מאמר שיטה

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

DOI:

10.3791/69986

⸱

27 בפברואר 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת הפרוטוקולים הללו היא להעריך את הארגון ותפקוד המחסום של צמתים מקפלים (pSJs) ברקמות אפיתל שמקורן באקטודרמלי של עוברי דרוזופילה. pSJ יוצר מחסום חוסם על הקרום הצידי של רקמות אקטודרמליות כולל האפידרמיס, בלוטות הרוק, קנה הנשימה והמעי האחורי, הדומה פונקציונלית לצומת ההדוק ברקמות החולייתנים. בדרוזופילה זוהו 30 חלבונים הנדרשים להיווצרות pSJs. חלבוני הליבה של pSJ ממוקמים בתחילה לאורך הממברנה הלטרלית אך מתעשרים בעוצמה באזור הצידי האפיקלי של הצומת, ממש בסיסי לצומת ההדבקות, בשלב 16 של העובר. בשלב המאוחר ה-15 של העובר, לרקמות אלו יש צומת חסימה מתפקדת לחלוטין. מאמר זה יתאר פרוטוקולי צביעת חיסון וחדירות צבע שניתן להשתמש בהם לחקירת הארגון והתפקוד של pSJ בעוברים נשלטים ועוברים מוטנטיים. שימוש מוצלח בפרוטוקולים אלו יכול לשמש להדגמת פונקציית החסימה של pSJs, ולבדוק האם גן לא ידוע מקודד רכיב מרכזי של המחבר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפקיד קריטי של רקמות אפיתל הוא להפריד אזורים מובחנים בתוך האורגניזם. יצירת סביבות ייחודיות אלו חיונית לתפקוד האיברים ולהגנה על האורגניזם מאיומים חיצוניים. הצומת החסימה שנוצרת בין תאי האפיתל אחראית להקמה ולשימור סביבות אלו על ידי מניעת זרימה פארא-תאית של מומסים בין הצד האפיקלי והבסיסי של האפיתל 1,2. אצל אורגניזמים של חולייתנים, הצומת החסימה נקראת החיבור הצמוד, בעוד שבחסרי חוליות כמו Drosophila melanogaster 1,3 היא מכונה צומת הספטה (SJ). ישנם שני סוגים של SJ בפרוקי רגליים, המובחנים על ידי התפלגות הרקמות שלהם ומבנה אולטרה-סטרוקטיבי4. צמתים ספטיים מקופלים (pSJs) נמצאים ברקמות שמקורן אקטודרמלית כגון האפידרמיס, בלוטות הרוק, קנה הנשימה והמעי האחורי. הם מאופיינים באופן אולטרסטרוקטוריאלי על ידי מערך דמוי סולם של חומר צפוף אלקטרונים במרחב החוץ-תאי בין התאים, שנמצא ממש בסיסי לצומת הדבקים 3,5. לעומת זאת, מחלקות ספט חלקות (sSJ) נמצאות ברקמות שמקורן אנדודרמלית כמו צינורות המעי האמצעי ומאלפיגיאן, ואינם מראים ספטות צפופות אלקטרונים בין תאים6.

מחקרים גנטיים בדרוזופילה זיהו 30 חלבונים הנדרשים למבנה ולתפקוד של pSJ וזיהו חלבונים נוספים השוהים בצומת אך לא נראה שיש להם תפקיד בהקמה או בתחזוקתם (נבדקב-7). מהניתוחים הללו, מדענים חילקו חלבוני SJ לשלוש קטגוריות. חלבוני הליבה של SJ נמצאים בצומת ונדרשים להקמה ותחזוקה של החיבור. שבעה עשר חלבונים זוהו כחלבוני ליבת pSJ, כולל Coracle (Cora), Neurexin IV, Macroglobulin-Complement-related (Mcr), Kune-kune ו-ATPase alpha 8,9,10,11,12. תשעה חלבונים זוהו כחלבוני pSJ נלווים הנדרשים להקמה ו/או לתחזוקה של המחבר, אך אינם בהכרח שוכנים בצומת. מחלקה זו כוללת חלבונים כמו Rab5, Rab11 ו-Coiled 13,14. לבסוף, חלבוני ה-pSJ מתמקמים ב-pSJ אך ניתנים להחלפה להקמה ותחזוקה של הצומת. דוגמאות לארבעת חברי הקבוצה כוללות את Discs Large ו-Fasciclin III15,16.

הקמת pSJ שלם פונקציונלית היא תהליך רב-שלבי שמתחיל באמצע העובר כאשר כל חלבוני הליבה של pSJ מתבטאים במלואם. חלק מהגנים המרכזיים של pSJ מתבטאים באופן אימהי, אך כולם מראים ביטוי זיגוטי חזק בשלב12-17. בשלב 12, חלבוני הליבה של pSJ מתמקמים לאורך כל הממברנה הלטרלית. בשלבים 13-16, חלבוני הליבה של pSJ עוברים אנדוציטוזה ואז ממוחזרים חזרה לממברנה הצדדית באזור ה-pSJ. תהליך זה דורש חלבוני עזר של pSJ, כולל Rab5 ו-Rab1114. בשלב 16, חלבוני הליבה של ה-pSJ ממוקמים באופן הדוק באזור ה-pSJ לאורך הממברנה הצדדית. בהתאם לתצפיות אלו, פונקציית החסימה המלאה של החיבור מתרחשת בשלב המאוחר 15 של העובר12. הדבר מוצג בצורה הטובה ביותר באמצעות בדיקת חדירות צבע. לפני יצירת הצומת, חרוז דקסטרן של 10 קילו-דלטון המסומן בסמן פלואורסצנטי כמו רודאמין יכול לעבור דרך המרחב הפרתאלי בין התאים. אם הדקסטרון המסומן מוזרק לתוך ההמוקול, הוא יצטבר במהירות אל הלומן של אפיתל צינורי כגון קנה הנשימה, בלוטת הרוק והמעי האחורי. לאחר שה-pSJ מתוח פיזיולוגית בסוף שלב 15, הדקסטרון המוזרק מוגבל לצד הבסיסי של האפיתל ואינו יכול להצטבר בלומן (התחום האפיקלי) של איברים אלו.

חלבוני pSJ ליבה חולקים תכונה אופיינית שבה כל חלבון pSJ ליבה דורש נוכחות של כל שאר חלבוני הליבה pSJ למיקום תת-תאינכון 18,19. תלות זו ביצירת pSJ היא תכונה מגדירה של חלבוני הליבה של pSJ והיא הבסיס לפרוטוקולים המוצגים במאמר זה. מוטציות בגנים הליבה או העזר של pSJ מובילות לקטלניות עוברית ומאופיינות במיקום לא נכון של חלבוני pSJ ליבה אחרים לאורך הממברנה הלטרלית בעוברים בשלב 16, במקום להיות ממוקמים בצפיפות באזור האפיקלי הטבעי שלהם. לעומת זאת, מוטציות בגנים תושבי pSJ אינן מובילות לאי-מיקום של חלבוני הליבה של pSJ15. ההפרעה התפקודית של ה-pSJ במוטציות הגנטיות הליבתיות והנלוות של ה-pSJ מתגלה על ידי הצטברות דקסטרון מסומן של 10 kDa בלומן של קנה הנשימה, בלוטות הרוק או המעיים האחוריים בעוברים מוטנטים בשלב 16 או 17. לבסוף, המאפיין המבדיל בין חלבון ליבה לחלבון pSJ משני הוא המיקום התת-תאי שלהם. חלבוני הליבה של pSJ קשורים באופן הדוק ל-pSJ לאחר היווצרותם, בעוד שחלבוני pSJ משניים קריטיים להרכבת החיבור אך אינם בהכרח שוכנים בצומת. הדוגמאות הטובות ביותר לחלבוני pSJ משניים הן Rab5 ו-Rab11. שניהם חלבונים ציטופלזמיים המסייעים בהעברת מטען מממברנת הפלזמה לאנדוזומים מוקדמים וממחזרים את האנדוזומים ואז חזרה לממברנתהפלזמה 14. כדי להבחין האם חלבון pSJ פוטנציאלי חדש הוא רכיב ליבה או חלבון משני, בדרך כלל מועיל ליצור נוגדן ספציפי או לבטא חלבון רקומביננטי מסומן פלואורסצנטית, כדי לקבוע היכן חלבונים אלו מתמקמים בנקודות שונות בתהליך הבשלת ה-pSJ.

מטרת הפרוטוקולים הללו היא להבחין באופן חד-משמעי בין חלבוני pSJ פוטנציאליים לבין חלבוני pSJ המקומיים. מספר מחקרים חשפו תפקידים נוספים שאינם אוקלאודיים לחלבוני pSJ במהלך ההתפתחות, כולל תפקידים במורפוגנזה ובקוטביות האפיקלית-בסיסית 17,20,21,22. ככל שהעניין בביולוגיה של pSJ גובר ויותר חלבוני pSJ פוטנציאליים מזוהים, הפרוטוקולים הפשוטים והקלים לפרשנות המוצגים כאן יסייעו לחוקרים לאפיין נכון את ארגון ה-pSJ ואת פונקציות החסימה של חלבונים אלה. בספרות תוארו גישות ניסיוניות נוספות רבות לאפיון חלבוני pSJ, כולל התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה (FRAP) ומיקרוסקופיית אלקטרוני העברה 6,23. למרות שגישות אלו לעיתים קרובות מאוד שימושיות, מבחן הצבעה החיסונית המוצגת כאן מספק המחשה מהירה של מיקום חלבוני pSJ ללא שיטות אולטרה-מבניות יקרות וגוזלות זמן, בעוד שבדיקת חדירות הצבע מציעה קריאה פונקציונלית של שלמות ה-pSJ שאינה ניתנת להשגה באמצעות הדמיה בלבד. בנוסף, ניתן לבצע בדיקות אלו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי כגון מיקרוסקופ פלואורסצנציה איכותי ומערכת מיקרו-הזרקה בסיסית. יש לציין כי בדיקות אלו מותאמות לניתוח עוברי דרוזופילה שלב 16 ואינן מתאימות להערכת ארגון או תפקוד של sSJs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הבמה של עוברים

  1. יש לשלב זבובים זכרים ונקבות בריאים עם הגנוטיפים המתאימים (ראו טבלת חומרים לדוגמה) ומניחים אותם בכלובי איסוף עוברים עם צלחות מיץ תפוחים טריות המרוחות במשחת שמרים. תנו לזבובים להסתגל לכלובי איסוף ביציות יום או יומיים לפני שמתחילים באיסוף עוברים.
  2. אספו עוברים על צלחות מיץ תפוחים ואפשרו להם להתפתח לשלב 16 (~13 שעות לאחר הטלת הביצים (AEL) ועד 16 שעות AEL בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס). אפשרו לבוגרים להטיל ביצים מופרות במשך שעה עד שעתיים על צלחות מיץ תפוחים, הוציאו את הצלחת מכלוב איסוף הביצים, ואז התיישנו ל-13-16 AEL בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. חלופה נוספת היא לאסוף עוברים ללילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ואז לבחור עוברים בשלב 16 לפני הקיבוע או במהלך ההדמיה לאחר קיבוע וצביעת חיסונים.
    הערה: ניתן להעריך שלב עוברי באמצעות מורפולוגיית המעי, שניתן להמחיש בקלות ביותר על ידי אוטופלואורסצנציה בספקטרום ה-UV (כלומר, ערוץ DAPI). בעוברים בשלב 16, המעי מופיע כשלושה אליפסות ארוכות מקבילות בניצב לציר הארוך של הגוף (איור 1H).

2. קיבוע וצביעת חיסון של עוברים

  1. הרכיבו סלסלת איסוף עוברים עם רשת ניילון (רשת 120 מ"מ). כסו את הפתח ואת הברגות הסל עם רשת ניילון, ואז הברגו את המכסה.
  2. הוציאו בעדינות את העוברים מצלחת מיץ התפוחים עם מברשת צבע ותמיסת שטיפת עוברים. שפכו את תערובת העוברים לסלסלת איסוף העוברים ושוטפים אותם במים מזוקקים.
    הערה: יש להיזהר לכוון את המים לתוך סלסלת איסוף העוברים ולהימנע מהתזת העוברים על דפנות הסל, מה שעלול לגרום לאובדן עובר עקב היצמדות.
  3. דכוריון העוברים על ידי טבילה של סל איסוף העוברים והעוברים במגש המכיל 50% אקונומיקה מסחרית (ריכוז סופי של 3.75% נתרן היפוכלוריט). ערבבו את העוברים באקונומיקה ושמרו אותם טבולים 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. הוציאו את הסל מהאקונומיקה ושוטפים את העוברים במים מזוקקים, שוב כדי לכוון את זרימת המים לתוך הסל הפנימי.
  4. הכינו בקבוקון קיבוע על ידי הוספת נפחים שווים של תמיסת פרפורמלדהיד טרייה של 4% והפטן לבקבוקון סינטילציה של 20 מ"ל. הכינו תמיסת פרפורמלדהיד על ידי המסה מתאימה של פרפורמלדהיד במי מלח חמים (~90°C) 1x עם בופר פוספט (PBS) בתוך מכסה אדים כימי. כדי להאיץ את תהליך ההמיסה, הוסף 10 מיקרוליטר של 14 N נתרן הידרוקסיד (לכל 10 מ"ל PBS) לקיבוע עד שהפורמלדהיד נכנס לתמיסה, ואז מוסיפים 10 מיקרוליטר של 14 N חומצה כלורית כדי להחזיר את ה-pH לנייטרלי.
    אזהרה: תמיד יש ללבוש חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות בעת טיפול בפארפורמלדהיד והפטן, ולהשתמש בו רק מתחת למכסה אדים כימי. פאראפורמלדהיד הוא חומר מסרטן והוא קורוזיבי, בעוד שהפטן דליק מאוד ומגרה עור ועין.
  5. פירקו את סלסלת איסוף העוברים וטבלו את רשת הניילון עם עוברים מפורקים בהפטן. העוברים יתנתקו מהניילון ויתייצבו בממשק בין הפטן (השכבה העליונה) ל-fix (השכבה התחתונה). תקן את העוברים על ידי ניעור בקבוקון הקיבוע על שייקר פלטפורמה במהירות של 240 סיבובים לדקה (RPM) למשך 20 דקות.
  6. הסר את התיקון מבקבוקון הקיבוע עם פיפטת פסטר בתוך מכסה אדים כימי. השליך את התיקון במיכל פסולת כימית מסוכנת מאושר. הוסיפו נפח שווה של מתנול, סגרו את תא הקיבוע וננערו אותו בחוזקה במשך 5-10 שניות. העוברים הקבועים ייקרעו ממעטפת הויטלין וישקעו לתחתית המתנול (השכבה התחתונה). מעטפות ויטלין וכל עובר שלא הצליח להשתחרר מעטפת הוויטלין יישארו בממשק ויוסרו בשלב 2.7.
    זהירות: תמיד לבש חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות בעת טיפול במתנול, שכן הוא רעיל ודליק.
  7. הסר את הפטן עם פיפטת פסטר והשליך אותו במיכל פסולת כימית מסוכנת מאושר. לאחר מכן, מסירים את רוב המתנול, משאירים את העוברים בבריכה קטנה של מתנול, וזורקים את המתנול בפסולת כימית מסוכנת. הוסיפו 5 מ"ל מתנול, סובבו את העוברים ותנו להם לשקוע. הסר את רוב המתנול שוב וחזור על התהליך הזה פעמיים נוספות.
  8. העבר את העוברים במתנול לצינור תרבית זכוכית בנפח 0.8 מ"ל. הסר את המתנול והוסיף 750 מ"ל תמיסת בלוק (PBS בתוספת 1% סרום חמור רגיל ו-0.1% טריטון X-100). שטפו את העוברים 3 פעמים ב-PBS, ואז דגרו אותם בתמיסת בלוקים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על נדנדה בפלטפורמה.
  9. שטוף את העוברים פעם נוספת ב-PBS ואז מוסיפים בלוק עם נוגדנים ראשוניים. השתמש בנוגדנים נגד חלבון pSJ ליבה (למשל Coracle) וחלבון צומת דבק (למשל, E cadherin). דגרו את העוברים בנוגדנים ראשוניים בלילה בטמפרטורה של 4°C או למשך 3-4 שעות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על נדנדה בפלטפורמה.
  10. הסר את הבלוק עם נוגדנים ראשוניים ושוטף את העוברים שלוש פעמים ב-PBS. הוסיפו בלוק ושטפו את העוברים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה בפלטפורמה.
  11. שוטפים את העוברים פעם נוספת ב-PBS, ואז מוסיפים את תמיסת החסימה ואת הנוגדנים המשניים המסומנים פלואורסצנטית, הספציפיים לנוגדנים הראשיים ששימשו בשלב 2.9. דגרו עוברים בטמפרטורת החדר למשך 3-4 שעות או ללילה בטמפרטורה של 4°C.
  12. הסר את הבלוק עם נוגדנים משניים ושוטף את העוברים שלוש פעמים ב-PBS. הוסיפו בלוק ושטפו את העוברים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה בפלטפורמה.
  13. שוטפים את העוברים שוב ב-PBS, ואז העבירו אותם לזכוכית מיקרוסקופ באמצעות פיפט פסטר. סחוט עודפי PBS באמצעות רצועות קטנות של נייר ווטמן, תוך זהירות לא לגעת בעוברים. כסו את העוברים במדיום הרכבה (זמין מסחרית או עשוי מ-90% גליצרול, 10% M טריס, pH 8.0, עם 0.5% n-פרופיל גלאט כחומר אנטי-דהוי). כסו בזכוכית כיסוי בגודל מתאים בגודל 1.5, ואטמו את הקצוות עם לק.

3. הדמיה וניתוח נתונים של עוברים עם צבעי חיסון

  1. לתוצאות מיטביות, צלמו עוברים על מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של טבילה בשמן פי 40. השתמשו בעוברים בקרה כדי לקבוע את עוצמת הלייזר והגבר על הקונפוקל ולהשיג אות פלואורסצנטי חזק מבלי לרווי פיקסלים יתר על המידה. לזהות עוברים בשלב 16 לבחירה (כלומר, כאלה שאינם מבטאים GFP מקודד במאזן כדי לזהות עוברים מוטנטיים) באמצעות מורפולוגיית מערכת העיכול המרכזית. התמקדו בסריקה בבלוטת הרוק או במעי האחורי, שכן האיברים הללו מקוטבים ויש להם ממברנות לטרליות ארוכות, המותאמות להבחנה בין צומת ההידבקות, ה-pSJ והמשטח הלטרלי שנותר. תמונה במיקום z שתכלול את הקוטר הגדול ביותר האפשרי של הלומן של בלוטת הרוק או המעי האחורי כדי לצפות בממברנה הצדדית המלאה של תא האפיתל.
    הערה: הדוגמה המוצגת באיור 1C צולמה במיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשת HC PL APO 40x/1.3 CS2 עם עוצמת לייזר של 1.59 ורווח של 3.3 ללייזר 561 ננומטר, ועוצמת לייזר של 2.0 ורווח של 21.7 ללייזר 638 ננומטר (ראו טבלת חומרים).
  2. דמיין רקמה מקוטבת בלפחות 20 עוברים בשלב 16 ומוטנטי. יש לתעד רק נתונים מעוברים שבהם סמן החיבור של הדבק ממוקם באופן הדוק באזור הצד האפיקלי של הממברנה כדי להבטיח שהעובר היה מקובע וצובע כראוי. לאחר מכן, רשמו את התפלגות סמן ה-pSJ לאורך הממברנה הצידית. בעוברים שלב 16 מסוג פרא, יש לחפש העשרה חזקה של חלבוני pSJ לאורך ~10-15% של הממברנה הצדדית בדיוק בבסיס לצומת ההדבקות.
    הערה: אי-מיקום אפילו של 10-20% מחלבון ה-pSJ לאורך הממברנה הצדדית הוא אבחנתי לפגם ארגוני ב-pSJ. פגמים בארגון pSJ חדירים מאוד בכל העוברים המוטנטיים הליבתיים והנלווים, ולכן כדאי לצפות לראות 75-100% מהעוברים המוטנטיים שמציגים חלבון pSJ לא ממוקם בבירור.

4. הכנה להזרקת צבע

  1. הכינו תמיסת צבע חדשה על ידי המסה של 10 kDa דקסטרן עם תווית רודמין ל-1 mg/mL ב-0.5 מ' נתרן פוספט, pH 7.5 ו-5 mM אשלגן כלוריד.
  2. משוך צינור קפילרי (1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ ID עם סיבים) לתוך מחט זכוכית באמצעות מושך מחטים.
    הערה: מחטים מושכות הן ייחודיות וההגדרות למחטים אידיאליות משתנות לעיתים קרובות מיום ליום. למחטים טובות יש הצדדה הדרגתית לנקודה חדה וצריכות להיות בין הצורות המוצגות באיור 2A. המחט השמאלית ארוכה יותר ועלולה להתעקם כאשר היא נדחפת לעובר. אפשר לתקן זאת על ידי שבירת המחט מחדש מהנקודה. המחט הימנית תקינה, אך תהיה בעלת קוטר גדול יותר כשהיא נשברת בהתחלה ועלולה לדחוף יותר מדי נוזל לעובר. אם זה קורה, תחליף למחט חדשה עם נקודה דקה. הכי טוב למשוך כמה מחטים בבת אחת כאשר התנאים על מושך המחטים יוצרים מחטים בצורתם הנכונה. מחטים עודפות ניתן לאחסן במיכל סגור עם חתיכת קצף או סרט דבק כדי לקבע את המחטים באופן עצמאי.
  3. טען את המחט למחזיק המחט במיקרומניפולטור. סדר את המיקרומניפולטור ליד מיקרוסקופ הפוך (איור 2F). כוון את המחט קרוב ככל האפשר למקביל למגלש המיקרוסקופ והנמיך אותה כך שתהיה באותו מישור z כמו הצד של המחסנית.
  4. שבור את קצה המחט על ידי פגיעה בצד של מגלש המיקרוסקופ. הרם את המחט מעל גובה הסלייד והסר אותה לטעינה.
  5. מלאו את הצינור הקפילרי בצבע באמצעות קצה הפיפטה הקטן ביותר הזמין (קצה P2 או P10) או באמצעות פעולה קפילרית על ידי הנחת קצה המחט בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם הצבע.
  6. טען מחדש את המחט המלאה לתוך מחזיק המחט ובדק את זרימת הדקסטרן על ידי הזרקת קצת לטיפה של שמן הלוקרבון על פני מגלש מיקרוסקופ.
    הערה: מחט שבורה היטב לא תדלוף בלי להוסיף לחץ, וקצב הזרימה יכול להשתנות לפי כמות הלחץ שמופעל על הבוכנה שעל המזרק.

5. הרכבת עוברים והזרקת צבע

  1. בחרו עוברים בשלב 16 או 17 (בקרה ומוטנטים) תוך שימוש במורפולוגיה של מערכת העיכול המרכזית כסימן סידור.
  2. צור קו שקוע על צלחת מיץ תפוחים באמצעות כיסוי בעובי 22 על 22 # 2. מסודרים כ-25 עוברים שלביים על צלחת מיץ התפוחים, כאשר קצותיהם האחוריים נוגעים בקו והמשטח התחתון פונה כלפי מעלה.
  3. מרח חתיכת סרט דו-צדדי על כיסוי 22x2 #2. נגעו בסרט על קו העובר ושפשפו בעדינות את הכיסוי כדי להעביר את העוברים מהצלחת אל הסרט הדו-צדדי על הכיסוי (איור 2B).
  4. חבר את הכיסוי למחסנית מיקרוסקופ על ידי הוספת טיפה של שמן הלוקרבון למחסנית ושימוש בפעולה קפילרית ליצירת קשר. כוון את הכיסוי קרוב יותר לצד המגלשה, הפוך לכל חלק מטושטש. ייבשו את העוברים למשך 3-5 דקות במיכל נוזל או באוויר על ספסל מעבדה למשך 10-15 דקות (איור 2C-E). כסו את העוברים לחלוטין בשמן הלוקרבון.
    הערה: העוברים יהיו מעט פחות נפוחים לאחר התייבשות אך לא יהיו רפויים מאוד. העוברים המוצגים באיור 2E נותרו לייבוש באוויר במשך 15 דקות בחדר עם לחות יחסית של 42% בטמפרטורה של 21.2°C.
  5. התקן את המחסנית עם העוברים על המיקרוסקופ ההפוך כאשר העוברים פונים כלפי מעלה (הרחק מהמטרה). יישר את המיקרומניפולטור כך שהמחט תהיה פונה לקצה האחורי של העוברים בזווית הקרובה ככל האפשר למקביל לעוברים (איור 2G). כוון את ציר ה-z של המיקרומניפולטור כך שקצה המחט מיושר לנקודת האמצע של העובר (לאורך הציר הגב-וונטרלי).
  6. הזרקו את העוברים על ידי הזזת השלב במהירות לתוך המחט כך שקצה המחט ייכנס להמוקול של העובר. הזרקו כמות קטנה של צבע (~0.2-0.5 ננוליטר) באמצעות מזרק בנפח 10, 25 או 50 מ"ל. משכו במהירות את המחט, העבירו את השלב לעובר הבא, וחזרו על התהליך. הזריק כמה שיותר עוברים ב-10 דקות.
    הערה: חשוב שהמחט תוכנס כ-25% מהדרך לעובר כדי שהצבע לא יוזרק ישירות למרחב הפריוויטלין הרציף עם הלומן של המעי הקדמי והאחורי. הצבע המוזרק אמור להיראות כאילו הוא "מתנפח" את העובר, מה שגורם לו להיראות נפח יותר. הזרקה מופרזת תגרום לבועה של צבע והמולימפה שיוצאים מאתר ההזרקה ויש להימנע מכך.
  7. הוסף שמן הלוקרבון נוסף וכסה את העוברים עם כיסוי 22 x 22 #2. שמן ההלוקרבון הנוסף יוצר שכבה אחידה יותר בין שני הכיסוי, ומונע מעוברים להידחק.

6. דימות וניתוח נתונים

  1. בצע הדמיה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי (10x או 20x מטרות אוויר מספיקות להניב תוצאות חד-משמעיות). בקונפוקלי, הדמיית ערימת z דרך כרבע מהעומק (לאורך הציר הגחוני הגב) של העובר תגלה אם הדקסטרון המסומן נכנס ללומן של קנה הנשימה והמעי האחורי (יש צורך בקטעים עמוקים יותר או שינוי כיוון העוברים עם משטח וונטרלי למעלה כדי לראות את בלוטות הרוק).
    הערה: הדוגמאות המוצגות באיור 3 צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשת יבש HC PL APO 10x/0.4 CS2 עם עוצמת לייזר של 2.0 ורווח של 13.6 עבור לייזר 561 ננומטר. 24 פרוסות z הושגו עם גודל צעד z של 2.4 ננומטר (ראו טבלת החומרים).
  2. אפשרו לעובר שהוזרק להזדקן במשך 10 דקות ואז בדקו את הלומן של קנה הנשימה, בלוטת הרוק או המעי האחורי להצטברות הדקסטרון המסומן. רשמו את הגנוטיפ והשלב של כל עובר והאם יש הצטברות של דקסטרון מסומן באיבר צינורי כלשהו. שימו לב לכל עובר שבו המרחב הפריוויטליני מוכתם מאוד בצבע, שכן ייתכן שהם מייצגים עוברים שהוזרקו בטעות למרחב זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המוצגים כאן משמשים לחקר ארגון ותפקוד pSJ ברקמות אקטודרמליות בעוברי דרוזופילה בשלב 16. פרוטוקולים אלו חלים רק על pSJ ואינם יכולים לשמש לחקירת sSJs. מוטציה בגן שגורמת לכישלון למקם חלבוני pSJ אחרים באזור ה-pSJ בעוברים בשלב 16 וליצור צומת חסימה בשלב 16 היא או בגן הליבה של pSJ או בגן pSJ משני. ההבדל העיקרי בין השניים הוא האם החלבון המקודד ממוקם תת-תאית ל-pSJ לאחר שנוצר צומת פונקציונלי בעוברים מסוג פראי. במקרה כזה, החלבון יסווג כחלבון pSJ ליבה. כדי להדגים עיקרון זה, אנו מראים תחילה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חלבוני pSJ ליבה ועזר באמצעות שני בדיקות פשוטות יחסית שניתן לבצע במעבדות צנועות עם יכולות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המבחן הראשון בוחן את הארגון המולקולרי של ה-pSJ באפיתל מקוטב בוגרים באמצעות הדמיה קונפוקלית של עוברים מוטנטים קבועים. הבדיקה השנייה בודקת את שלמות פונקציית החסימה של ה-pSJ על ידי הזרקת מולקולות דקסטרן מסומנות בצבע של 10 kDa לעוברים חיים בשלב 16. הפשטות של הפרוטוקולים הללו והעובדה שפגם בארגון ובפונקציה של pSJ הוא אבחנתי מלא למוטציות הליבה והנלוות, ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למרכז המלאי לדרוזופילה של בלומינגטון על הסטודנטים שבהם השתמשו במחקר זה. אנו מודים לבנק Developmental Studies Hybridoma על הנוגדנים ששימשו במחקר. אנו גם מודים למחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב על השימוש בסטריאוסקופ הפלואורסצנציה Leica MZ10F שלהם לגנוטיפינג ובשלב של עוברים לדיסקציה ולמיקרוסקופ הפלואורסצנציה ההפוכה DMi8 לניסויי הזרקת צבע. אנו מודים להלן זלץ, פרופסור לגנטיקה ומדעי הגנום, בית הספר לרפואה של CWRU, על סיפוק המיקרומניפולטור ועל ששלפה כמה מהמחטים ששימשו בניסוי הזרקת הצבע שהוצג במחקר זה. הפרויקט נתמך על ידי מענק מקרן המדע הלאומית (IOS 2111069) ל-REW.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור קפילרי למחטים (Boro 1 X 0.5/סיבים)FHC30-30-1
מיקרוסקופ קונפוקלילייקהStellaris 5 
זכוכית כיסוי 22 x 22 עובי להזרקותפישר סיינטיפיק12-540-B
זכוכית כיסוי בגודל 22 על 30 בעובי 1.5 לצילוםקורנינג2980-233
צינור תרבית לצביעת חיסון (6 x 50 מ"מ) פישר סיינטיפיק14-958-A
כלוב איסוף עובריםג'נסי סיינטיפיק59-100
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטילייקהMZ10 F
נפט הלוקרבון (700)ג'נסי סיינטיפיק59-131
הפטןפישר סיינטיפיקH350-4
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוךלייקהDMi8
סלסלות רשת לפרק עובריםג'נסי סיינטיפיק46-101
מתנולפישר סיינטיפיקA412-4
מיקרומניפולטורנארישיגהMN151
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-544-2
מושך מחטכלי דיוויד קופףדגם 720
סרום חמור רגילג'קסון אימונו-רסיירץ'017-000-121
רשת ניילון (120 מיקרומטר)ג'נסי סיינטיפיק57-102
עדשת אובייקטיבית HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1לייקה11506537
עדשת אובייקטיבית HC PL APO 10x/0.40 CS2לייקה15506407
עדשת אובייקטיבית HC PL APO 40x/1.30 CS2לייקה15506358
לוחות פטרי בגודל 60 x 15 מ"מקורנינג351007
נדנד פלטפורמהגלוב סיינטיפיקGTR-FS
נוגדן ראשוני (קורקל)DSHBC566.9
נוגדן ראשוני (קורקל)DSHBC615.16
נוגדן ראשוני (E cadherin)DSHBDCAD2
נוגדן ראשוני (Mcr)מעבדת מחלקה, CWRUהפוליקלונל של חזיר הים
רודאמין מסומן דקסטרן של 10 קילו-דלטוןגשושיות מולקולריותD1824
נוגדן משני (אנטי-חזיר חמור Cy3)ג'קסון אימונו-רסיירץ'706-165-148
נוגדן משני (אנטי-עכבר לחמור Cy2)ג'קסון אימונו-רסיירץ'715-225-151
נוגדן משני (Cy5 נגד עכברוש לחמור)ג'קסון אימונו-רסיירץ'712-175-150
שייקר שולחןניו ברונסוויק סיינטיפיקרעידת פלטפורמה C2
טגוספט (מתיל 4-הידרוקסיבנזואאט)TCIH0216
טריטון X-100פישר סיינטיפיקBP151500
בקבוקים לקיבוע (20 מ"ל בקבוקוני נוזל סינטילציה של WHEATON)פישר סיינטיפיק03-341-73C
Whatman 3MM  נייר כרומטוגרפיהפישר סיינטיפיק05-716-6H
<מניות חזקות>זבובים<חזק>גנוטיפ מלא<חזק>מספר מניות<חזק>מקור
COR4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
W1118w[1118]5905BDSC
<חזק>פתרון<חזק>מתכון
10x PBSמערבבים 90 גרם NaCl, 20 גרם Na2HPO4, ו-8.3 גרם NaH2PO4.H2O ו-dH20 ל-1L. לסנן את הסינון. מדלל ל-1X עם dH2O לשלבים של שטיפה בצביעת חיסונים.
10% פתרון טריטון X-100מערבבים 1 מ"ל טריטון X-100 עם 9 מ"ל dH2O על נדנדה בפלטפורמה עד להמיסה. אחסן בטמפרטורת החדר.
50% אקונומיקהערבבו 10 מ"ל אקונומיקה מסחרית (7.5% נתרן היפוכלוריט) עם 10 מ"ל מים לפני דקוריון עוברים.
צלחות מיץ תפוחיםלהרתיח 15 גרם אגר דרוזופילה ב-725 מ"ל dH2O. הוסיפו 25 גרם סוכר ו-250 מ"ל מיץ תפוחים וערבבו עד שמתערבבים. תן לתמיסה להתקרר ל-55 מעלות צלזיוס ואז להוסיף 1.3 גרם טגוספט ולערבב בעדינות. שופכים לפלטות פטרי בגודל 60 על 15 ותנו להתקרר. חנות ב-4C.
פתרון חסימהמערבבים 9.8 מ"ל של 1X PBS עם 100 אול של 10% טריטון X-100 ו-100 אולם של סרום נורמלי דונקי בצינור קוני של 15.
תמיסת שטיפת עובריםהכינו 10X תמיסת שטיפת עובר על ידי ערבוב 70 גרם NaCl ו-2 מ"ל טריטון X-100 ל-1 ליטר dH2O. מדלל ל-1X עם dH2O לתמיסה עובדת.
תיקוןחממו מראש 10 מ"ל של 1X PBS במיקרוגל. הוסף 0.4 גרם ו-nbsp; של פאראפורמלדהיד ופיפט לערבוב. הוסיפו 10 אולטר של 14N NaOH כדי להאיץ את ההתמוססות. הנח על בלוק חום של 90 מעלות עד שהוא נמס. ברגע שאין פאראפורמלדהיד מוצק, הוסף 10 אולטר של 14N HCL כדי לכוון את ה-pH לנייטרלי. תמיד כדאי ללבוש חלוק מעבדה, כפפות וגוגל כשמשתמשים בפארפורמלדהיד.
מדיית הרכבהמערבבים 9 מ"ל גליצרול ו-1 מ"ל של בסיס 1M Tris pH 8.0. הוסף 0.05 גרם n-פרופיל-גלאט,  מערבבים וחממים כדי להמיס. Aliquot 0.5 מ"ל לתוך צינורות אפנדורף. 
תמיסת רודמין דקסטרןהכינו תמיסת צבע טרייה על ידי המסה של 10 kDa דקסטרן מסומן ברודמין ל-1 מ"ג/מ"ל ב-0.5M נתרן פוספט, pH 7.5 ו-5 מילימטר אשלגן כלוריד.
משחת שמריםערבבו 50 גרם שמרים מסחריים (כוכב אדום) עם קמצוץ סוכרוז וכמות מים מספקת להכנת משחה סמה. חנות ב-4C.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים