיר אפיטופים. עיבוד פרפין גם מייצר הפרעות אוטופלואורסצנציה פנימיות שפוגעות בזיהוי אות ובניתוח כמותי. שינויים אלו מחייבים הליכי שליפת אנטיגן, בדרך כלל כוללים שחזור אפיטופים מושרה על ידי חום (HIER) או שליפת אפיטופים מונעים פרוטאוליטי (PIER), כדי להחזיר את הנגישות לנוגדנים⁶. למרות התערבויות אלו, נוגדנים רבים זמינים מסחרית אינם תואמים לדגימות מוטמעות בפרפין, ותנאי השליפה הקשים עלולים לפגוע עוד יותר באיכות אות הפלואורסצנטי ולגרום ליצירת ארטיפקטים של הלבנת פוטו.

קריוסקציה מציעה שיטת עיבוד חלופית ליישומי אימונופלואורסצנציה. ניתן להשתמש בשתי שיטות קריושימור להכנת רקמות. הגישה הראשונה כוללת הקפאה מהירה על ידי טבילה ישירה של דגימות רקמה טריות באמבט איזופנטן מקורר מראש עם חנקן נוזלי להשגת טמפרטורות מתחת ל-20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חתך באמצעות מיקרוטומים קריוסטטים המצוידים בתאי חיתוך מבוקרי טמפרטורה. הפרוטוקול השני עושה שימוש בתקופת קיבוע קצרה בפראפורמלדהיד (PFA) או פורמלין, ואחריה הגנה קריוגנרית באמצעות חדירת סוכרוז מדורגת לפני ההקפאה. תהליך השימור בהקפאה יוצר מטריצה קשיחה השומרת על שלמות הרקמה תוך שמירה על מבנה החלבון המקומי החיוני לזיהוי נוגדנים. חתך קפוא שומר על רקמות במצב כמעט טבעי עם שינויים כימיים מינימליים⁷, ובכך מפחית את הצורך בהליכים קשים לשאיבת אנטיגנים ומאפשר שימוש במגוון רחב יותר של נוגדנים ראשוניים, כולל כאלה שאינם תואמים לרקמות הטבועות בפרפין עקב מסכת אפיטופים או דנאטורציה⁸.

תהליך הקריוחתך בדרך כלל עושה שימוש בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), מדיום הטמעה מסיס במים המורכב מאלכוהול פוליוויניל ופוליאתילן גליקול, המספק תמיכה מבנית במהלך החתך תוך שמירה על שקיפות ותואמת למערכות זיהוי פלואורסצנטיות. הטמעת OCT מאפשרת יצירת חתכים דקים ואחידים בעובי של 5–15 מיקרון, בהתאם לדרישות האנליטיות הספציפיות ולמאפייני הרקמה⁹. שימור קונפורמציות חלבון טבעיות בחתכים קפואים שומר על יחסי אות לרעש אופטימליים החיוניים לניתוח אימונופלואורסצנציה כמותי, תוך שמירה על אפיטופים שלמים המאפשרים שימוש במגוון רחב יותר של נוגדנים ראשוניים, כולל כאלה שאינם תואמים לרקמות מוטמעות בפרפין⁸.

עם זאת, חתך רקמות קפוא מציב אתגרים טכניים ייחודיים, במיוחד בעת עיבוד חומרים סינתטיים בעלי תכונות פיזיקוכימיות מובחנות לעומת רקמות ביולוגיות מקומיות. ההתפשטות התרמית השונה בין פולימרים סינתטיים לממשקי רקמה ביולוגית במהלך ההקפאה עלולה לגרום למתח מכני מקומי שפוגע בשלמות המבנה ויוצר ארטיפקטים של חתך¹⁰. יתרה מזאת, הקשיחות הטבועה בחומרים סינתטיים רבים ביחס לרקמות ביולוגיות קפואות עלולה לגרום לסטיית להב במהלך החיתוך, מה שמוביל לעובי חתך לא אחיד ולנזק הן לדגימה והן לציוד החיתוך. מגבלות טכניות אלו מחייבות פרוטוקולי עיבוד מיוחדים שיכולים להתאים לדרישות הייחודיות של דגימות המכילות שתלים, תוך שמירה על יתרונות החתך הקפוא ליישומי אימונופלואורסצנציה.

כדי להתמודד עם מגבלות אלו, מחקר זה פיתח פרוטוקול קריוסגרציה המשלב ייצוב שרף סלקטיבי שניתן לריפוי ב-UV עם פרמטרי חתך קריוסטט מבוקרים, כדי לאפשר ניתוח אימונופלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה ורב-פרמטרית של מבני רקמת שתל.

פרוטוקול

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של Mayo Clinic (IACUC) תחת מספר אישור A00003765-18-24. כל ההליכים הכוללים שתלים ביוקואמיטיביים סינתטיים בוצעו בתנאים סטריליים, בהתאם לפרוטוקולי בטיחות ביולוגית מתאימים.

1. עיבוד דגימה והגנה קריו-פרוגרטיבית

הערה: יש לטפל בפורמלין אך ורק במכסה אדים כימי ולבוש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, משום שפורמלין מכיל פורמלדהיד, מגרה חזק, רגיש ומסרטן.

1. קיבעו דגימות שתל סינתטי ביוקומטיביות משולבות ברקמה בפורמלין בופר ניטרלי של 10% במהלך הלילה בטמפרטורה של 4° צלזיוס, תוך שימוש במינימום 10 נפחי קיבוע יחסית לנפח הרקמה כדי להבטיח טבילה מלאה וחדירה מספקת. מטרת תקופת הקיבוע המוגבלת הזו היא להשיג מינימום קישור צולב תוך שמירה על מורפולוגיית הרקמות. (ראו טבלת חומרים לחומרים המשמשים בפרוטוקול.)
2. העבר דגימות לתמיסת סוכרוז של 15% שהוכנה בתמיסת מלח עם בופר פוספט (PBS) לדגירה לילית בטמפרטורה של 4°C עם ערבוב עדין. ודא חדירת סוכרוז מלאה כפי שמעיד שקיעת הרקמות.
3. העבירו דגימות לתמיסת סוכרוז של 30% ב-PBS לדגירת לילה שנייה בטמפרטורה של 4° צלזיוס. אשר איזון מלא על ידי שקיעת רקמה לתחתית המיכל, מה שמעיד על חדירת סוכרוז מספקת ותזורת מים.
4. הכינו יחס נפחי של 1:1 של תמיסת סוכרוז של 30% ותרופת OCT. דגמו דגימות בתווך מעבר זה במשך שעתיים בטמפרטורה של 4°C, ואז מעבירים ל-100% OCT למשך שעה אחת להשגת איזון מלא, כפי שמעיד מראה אטום אחיד של הרקמה.
5. מקמו את הדגימות בזהירות במולדות קריו-סטנדרטיות מלאות בתרכובת OCT טרייה, כדי להבטיח כיוון אופטימלי למשטחי החיתוך. התמצאו עם ממשק השתל-רקמה זמין להליכים הבאים. הסר בועות אוויר באמצעות מלקחיים מקוררים מראש.
6. הניחו קריומולד מלאים מיד על פלטפורמת הקרח היבש כדי ליצור גרדיאנט טמפרטורה המעודד היווצרות גבישי קרח מהירה מלמטה ומעלה. יש לעקוב במשך 10–15 דקות עד להתגבשות מלאה, המאושרת על ידי המראה הלבן והאטום האופייני של תרכובת OCT קפואה. העבר בלוקים קפואים לאחסון בטמפרטורה של –80° מעלות צלזיוס או ישירות לתא הקריוסטט לחתך מיידי.

2. הגדרת קריוסטאט וחתך ראשוני

1. לשמור על תא בקרת טמפרטורה בקריסטט ב-15° מעלות צלזיוס. לאמת את הטמפרטורה באמצעות ניטור דיגיטלי משולב ולאזן את הטמפרטורה במהלך הלילה לפני הכנסת הדגימה.
2. להתקין להבים חד-פעמיים חדשים. קבע את זווית הלהב לחתך משולב של חומר סינתטי-ביולוגי בהתאם לדרישות היצרן.
3. עובי החתך הרצוי (50–100 מיקרון) מתוכנת לתוך הקריוסטאט על ידי בחירת הגדרת העובי בלוח הבקרה, התאמה באמצעות מקשי החצים ואישור הפרמטר על ידי לחיצה על מקש הגדרה .
4. מתקדמים דרך הדגימה המוטמעת כדי להגיע לעומק שנקבע מראש התואם לממשק השתל-רקמה. מעקב אחר פני השטח המתקדמים של החתך כדי לזהות מישור אופטימלי ליישום שרף UV, המאופיין בשינויים עדינים באטימות הרקמה ובחשיפה הראשונית להיקף השתל, והעומק מאושר כאשר תכונות אלו נשארות נראות באופן עקבי לאורך חתכים שנחתכו.
   הערה: עצור את החתך מיד עם ההגעה לממשק הקריטי כדי למנוע התקדמות מעבר לאזור היעד.

3. יישום שרף שניתן לריפוי ב-UV

הערה: יש לטפל בשרף שניתן לרפא על ידי UV באזור מאוורר היטב תוך כדי לבישת ציוד מגן מתאים ולהגן על העיניים והעור מפני אור LED ו-UV. שרפים אלו מכילים מגרים שיכולים לגרום לתגובות עור ועיניים, וחשיפה ל-LED ו-UV עלולה לגרום לפגיעת עיניים הנגרמת מ-UV.

1. חתכו פאראפילם באמצעות מספריים למידות של 2–3 מ"מ החורגים מהיקף השתל. הפרדו בזהירות מהגב הנייר המגן באמצעות מלקחיים סטריליים.
2. יש לפזר 5–10 מיקרוליטר שרף שניתן לריפוי UV על פני שטח חשוף של פרפילם (איור 1A). נפח השרף מותאם על ידי ביצוע יישומי בדיקה ראשוניים שבהם מחלקים נפחים הדרגתיים, והפיזור המתקבל מוערך ויזואלית כדי להבטיח כיסוי אחיד של פני השטח ללא הצפה או הצטברות יתר של שרף שעלולים להפריע לחתיכה.
3. החליפו מיד את גב הנייר המגן על פני פרפילם טעון בשרף. יש להחיל גלגל תפר פוליאוריתן (2 אינץ') בלחץ עקבי במעברים חופפים ומקבילים, ואחריהם מעברים ניצבים להשגת שכבת שרף דקה ואחידה (איור 1B).
4. הסר בזהירות שכבת נייר מגנה, וחשוף סרט שרף שמפוזר באופן אחיד. מקם שרף-פרפילם ישירות מעל פני השתל החשוף, כדי להבטיח יישור מדויק עם ממשק השתל-רקמה (איור 1C).
5. יש להניח גלגל תפר פוליאוריתן ממרכז השתל החוצה כדי להסיר בועות אוויר ולהבטיח מגע אינטימי בין שרף למשטחים סינתטיים וביולוגיים (איור 1D).
6. מיקום באורך גל 405 ננומטר עם מקור אור UV LED במרחק 2–3 ס"מ ישירות ממשטח השתל. חשיפה ל-90 שניות כדי להבטיח פולימריזציה מלאה, מאושרת על ידי הערכה מישושית של קשיחות השרף ומאפיינים לא דביקים (איור 1E). יש להניח כיסוי מגן UV מעל חלון תא הקריוסטט לפני פוטופולימריזציה של UV כדי להגן על המפעיל מחשיפה מזיקה ל-UV במהלך תהליך ייבוש שרף.

4. שחזור חתכים והכנת מגלש

1. הסרת הפרפילם בתנועה רציפה אחת כדי למנוע הפרעה מכנית בממשק השרף-רקמה. היצמדות מלאה לשרף מאושרת על ידי בדיקת המשטח החשוף תחת תאורת קריוסטט לכיסוי אחיד של שרף, היעדר הרמה בקצה הרקמה, והיעדר שאריות פאראפילם נראות לעין.
2. דגימות חתך לעובי של 8 מיקרון שנקבע מראש באמצעות מנגנון התקדמות מיקרוטום מכויל. עקבו אחרי כל קטע לעובי עקבי והיעדר ארטיפקטים (דחיסה, קריעה, חתכים לא שלמים). מקמו את פלטת הנגד גלגול בצורה מיטבית כדי למנוע עיקול (איור 1F).
   הערה: שקופיות זכוכית דביקות הידרופיליות ומטען חיובי משמשות משום שהן מספקות שמירה עליונה של דגימות מאתגרות, ומשפרות את ההיצמדות במהלך העברת החתך והעיבוד שלאחר מכן. התווית מחליקה בנפרד לפני העברת החתך.
3. מיקום משטח הדבק של הסלייד, תוך הבטחת מגע ראשוני בקצה החתך לפני מגע הדרגתי על פני כל השטח. ודא שמשטח השרף שנוצר מ-UV נדבק למחסנית תוך שמירה על פני הרקמה כלפי מעלה לאימונופלואורסצנציה (איור 1G).
4. לחץ בעדינות על מכלול הסקש-סלייד כדי להסיר בועות אוויר. בדוק את הכיוון הנכון תחת תאורת קריוסטט, כדי לאשר את הממשק השלם-שתל לרקמה.

5. אחסון ושימור

1. הניחו שקופיות שהושלמו בתיבות אחסון מסומנות מראש בטמפרטורה של –20° צלזיוס ליישומים הדורשים עיבוד תוך 72 שעות.
2. השתמש בתנאי טמפרטורה של 80° מעלות צלזיוס לתקופות שימור העולות על שבוע.

6. פרוטוקול צביעת אימונופלואורסצנציה

הערה: יש לטפל בפפסין עם ציוד מגן מתאים, שכן הוא מגרה בעור ובנשימה.

1. שלפו שקופיות מהאחסון והעברו לתאי לחות למשך 15–20 דקות לאיזון טמפרטורת החדר.
2. בצע שלושה מחזורי שטיפה של PBS ברצף בני 2 דקות.
3. שליפת אנטיגן:
   1. שיטת שחזור אפיטופים מושרה בחום (HIER): החלקה אופקית במיכלים הבטוחים למיקרוגל עם תמיסת שליפה של מטרות 1x. מיקרוגל (יציאה של 1000 וואט) בעוצמה גבוהה, למשך 15 דקות, ואחריה קירור לטמפרטורת החדר.
   2. שיטת שחזור אפיטופים מושרה פרוטאוליטי (PIER): מרחים 100–150 מיקרוליטר תמיסת פפסין מוכנה לשימוש לכל חתך. כיסו בכיסויי פלסטיק זמניים ודגרו בטמפרטורה של 37° מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתא לח.
4. בצע שלושה מחזורי שטיפת PBS רצופים (2 דקות כל אחד).
5. מרח 1 מ"ל תמיסת חסימה המכילה 0.1% סאפונין ו-2.5% סרום עזים רגיל ב-PBS. דגרו 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
6. בצע שלושה מחזורי שטיפת PBS רצופים (2 דקות כל אחד).
7. מרחו 100 מיקרוליטר תמיסות נוגדנים ראשוניות בריכוזים אופטימליים:
   1. פוליקלונל ארנב אנטי-קולגן IV בדילול 1:100.
   2. פוליקלונל ארנב אנטי-למינין בדילול 1:500.
   3. נוגדן מונוקלונלי אנטי-F4/80 לארנב בדילול של 1:500.
8. כיסו בכיסויי פלסטיק זמניים ודגרו במשך הלילה בטמפרטורה של 4° מעלות צלזיוס בחדרים לחים.
9. בצע שלושה מחזורי שטיפת PBS (2 דקות כל אחד).
10. יש להפעיל נוגדנים משניים בריכוז של 10 מיקרוגם/מ"ל.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. עז אנטי-ארנב IgG Alexa Fluor 488
11. דגרו 60 דקות בטמפרטורת החדר בתנאים חשוכים.
12. צביעת אגלוטינין בנבט חיטה (WGA) אופציונלית:
    1. מרח WGA-Alexa Fluor 647 בעוצמה של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS עם 2.5% סרום עזים תקין.
    2. כיסו ודגרו בטמפרטורה של 37° מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בצע שלושה מחזורי שטיפה רצופים של 2 דקות ב-PBS.
13. מרחו מדיית התקנה קשה של 80 מיקרו ליטר עם צבע נגד גרעיני לכל מקטע.
14. כסו את הכיסוי בזכוכית הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר.
15. אפשר למגלשות להתקשות אופקית בטמפרטורת החדר למשך שעתיים בחושך.
16. שמרו בטמפרטורה של 4°C עד שבוע לאיכות הדמיה מיטבית.

7. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ורכישת תמונה

1. בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך עם ערכות פילטר יצרן: 360/460 ננומטר גירור/פליטה, 470/525 ננומטר גירור/פליטה, 545/605 ננומטר גירור/פליטה, 620/700 ננומטר גירור/פליטה.
2. התמונות מצלמות על ידי בחירת כל ערוץ פלואורסצנציה בתפריט הסינון של תוכנת המיקרוסקופ. לפני אופטימיזציית החשיפה, מתבצע הליך איזון שחור על ידי בחירה ב'התאמת איזון שחור ' כדי להבטיח תיקון בסיסי מדויק לכל ערוץ. פרמטרי החשיפה מותאמים על ידי פתיחת חלון לכידת התמונה , הפעלת מצב חי , והתאמת בקרות החשיפה ועוצמת האור עד להשגת יחס אות לרעש גבוה ללא רוויה פיקסלית. רוויה מנוטרת באמצעות תצוגת ההיסטוגרמה של התוכנה וכלי Highlight Saturated Pixels . כל ערוץ מותאם באופן עצמאי לפני רכישת התמונה.
3. בצע רכישת אריחים אוטומטית עם חפיפה של 10% של היצרן בין שדות סמוכים. שמור על התאמת מיקוד אוטומטית לאורך כל תהליך הרכישה.

תוצאות

הערכת איכות החלק ואופטימיזציה
לאחר ייצוב וחתך בשרף UV בעובי 8 מיקרון, אספו חתכים על שקופיות דבק והערכנו לבקרת איכות. חתכים איכותיים מראים מורפולוגיה שלמה ללא סדקים משמעותיים או ארטיפקטים שבורים, עם ארכיטקטורת רקמה רציפה וממשק שתל-רקמה משומר (איור 2A). מקטעים המציגים נזק מבני משמעותי, כולל סדקים או הפרדת רקמות משטח השתל המיושב בשרף, אינם נכללים בניתוח נוסף (איור 2B). ראוי לציין כי יישום שרף שניתן לריפוי ב-UV ל...

דיון

שיטת ייצוב שרף הניתנת לריפוי UV מספקת גישה חלופית לחתך דגימות רקמה מוטמעות-OCT המכילים חומרים סינתטיים שקשה לעבד אותם באמצעות טכניקות חתך קפוא סטנדרטיות. למרות שיש מגוון אפשרויות דבק, כגון מחסניות טעונות, סרטי הדבקה לרקמה ותמיכות דביקות נוספות, כדי לסייע במניעת ניתוק חלקי רקמה או דגימות שבירות במהלך הטיפול, מוצרים אלו מציעים הידבקות למחסנית ואינם מספקים את החיזוק המכני הנדרש בממשק השתל-רקמה במהלך החיתוך. יתרה מזאת, כיום אין שרפים ניתנים להתפשטות עם ייפוי UV המיועדים ליישום דק ואחיד ישירו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אור אולטרה סגול צוואר אווז 5W 395– 405 ננומטר לייבוש שרף	אמזון	UPC & lrm; 603335835561
נוגדן - אנטי-F4/80 (מונוקלונלי)	אבקאם	AB300421	1:500
נוגדן - קולגן IV (פוליקלונלי)	אבקאם	ab6586	1:100
נוגדן - Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 מיקרוג'/מ"ל
נוגדן - עז אנטי-ארנב IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 מיקרוג'/מ"ל
נוגדן - למינין (פוליקלונלי)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	פורמלאבס	FLBMCL01	חומר ביוקומוניטיבי #1
BioMed Durable	פורמלאבס	FLBMDU01	חומר ביוקואמיטיבלי #2
10% פורמלין ממופר	קרדינל הלת'	C4320-101
מסנן BZ-X Cy5	קיינס	OP-87766	סט פילטרים
BZ-X פילטר DAPI	קיינס	OP-87762	סט פילטרים
מסנן BZ-X GFP	קיינס	OP-87763	סט פילטרים
מסנן BZ-X TRITC	קיינס	OP-87764	סט פילטרים
תוכנת מנתח BZ-X800	קיינס	BZ-X800	תוכנה משולבת
Fisherbrand Premium Coverglass  50 x 24 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-544-14
מדפסת תלת-ממד Form4B	FormLabs	מדפסת F4B
מיכל שרף Form4	פורמלאבס	RT-F4-01
סרום עזים	גיבקו	16210064
HM525 NX Cryostat	אפרדיה	956641EC
מיקרוגל ביתי	פנאסוניק	NN-S766BA	הספק של 1000 וואט
כיסויי פלסטיק IHC-Tek בגודל 24 מ"מ x 60 מ"מ	IHC World	IW-2601	כיסוי זמני
JDiction שרף UV נמוך צמיגות	אמזון	6974143904430	אוטופלואורסצנציה גבוהה
Keyence BZ-X800	קיינס	BZ-X800
בואו נעשה שרף שרף UV שרף שקוף מסוג קשה	אמזון	ALR00038	אוטופלואורסצנציה גבוהה
בואו נבדוק שרף UV שקופ מסוג צמיגות גבוהה	אמזון	ALR00048
סליידי זכוכית מיקרו של Matsunami MAS	Newcomer Supply	SUMAS1190	סלייד דביק
שתל ניתוחי מדפור	סטרייקר	8662	חומר ביוקומוניטיבי #3
מר שרף UV שרף צלול	אמזון	B08FRF9QTB	אוטופלואורסצנציה גבוהה
להב MX35 אולטרה מיקרוטום	אפרדיה	3053835
Parafilm M Laboratory Film	פאראפילם	P7543-1EA
פפסין	סיגמא	R2283-15ML
pH 7.4 במי מלח מפושט בפוספט	Sigma	P3813
Plan Apo & lambda; 40X	קיינס	BZ-PA40	עדשת אובייקטיבית
Plan Apo & lambda; 4X	קיינס	BZ-PA04	עדשת אובייקטיבית
גלגל תפר פוליאוריתן	אמזון	682698799567
התקנת אנטי-פייד זכוכית ProLong עם כתם NucBlue	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Counterstain
סאפונין	מיליפור	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
יריעת סיליקון סטרילית	בנטק	PR72034-51N
תמיסת שחזור מטרות, pH6 של ציטראט	אג'ילנט	S236984-2
תרכובת O.C.T של Tissue-Tek	סאקורה	4583
אגלוטינין חיטה אלקסהפלואר 647	Invitrogen	W32466	5 מיקרוגרם/מ"ל