מבחן FRET חד-מולקולי מאפשר ניתוח כמותי של חישול מתווך Hfq בין sRNA חיידקי ל-mRNA, ומאפשר מדידת קינטיקה ויציבות אינטראקציה. תוצאות מייצגות מראות כיצד אורך הזרע, מוטיבים של קישור Hfq ומרווחי המוטיבים משפיעים על יצירת דופלקס RNA.
מאמר מחקר
השפעת אורך הזרע ומוטיבים של קישור על אנילינג sRNA-mRNA בתיווך Hfq שנבדק באמצעות FRET חד-מולקולי
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגדרת הכללים השולטים באנילינג בין RNA חיידקים קטנים (sRNAs) לבין מטרות ה-mRNA שלהם היא מאתגרת, שכן RNA אלו הטרוגניים מאוד ברצף ובמבנה. כדי להפריד את תרומת התכונות הבודדות, שינינו באופן שיטתי את הגורמים המרכזיים, כולל חוזק הזרעים, מוטיבים של קישור ל-Hfq, והמרווחים ביניהם. השפעות תכונות אלו על יציבות הדופלקס בין sRNA-mRNA נבדקו באמצעות העברת אנרגיית תהודה פורסטר חד-מולקולית (smFRET), המאפשרת ניטור מולקולות RNA בודדות בקנה מידה של מילישניות ומספקת גישה לאירועים דינמיים שלעיתים מוסתרים בבדיקות אנסמבל.
אנו מראים שאזורי זרעים קצרים (4-5 bp) יוצרים קומפלקסים לא יציבים וקצרי מועד, בעוד שזרעים ארוכים יותר (8-10 bp) מייצרים דופלקסים יציבים. הארכת מוטיבים של קישור ל-Hfq או הכנסת מרווח בין אתרי הקישור ב-mRNA האריכה עוד את חיי האינטראקציה, ומדגישה את חשיבות חוזק המוטיבים וסידור המרחב ביעילות האנילינג המתווכת על ידי Hfq. יתרה מזאת, גישה זו מספקת מסגרת איתנה וניתנת לשחזור לניתוח דינמיקת אינטראקציות RNA-RNA ברזולוציה של מולקולה בודדת ולבדיקת מנגנוני צ'פרון RNA.
מבוא
ביטוי הגנים של החיידקים מווסת באופן נרחב ברמה שלאחר השעתוק על ידי RNA קטנים. RNA קצרים אלה (בדרך כלל 50-300 n) פועלים על ידי זיווג בסיסים עם mRNA המטרה1. במקרים רבים, sRNA מאנלים לאתרי קישור לריבוזומים כדי לדכא תרגום או לגרום לדעיכת mRNA על ידי גיוס RNאזות 2,3. למרות שאינטראקציות אלו נחקרו בהרחבה באמצעות בדיקות גנטיות וביוכימיות, רוב הגישות הזמינות מסיקות ויסות בעקיפין מהשפעות במצב יציב על רמות ה-RNA או פלט החלבונים, מה שמקשה על פתרון הדינמיקה הבסיסית של הקשר.
ויסות מטרה יעיל דורש לעיתים קרובות את ה-RNA המלווה Hfq, חלבון קטן הדמוי Smהקסמרי 4,5. HFQ מאריך את מחצית החיים של sRNA על ידי הגנה מפני נוקלאזים6 ומקדם אנילינג עם mRNA יעד 7,8. HFQ משיגה פונקציות אלו באמצעות שלושה משטחים נפרדים של קישור RNA עם העדפות שונות: הפאה הדיסטלית מזהה מוטיבים של AAN שנמצאים בדרך כלל ב-mRNA, הפנים הפרוקסימליות קושרת רצפים עשירים ב-U האופייניים לסטרימינטורים של sRNA, והשפה מתקיימת אלקטרוסטטית עם עמודי השדרה של RNA9. עם זאת, Hfq נמצא בשפע נמוך בהרבה מהמאגר הכולל של RNA האינטראקטיביים10,11. למרות המגבלה הנראית לעין זו, sRNA מסונתזים חדשים מוצאים במהירות את מטרותיהם ומפעילים ויסות בתוך דקות מהשעתוק12. פרדוקס זה מציע שאינטראקציות RNA-Hfq הן דינמיות מאוד, כאשר RNA מתחברים ומתנתקים באופן רציף במקום להישאר קשורים בקומפלקסים יציבים13,14. הבנת האופן שבו אינטראקציות חולפות כאלה מייצרות ויסות אמין דורשת גישה ניסויית לאירועי קישור בודדים ולא לממוצעי אוכלוסייה.
האינטראקציות בין sRNA ל-mRNA מתווכות על ידי רצפי זרעים משלימים בצורה לא מושלמת, אשר חייבים למקם את אתרי ההתאמה שלהם בתוך mRNAs שלרוב ארוכים ומובנים מאוד. בנוסף, המרחק בין אזור זרע ה-sRNA לאתר הקשירה ל-Hfq ב-mRNA יכול להשתנות במידה ניכרת15, מה שמסבך עוד יותר את תהליך החישוש. HFQ מסייע להתגבר על אתגרים אלו על ידי העברת sRNA בגמישות בין אתרי קישור פוטנציאליים במטרה, ובכך מגבירה את הסיכוי להיתקל באזור הזיווג הנכון16. זיווג מתווך HFQ יכול גם לעצב מחדש מבני mRNA מקומיים, לפתוח באופן זמני אזורים מזווגי בסיס ולחשוף רצפים שאינם נגישים בדרך כלל. עם זאת, שיפוץ כזה עלול גם להוביל לאירועי חישוש לא פרודוקטיביים או כושלות. אינטראקציות חולפות אלו יכולות לעיתים להיות מייצבות על ידי מוטיבים חזקים של קישור Hfq הממוקמים סמוך לאתר הזיווג17. למרות גמישות זו, לא כל המפגשים עם sRNA-mRNA מובילים להיווצרות דופלקס יציבה, והגורמים שקובעים את יעילות האנילינג עדיין אינם מובנים היטב. בפרט, עדיין לא ברור כיצד דטרמיננטי רצף בודדים תורמים כמותית לחיי חיי קישור וליציבות מורכבת.
כאן, הקמנו מערכת מולקולה בודדת מינימלית מחודשת המאפשרת מניפולציה מדורגת של דטרמיננטי רצף ומדידה ישירה של קינטיקת אנילינג באמצעות smFRET. במערכת זו, תכננו זוגות RNA עם חישוש לא יעיל בתחילה ותכונות מפתח ששונו באופן שיטתי, כולל חוזק הזרע, חוזק המוטיבים הקשור ל-Hfq, והמרווחים בין אתרים אלו, כדי לנתח כיצד פרמטרים בודדים משפיעים על יציבות הדופלקס. על ידי בידוד תכונות רצף מוגדרות במערכת מבוקרת במבחנה , גישה זו מאפשרת ניתוח מכני של כללי מיקוד sRNA שקשה לפרק אותם ב-vivo בשל מורכבות הרשת והשפעות רגולטוריות עקיפות.
פרוטוקול
פרוטוקול זה מתאר את מבחן FRET חד-מולקולי לניטור אנילינג sRNA-mRNA. הוא כולל נהלים לעיצוב RNA מודל, סינתזה, פסיבציה ופונקציונליזציה של שקופיות, דימות מולקולה בודדת וניתוח נתונים כמותי.
הכנת RNA
עצב את רצפי ה-sRNA וה-mRNA בסיליקו. כל sRNA צריך להסתיים עם סיום שעתוק ולהכיל מוטיב Hfq עשיר ב-U וכן רצף זרעים המשלים את ה-mRNA המטרה. ה-mRNA המתאים צריך לכלול חזרות AAN המשמשים כמוטיב קישור ל-Hfq ורצף משלים לאזור זרעי ה-sRNA. רצפים מחוץ לקישור Hfq הם אקראיים תוך הימנעות ממוטיבים של AAN ומסלולי U עשירים כדי למנוע אינטראקציות Hfq לא מכוונות. הוסיפו רצף משלים קשור לקצה ה-3' של ה-mRNA כדי לאפשר קיבוע על פני השטח במהלך ההדמיה. חיזוי מבנים משניים של RNA ללא רצף משלים של קשרים באמצעות RNAstructure דרך שרת האינטרנט או מקומית18. לניתוח מבוסס רשת, העלה רצפי FASTA לשרת האינטרנט RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) ובחר לחזות מבנה משני. השתמש בפרמטרים ברירת מחדל (טמפרטורה 37°C, ללא הגבלות קיפול). לאחר החישוב, בדוק את דיאגרמת המבנה ואת ההסתברות לקיפול. אזורים סווגו כחסומים אם נוקלאוטידים בתוך מוטיב הזרע או קישור Hfq חזו הסתברויות זיווג בסיסים >60%. רצפים שעברו סף זה עוצבו מחדש.
הכינו תבניות DNA לשעתוק במבחנה על ידי הרחבת אוליגונוקלאוטידים חופפים באמצעות DNA פולימראז, בהתאם לפרוטוקול היצרן. ריכוז הפריימר היה 3 מיקרומולר כל אחד. תוכנית התרמחזורים שימשה לפי המלצת היצרן, למעט שמספר מחזורי ההגברה הופחת ל-8, מה שהספיק להרחבת הפריימרים.
תמלל RNA בטמפרטורה של 37 °C למשך 3 שעות ועד לילה באמצעות פולימראז T7 RNA בבופר שעתוק 1× (80 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM spermidine, 10 mM NaCl), בתוספת 1 mM כל NTP, 40 mM DTT, ו-30 mM MgCl2. עצור את התגובה על ידי הוספת EDTA לריכוז סופי של 30 מ"מ. להשקעת RNA, יש להוסיף 1/10 נפח של 3 M NaOAc (pH 5.4), ואחריו 2.5-3 נפחים של ≥99% אתנול. מערבבים היטב ודגרו בטמפרטורה של מינוס 80°C למשך שעה. RNA כדורי בצנטריפוגציה ב-≥20,000 × גרם למשך 35 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסירו את הסופרנטנט, שטפו את הכדור עם 70% אתנול, וייבשו באוויר לזמן קצר. המיס את כדור ה-RNA ב-20 מיקרוליטר של 8 מיליון אוריאה וחמם ב-90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לטהר את ה-RNA על ג'לים של 8% פוליאקרילאמיד המכילים 8 מיליון אוריאה. הסרת הפסים המעניינים ושחרר את ה-RNA במהלך הלילה בבופר ההשקה (0.3 מיליון נתרן אצטט, pH 5.4, 1 mM EDTA). לשחזר את ה-RNA באמצעות משקע אתנול (לעקוב אחרי הוראות השקיעת DNA) ולהמיס את הכדור במים ללא נוקלאז.
כדי להכין RNA לתיוג פלואורסצנטי, יש לבצע שעתוק במבחנה כפי שתואר, תוך השלמת התגובה ב-32 mM GMP ליצירת תמלילים הנושאים מונופוספט בגודל 5' לטפל ב-RNA ב-1-אתיל-3-[3-דימתילאמינופרופיל] קרבודיאמיד הידרוכלוריד19 (EDC) ואימידאזול כדי להכניס קבוצת אמינים בקצה 5 רגל. דגרו את ה-sRNA בבופר פחמן-ביקרבונט (pH 8.5) עם אסטר Alexa Fluor 555 או Cy3 NHS, בהתאם להוראות היצרן. לטהר את ה-RNA המותאם באמצעות עמודי ספין כרומטוגרפיים, לשקע באתנול, ולהמיס את הכדור במים ללא נוקלאז. קבעו את יעילות הסימון ספקטרופוטומטרית על ידי מדידת ספיגה ב-260 ננומטר ובמקסימום הספיגה הספציפי לצבע באמצעות ספקטרופוטומטר ננודרוף או שווה ערך. חשב את ריכוזי ה-RNA והצבע באמצעות חוק ביר-למברט ומקדמי ההכחדה המתאימים שמספק יצרן הפלואורופור. יעילות התיוג מוגדרת כיחס מולרי של צבע ל-RNA והייתה בדרך כלל מתקרבת ל-100%. RNA מסומנים יכולים להיאחסן בטמפרטורה של -20°C.
סדר אוליגונוקלאוטידים ב-DNA הנושאים חתיכת ביוטין של 3′ ומקשר C6 של 5′-אמינו. השקיעת DNA באמצעות אתנול ונתרן אצטט כפי שתואר לעיל. סמנו את קבוצת האמינים עם אסטר Cy5 NHS בבופר פחמן-ביקרבונט (pH 8.5) לפי הוראות היצרן. קבעו את ריכוז ה-DNA המסומן ספקטרופוטומטרית כפי שתואר לעיל. דנ"א מסומן ניתן לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
טיהור HFQ
גדל תאי Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB הנושאים את ביטוי Hfq פלסמיד pET21b-EcHfq, שבו גן ה-Hfq של E. coli מבוטא ממפרמוטר המושרה על ידי IPTG. Hfq מבוטא ללא תג זיקה; החלבון הטבעי מכיל מספיק שאריות היסטידין חשופות לפני השטח כדי לאפשר טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה Ni2+ . גדל תאים בליטר אחד של מדיום LB-Miller בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוסל-OD 600 של 0.6. השרתו ביטוי Hfq על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 1 mM ודגירה למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. קצור את התאים בצנטריפוגציה ב-5,000 × גרם למשך 10 דקות, ואז החזיר את הכדור ל-50 מ"ל של בופר ליזיס (50 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 500 מ"מ NH4Cl, 250 מ"מ MgCl2, 1 מ"מ 2-מרקפטואנול, אזהרה: 2-מרקפטואנול רעיל, הידית במכסה אדים). ליזז את התאים באמצעות סוניקציה על קרח באמצעות מצב פולס של 50% מחזור עבודה. מרח שלושה פולסים של 40 שניות עם מרווחי קירור של דקה אחת על הקרח בין הפאימות. צנטריפוגה את הליזאט ב-27,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חממו את הסופרנטנט בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, ואז צנטריפוגה שוב באותם תנאים. לטפל בסופרנטנט המתקבל עם RNase A (30 מיקרוגרם/מ"L) ו-DNase I (5 U/mL) למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, ולאחר מכן סינון דרך פילטר 0.45 מיקרון. מרח את הליזאט המובהר על עמודת כרומטוגרפיה עם זיקה הטעונה מראש ב-NiSO4. שטוף את העמודה עם בופר (50 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 500 מ"מ NH4Cl, 0.5 מ"מ מ"מ 2-מרקפטואנול). השחרר את החלבון באמצעות אותו בופר עם ריכוז גרדיאנט אימידאזול ליניארי מ-10 מ"מ עד 1 מ'. אסוף את החלקים המכילים Hfq וטען אותם על עמודת הכרומטוגרפיה HiLoad 16/600 Superdex 200 עם מאזן עם בופר HB (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% גליצרול). הפעל את העמודה לפי הוראות היצרן. ניתוח SDS-PAGE מייצג של טיהור Hfq מוצג באיור משלים 1. ריכזו את החלבון המטוהר, במידת הצורך, באמצעות מסננים צנטריפוגליים (3 kDa MWCO). אליקווטים מטוהרים של Hfq יכולים להיאחסן בטמפרטורה של -80°C.
ניסויים במולקולה בודדת
פסיבציה של שקופיות קוורץ20
הכינו שקופיות קוורץ עם חמישה חורים מקבילים (קוטר 0.8 מ"מ) שנקדחו ליד כל קצה ארוך. הניחו סליידים וכיסויי קוורץ בצנצנת צביעה של Hellendahl (מחזיק שקופיות) וצרו סוניקט באצטון למשך 20 דקות (זהירות: אצטון דליק ונדיף; עבדו במכסה אדים). חזור על שלב הניקוי עם מתנול (זהירות: מתנול רעיל ודליק; הידית בתוך מכסה אדים). שטוף היטב את המחסניות במים וסוניק ב-1 מטר KOH למשך שעה (אזהרה: KOH הוא צורב, יש ללבוש כפפות והגנה על העיניים). שטוף את הסליידים במים, ואז סוניקט ברצף באצטון ומתנול למשך 20 דקות כל אחד. חזור על ניקוי ה-KOH באמצעות 5 מטר KOH למשך שעה, ואחריו שטיפה יסודית במים (זהירות: לטפל ב-KOH מרוכז עם ציוד מגן מתאים). ייבשו את המגלשות באוויר. הכינו סט נקי של צנצנות Hellendahl לצביעה ושטפו אותן בהקסאן (זהירות: הקסן דליק מאוד; הידית במכסה אדים), ואז אפשרו להם להתייבש באוויר. הנח את המחסניות במחזיק השקופיות ושוטף אותן פעמיים עם הקסאן. הוסף 75 מ"ל הקסן למחזיק המחסנית והזריק בזהירות 50 מיקרוליטר דיכלורודימתילסילן (DMDCS) מתחת לפני השטח של ההקסאן (הערה: הימנע מחשיפת DMDCS לאוויר). דגר את המחסניות בנדנוד עדין למשך 1.5 שעה. שטוף וסוניק את השקופיות בהקסאן למשך דקה אחת וחזר על השלב שלוש פעמים כדי להסיר את שאריות ה-DMDCS. ייבשו את המחסניות באוויר ואטומו אותן בוואקום בצינורות של 50 מ"ל (למשל, פלקון או צינורות חרוטיים). ניתן לאחסן שקופיות מוכנות בטמפרטורה של −20°C עד לשימוש נוסף.
הרכבה ופונקציונליזציה של תעלות זרימה
ניתן להרכיב ערוץ זרימה פשוט באמצעות סלייד קוורץ, כיסוי זכוכית, סרט דו-צדדי, קצות פיפטות ואפוקסי. מרח רצועות דקות של סרט דו-צדדי בין החורים במגלש הקוורץ ומניח את הכיסוי למעלה. לאטום את הקצוות הארוכים עם אפוקסי. חותכים כ-5 מ"מ מקטעים מקצה פיפטה (גם הקצה הצר וגם הקולר הרחב) ומכניסים אחד לחור שישמש כיציאה, ואת השני לחור מקביל ליצירת מיכל כניסה. אבטח את שניהם עם אפוקסי. מיכל הכניסה צריך לשמור נוזל מבלי לדלוף לפני ההזרקה. כדי למשוך פתרונות דרך התעלה, חבר צינור ממזרק של 1 מ"ל ליציאה.
טפל בתעלות ברצף עם המגיבים הבאים כדי לתפקד את המשטח: BSA ביוטינילט (0.2 מ"ג/מ"ל) למשך 5 דקות, טווין-20 (0.2%) למשך 10 דקות, ו-NeutrAvidin (0.1 mg/mL) למשך דקה אחת. כ-100 מיקרוליטר מכל תמיסה מספיקים לכל ערוץ. הימנעו משאיבת נוזל רב יותר ממה שיש במאגר הכניסה, שכן זה יכניס אוויר לתעלה וייצור בועות. השאירו נפח קטן של תמיסה במיכל בין השלבים כדי למנוע את התייבשות של התעלה. שטוף היטב עם בופר TNK 1× (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 50 מ"מ NaCl, 50 מ"מ KCl) בין כל שלב. טיפול זה יוצר משטח ביאוטין-ניוטראבידין לקיבוע RNA.
הכינו דופלקסים של mRNA-tether מיד לפני הקיבוע על ידי ערבוב mRNA של 40 ננומטר עם 20 ננומטר DNA מסומן בביוטינילציה Cy5. דנאטור התערובת ב-75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בבופר 1× TNK (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 50 מ"מ NaCl, 50 מ"מ KCl), ואז מבצע ריפולד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומאוזן ב-20 מעלות צלזיוס.
מדלל את הדגימה פי 50 בבופר הדמיה (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hydroxy-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-קרבוקסילית, 0.01% אוקטאתילן גליקול מונודודציל את'ר, 0.8% גלוקוז, מעכב 2 U/mL RNase) והזרקה לערוץ הזרימה כדי לייצב את ה-mRNA. דגרו למשך דקה, ואז שטפו עם בופר הדמיה בתוספת מערכת איסוף חמצן (165 U/mL גלוקוז אוקסידאז ו-2170 U/mL קטלאז) להפחתת הלבנת הפוטו.
הכינו קומפלקסים של sRNA-Hfq על ידי ערבוב הרכיבים ביחס 1:1 לריכוז סופי של 250 ננומטר בבופר TNK 1× ודגרו במשך 5-15 דקות בטמפרטורת החדר. מדלל את הקומפלקסים פי 50 בבופר ההדמיה המכיל את מערכת איסוף החמצן והזריק אותם לערוץ הזרימה מיד לפני ההדמיה.
רכישת נתונים במולקולה בודדת
התקן את מיקרוסקופ ה-TIRF המבוסס פריזמה על ידי הפעלת מצלמת EMCCD ולייזרים. התקן את המחסנית המוכנה עם תעלות זרימה מורכבות על שלב המיקרוסקופ והניח את הפריזמה מעל. השתמש בתוכנה אחת (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) כדי להשיג נתונים. בתוכנה, קבעו את רמת הרקע על ידי בחירת AutoScale והעתקו את הערך שהושג לשדה הרקע. הגדר את קצב הרכישה ל-100 ms. Excite Alexa Fluor 555 או Cy3 באמצעות לייזר 532 ננומטר ו-Cy5 באמצעות לייזר 633 ננומטר. איסוף פליטות משני הערוצים בו-זמנית באמצעות מטרה של 60× טבילה במים. לכל סרט, התחל בעשר פריימים של עירור 633 ננומטר כדי למקם mRNA מסומנים ב-Cy5 בשדה הראייה. המשיכו להקליט במשך 5 דקות עם עירור של 532 ננומטר. סיימו את הרכישה עם 1 שנייה של עירור של 633 ננומטר כדי לאמת הלבנת Cy5. זה ייצור את קובץ הסרט .pma, שניתן להשתמש בו לניתוח.
ניתוח נתונים של מולקולה בודדת
ניתוח קבצי .pma גולמיים באמצעות סקריפטים מותאמים אישית של IDL לביצוע מיפוי ערוצי תורם-מקבל וחילוץ מסלולי עוצמת פלואורסצנציה. ראשית, הקליטו סרט כיול באמצעות חרוזי פלואורסצנט רב-צבעוניים הניתנים לזיהוי בערוצי התורם והקולט בעת עירור באמצעות לייזר 532 ננומטר או 633 ננומטר. השתמשו בסרט הכיול הזה כדי ליצור קובץ מיפוי שמיישר ערוצי תורם ומקבל. ייסלו את קובץ המיפוי שנוצר על כל ההקלטות הניסיוניות כדי לזהות זוגות תורם-מקבל מתאימים, לזהות נקודות פלואורסצנטיות, ולייצוא עקבות זמן עוצמה לניתוח FRET במורד הזרם. הוראות מפורטות שלב אחר שלב מסופקות יחד עם התסריט (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).
מעקבי עוצמת התהליך ב-MATLAB באמצעות הסקריפט s_tr_E.m. הפעל את הסקריפט והכנס לתיקייה הכוללת את קבצי .traces ו-.pks, ואחריהם אינדקס הקבצים ופתרון הזמן. בחר את חלון המסגרת שבו משתמשים לזיהוי נקודות כאשר מתבקשים. הסקריפט מציג אז את עוצמת התורם והמקבל בכל נקודה בודדת. נווט בין מולקולות באמצעות פקודות מקלדת (b לחזור, g לקפוץ למולקולה מסוימת). הגדר קווי בסיס של תורם ומקבל (k) ותיקון דליפה (l) על ידי לחיצה על הגרפים בעת הצורך. שמור את העקבות שהתקבלו בנפרד כקבצי .dat המכילים עוצמות זמן, תורם ומקבל על ידי לחיצה על s. השתמש בקבצים המיוצאים לניתוח כמותי במורד הדרך.
השתמש בתוכנת מאתר השיא כדי לנתח עקבות smFRET בודדים ולהפיק אירועי קישור לצורך כמות, כולל ניתוח זמן השהייה והתפלגויות מצבי FRET. הפעל את התוכנית ופתח את התיקייה שמכילה את קבצי .dat המעקב המיוצאים באמצעות תפריט הקבצים. הגדר את ערכי הבסיס וערכי הדליפה בין תורם למקבל שנקבעו קודם באמצעות סקריפט MATLAB. לאחר מכן, הגדר את ספי העוצמה שינחו זיהוי שיא אוטומטי כך שכל אירועי הקישור המאומתים ויזואלית יהיו מעל הערכים הנבחרים. אם רעש גורם לאירוע יחיד להתפצל למספר פיקים, יש למזג אותם ידנית באמצעות פונקציית המיזוג המובנית. לחץ על Save peaks כדי לייצא אירועים שזוהו כקבצי .csv המכילים זמן התחלה, זמן סיום ויעילות ממוצעת FRET לכל אירוע. קבצי הפלט נשמרים בתיקיית peaks, בעוד שערכי FRET רזולוציה לכל אירוע נכתבים לתיקיית הסריגים הגבוהים. יעילות ה-FRET מחושבת על ידי חלוקת עוצמת הפלואורסצנציה של המקבל בסכום עוצמות התורם והמקבל, תוך שימוש בערכים המתוקנים לדליפה רקע ותורם לערוץ המקבל. בדוק ידנית עקבות לפוטהלבנת Cy5, שזוהה על ידי ירידה חדה ביעילות ה-FRET המלווה בעלייה בעוצמת Cy3. כאשר מתרחשת הלבנת פוטו, יש להניח שהקישור נמשך כל עוד פלואורסצנציה של Cy3 נשארת ניתנת לזיהוי, ותתקן את משך השיא על ידי עריכת קבצי .csv המתאימים.
ייבא ערכי יעילות FRET בפתרון פריימים מקבצי הסריגים השיא ל-GraphPad Prism. יצירת היסטוגרמות FRET באמצעות פונקציית התפלגות התדירות והתאמת ההתפלגויות עם מודלים גאוסיאניים לזיהוי אוכלוסיית ה-FRET הדומיננטית.
קבעו זמני השהייה לאירועי קישור בודדים על ידי הפחתת אסוציאציות מנקודות זמן דיסוציאציה באמצעות גיליון אלקטרוני. חשב את שיעור האירועים החולפים (<10 שניות) עבור כל חזרה ניסויית. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו ב-GraphPad Prism. השוואות בין שני מצבים הוערכו באמצעות מבחני t לא מזווגים, והשוואות בין שלושה מצבים או יותר נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי.
תוצאות
אורך הזרע קובע את המשטר הדינמי של זיווג sRNA-mRNA
הקמנו בדיקה מינימלית של מולקולה אחת כדי לבדוק כיצד תכונות הרצף שולטות באנילינג המתווכת על ידי Hfq. RNAים מודליים תוכננו לפי ארכיטקטורות שתוארו קודם של זוגות sRNA-mRNA תלויי Hfq 16,17 ונשאו מוטיב קישור Hfq עשיר באדנוזין על ה-mRNA ואתר קישור עשיר באורידין בשוליים ב-sRNA (איור 1A). ה-sRNA סומן ב-Alexa Fluor 555 (תורם) בקצה ה-5ʹ ובכבל mRNA-DNA עם Cy5 (מקבל), מה שאפשר זיהוי של קרבה הנגרמת על ידי זיווג בסיסים באמצעות FRET.
שינוי ההשלמה של הזרעים בין 4, 5, 8 ל-10 bp יצר התנהגויות דינמיות מובחנות. עם זרע של 4 בסיסים, האינטראקציות היו בעיקר חולפות והראו יעילות FRET הטרוגנית, מה שמרמז על זיווג בסיסים לא שלם (איור 1B-D). לעומת זאת, זרעי 8-bp ו-10-bp הניבו דופלקסים יציבים שלעיתים נשארו לאורך חלון התצפית (איור 1C). האינטראקציות יצרו את מצב ה-FRET הגבוה הצפוי (E FRET ≈ 0.79-0.80, איור 1D), התואם לזיווג בסיסים מלא בין RNA. זרע של 5 bp יצר אירועי קישור קצרים אך מוגדרים היטב (E FRET ≈ 0.66), מה שסיפק טווח דינמי מעשי לשינויים הבאים ברצף ה-RNA (איור 1B-D). לכן השתמשנו בקונספלומנטריות של 5-bp בכל הבדיקות במורד הזרם.
מוטיבים חזקים יותר לקשירת Hfq מגבירים את יציבות קומפלקס sRNA-mRNA
לאחר מכן שאלנו כיצד חוזק הקשירה ב-Hfq מווסת את חיי הקישור בהתאמה קבועה של 5 בסיסים. הרחבת מוטיב ה-mRNA מ-AAN4 ל-AAN6 הגדילה משמעותית את הסיכוי להיווצרות קומפלקסים יציבים (p < 0.001). אורך החיים הממוצע עלה מ-7.5 שניות ל-18 שניות, והחלק של אירועים לא יציבים < 10 שניות ירד מ-80 ± 2% ל-68.3 ± 2.9% (איור 2A-C).
לאחר מכן בדקנו את השפעת מוטיב קישור Hfq על ה-sRNA. קיצור אתר הקישור לשוליים מ-UUAUUUUU ל-CUUC (sRNA-SR, "שפה קצרה") יצר אינטראקציות לא יציבות מאוד (אורך חיים ממוצע 1.9 שניות עם AAN4), וחיזוק מוטיב ה-mRNA בהקשר זה השפיע רק במידה מתונה (ממוצע 3.0 שניות עם AAN6, לא משמעותי, איור 2B,C). לכן, שני הזוגות תורמים ליציבות הקומפלקס המופק, אך מגעי sRNA-Hfq חלשים מגבילים את הרווחים ממוטיב mRNA חזק יותר.
מרווח בין אתרי Hfq ואתרי זרעים ב-mRNA מקדם קומפלקסים ארוכי חיים
Hfq יכול להישאר קשור לאזור ה-AAN תוך שימוש במשטח השפה שלו כדי להקל על החיפוש אחר אתר זוגיות מיטבי של sRNA16. תכונה זו הצביעה על כך שמרחק נוסף בין שני אזורי הקשר ב-mRNA עשוי להשפיע על יציבות האינטראקציה.
כדי לבדוק זאת, הכנסנו מרווח חד-גדילי 15-NT בין אתרי הקישור Hfq ו-sRNA (N15). שינוי זה הגדיל משמעותית את אורך חיי אירועי האנילינג היציבים מ-7.5 שניות (AAN4) ל-47 שניות (AAN4-N15) (עמוד < 0.01) (איור 3A,B). אחוז אירועי הקישור שנמשכו פחות מ-10 שניות ירד גם הוא מ-80 ± 2% ל-44 ± 6% (איור 3C). נתונים אלה מצביעים על כך שגמישות נוספת בין מודולי הקישור יכולה לייצב את הביניים של האנילינג ולקדם דופלקסים ארוכי חיים.
זמינות נתונים:
כל הנתונים התומכים בממצאי מחקר זה, כולל מסלולי FRET חד-מולקוליים, מערכי נתונים מעובדים וסקריפטים לניתוח, זמינים לציבור במאגר הנתונים של מנדלי בכתובת: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
איור 1: השפעת השלמת sRNA-mRNA על יעילות הקישור. (A) בדיקת smFRET לחישוש sRNA-mRNA. הזיווג בין ה-sRNA המסומן באלקסה פלואר 555 לבין קומפלקס ה-mRNA-Cy5-DNA המקובע יוצר אות FRET גבוה. mRNA במודל מכיל אתר קישור ל-Hfq (AAC)4 (כחול) ואתר קישור ל-sRNA (S5, אדום), ואחריו חמישה נוקלאוטידים ואזור ההיבריד RNA-DNA. sRNA כוללים אתר קישור לשוליים (כתום). הפאנלים ב-(B-D) מקובצים לפי תנאי ניסויי (אורך הזרע). (B) אירוע קישור מייצג של sRNA על מולקולת mRNA בודדת. מוצגים עקבות עוצמת פלואורסצנציה של sRNA מסומן על ידי Alexa Fluor 555 (תורם, ירוק) ו-Cy5-DNA (מקבל, אדום). Cy5 היה נרגש ישירות בעשרת הפריימים הראשונים והאחרונים של ההקלטה. (C) רסטרגרמות המציגות 50 מולקולות mRNA מייצגות הקשורות על ידי sRNA-Hfq. כל פס אופקי מייצג אינטראקציה אחת בין sRNA ל-mRNA. (D) היסטוגרמות של יעילות FRET לאינטראקציות בין mRNA ל-sRNA המכילות 4 bp (N = 416 mRNA), 5 bp (N = 513 mRNA), 8 bp (N = 191 mRNA), או 10 bp (N = 105 mRNAs) אזורים משלים. יעילות ה-FRET חושבה על פי עוצמות תורם ומקבל מתוקן בסיס ודליפה עבור אירועי קישור בודדים במרווחי זמן של 0.1 שניות. התאמות גאוסיות (כחולות) מוצגות כמצביעות על אוכלוסיית ה-FRET הדומיננטית ולא שימשו לחישוב ערכי E_FRET. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 2: השפעת אורך המוטיבים של קישור Hfq על אינטראקציות sRNA-mRNA. אזור הזיווג של הבסיסים בכל הגרסאות הוא באורך 5 בסיסים. (A) רסטרגרמות המציגות 50 mRNA מייצגים הקשורים לקומפלקסים sRNA-Hfq. כל פס אופקי מייצג אינטראקציה יחידה. דיאגרמות הקריקטורות למעלה ממחישות את עיצובי ה-RNA המתאימים עם שינויים במספר החזרות (AAC) ב-mRNA ובאורך אזור הקשירה לשוליים ב-sRNA (SR = "שפה קצרה"). צביעה כפי שמופיע באיור 1A. (ב) גרפים של פיזור של חיי חיי קישור sRNA-mRNA. כל נקודה מייצגת אירוע קישור יחיד. אורך חיים ממוצע (קו אופקי אדום): 7.5 שניות ל-mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA), 18 שניות ל-mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNA), 1.9 שניות ל-mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNA), ו-3 שניות ל-mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNA). (ג) גרף עמודות המראה את אחוז אירועי הקישור הקצרים מ-10 שניות. פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן משני מערכי נתונים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי על ידי אנובה חד-כיוונית עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי להשוואות מרובות. עמוד < 0.001, ****p < 0.0001; NS, לא משמעותי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור 3: השפעת אורך המרווח בין אתרי קישור Hfq ל-sRNA על אינטראקציות sRNA-mRNA. אזור הזיווג של הבסיסים בכל הגרסאות הוא באורך 5 בסיסים. (A) רסטרגרמות המציגות 50 mRNA מייצגים הקשורים על ידי קומפלקס sRNA-Hfq. כל פס אופקי מייצג אירוע קישור יחיד. הדיאגרמות המצוירות למעלה ממחישות את עיצוב ה-RNA המתאים. N15 = מרווח 15 nt ברצף אקראי. צביעה כפי שמופיע באיור 1A. (ב) גרפים של פיזור של חיי חיי קישור sRNA-mRNA. כל נקודה מייצגת אירוע קישור יחיד. אורך חיים ממוצע (קו אופקי אדום): 7.5 שניות ל-mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNAs) ו-47 שניות ל-mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNA). (ג) גרף עמודות המראה את אחוז אירועי הקישור הקצרים מ-10 שניות. פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן משני מערכי נתונים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t לא מזווג. **p < 0.01. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
איור משלים 1: טיהור E. coli Hfq. ניתוח SDS-PAGE של ביטוי וטיהור Hfq. (למעלה) דגימות שנאספו במהלך טיהור על עמודת זיקה Ni2+ (HiTrap), כולל לפני האינדוקציה, לאחר השראה, כדור, ליזאט, עומס, זרימה, שברי שטיפה, ושברים שיאיים מושלפים. (למטה) SDS-PAGE של שברי שיא לאחר כרומטוגרפיית הוצאת גודל בעמודת HiLoad 16/600 Superdex 200. צורות מונומריות (~11 kDa) ו-hexameric (~66 kDa) של Hfq מסומנות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.
דיון
מחקר זה קובע מבחן מינימלי של מולקולה אחת לניתוח כיצד תכונות מסוימות של רצף RNA קובעות את יעילות האנילינג של sRNA-mRNA המתווכת על ידי Hfq. על ידי שינוי אורך הזרע, עוצמת המוטיבים של קישור Hfq, ורווחים בין מודולי קישור, כימתנו ישירות כיצד כל פרמטר תורם ליציבות דופלקס ברזולוציה של מולקולה בודדת. בניגוד למדידות קבוצתיות, המדווחות על השפעות ממוצעות אוכלוסייה, גישה זו פותרת ישירות אירועי קישור ודיסוציאציה בודדים, ומאפשרת מדידת הטרוגניות קינטית ואינטראקציות חולפות. התוצאות שלנו מראות שגם אזורים קצרים עם זרעים יכולים לפעול זמנית, בעוד שזרעים ארוכים מייצרים דופלקסים יציבים עם אורך חיים ממושך. ממצאים אלה תואמים לנתונים מוקדמים יותר ב-in vivo ובאנסמבל, שהראו כי אזורים טבעיים של זרעים ב-sRNA חיידקיים בדרך כלל משתרעים על פני 6-12 נוקלאוטידים ולעיתים נדירות יוצרים דופלקסים משלימיםלחלוטין 21,22,23.
מצאנו גם ששני המוטיבים של mRNA ו-sRNA לקישור Hfq משפיעים מאוד על יציבות הדופלקס. הארכת מוטיב ה-AAN על ה-mRNA האריכה את חיי הקשר, תוך קיצור אתר הקישור לשוליים של ה-sRNA ערערה משמעותית את יציבותם. זה תומך במודל שיתופי שבו הפאה הדיסטלית של Hfq מעגנת מוטיבים עשירים ב-mRNA באדנוזינים, והשפה מגייסת sRNA עשירים באורידין לקידום יישור יעיל של אזורים משלימים 9,17. בניגוד לבדיקות גנטיות או מבוססות מדווח, שמזהות בדרך כלל רק תוצאות רגולטוריות פרודוקטיביות, מערכת זו מפרידה כמותית בין יציבות הקישור להשפעות במורד הזרם, ומאפשרת השוואה ישירה לאופן שבו תכונות רצף בודדות מווסתות את חיי האינטראקציה הפיזיקלית. מוטיב חזק של קישור לשוליים חשוב במיוחד כאשר נדרשים סידורים מבניים להתאמה בין sRNA-mRNA, שכן הוא משפר את שמירת ה-RNA ב-Hfq17. סבורים גם שהשפה מקדמת סריקה צדדית של mRNA באמצעות קומפלקסים sRNA-Hfq16, תכונה שעשויה להיות חשובה במיוחד כאשר אתרי היעד רחוקים מאזור הקשירה ל-Hfq. התוצאות שלנו עם מרווח 15-NT בין אתרי הקישור תומכות בתפיסה זו, ומראות כי גמישות נוספת בין הזרע למוטיב Hfq משפרת את יציבות הזוגיות, ייתכן על ידי הפחתת מגבלות סטריות במהלך החלפת גדרים.
מעבר למערכות טבעיות, התוצאות רלוונטיות לעיצוב של sRNA סינתטי או מהונדס. רוב אסטרטגיות העיצוב הקיימות מתמקדות באופטימיזציה של אזור זרעים או פיגום כללי 23,24,25, אך הנתונים שלנו מדגישים גורמים נוספים כמו המרווח בין מוטיב הקשירה ל-Hfq לאזור היעד. מכיוון שמאפייני רצף מוכנסים בצורה מבוקרת ומודולרית, המבחן מספק מסגרת ניסוי שיטתית לבדיקת כללי העיצוב. עיקרון זה עשוי להנחות בנייה עתידית של sRNA מלאכותי עם יעילות רגולטורית משופרת.
בעוד שהגישה מאפשרת ניתוח כמותי וניתן לשחזור של אינטראקציות RNA-RNA, יש לה גם מגבלות. הבדיקה חוקרת אזורים משלימים לחלוטין, בעוד שרוב האינטראקציות הפיזיולוגיות בין sRNA ל-mRNA מכילות חוסר התאמות ובליטות שיכולות להשפיע על הזיהוי והוויסות שלה. השיטה מודדת את חיי הקישור של sRNA-mRNA אך אינה מתמודדת ישירות עם תוצאות רגולטוריות בהמשך, כגון עיכוב תרגום או דעיכת mRNA. התאמות עתידיות של מבחן זה עשויות לכלול אזורי זרעים לא תואמים, תכולת GC משתנה, או ריבוזומים ודגרדוזומים כדי לבדוק באופן שיטתי כיצד גורמים אלה מעצבים את קינטיקת הקשר.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לפרופ' שרה וודסון על הקלה בגישה למכשירים חד-מולקוליים. מחקר זה מומן על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (2022/46/E/NZ1/00462 ל-EMM), ומענק התקנת EMBO (IG 5730-2024 ל-EMM).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.45 & mu; מסנן m | מיליפור | HABG04700 | |
| עמודת Hi-Trap של 5 מ"ל | ציטיבה | GE17-0408-01 | |
| אצטון | מרק | 270725 | דרגת HPLC |
| אקרילאמיד: תמיסת ביס-אקרילאמיד | מרק | A2792-100ML | |
| ALEXA555 אסטר סוקסינימידיל של ה-NHS | תרמו פישר | A20009 | |
| מסנני Amicon Ultra Centrifugal (NMWL, 3 kDa) | מרק | UFC900308 | |
| כלוריד אמוניום | מרק | 1330-500G | |
| אמפיצילין | מרק | A9518-5G | |
| ATP | ליניגל כימיקלים | K054.1 | |
| בטא-מרקפטואנול | מרק | M3148-500ML | |
| ביולוגיה-BSA | מרק | A8549-10MG | |
| עמודי Bio-Spin עם Bio-Gel P-30 | ביוגרפיה ראד | 7326231 | לטיהור RNA המסומן |
| קטלאז | מרק | C9322 | |
| CTP | ליניגל כימיקלים | K057.4 | |
| אסטר CY3 HNS | ציטיבה | PA13105 | |
| אסטר סוקסינימידיל Cy5 NHS | ציטיבה | PA15101 | |
| DDT | תרמו פישר | R0861 | |
| דיכלורודימתילסילן | מרק | 440272 | |
| אוליגומרים של DNA (קשר) מקשר אמינו 5&פריים C6 | תרמו-מדעי | לא זמין | |
| Dnase I | תרמו-סיינטיפיק | 18047019 | |
| EDC | תרמו-מדעי | PG82079 | |
| EDTA | מרק | ED2SS-1KG | |
| מצלמת EMCCD | אנדור | ||
| אתנול | מרק | 1085430250 | |
| גלוקוז | מרק | D9434-1KG | |
| גלוקוז אוקסידאז | מרק | G2133-50KU | |
| גליצרול | מרק | G5516-1L | |
| GMP | מרק | G8377 | |
| GTP | ליניגל כימיקלים | K056.4 | |
| HCL | מרק | 1.00318 | |
| הקסן | תרמו פישר | 045652.M1 | |
| עמודת החריגה בגודל HiLoad 16/60 Superdex 200 | ציטיבה | GE28-9893-35 | |
| IPTG | מרק | 420322-1GM | |
| KCl | מרק | P9541-1KG | |
| KOH | מרק | 484016-1 ק"ג | |
| כלוריד מגנסיום | מרק | M8266-1KG | |
| מתנול | מרק | 34885-M | דרגת HPLC |
| ניוטרווידין | תרמו פישר | 31000 | |
| סולפט ניקל | מרק | 1067261000 | |
| ניקול | מרק | P8925-1G | |
| פולימראז Q5 | NEB | M0491S | משמש לייצור תבנית תמלול חוץ-גופית |
| RNase A | תרמו-מדעי | EN0531 | |
| RNasin Plus | פרומגה | N2611 | |
| נתרן אצטט | מרק | S7545-100G | |
| כלוריד נתרן | סיגמא-אלדריץ' | S3014-1KG | |
| ספרמידין | מרק לייף סיינס | S2626 | |
| בסיס טריס | תרמו-סיינטיפיק | 17926 | |
| טרולוקס | מרק | 238813-1G | |
| אוריאה | מרק | U1250-5KG | |
| UTP | ליניגל כימיקלים | K055.3 |
מקורות
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).