Method Article

תהליך עבודה להדמיה חיה וניתוח כמותי של רשתות מיקרוטובולים אצנטרוזומליים בביציות דרוזופילה

DOI:

10.3791/69983

⸱

June 26th, 2026

 ,  , 
1iNOVA4Health, NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב הדמיה חיה עם כלי ניתוח אוטומטיים לניתוח דינמיקת מיקרוטובולים בביצית הדרוזופילה . תהליך עבודה זה מאפשר מדידה יעילה וניתנת לשחזור של התנהגות מיקרוטובולים, כולל גדילה, כיוון, מהירות וארגון מרחבי, וניתן להתאים אותו לסוגי תאים אחרים בעת אופטימיזציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלד התא המיקרוטובול (MT) חיוני לפונקציות תאיות רבות, כולל צורת התא, קוטביות, נדידה וחלוקה. בעוד שצנטרוזומים משמשים כמרכז הארגון הראשי ל-MT (MTOC) בתאי בעלי חיים מתחלקים, תאים ממוינים רבים, כולל ביציות Drosophila , מסתמכים על מסלולים א-צנטרוזומליים להרכבת רשתות MT. בניגוד לידע הנרחב על ארגון MT בתאים מתרבים, מעט ידוע על האופן שבו רשתות MT מתאספות ללא צנטרוזומים. ביציות דרוזופילה מספקות מודל עוצמתי לחקר ארגון ודינמיקת MT אצנטרוזומליים. עם זאת, רשת ה-MT הצפופה שלהם מאתגרת את ההדמיה הקונבנציונלית. הדמיה חיה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של צמיחת וכיוון MT, אך שיטות הניתוח הסטנדרטיות נשארות מוגבלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס הדמיה חיה לניתוח דינמיקת גידול MT בביצי דרוזופילה באמצעות End-Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP), חלבון מעקב פלוס-אנד שמסמן אתרי פולימריזציה פעילה של MT. מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של אייריסקה מאפשרת זיהוי שביטי EB1, בעוד שמקרואים מותאמים אישית של פיג'י וסקריפטים בפייתון מספקים כימות יעיל וניתן לשחזור של צפיפות השביטים, מהירותם, אורכם וכיוונם. אישרנו שיטה זו על ידי השוואת ביציות ביקורת עם אלו שעברו דפולימריזציה של MT שנגרמה מקור, וכן מוטנטים של פטרונין (CAMSAP בבני אדם), מייצב MT מינוס קצה משומר ורכיב מרכזי ארגון מיקרוטובולים לא-צנטרוזומליים (ncMTOC), כבקרה חיובית לדינמיקת MT פגועה. הניתוחים שלנו חשפו דינמיקת MT ספציפית לאזור, כולל העשרה קדמית של שביטי EB1 והטיות אופייניות, ואישרו את רגישות תהליך העבודה לזיהוי הפרעות עדינות בגדילת MT. גישה זו מספקת מסגרת אמינה וידידותית למשתמש לחקר התנהגות MT בביציות. הפרוטוקול שלב אחר שלב מאפשר חקירת רגולטורים של MT בהקשר זה ויכול להיות ניתן להתאמה לסוגי תאים מופרזים אחרים, כגון נוירונים ותאי אפיתל, עם אופטימיזציה מתאימה. באופן רחב יותר, היא תומכת במחקרים מכניים ובסקרים גנטיים הבוחנים כיצד ארכיטקטורות MT מגוונות עומדות בבסיס תפקודים תאיים מיוחדים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלד התא של המיקרוטובול (MT) הוא מרכיב חיוני בתא האאוקריוטי, ומשחק תפקידים חיוניים בקביעת ושימור צורת התא, קוטביות וחלוקה. ההתנהגות הדינמית של פולימרי MT, המאופיינת בצמיחה ובהתכווצות, היא קריטית עבור תהליכים מבוססי MTרבים 1,2. ההרכבה של מערכי MT שונים מתבססת על הפעולה המשותפת של מרכזי ארגון מיקרוטובולים (MTOCs), מהם נוצרים גרעינים, ועל פעילות חלבוני הוויסות השונים של MT השולטים ביציבות, הכיוון והדינמיקה של MT 1,2,3. ה-MTOC הנחקר ביותר הוא הצנטרוזום, שמייצר מערכים רדיאליים של MT החשובים לוויסות צורת התא וקוטביות באינטרפאזה ולהרכבת ציר מיטוטי במיטוזה 4,5. עם זאת, ביציאה או התמיינות מיטוזית, כמו בנוירונים ותאי אפיתל, פעילות MTOC מרכזית לעיתים נחלשת, ובמקרים קיצוניים, כמו בביציות, ניתן לבטל אותה 6,7. דבר זה קשור לעיתים קרובות לשיפוץ ספציפי לסוג תא של שלד התא ה-MT, עם הקצאת תפקוד MTOC לאתרים תאיים אחרים 2,3,8, המכונים בדרך כלל MTOCs לא-צנטרוזומליים (ncMTOCs). בעוד שהושגה התקדמות משמעותית בהבהרת ארגון MT בתאי מיטוזה, ידוע מעט יחסית על האופן שבו MT נוצרים, מייצבים ומסודרים במרחב בתאי בעלי חיים היוצאים ממיטוזה או עוברים התמיינות2. ראוי לציין שבאורגניזמים חיים, רוב התאים אינם מתחלקים; הם יצאו ממחזור התאים ו/או התמיינו. לכן, חשוב להבין כיצד שלד התא של MT מורכב ומווסת בהקשרים אלו. ידע זה חיוני לחשיפת האופן שבו ארכיטקטורות MT ייחודיות מבוססות כדי לתמוך בתפקודים תאיים מיוחדים.

ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מספקת מערכת עוצמתית לחקר ארגון ותפקוד MT אצנטרוזומלי. בשלבים הביניים של האוגנזה, פעילות הצנטרוזומים נחלשתב-9, ו-MTs נוצרים מ-ncMTOCs הממוקמים בקורטקס הקדמי-צדדי של הביציות (איור 1B). רשת MT זו חיונית למיקום של mRNA, חלבונים ואברונים אימהיים, שהם קריטיים להקמת צירי העובר העתידיים ולהתפתחותם10,11. מחקרים קודמים הראו כי ncMTOCs של הביציות מורכבים מחלבון ה-MT מינוס אנד פטרונין, שיוצר קומפלקס עם חלבון הספקטרפלאקין Shot, המעוגן לשלד האקטין הקורטיקלי. הוצע כי MTs גדלים ממקטעי MT קצרים שנוצרים על ידי ניתוק אנזימים כמו קטנין, שיכולים לשמש כזרעים לפולימריזציה נוספת של MT12. מנגנונים דומים הוצעו גם בתאים ממוינים אחרים, כמו נוירונים13, שבהם הפעילות הצנטרוזומלית מצטמצמת. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם ניתוק מייצר רשתות MT מורכבות, כמו בביצית, נותרו לא מובנים היטב. עדיין לא ברור אם ה-MTs בהקשרים אלו נוצרים בעיקר באמצעות סידור מחדש מבוסס ניתוק או משילוב של ניתוק וגרעין MT דה-נובו. המורכבות של רשת ה-MT של הביציות הופכת אותה למערכת אידיאלית לחקר האופן שבו MTs נוצרים ומאורגנים מחוץ להקשר הצנטרוזומלי המוכר. ראוי לציין שזה גם מהווה אתגר להדמיה ולניתוח: רשת ה-MT הצפופה בתוך הביצית מקשה על זיהוי MT בודדים באמצעות גישות אימונו-צביעה או דימות סטטיות קונבנציונליות 2,14.

הדמיה חיה שיפרה משמעותית את היכולת לחקור רשתות MT, שכן היא מאפשרת ויזואליזציה של אירועי פולימריזציה של MT בזמן אמת, ומציעה תובנות מפתח על הדינמיקה והכיוון של צמיחת MT. מחקרים קודמים ניתחו בהצלחה את דינמיקת גדילת MT בביציות באמצעות הדמיה חיה של סמנים פלוס-אנד 14,15,16. עם זאת, במקרים רבים, נהלי ניתוח התמונה המשמשים לכימות דינמיקת MT מתוארים רק בקצרה, מסתמכים על יישומים מותאמים אישית או ספציפיים למעבדה, או אינם זמינים לציבור, מה שמגביל את השחזוריות והאימוץ הרחב יותר. השיטה שלנו בונה על הגישות הקודמות הללו על ידי מתן צינור ניתוח מתועד במלואו, פתוח וידידותי למשתמש, המאפשר כימות סטנדרטי של פרמטרי גידול MT בין מערכי נתונים ותנאי ניסוי. בפרוטוקול זה, דינמיקת ה-MT מדומים באמצע הבוגנזה, כאשר שלד התא של MT מאורגן על ידי רשתות MT אצנטרוזומליות. חלבון מעקב מתפתחים מוצגים באמצעות EB1-GFP, חלבון מעקב בקצה פלוס-אנדשל MT 17,18, ונרכשים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת לייזר עם גלאי מערך במצב מהיר מאוד. החידוש בגישה שלנו טמון בניתוח התמונה: צינור מתועד לחלוטין, ידידותי למשתמש, שלב אחר שלב, שמחייב את המשתמשים לבחור רק אזורים שמעניינים אותם. עיבוד תמונה וכימות מתאפשרים באמצעות מאקרואים מותאמים אישית של פיג'י וסקריפטים בפייתון, המאפשרים זיהוי יעיל וניתן לשחזור של שביטי EB1 וחילוץ פרמטרים, כולל כיוון צמיחה, מהירות וארגון מרחבי. מסגרת זו מספקת כלי סטנדרטי ונגיש להשוואת דינמיקת MT בתנאי ניסוי.

במאמר זה, אנו משתמשים בשיטה זו להשוואת גידול MT בביציות הביקורת ובביציות שמפורקות בטיפול קר. דבר זה משמש הן לאימות הפרוטוקול והן לתמיכה במחקרים עתידיים שמטרתם לנתח את תפקיד החלבונים המועמדים בוויסות MT.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גנטיקה של זבובים

הערה: כדי להמחיש MTS בביצית, פרוטוקול זה משתמש בטרנסגן זמין לציבור (טבלת חומרים) שמבטא את חלבון המעקב של MT פלוס-אנד EB1 המסומן בתג GFP (Green Fluorescent Protein)מספר 19. EB1-GFP נקשר ספציפית ל-MTS וקצות מתפתחים, ומופיע כ"שביטים" פלואורסצנטיים הנעים בכיוון הפולימריזציה17,18. דבר זה מאפשר ויזואליזציה וכימות של דינמיקת גידול MT, כולל כיוון הצמיחה, המהירות וההתפלגות המרחבית בתוך הביציות14,20.

  1. שמרו על כל זני הזבובים על מדיום קמח תירס-אגר סטנדרטי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס באמצעות טכניקות גידול דרוזופילה סטנדרטיות.
  2. הצלבת 8–12 נקבות בתוליות הנושאות טרנסגן UAS-RNAi המיועד לביטוי חלבון מעניין, ל-5 זכרים של הגנוטיפ matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
    הערה: כדי לפשט את הכליאות הגנטיות, יש ליצור ציר זבוב על ידי חציית קו V32-Gal4 (החדרה על הכרומוזום השני) עם קו EB1-GFP (החדרה על הכרומוזום השלישי). מכיוון ש-EB1-GFP נמצא תחת שליטת פרומוטר UASp, דרייבר V32-Gal4 משרה ביטוי של EB1-GFP וכן כל טרנסגן UAS-RNAi שהוכנס בהכלאות הבאות במידת הצורך.
  3. לאחר בקיעת צאצאי F1, בחרו 10–15 זבובים נקביים מהגנוטיפ הרצוי (פחות משבוע).
  4. העבר את הנקבות, יחד עם 2–3 זכרים, לבקבוקון טרי המכיל כמות קטנה של משחת שמרים על פני המזון. משחת שמרים מעודדת את התפתחות הביצים ומקדמת את התקדמות התפתחות תא הביצים. נוכחות הזכרים מבטיחה הזדווגות, מה שמקדם גם בגרות ביציות והטלת ביצים. שמור על הזבובים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
    הערה: כדי לחקור את תפקידם של גנים ספציפיים בדינמיקת MT, ניתן להשיג הפלת חלבונים באמצעות מערכת UAS/GAL421, עם הנהג האימהי הזמין לציבור matα4-Gal4-VP16 (המוכר גם כ-V32-Gal4; טבלת החומרים), שמתחילה ביטוי Gal4 בקו הנבט ממצבים 3–4 של אוגנזה. כפי שתואר לעיל, מנוע זה גורם לביטוי של מבני EB1-GFP וכן UAS-RNAi, ומאפשר דלדול חלבונים רלוונטיים רק לאחר שלב הגרמריום. אסטרטגיה זו עוקפת את הפונקציות המוקדמות האפשריות של החלבונים הממוקדים במהלך החלוקות הראשוניות של המיטוזה והגדרת הביצית. בעת ביצוע ניסויים כאלה, יש להכין את הזבובים כפי שתואר קודם.

2. ניתוח שחלות

  1. הרדימו את נקבות ה-F1 באמצעות CO₂ על כרית זבוב סטנדרטית ובחרו נקבה אחת לניתוח.
  2. העבר את הנקבה הנבחרת ישירות לצלחת זכוכית בעובי 35 מ"מ (בעובי זכוכית 0.13–0.15 מ"מ) והנח טיפה של שמן הדמיה מעל הזבוב.
  3. מקם את הזבוב בצד התחתון כלפי מעלה (הכנפיים פונות כלפי מטה). באמצעות זוג פינצטה אחד, החזק בעדינות את החזה התחתון עם פינצטה, ועם זוג פינצטה נוסף, צבוט מעט קוטיקולה בטנית מהקצה האחורי של הבטן.
  4. חלצו בעדינות את דרכי הרבייה על ידי משיכתה בזהירות דרך הפתח.
  5. בודדו את השחלות ואז את השחלות הבודדות על ידי החלקה עדינה דרך השמן באמצעות פינצטה. בעת מניפולציה של השחלות, תמיד החזק אותן בתא הביציות הישן (שלבים 13–14) כדי להימנע מפגיעה בשלבים האמצעיים השבריריים יותר (שלבים 6–9), שהם אלו שמעניינים את התמונה (איור 1A,B).
  6. אחזו בקצה הקדמי של השחלות, שם נמצאים הגרמריום ותאי הביציות בשלבים המוקדמים (איור 1A,B). הפעילו מתח איטי ויציב להפרדת שחלות בודדות. כשאתה מושך, יופיעו תאי ביצים בשלבים שונים של התפתחות. תהליך זה ניתן לחזור על עצמו מספר פעמים לכל שחלה כדי לבודד שחלותנוספות 22 (ראו וידאו להדגמה).
    הערה: עבור ביציות שעברו טיפול קר לצורך דה-פולימריזציה של MT, בוצעו כריתוחים כפי שתואר קודם, אך באמצעות בופר BRB-80 במקום שמן הדמיה. השחלות שנחתכו הועברו לאחר מכן למיקרופופציות המכילות BRB-80 ונדגרו על קרח למשך 15 דקותו-23 דקות. לאחר הדגירה, השחלות הועברו לצלחת זכוכית עם שמן הדמיה, והפרוטוקול חודש משלב 3.1.

3. הדמיה חיה

  1. הניחו את הצלחת עם תחתית הזכוכית על שלב המיקרוסקופ באמצעות מחזיק הסלייד המתאים.
  2. בחרו תאי ביצים משלב 7 או 8 להדמיה.
    הערה: ניתן לזהות תאי ביציות בשלבים אלו בהתבסס על גודל הביציות ומיקום הגרעין. הביצית גדולה בבירור מתאי האחיות הבודדים ותופסת בערך שליש (שלב 7) עד חצי (שלב 8) של תא הביצית. גרעין הביצית ממוקם בקורטקס הקדמי של הביצית, סמוך לתאי האחיות24.
  3. הימנע מהדמיית תאי ביציות המראים חוסר רציפות בשכבת תאי הזקיק החיצונית או סימנים אחרים לנזק, שעשויים להעיד על הפרעה מכנית שנגרמה על ידי המלקחיים. לאיכות תמונה מיטבית, השתמשו במערכת הדמיה קונפוקלית מהירה עם יחס אות לרעש (SNR) גבוה ומטרת 63x (1.40 NA, טבילה בשמן). ודאו שאתם עומדים בקריטריוני הדגימה של Nyquist-Shannon.
  4. כוון את המוקד וקבע את החשיפה המתאימה, שכן היא עשויה להשתנות בהתאם למבנה EB1 שבו משתמשים (למשל, פרומטורים שונים או תגי פלואורסצנט) ומערכת המיקרוסקופ. האות צריך להיות בהיר מספיק כדי לעקוב אחרי דינמיקת השביטים, אך לא רווי או מוסתר על ידי פלואורסצנציה ברקע.
  5. כוון את לייזר 488 ננומטר לעורר את הפלואורופור של GFP (10% עוצמת לייזר; רווח הגלאי = 750 וולט). בחר חלון פליטה מתאים של 500–550 ננומטר או סט פילטר מקביל לפלואורופור GFP.
  6. רכוש סרטי טיימלפס באורך של לפחות 4 דקות, תוך שימוש במרווח פריימים של 500 מילישניות (2 פריימים לשנייה) כדי לקבל מספיק נתונים למעקב אחר קצות MT פלוס בודדים. (סרטון משלים 1 ממחיש רכישת טיימלפס מייצגת המתאימה לניתוח מעקב אחר MT מאוחר יותר).
  7. עבד את התמונות שנרכשו באמצעות עיבוד גלאי המערך בתוכנת רכישת מיקרוסקופ עם עוצמת מסנן עיבוד ברירת מחדל.
    הערה: לאחר טבילה בשמן הדמיה, השחלות המנותקות נשארות חיות עד 90 דקות. במהלך תקופה זו, ניתן לצלם תאי ביצים ללא סימני התדרדרות משמעותיים. לאחר תקופה זו, יש לנתח נקבה חדשה ולהכין תאי ביצים טריים להדמיה20.

4. עיבוד תמונה

בצע את תהליך העבודה הבא ליצירת גרפים וסטטיסטיקות לכימות פרמטרים שונים הקשורים לדינמיקת MT. בצע כל שלב אוטומטית באמצעות מאקרו/סקריפט או ידנית על ידי ביצוע הפרוטוקול (איור 2). כל מאקרו פיג'י, סקריפטים למעקב וקוד ניתוח פייתון המשמשים בזרימת עבודה זו מסופקים כקבצי קידוד משלימים 1–7.

  1. עיבוד מוקדם של תמונה - שלב 1
    הצעדים הבאים מכינים תמונות גולמיות של טיימ-לאפס על ידי תיקון פוטובלינינג והפחתת רעשי רקע, תוך הבטחת יציבות האות למעקב. ראשית, נראות EB1 משופרת באמצעות מסנן Difference of Gaussians (DoG), הפועל כמסנן פס מרחבי. על ידי חיסור תמונה מטושטשת מאוד מתמונה מטושטשת קלות, תהליך זה מדכא ערפל ציטופלזמי בתדר נמוך ורעש פיקסלים בתדר גבוה תוך בידוד האות המוגבל של שביטי EB1. שנית, מסנן גרדיאנט זמני מיושם במיוחד כדי לשפר במיוחד את קצות ה-MT הגדלים. ערימת התמונה נחתכת מחדש כדי למפות את הממד הזמני לציר ה-Y המרחבי. לאחר מכן מוחלת קונבולוציה חד-ממדית עם גרעין [-1 0 1] כדי לחשב את הנגזרת הזמנית לכל פיקסל, ומדגישה את הקצה המוביל של השביטים הנעים שבהם העוצמה עולה במהירות הגבוהה ביותר. הערימה נחתכת מחדש למידותיה המקוריות, מוזגת לתמונה מורכבת ומיוצאת לניתוח.
    הערה: שלב זה ניתן לבצע באצווה עבור כל הקבצים בתיקייה על ידי גרירת קובץ המקרו File1.Step1_MTs_macro.ijm (קובץ קידוד משלים 1) לפיג'י ולנהל את המקרו.
    1. התקנת תוסף דרישת קדם (הגדרה חד-פעמית)
      1. השיק את פיג'י. עבור ל-Plugins > Install בשורת התפריט.
      2. בדפדפן הקבצים, בחר את קובץ File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (קובץ קידוד משלים 7) המסופק עם פרוטוקול זה.
      3. כאשר מתבקשים לשמור את התוסף, ודא שהיעד הוא תיקיית התוספים ברירת המחדל בתוך תיקיית ההתקנה של פיג'י ולחץ על שמור.
      4. הפעל מחדש את פיג'י כדי להשלים את ההתקנה.
        הערה: גרסה מקומפלת זו של התוסף זהה לגרסה המובנית של פיג'י, אך היא מסירה את הצורך בהתקנת Java Development Kit (JDK) נפרדת, מה שמפשט את תהליך ההגדרה.
    2. תיקון והפחתת אקונואיזם:
      1. פתח את Fiji, ואז פתח כל קובץ באמצעות תוסף Bio-Formats Importer
      2. פיצוי על דעיכת הפלואורסצנציה לאורך זמן על ידי הרצת תוסף תיקון הלבנה, באמצעות תיקון הלבנה ביחס פשוט (רקע = 0).
      3. הרץ את מסנן Kalman Stack Filter בהידור (acquisition_noise = 0.1; הטיה = 0.7) כדי לדכא רעש פוטונים אקראי תוך שמירה על דינמיקת האות האמיתית לאורך זמן
      4. חתכו את ממד זמן התמונה שנוצר כדי לקצר את זמן העיבוד, אם רוצים.
        הערה: שלבים אלו יוצרים תמונה מנותקת מהרעש, שמופיעה מאוחר יותר כערוץ 1 בסוף שלב 1 (4.1.5) (איור 3A). מומלץ להוציא את 5 עד 10 הפריימים הראשונים (נקודות זמן), שכן חלון הגלילה של מסנן קלמן מסנן רק חלקית את הפריימים הראשוניים הללו.
    3. הבדל בשיפור תכונות בין גאוסיאנים (DoG):
      1. שכפל את התמונה מ-4.1.2.4 פעמיים (לחץ קליק ימני על התמונה ולחץ על כפילות).
      2. החלו את תוסף הטלטוש הגאוסי על עותק אחד באמצעות סיגמא נמוך (σ = 1).
      3. החלו את תוסף הטשטוש הגאוסי על העותק השני באמצעות סיגמה גבוהה (σ = 8).
      4. פתח את מחשבון התמונה של התוסף והחסר את תמונת הסיגמא הגבוהה מהתמונה הנמוכה (= Low – High) כדי לבודד פרטים עדינים.
      5. הסר את הרקע באמצעות מתמטיקה > חיסור של פיג'י ובחר ערך (סף DoG = 100) כדי לשמור רק על האות האמיתי במידת הצורך.
        הערה: שלבים אלו יוצרים תמונה של הבדל גאוסיאני, שמופיעה מאוחר יותר כערוץ 2 בסוף שלב 1 (4.1.5) (איור 3B).
    4. שיפור אות EB1-GFP:
      1. בחר את התמונה מ-4.1.2.4 והשתמש בתוסף Reslice עם הגדרות: top, ללא אינטרפולציה.
      2. השתמש בתוסף Convolve 2D עם קרנל [–1 0 1] כדי לשפר את הטיפים של MT.
      3. השתמש שוב בתוסף Reslice עם אותן הגדרות כדי לשחזר את מידות התמונה המקוריות.
      4. הערה: שלבים אלו ייצרו תמונה עם אות EB1-GFP משופר. תמונה זו תופיע מאוחר יותר כערוץ 3 בסוף שלב 1 (4.1.5) (איור 3C).
      5. מיזוג ערוצים וייצא תמונה:
        1. ממזג את תמונת MT EB1-GFP (4.1.2.4) עם תמונת Difference of Gaussians (4.1.3.5) ותמונת שיפור האות EB1-GFP (4.1.4.3) באמצעות תוסף Merge Channels. ודא שהתמונה שתשמש לניתוח נוסף מוצבת בערוץ 3 במהלך תהליך המיזוג.
        2. שמור את הקובץ המתקבל כקובץ .tif, באמצעות פורמט השם: "filename"_processed.tif. ודא שהתמונה המשמשת לניתוח במורד הזרם מסתיימת ב-_processed.tif
  2. אזורי עניין (ROI) - שלב 2
    בשלב זה יוגדרו שלושה ROIs לאורך ציר הקדמי-אחורי של הביצית: קדמי (ROI1), אמצעי (ROI2) ואחורי (ROI3). בצע סגמנטציה מרחבית זו כדי לאפשר ניתוח דינמיקת MT באזורים שונים של הביצית.
    הערה: ניתן להריץ את שלב 2 עבור כל "שם קובץ"_processed.tif על ידי גרירת קובץ המאקרו File_2_Step2_MTs_macro.ijm (קובץ קידוד משלים 2) לפיג'י ולחיצה על Run. המאקרו יבקש מהמשתמש לצייר מלבן בביצית ידנית. האזור הקרוב ביותר לתחילת הפוליגון (הלחיצה הראשונה) מתאים ל-ROI הראשון. האזור המלבני שנבחר יחולק אוטומטית ל-ROI מלבני שווה. אם לא נשמרים ROI, השלבים הבאים ירוצו בתמונה המלאה.
    1. הגדרת החזר השקעה:
      1. פתח את קובץ היעד דרך Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. השתמשו בכלי הפוליגון כדי לצייר אזור מעניין המשתרע על פני האזור הרצוי.
      3. הוסף את האזור הנבחר למנהל ה-ROI (לחץ על מקש T).
      4. חזור על שלב 4.2.1 כדי לבדוק כמה ROI אתה צריך.
    2. שטח מדידה וייצוא:
      1. בחר את התשואה הראשונה
      2. הרץ ניתוח → מדידה, ושמור את ערך האזור כקובץ בשם: "filename"_processed_RoiArea.csv
        הערה: שם הקובץ חייב להתאים לשם התמונה המקורי ולהסתיים ב: _processed_RoiArea.csv
      3. השתמש במנהל התשואה כדי לשמור את ה-ROIs. השתמש באותו שם קובץ עם ה. הרחבת ROI עבור ROI יחיד, או הרחבת .zip עבור מספר ROIs.
  3. זיהוי ומעקב אחר שביטי EB1-GFP - שלב 3
    השתמשו בתוסף TrackMate25 כדי לזהות שביטים EB1-GFP ולעקוב אחרי תנועתם לאורך זמן.
    הערה: ניתן להחיל את STEP 3 על כל "שם קובץ"_processed.tif על ידי גרירת קובץ המקרו File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (קובץ קידוד משלים 3) לפיג'י ולחיצה על RUN. לאחר מכן בחר תיקייה לעיבוד. ה-ROI יטענו אוטומטית, והניתוח יבוצע עבור כל קובץ, מה שייוצר פלטים נקודתיים ומסלולים מתאימים. לפני עיבוד אצווה, מומלץ לנתח 2–3 תמונות מייצגות כדי לוודא ויזואלית שההגדרות ברירת המחדל של הגלאי והמעקב מתאימות לגודל ולדינמיקה של השביטים. אם ההגדרות מתאימות, המשתמש יכול להתאים את הפרמטרים הרלוונטיים כדי לעקוב במדויק אחרי טיפים של EB1, ובכך למזער שליליות שגואות וחיוביות שגויות.
    1. פתח את קובץ היעד דרך Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
    2. פתח את התוסף TrackMate. בחר כן אם מבקשים להחליף בין T ל-Z.
    3. בחר בגלאי לוגים. הגדר את קוטר החלקיקים ל-0.5 מיקרון (כוון לפי הצורך)
    4. הגדר את סף האיכות ל-30 (מתאים לפי הצורך). הפעל גם לוקליזציה תת-פיקסלית וגם תהליך קדם-עיבוד באמצעות פילטר חציוני.
    5. הסר כל סינון נקודתי נוסף. בחר את שיטת המעקב של קלמן
    6. הגדר רדיוס חיפוש התחלתי ל-0.5, רדיוס חיפוש של 0.7, ופער פריימים מקסימלי של 2 (כוון לפי הצורך - רדיוס החיפוש הראשוני מזרע את המעקב, רדיוס החיפוש שולט כמה נקודה יכולה לזוז בין פריים, והרווח המקסימלי מאפשר היעלמויות קצרות במסלול).
    7. דלג על סינון המסילה שמופיע. לאחר שהשיר הושלם, עבור ל-Spots → Export to CSV, וקבע את שם הקובץ: "filename"_ROI01_spots.csv
    8. הערה: שמות הקבצים צריכים לשקף את מספר התשואה שנבדקו. אם משתמשים במספר ROIs, שמור כל קובץ פלט עם מזהה תואם, כגון _ROI01, _ROI02 וכו'.
  4. ויזואליזציה של נתונים וניתוח כמותי - שלב 4
    השתמש בסקריפטים של פייתון כדי לעבד את נתוני המעקב ולחשב פרמטרים מרכזיים, כולל מספר השביטים, מהירות, אורך חיים, עקביות זוויתית וכיוון. סקריפטים אלו מייצרים טבלאות סיכום (קבצי CSV), גרפים וניתוח סטטיסטי לתמיכה בניתוח כמותי של דינמיקת MT (איור 4).
    1. הגדרת סביבת תוכנה:
      1. התקן את הפצת Python (3.12). ודא שהספריות החיצוניות הבאות של פייתון מותקנות (באמצעות pip install, pandas numpy, scippy, matplotlib, seaborn, ipython statsmodels notebook): Pandas ו-NumPy (לטיפול במבני נתונים וחישוב נומרי), SciPy ו-Statsmodels (במיוחד scipy.stats, לסטטיסטיקה מעגלית ובדיקת השערות), Matplotlib ו-Seaborn (ליצירת גרפים של ורדים ותרשימי עמודות סטטיסטיים), IPython (לכלי תצוגה בתוך המחברת), Jupyter Notebook (לשימוש במחברת).
      2. הנח את מודולי הניתוח המותאמים (File_5_MTModule1.py ו-File_6_MTModule2.py – קבצי קידוד משלים 5 ו-6) בתיקיית השורש לצד מחברת הניתוח (File 4_Step4_MTs_results.ipynb – קובץ קידוד משלים 4).
      3. פתח את מחברת Jupyter על ידי הרצת הפקודה "jupyter notebook" בטרמינל Python וטעון את מחברת File 4_Step4_MTs_results.ipynb – מחברת קידוד משלים 4.
    2. נתוני קלט והגדרת פרמטרים:
      1. מלאו את מסד הנתונים כדי למפות את השכפולים הביולוגיים למטא-דאטה הניסיוניים שלהם.
      2. ספק את הדברים הבאים לכל ניסוי: שם בסיס: מחרוזת המזהה הייחודית שנמצאת בשמות הקבצים, תנאי: קבוצת הניסוי (למשל, "בקרה", "מטופל"), זווית תיקון: הזווית הנדרשת ליישור התשואה עם הציר הביולוגי (למשל, קדמי = 0°).
      3. כוון את הפרמטרים: ייצוא פורמט תמונה ו-DPI, צבעי גרוט, וגודל ה-bin ברירת המחדל לחישובים זוויתיים
      4. הגדר את פרמטרי סינון הנתונים כך שלא יהיו מסלולים קצרים: אורך מינימלי של מסיל: מסלולים קצרים מזה מושלכים
    3. ביצוע צינור הניתוח:
      1. קרא והפעיל את כל תאי הקוד כדי לעבד את נתוני המעקב הגולמיים. הסקריפט עובר דרך רשימת מסד הנתונים כדי לבצע את השלבים הפרוצדורליים הבאים:
        1. זהה את כל קבצי ה-CSV הספציפיים ל-ROI המשויכים לכל שם בסיס.
        2. מסננים מסלולים לפי האורך המינימלי (רק מסלולים שנמשכים ליותר מ-3 פריימים נשמרים), מחשבים מהירויות מיידיות, מחשבים תזוזה כוללת ומיישמים את תיקון זווית ההתייחסות לכל המסלולים.
        3. נרמול את ספירת השביטים לפי אזור התשואה (נטען מהמטא-דאטה) כדי לחשב את צפיפות השביטים.
      2. אגרגו נתונים מעובדים למערך נתונים ראשי (df_all) וחישבו סטטיסטיקות סיכום כלליות (מהירות ממוצעת, משך מסלול ואורך וקטור עקביות זוויתית) עבור כל ROI.
      3. בצע את פונקציית make_combined_rose_panel ליצירת גרפים מקובצים של ורדים. זה יוצר השוואת פאנלים זו לצד זו של התפלגויות זוויתיות לכל ה-ROI בכל תנאי ניסוי. בצע create_comprehensive_analysis_plots_enhanced כדי ליצור דיאגרמות עמודות למדדים סקלריים.
      4. בצע את פונקציית run_angle_analysis_pipeline לביצוע ניתוח כיוון ספציפי:
        1. סווג מסלולים למיכלי כיוון באמצעות שתי אסטרטגיות: קרדינל בינינג (4 מיכלים ברוחב 90°: צפון/קדמית, מזרחית/ימינה, דרום/אחורית, מערבית/שמאלית) ו-Anterior/Posterior Binning (2 מיכלים של 180° קדמי לעומת אחורי).
        2. חשב את אחוז המסילות הנעות בכל כיוון מוגדר לכל ביצית.
    4. ניתוח סטטיסטי ויצירת פלט:
      1. עברו על מדדים סקלריים מוגדרים: מספר ממוצע של שביטים לכל פריים לשטח, משך מסלול ממוצע של השביט, ומהירות ממוצעת של השביט. עבור כל מדד, הוא מבצע את הדברים הבאים:
        1. בצע בדיקות Kruskal-Wallis או Mann-Whitney U להשוואות עצמאיות בין תנאי ניסוי.
        2. בצע בדיקות פרידמן או וילקוקסון כדי להעריך עקביות בין תשואה על ההשקעה.
        3. בצע מבחני דירוג חתום של פרידמן ווילקוקסון ( בשיטת פראט) כדי להעריך העדפות כיוון (למשל, צפון מול דרום) בכל ROI.
        4. ייצא את התוצאות הבאות לתיקיית התוצאות : סיכומי CSV (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), דוחות סטטיסטיים (למשל, velocity_mwu.csv ממוצע של שביט), ו-Plots (קבצי PNG ברזולוציה גבוהה).
          הערה: שלב 4 ניתן לביצוע רק בפייתון. פתח את File_4_Step4_MTs_results.ipynb וקרא והרץ את כל התאים. כל תא מכיל הוראות לביצוע והתוצאה הצפויה המתאימה.

5. ניתוח סטטיסטי:

הערה: בשל ההתפלגות הלא-גאוסית של נתוני המעקב, נעשה שימוש במבחנים סטטיסטיים לא-פרמטריים לכל ההשוואות.

  1. הערכו הבדלים בלתי תלויים בין תנאי ניסוי (למשל, מבחן בקרה מול מטופל) באמצעות מבחן Mann-Whitney U (לשתי קבוצות) או מבחן Kruskal-Wallis ואחריו השוואות זוגיות לאחר מכן (עבור >2 קבוצות)).
  2. הערכו העדפות אוריינטציה בתוך אותו ROI באמצעות מבחן Friedman (ההבדל הגלובלי) ואחריו מבחן Wilcoxon Signed-Rank (בזוגות).
  3. לטפל בקשרי הפרש אפס באמצעות שיטת פראט.
  4. דווח על השוואות זוגיות כערכי p לא מתוקנים כדי לשמור על עוצמה סטטיסטית. השתמשו בסקריפטים המסופקים כדי לדווח על ערכי p גולמיים ומתוקנים, כאשר מובהקות מוגדרת על 0.05. דווח על כל הסטטיסטיקות הסיכומיות כממוצע ± שגיאת תקן ממוצעת (SEM) אלא אם צוין אחרת).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה שימש בהצלחה לניתוח דינמיקת גדילה וקוטביות של MT בביצי Drosophila melanogaster בשלבים הביניים של הביצה, באמצעות EB1-GFP, חלבון מעקב פלוס אנד שמסמן אתרי פולימריזציה פעילהשל MT 17,18. כאשר מדומים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר, EB1-GFP מופיעים כ"שביטים" בהירים ומנוקדים הנעים בכיוון של גידול MT17,18 (איור 3A; סרטון משלים 1). מעקב וכימות של השביטים הללו מאפשר הערכה מדויקת של גרעין, הארכת וארגון MT בתוך הביצית. באמצעות פרוטוקול זרימת עבודה זה, דינמיקת MT הוערכה בביציות בקרה ובביציות שעברו הפרעה ניסיונית ברשת MT. באופן ספציפי, התנהגות שביט EB1 הושוותה בשלושה מצבים: ביציות ביקורת שלא טופלו, ביציות ביקורת מטופלות בקור, וביציות הטרוזיגוטיותשל P אטרון מוטנטיות 12,26. טיפול בקור גורם לדפולימריזציה של MT, ומאפשר הערכה של צמיחת MT מחדש במהלך ההתאוששות. הביציות של מוטנטp-atronin ההטרוזיגוטי (+/patr05252) נכללו כבקרה חיובית לדינמיקת MT פגועה. פטרונין הוא מייצב MT שמור מינוס קצה27, ומרכיב מרכזי ב-ncMTOCs בביציות12 וברקמות אחרות2. מחקרים קודמים הראו כי מוטנטים בפטרונין שעברו דפולימריזציה של MT מראים ירידה משמעותית במספר שביטי EB1 לאחר צמיחהמחדש 12. לכן, הכללת מוטנטים פטרונינים הטרוזיגוטיים אפשרה אימות השיטה מול רקע ידוע של פגום בצמיחה מחדש של MT. ביציות בשלב 7-8 צולמו כאשר הצנטרוזומים מוחלשים ו-MTs נוצרים דרך מסלולים אצנטרוזומליים.

בהתאם לתצפיות קודמות, הצפיפות הגבוהה ביותר של שביטי EB1 זוהתה באזור הקדמי של הביצית, עם ירידה הדרגתית לכיוון14,15 האחורי (איור 5B; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2). כדי להבחין בין אירועי פולימריזציה אמיתיים של MT לבין אותות נייחים או מחוץ למישור, פרוטוקול זה מבחין בין מספר מוקדי EB1-GFP הכולל שזוהו לבין תת-הקבוצה של המוקדים הניידים. השבר הבלתי נייד ככל הנראה מייצג שביטים או שביטים נייחים הנעים בעיקר במישור הצירי (איור 5A,B). ניתוחים של אורך המסלול ומהירות הגדילה של MT בוצעו בלעדית על שביטים ניידים EB1-GFP כדי להימנע מהכללת אותות נייחים או תנועות ציריות שעלולות להפריע להערכת אורך ומהירות. סך כל מוקדי EB1-GFP והחלק הנייד מוצגים בגרפים נפרדים כדי לאפשר השוואה ישירה בין גילוי כולל להתנהגות דינמית (איור 5A,B). בביציות בקרה, הפרוטוקול מדד 0.189 ± 0.02 שביטים זזים SEM EB1 למיקרומטר2 (18.9 שביטים EB1 ל-100 מיקרון2) באזור הקדמי, אחריהם 0.064 ± 0.02 SEM ו-0.043 ± 0.01 SEM EB1 נעה למיקרומטר2 באזורים האמצעיים והאחוריים, בהתאמה (6.4 ו-4.3 שביטים EB1 ל-100 מיקרום2) (איור 5B; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2). מחקרקודם של 28 שמדד שביטים מסוג EB1 באותו שלב התפתחותי זיהה 48.54 שביטים EB1 ל-100 מיקרומטר2, שהם גבוהים יותר מהערכים שזוהו כאן עבור שביטים זזים מסוג EB1-GFP. עם זאת, הערכים הנמדדים עקביים כאשר מתחשבים במספר השביטים הכולל EB1-GFP שזוהו (איור 5A; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2). סעיף החומרים והשיטות במחקר זה אינו מפרט כמה ערימות z שימשו להדמיית הביציות. לכן ייתכן שיותר מ-z-stack אחד נכללו בניתוח, מה שיכול היה לתרום למספר הגבוה יותר של שביטי EB1-GFP שזוהו. גורם נוסף שעשוי להשפיע על הערכים המדווחים הוא אזור הביצית שנבחר לכימות השביט. אם אזורים מעניינים היו נבחרים קרוב יותר לקוטב הקדמי ביותר, שבו צפיפות השביט EB1 היא הגבוהה ביותר, ייתכן שזה היה מעלה את צפיפות השביטים הממוצעת בהשוואה למדידות המוצגות כאן. עם זאת, התוצאות שהושגו כאן הן באותו סדר גודל ומשקפות באופן עקבי ירידה בצפיפות שביטי EB1 לכיוון האזור האחורי כפי שדווח קודםלכן 14,15.

לאחר צמיחה מחודשת של MT שנגרמה מקור, ביציות הביקורת הראו מספרי שביט EB1 דומים לאלו של קבוצת ביקורת לא מטופלת, מה שמעיד על התאוששות חזקה מ-MT. לעומת זאת, בהתאם לדיווחיםקודמים 12, מוטנטים בפטרונין הראו ירידה משמעותית במספר השביטים הנעים EB1 באזור הקדמי (ROI1) בהשוואה לשני הביקורים (איור 5B; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2). למרות שמספרי השביטים באזורים האמצעיים והאחוריים (ROIs 2 ו-3) גם הם ירדו, הבדלים אלו לא היו מובהקים סטטיסטית (איור 5B). הירידה שנצפתה כאן הייתה פחות בולטת מזו שדווחה בבדיקות מבוססות נוקודזול12. סביר להניח שזה משקף את השימוש במוטנטים פטרונינים הטרוזיגוטיים שבהם רק אלל אחד עבר מוטציה. בנוסף, פרוטוקול דה-פולימריזציה המושרה על ידי קור עשוי שלא להפר את כל הפולימריזציה המלאה, והמרווח של 5–15 דקות בין הסרת הקרח להדמיה ככל הנראה מאפשר גרעין וצמיחה מחדש של MT לפני איסוף הנתונים. לעומת זאת, בדיקות מבוססות נוקודזול מתבצעות מיד לאחר השבתה של קולסמיד באמצעות לייזר UVמיקרוסקופ 12. עם זאת, תוצאות אלו מראות שפרוטוקול זה מסוגל לזהות שינויים ביולוגיים רלוונטיים ואזוריים בארגון MT. הם גם מתיישרים עם העשרת ncMTOCs ושל פטרונין, רכיב ליבה של ncMTOC, בחלק הקדמי של הביצית. הירידה החלשה יותר במספר השביטים באזורים האמצעיים והאחוריים עשויה גם לשקף את ההדרה ההתפתחותית של ncMTOCs ופטרונין מהקליפת האחורי בשלבים12 אלה.

ניתוח אורך מסלול EB1 בביציות בקרה חשף שבילי שביטים ארוכים יותר באזור הקדמי של הביצית (0.613 מיקרון ± 0.04 SEM) ושביטים קצרים יותר באזורים האמצעי והאחורי (0.463 מיקרון ± 0.04 SEM ו-0.488 מיקרון ± 0.05 SEM, בהתאמה) (איור 5C; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2). ממצא זה תואם נתונים קודמים שהראו כי MTs שורדים תקופות קצרות יותר בקוטב האחורי מאשר בקוטב הקדמי, מה שמרמז ש-MTs בקוטב האחורי הם קצריםיותר 14. בביציות מוטנטיות פטרונין הטרוזיגוטיות שעברו טיפול קר, אורך שביט EB1 קטן משמעותית בהשוואה לביקורת שעברו טיפול קר באזורים הקדמיים והאחוריים. מגמה דומה שאינה מובהקת סטטיסטית נצפתה באזור האמצעי (איור 5C; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2), המצביעות על ירידה חלקית ביציבות MT. ביחד, תוצאות אלו תומכות בתפקיד הידוע של פטרונין כמייצב MT בקצה מינוס והן תואמות תצפיות קודמות בתאי תרבית דרוזופילה, שבהן אובדן פטרונין גורם לצירים קצרים יותר של MT12,27. ממצאים אלו גם מדגישים את הרגישות של פרוטוקול זה בזיהוי הפרעות עדינות אך ביולוגיות משמעותיות בדינמיקת MT.

בעת מדידת מהירות שביט EB1 בביציות השלטה, הניתוח זיהה מהירויות ממוצעות של 0.208 ± 0.01 מיקרומטר/שנייה, 0.207 ± 0.01 מיקרומטר/שנייה, ו-0.202 ± 0.01 מיקרון/שנייה באזורים הקדמיים, האמצעיים והאחוריים, בהתאמה (איור 5D; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2), התואם לעבודות קודמות 14,15. ביציות הביקורת הראו ירידה קלה במהירות הגדילה של MT מהאזור הקדמי לאזור האחורי. ייתכן שזה משקף את ההעשרה של ncMTOCs, יחד עם חלבונים נוספים הקשורים למיקרוטובול (MAPs) שטרם זוהו באזורים הקדמיים-לטרליים, המסייעים בצמיחה והתרחבות MT, ובכך תורמים לירידה האחורית הנצפית. בביציות שעברו טיפול קר, מוטנטים הטרוזיגוטיים של פטרונין הראו מגמה לא מובהקת סטטיסטית לירידה קלה במהירות הגדילה של MT בהשוואה לביקורת, אם כי הבדל זה לא הגיע למובהק סטטיסטי (איור 5D; טבלה 1; טבלאות משלימות 1 ו-2). ממצא זה תואם תצפיות קודמות בתאי גזע עצביים של דרוזופילה המבטאים מוטנטים פטרונינים 29.

מיקום של ncMTOCs באזור הקדמי-צדדי של הביצית, יחד עם הוצאתם מהחלק האחורי, גורם לכך שרוב ה-MTOCs גדלים כאשר קצותיהם השליליים מעוגנים בקורטקס האנטרו-לטרלי. כתוצאה מכך, נוצר גרדיאנט קדמי-אחורי של MTS בתוך הביצית, עם הטיית כיוון מתונה: 60% מה-MTs גדלים לכיוון האחורי ו-40% לכיווןה-14 הקדמי. הפרוטוקול שלנו זיהה בהצלחה את ההטיה הזו בביציות הביקורת בכל אזורי הביצית (איור 5E). ההטיה בכיוון ה-MT הייתה בולטת יותר באזור האחורי, כפי שדווח קודםלכן 14. ראוי לציין כי ההעשרה האחורית בהטיית הכיוון אבדה לאחר טיפול קר בביציות פטרונין מוטנטיות הטרוזיגוטיות (איור 5E,F). בביציות ביקורת שעברו טיפול קר, כיוון ה-MT השתנה לכיוון גדילה מכוונת קדמית בכל האזורים. שינוי זה הופיע כמגמה באזורים הקדמיים והאמצעיים והפך למובהק סטטיסטית באזור האחורי (איור 5F). הסבר אפשרי לאובדן ההטיה לצד האחורי הוא שבתנאים שעברו טיפול קר, MTs פולימריזציה חדשה עשויה להזדקק לזמן כדי להתחבר ל-MAPs, כגון חלבוני מוטור, שמקדמים ייצוב MT ו/או קישור צולב. עיכוב בגיוס של גורמים אלו עלול לפגוע בחיזוק ה-MTs בעלי אוריינטציה אחורית. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח רגיש וכמותי של גדילת MT, אורך, מהירות וכיוון בתוך ביציות. הוא מזהה באופן אמין שינויים ספציפיים לאזור, בעלי משמעות ביולוגית בדינמיקת MT, בהתאם למחקרים קודמים, ומדגים רגישות לפתרון הבדלים עדינים בהתנהגות MT, כפי שמודגם בתצפיות שנעשו במוטנטים הטרוזיגוטייםשל אטרונין p.

figure-results-1
איור 1: Drosophila melanogaster oogenesis (A) סקירה של יצירת ביציות בשחלת דרוזופילה . כל שחלה מכילה 12–16 שחלות, הפועלות כקו ייצור ביציות. היווגנזה מתחילה בגרמריום, שם 2–3 תאי גזע בקו הנבט מתחלקים באופן אסימטרי, ויוצרים תא גזע ותא בת שמתחיל להתמיינות. תאים אלו עוברים 4 חלוקות מיטוטיות ליצירת ציסטה בת 16 תאים המחוברת בתעלות טבעת. מתאים אלו, אחד מהם יהפוך לביצית, בעוד האחרים משמשים כתאי אחיות, התומכים בצמיחת ובהתפתחות הביציות עד לשלב 14 בקצה האחורי. (ב) תכנית שלב 9 של תא ביצי דרוזופילה . ה-MT נוצרים מ-ncMTOCs הממוקמים בקורטקס הקדמי-לטרלי, אשר אינם מופרדים מהצד האחורי של הביצית12. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: דיאגרמת זרימת העבודה של הפרוטוקול. סקירה של השלבים העיקריים מניתוח שחלות והדמיה חיה ועד למעקב אחר שביטים וניתוח כמותי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: תמונות מייצגות שנוצרות על ידי עיבוד ביציות בשלבים 7–8. (A-E) תמונות מייצגות הממחישות את תהליך עיבוד התמונה בשלב 1 שהוחלו על ביציות בשלב 7–8 מביציות מבוקרות, בקרה עם טיפול קר, והטרוזיגוטי פטרונין05252 שעברו טיפול קר. ערוצים הם תמונה מייצגת מהקרנה מקסימלית של 2 פריימים מתוך סרט טיימלפס של 150 פריימים שנרכש בקצב של 0.5 שניות לפריים. (A) ערוץ 1, המתאים ליצירת תמונה מנוזפת מהביצית המדומה המתאימה. (B) ערוץ 2, המתאים ליצירת הבדל בתמונה גאוסית. (C) ערוץ 3, המתאים ליצירת תמונה שבה האות של שביטי EB1-GFP הוגבר כדי להראות את קצות השביטים. (ד) מיזוג ערוצים 2 ו-3, מה שעוזר להמחיש את קצות השביט שנוצרו מעיבוד ערוץ 2. (ה) מסלולי שביט EB1-GFP שנוצרים מ-Time-lapse C בפיג'י באמצעות תוסף קוד Temporal Color להמחשת דינמיקת MT. קוד הצבע מציין את הקרנת הזמן ל-20 פריימים (0.50 שניות בין הפריימים). פס קנה מידה = 10 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: צילום מסך של קטע ב-STEP 4 Jupyter Notebook. המחברת בנויה עם תאי Markdown שמספקים הוראות ברורות, ואחריהן תאי קוד שמפיקים תוצאות ויומנים בזמן אמת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: ניתוח דינמיקת שביטי EB1-GFP בביציות בשלב 7-8 שמטופל בקור. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM ל-ROI (ROI1–ROI3) עבור ביציות בקרירה, בקרה שעברו טיפול קר ופטרונין05252. מדידות שביט EB1-GFP התקבלו מתמונות טיים-לאפס שעובדו בפיג'י; אלא אם צוין אחרת, בוצעו ניתוחים על תמונות שעובדו בערוץ 3. מספר השביט הכולל EB1-GFP נותח מתמונות ערוץ 2 (תמונת DoG). המובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן קרוסקל–ווליס ואחריו השוואות לאחר מאן ווויטני, או מבחן פרידמן ואחריו מבחני זוגות תואמים של וילקוקסון, לפי הצורך (p < 0.05; p < 0.001; עמ' < 0.0001). (א) תרשים נקודות פיזור המציג את המספר הממוצע של מספרי השביטים הכוללים EB1-GFP. (B) תרשים נקודות פיזור המציג את מספר השביטים הניידים EB1-GFP הממוצע. (ג) תרשים נקודות פיזור המציג את אורך מסלול השביט הממוצע של EB1-GFP. (D) תרשים נקודות פיזור המראה את מהירות השביט הממוצעת EB1-GFP. (ה) גרפים של ורד המראים את כיוון מסלולי EB1-GFP בתוך ROI1–ROI3 בביקורת (n = 14), בביציות מטופלות בקור (n = 12), ובביציות פטרונין05252 שטופלו בקור (n = 11). האחוז הממוצע של כל מסלול לכל ביצית, המכוון לכיוון הקדמי (A) או האחורי (P), מצוין עבור כל מצב ו-ROI. (ו) גרף עמודות המציג את האחוז הממוצע של זוויות מסלול השביט EB1-GFP המכוונות לכיוון הצדדים הקדמיים והאחוריים של הביצית. חושבו אחוזים לכל ביצית ומייצגים את ההתפלגות היחסית של כיוון השביט בתוך כל ROI. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מטריקהROIשליטה (n=14)טיפול קר בקרה (n=12)פטרונין05252 מטופל בקור (N=11)
מספר השביט הכולל EB1-GFP (#/μm2)ROI 1 (קדמי)0.667 ± 0.180.691 ± 0.200.570 ± 0.17
ROI 2 (באמצע)0.394 ± 0.110.532 ± 0.150.400 ± 0.12
ROI 3 (אחורית)0.353 ± 0.090.561 ± 0.160.378 ± 0.11
מספר שביט EB1-GFP נייד (#/μm2)ROI 1 (קדמי)0.189 ± 0.020.175 ± 0.030.099 ± 0.03
ROI 2 (באמצע)0.064 ± 0.020.091 ± 0.020.056 ± 0.02
ROI 3 (אחורית)0.043 ± 0.010.104 ± 0.030.047 ± 0.02
אורך מסלול EB1-GFP של שביט (מיקרומטר)ROI 1 (קדמי)0.613 ± 0.040.621 ± 0.030.478 ± 0.07
ROI 2 (באמצע)0.463 ± 0.040.535 ± 0.030.410 ± 0.05
ROI 3 (אחורית)0.488± 0.050.543 ± 0.040.393 ± 0.05
מהירות שביט EB1-GFP (מיקרומטר/שנייה)ROI 1 (קדמי)0.208 ± 0.010.198 ± 0.010.188 ± 0.01
ROI 2 (באמצע)0.207 ± 0.010.199 ± 0.010.186 ± 0.01
ROI 3 (אחורית)0.202 ± 0.010.194 ± 0.010.177 ± 0.01

טבלה 1. סיכום מדידות שביט EB1-GFP באזורים קדמיים–אחוריים בביציות שנותחו. המדידות התקבלו מביציות פטרונין 05252 שטופלו בקור בביקורת, פטרונין05252 שטופל בקור. אזורים מעניינים הוגדרו כ-ROI1 (קדמי), ROI2 (אמצעי) ו-ROI3 (אחורי).

טבלה משלימה 1. ניתוח סטטיסטי של מדידות שביט EB1-GFP בין תנאי ניסוי. ערכי P מצביעים על הבדלים בין ביציות פטרונין05252 הטרוזיגוטיות של פטרונין 05252 עבור כל ROI (ROI1-ROI3). השוואות גלובליות בין שלושת התנאים בוצעו באמצעות מבחן קרוסקל–ווליס, ואחריו השוואות לאחר מכן בין מאן לוויטני.  אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

טבלה משלימה 2. השוואה סטטיסטית של מדידות שביט EB1-GFP בין ROIs בכל תנאי ניסוי. ערכי P מצביעים על הבדלים בין ROI1 (קדמי), ROI2 (אמצעי) ו-ROI3 (אחורי) בתוך ביציות פטרונין 05252 שטופלו בקור, בביקורת, והטרוזיגוט של פטרונין05252 . ההבדלים הכלליים בין ROI בכל מצב הוערכו באמצעות מבחן פרידמן. השוואות זוגיות בין ROIs בוצעו לאחר מכן באמצעות מבחני וילקוקסון תואמים לזוגות-דרגה חתומה. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

סרטון משלים 1. הדמיית טיים-לאפס של החלבון EB1-GFP במעקב פלוס אנד בביצית בשלב ביקורת 7–8, המדגימה רכישה מייצגת המתאימה לניתוח מעקב MT מאוחר יותר (קשור לאיור 3). אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. מאקרו Fiji/ImageJ לעיבוד מוקדם של תמונה. הוא מבצע אוטומציה של תיקון פוטובליצ'ינג, סינון קלמן וחיסור רקע באמצעות מסנן הפרש גאוסיאנים (DoG). הוא גם מיישם שיפור גרדיאנט זמני (חיתוך מחדש וקונבולוציה חד-ממדית) כדי להחזת הקצוות הקדמיים של קצות MT לשיפור דיוק המעקב. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. מאקרו Fiji/ImageJ להגדרת אזור עניין (ROI) חצי-אוטומטי. הוא מבקש מהמשתמש להגדיר את גבול הביציות ומחלק אוטומטית את הבחירה לאזורים שווים מרחקים (בדוגמה שלנו 3 אזורים: קדמי, מרכזי ואחורי) כדי לאפשר סטרטיפיקציה אזורית של הניתוח. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. סקריפט פייתון (שמבוצע בתוך Fiji/ImageJ) שמבצע מעקב אוטומטי אחרי שביטי EB1 באמצעות Trackmate. הוא מעבד תמונות מעובדות מראש באצוות, מזהה שביטים באמצעות פרמטרי איכות מוגדרים, מקשר אותם למסלולים ומייצא את נתוני הקואורדינטות הגולמיים כקבצי CSV. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. מחברת Jupyter המשמשת כממשק הראשי לניתוח כמותי. הוא טוען את נתוני המעקב הגולמיים, מבצע את צינור הניתוח, ומייצר את כל התוצאות הסופיות, כולל גרפים של ורדים, טבלאות סיכום סטטיסטיות וטבלאות השוואה לצפיפות, מהירות ואורך חיים של שביטים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 5: File_5_MTModule1.py. מודול Python מותאם אישית המכיל פונקציות שימושיות בסיסיות המשמשות לחילוץ נתונים ולחישובים גאומטריים בסיסיים. הוא כולל פונקציות למציאת קבצי ROI, חישוב מהירויות מיידיות וחישוב הזזות זוויתיות בסיסיות. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 6: File_6_MTModule2.py. מודול Python מותאם אישית הכולל פונקציות מתקדמות לניתוח והדמיה. הוא כולל את האלגוריתמים לצינור ניתוח הכיוון (קרדינל מול צירי בינינג), בדיקות סטטיסטיות חזקות (Friedman/Wilcoxon עם שיטת פראט), ויצירת גרפים פולריים (ורודים) באיכות פרסום. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

קובץ קידוד משלים 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. נדרש תוסף Java Kalman Filter מקומפל לפיג'י/ImageJ עבור שלבי הפחתת הרעש במקרו הקדם-עיבוד. גרסה עצמאית זו מבטלת את הצורך בערכת פיתוח Java נפרדת (JDK), ומפשטת את הגדרת התוכנה של המשתמש. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה חיה של דינמיקת MT בביציות מציבה אתגרים ייחודיים, שכן נדרשים מערכי נתונים איכותיים וניתוחים כמותיים כדי להפיק מידע משמעותי. בעוד שמחקרים קודמים דיווחו על גישות הדמיה חיה 14,15,16, שלבי ניתוח התמונה לעיתים מותאמים אישית מאוד, והפרוטוקולים אינם מספקים פירוט מספק לשחזוריות. כתוצאה מכך, חוקרים ללא מומחיות דימותית או חישובית נרחבת עלולים להיתקל במחסומים בשחזור ניתוחים אלו. כדי להתמודד עם אתגרים אלו, פותחה זרימת עבודה יעילה, המשלבת הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של Airyscan עם מאקרו וסקריפטים אוטומטיים וידידותיים למשתמש. צינור זה מאפשר זיהוי ומעקב יעילים של שביטי EB1, ואחריו ניתוח כמותי של כיוון MT, מהירות וארגון מרחבי. על ידי מזעור התערבות ידנית ומתן הוראות ברורות ושלב אחר שלב, תהליך העבודה מקדם את הנגישות והשחזור של ניתוח דינמיקת MT בביציות.

כריתת שחלות והכנת דגימה הם צעדים ראשונים קריטיים. יש לנתח בזהירות את הביציות כדי למנוע נזק מכני, ויש להגביל את משך ההדמיה ל-90 דקות לשמירה על חיוניות20. בחירת שלב חשובה: לאחר אמצע הביצות, הביצית גדלה ומצטברת חלמון בציטופלזמה, מה שמקשה יותר ויותר על המחשת אות EB1 מעבר לשלב 9. לכן, הדמיה מעבר לשלב 9 אינה מומלצת20. כמו כן, לכימותים שניתן לשחזר, כאשר אפשרי, ביציות בגודל דומה מועדפות, שכן זה מבטיח שאזורים מוגדרים מתאימים למיקומים קדמיים–אחוריים שווים בין דגימות.

בקרת טמפרטורה חיונית לשחזוריות. יש לשמור על מלאי זבובים בתנאי תרבית סטנדרטיים (25 מעלות צלזיוס) כדי לתמוך בהתפתחות תקינה ובביטוי עקבי של EB1-GFP, במיוחד במערכת GAL4/UAS, הרגישה לתנודות טמפרטורה. יציבות הטמפרטורה במהלך ההדמיה חשובה לא פחות, שכן שינויים יכולים להשפיע על דינמיקת MT. למרות שאין צורך בתא מבוקר טמפרטורה, מומלץ להימנע מתנודות טמפרטורה במהלך הרכישה.

לצורך רכישת תמונה, נבחרה הדמיה קונפוקלית בגלאי מערך בשל רגישותו הגבוהה ושיפור ה-SNR, ובכך צמצמו את הצורך בדנואיזציה לאחר רכישה. יש להשתמש במטרות מפתח מספריות גבוהות (ככל האפשר) יחד עם התאמת מקדם שבירה מתאים כדי למקסם את הרזולוציה הצידית והצירית, שהיא קריטית לפתרון שביטים בודדים ברשתות צפופות. יתרה מזאת, יש לעקוב אחרי קריטריוני הדגימה של נייקוויסט-שאנון30 ב-XYZ ובזמן כדי למנוע אובדן דיוק במעקב אחרי השביט. חשוב לא פחות הוא הבחירה המדוקדקת של מישור ההדמיה לאורך ציר ה-z. הדמיה עמוקה מדי גורמת לאובדן פלואורסצנציה עקב פיזור אור, בעוד שהגבלת הרכישה למשטח הקורטיקלי אינה מצליחה ללכוד את מלוא הדינמיקה של שביטי EB1. הנתונים המידעיים ביותר מתקבלים במיקום z ביניים. יש להימנע מביציות שבהן הגרעין נמצא במישור הנבחר, שכן תא הגרעין מזיז חלק גדול מהציטופלזמה וחסר מסלולי EB1, ובכך מפחית את מספר השביטים הניתנים לזיהוי.

למרות שמותאם להדמיה קונפוקלית מבוססת גלאי מערך, צינור הניתוח הזה אינו תלוי בחומרה ותואם למודאליות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית בדיסק מסתובב. עם זאת, המשתמשים צריכים להיות מודעים לכך שמערכות עם NA או SNR נמוכים יותר עשויות לדרוש התאמות לפרמטרי הקדם-עיבוד של המאקרו (למשל, סבילות לרעש/סיגמות DoG) ועלולות להוביל לירידה בצפיפות זיהוי שביטים בהשוואה לערכים שהוצגו במחקר זה. עם זאת, למרות שהערכים המוחלטים עשויים להשתנות בין מערכות, המגמות היחסיות שנצפו בין תנאי הניסוי ל-ROIs צפויות להישאר יציבות.

בהתחשב במבנה התלת-ממדי הגדול של הביצית, הדמיה דו-ממדית לוכדת רק קטע אופטי ברשת ה-MT. כתוצאה מכך, שביטים הנעים בתלילות לאורך ציר ה-z עשויים לצאת ממישור המוקד, מה שעלול להוביל להערכת חסר של אורך החיים של המסילה והמהירות המוחלטת (שכן רק רכיב xy של וקטור המהירות נמדד). עם זאת, הדמיה נפחית תלת-ממדית מהירה של כל הביצית תדרוש שדות ראייה קטנים יותר, זמני חשיפה קצרים יותר וזמני תגובה מהירים יותר של הגלאי, ובכך מפחית את ה-SNR ומפזר את זמן הרכישה על פני מספר פרסות z, מה שפוגע ברזולוציה הזמנית הנדרשת למעקב מהיר אחרי שביטי EB1. כדי לצמצם שביטים לא נעים וארטיפקטים מחוץ למיקוד, הוטלו מסננים קונבולוציוניים ומינימום משך מסילה (למעט מסלולים < 3 פריימים) להסרת נקודות חולפות החוצות את מישור המוקד. יתרה מזאת, מאחר שהמגבלה הגיאומטרית הזו חלה באופן אחיד על תנאי ניסוי, ההבדלים היחסיים שנצפו בצפיפות, מהירות וכיוון השביטים נשארים חזקים. בעוד שטכניקות מתקדמות כמו מיקרוסקופיית שדה אור היו אידיאלית ללכוד את המבנה התלת-ממדי המלא בו-זמנית, הן עדיין אינן זמינות באופן נרחב. עם זאת, הערכים שנמדדו לכל פרמטרי הדינמיקה של MT תואמים לדיווחים קודמים, מה שמעיד כי פרוטוקול זה מתאים לחקירת דינמיקת MT בין מערכות ניסוי שונות.

לפני השימוש במקרואים בפרוטוקול זה, מומלץ לעבד את התמונות הראשונות ידנית כדי לוודא שפרמטרי התוכנה מותאמים כראוי. גורמים כמו רזולוציית הדמיה, הגדלה, יחס אות לרעש, קצב פריימים, והאם הנתונים הם חד-מישורי או z-stack יכולים כולם להשפיע על דיוק המעקב. התאמת פרמטרים באופן איטרטיבי תוך בדיקה ויזואלית של המסלולים המתקבלים כדי למזער חיוביים שגויים ושליליים שגויים. לאחר האופטימיזציה, ייסלו את הפרמטרים באופן עקבי בין מערכי הנתונים כדי להבטיח שחזוריות.

לבסוף, יש לציין כמה מגבלות בנוגע לפרשנות ביולוגית. EB1-GFP מתייג באופן סלקטיבי את קצוות ה-MT הגדלים ולכן מדווח על אתרים של פולימריזציה פעילה של MT במקום על כל אוכלוסיית ה-MT. MT יציבים וללא פולימריזציה הנמצאים בתקופת ההדמיה אינם מתגלים בשיטה זו. למרות שמגבלה זו פחות מגבילה בביציות באמצע-ביוציות, שבהם רוב ה-MT דינמיים מאוד, יש לקחת בחשבון אותה בעת יישום הפרוטוקול על סוגי תאים אחרים עם אוכלוסיות MT יציבות משמעותיות, כמו נוירונים31.

לסיכום, זרימת עבודה זו מאפשרת ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של דינמיקת MT בביצי דרוזופילה . על ידי שילוב דיסקציה אופטימלית, הדמיה חיה קונפוקלית בגלאי מערך וכלי ניתוח אוטומטיים, היא מספקת שיטה קפדנית אך נגישה לחקירת רגולטורים של MT בהקשר א-צנטרוזומי. בעוד שהעקרונות מאומתים בעיקר בביציות, עקרונות גישה זו ניתנים להתאמה, לאחר אופטימיזציה, לסוגי תאים אחרים, כולל תאים שאינם מתחלקים כמו נוירונים ואפיתליה, ומציעים פלטפורמה ניתנת להרחבה לסקרים גנטיים ולמחקרים מכניים של ארגון MT.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מאוד לאנטואן גישה (מכון ז'אק מונו, צרפת) על סיפקו בנדיבות את קו הטיסה UASp-EB1-GFP. אנו גם מודים לתמיכה הטכנית ולסיוע של מתקן המיקרוסקופיה בבית הספר לרפואה של נובה, הנתמך על ידי PPBI (POCI-01-0145-FEDER-022122), ומתקן הזבוב בבית הספר לרפואה של נובה, בתמיכת CONGENTO (LISBOA-01-0145-FEDER-022170). עבודה זו נתמכה במימון שהוענק ל-A.P.M. (2024/158225/PEX), על ידי יחידת המחקר UID/04462/2025: iNOVA4Health – Programa de Medicina Translacional, ועל ידי LS4FUTURE המעבדה הנלוויה (LA/P/0087/2020), כולם נתמכו כלכלית על ידי קרן החינוך (FCT) / Ministério da Educação, Ciência e Inovação. A.P.M. נתמך על ידי חוזה חוקר FCT במסגרת תכנית CEECIND/02842/2020), ו-J.C. נתמך על ידי מלגת דוקטורט FCT (2023/03665/BD).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דומונט #5 מלקחייםכלי המדע המדויק11252-20
EB1::GFPמד"ר אנטואן גישה, CNRS, מכון ז'אק מונוד, צרפתגנוטיפ: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
צלחות פטרי עם תחתית זכוכיתMatTekP35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16 מרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון7062גנוטיפ: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEFVWR כימיקלים24627.188
מוטנט פטרוניןמרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון16647גנוטיפ: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118מרכז המלאי דרוזופילה בלומינגטון3605
Zeiss LSM 980 עם Airyscan 2צייס

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Microtubules and microtubule-associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a022608(2018).">Goodson, H. V., Jonasson, E. M. Microtubules and microtubule-associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a022608(2018).
  2. Mechanisms of microtubule organization in differentiated animal cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (8), 541-558 (2022).">Akhmanova, A., Kapitein, L. C. Mechanisms of microtubule organization in differentiated animal cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (8), 541-558 (2022).
  3. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).">Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  4. Building the right centriole for each cell type. The Journal of Cell Biology. 217 (3), 823-835 (2018).">Loncarek, J., Bettencourt-Dias, M. Building the right centriole for each cell type. The Journal of Cell Biology. 217 (3), 823-835 (2018).
  5. The Centrioles, Centrosomes, Basal Bodies, and Cilia of Drosophila melanogaster. Genetics. 206 (1), 33-53 (2017).">Lattao, R., Kovács, L., Glover, D. M. The Centrioles, Centrosomes, Basal Bodies, and Cilia of Drosophila melanogaster. Genetics. 206 (1), 33-53 (2017).
  6. Centrosome reduction during gametogenesis and its significance. Biology of reproduction. 72 (1), 2-13 (2005).">Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome reduction during gametogenesis and its significance. Biology of reproduction. 72 (1), 2-13 (2005).
  7. Towards understanding centriole elimination. Open biology. 13 (11), (2023).">Kalbfuss, N., Gönczy, P. Towards understanding centriole elimination. Open biology. 13 (11), (2023).
  8. Microtubule organization, dynamics and functions in differentiated cells. Development. 144 (17), 3012-3021 (2017).">Muroyama, A., Lechler, T. Microtubule organization, dynamics and functions in differentiated cells. Development. 144 (17), 3012-3021 (2017).
  9. A mechanism for the elimination of the female gamete centrosome in Drosophila melanogaster. Science. 353 (6294), aaf4866-aaf4866 (2016).">Pimenta-Marques, A., Bento, I., Lopes, C. A. M., Duarte, P., Jana, S. C., Bettencourt-Dias, M. A mechanism for the elimination of the female gamete centrosome in Drosophila melanogaster. Science. 353 (6294), aaf4866-aaf4866 (2016).
  10. mRNA localization and translational control in Drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).">Lasko, P. mRNA localization and translational control in Drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
  11. Shot regulates the microtubule reorganization required for localization of axis-determining mRNAs during oogenesis. FEBS Letters. 590 (4), 431-444 (2016).">Lee, J., Lee, S., Chen, C., Shim, H., Kim-Ha, J. Shot regulates the microtubule reorganization required for localization of axis-determining mRNAs during oogenesis. FEBS Letters. 590 (4), 431-444 (2016).
  12. Patronin/Shot Cortical Foci Assemble the Noncentrosomal Microtubule Array that Specifies the Drosophila Anterior-Posterior Axis. Developmental Cell. 38 (1), 61-72 (2016).">Nashchekin, D., Fernandes, A. R., St Johnston, D. Patronin/Shot Cortical Foci Assemble the Noncentrosomal Microtubule Array that Specifies the Drosophila Anterior-Posterior Axis. Developmental Cell. 38 (1), 61-72 (2016).
  13. Cutting, Amplifying, and Aligning Microtubules with Severing Enzymes. Trends in cell biology. 31 (1), 50-61 (2021).">Kuo, Y. W., Howard, J. Cutting, Amplifying, and Aligning Microtubules with Severing Enzymes. Trends in cell biology. 31 (1), 50-61 (2021).
  14. A PAR-1–dependent orientation gradient of dynamic microtubules directs posterior cargo transport in the Drosophila oocyte. Journal of Cell Biology. 194 (1), 121-135 (2011).">Parton, R. M., et al. A PAR-1–dependent orientation gradient of dynamic microtubules directs posterior cargo transport in the Drosophila oocyte. Journal of Cell Biology. 194 (1), 121-135 (2011).
  15. Localised dynactin protects growing microtubules to deliver oskar mRNA to the posterior cortex of the Drosophila oocyte. eLife. 6, (2017).">Nieuwburg, R., et al. Localised dynactin protects growing microtubules to deliver oskar mRNA to the posterior cortex of the Drosophila oocyte. eLife. 6, (2017).
  16. The dynamic duo of microtubule polymerase Mini spindles/XMAP215 and cytoplasmic dynein is essential for maintaining Drosophila oocyte fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 120 (39), e2303376120(2023).">Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. The dynamic duo of microtubule polymerase Mini spindles/XMAP215 and cytoplasmic dynein is essential for maintaining Drosophila oocyte fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 120 (39), e2303376120(2023).
  17. Mammalian end binding proteins control persistent microtubule growth. The Journal of cell biology. 184 (5), 691-706 (2009).">Komarova, Y., et al. Mammalian end binding proteins control persistent microtubule growth. The Journal of cell biology. 184 (5), 691-706 (2009).
  18. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. The Journal of cell biology. 158 (5), 873-884 (2002).">Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. The Journal of cell biology. 158 (5), 873-884 (2002).
  19. Functionally Unequal Centrosomes Drive Spindle Orientation in Asymmetrically Dividing Drosophila Neural Stem Cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).">Rebollo, E., Sampaio, P., Januschke, J., Llamazares, S., Varmark, H., González, C. Functionally Unequal Centrosomes Drive Spindle Orientation in Asymmetrically Dividing Drosophila Neural Stem Cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Visualizing microtubule networks during Drosophila oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. , 99-112 (2015).">Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Visualizing microtubule networks during Drosophila oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. , 99-112 (2015).
  21. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system. Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 367-379 (1998).">Phelps, C. B., Brand, A. H. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system. Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 367-379 (1998).
  22. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. JoVE. (60), (2012).">Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. JoVE. (60), (2012).
  23. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133 (1), 129-139 (2006).">Januschke, J., Gervais, L., Gillet, L., Keryer, G., Bornens, M., Guichet, A. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133 (1), 129-139 (2006).
  24. Automatic stage identification of Drosophila egg chamber based on DAPI images. Scientific Reports. 6 (1), 18850(2016).">Jia, D., Xu, Q., Xie, Q., Mio, W., Deng, W. M. Automatic stage identification of Drosophila egg chamber based on DAPI images. Scientific Reports. 6 (1), 18850(2016).
  25. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature methods. 19 (7), 829-832 (2022).">Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. The BDGP gene disruption project: Single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).">Bellen, H. J., et al. The BDGP gene disruption project: Single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
  27. Patronin regulates the microtubule network by protecting microtubule minus ends. Cell. 143 (2), 263-274 (2010).">Goodwin, S. S., Vale, R. D. Patronin regulates the microtubule network by protecting microtubule minus ends. Cell. 143 (2), 263-274 (2010).
  28. Spatial activation of Kinesin-1 by Ensconsin shapes microtubule networks via ncMTOCs recruitment. bioRxiv. , Pre-print (2025).">Berisha, A. M., et al. Spatial activation of Kinesin-1 by Ensconsin shapes microtubule networks via ncMTOCs recruitment. bioRxiv. , Pre-print (2025).
  29. Patronin/CAMSAP promotes reactivation and regeneration of Drosophila quiescent neural stem cells. EMBO Reports. 24 (3), e56624(2023).">Gujar, M. R., et al. Patronin/CAMSAP promotes reactivation and regeneration of Drosophila quiescent neural stem cells. EMBO Reports. 24 (3), e56624(2023).
  30. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).">Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
  31. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).">van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A., Hoogenraad choogenraad, C. C., Akhmanova aakhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Developmental BiologyLive ImagingImage AnalysisMicrotubule DynamicsEB1 GFPOocyteDrosophila
Video Coming Soon

Related Articles