מאמר שיטה

הדמיה בזמן אמת של השפעת מדיה תזונתית על התפתחות ביופילם של Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת מיקרופלואידית

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 במאי 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מעריך את השפעת הרכבי חומרי הזנה עשירים (TSB) ומינימליים (FAB) על התפתחות ביופילם Pseudomonas aeruginosa PAO1 ו-PA14 בסביבת זרימה במצב יציב במיקרו-ערוץ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החיידק הפתוגני Pseudomonas aeruginosa הוא גורם מרכזי לזיהומים נוסוקומיים רבים, ועמידותו הגוברת לאנטימיקרוביאלית הובילה אותו לסיכון משמעותי על בריאות הציבור. מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף המתאר את השימוש במערכת מיקרופלואידית לוויזואליזציה וכימות בזמן אמת של התפתחות ביופילם בשני זנים מרכזיים של P. aeruginosa , PAO1 ו-PA14. השיטה עושה שימוש בלוחות מיקרו-ערוצים שקופים אופטית ורב-ערוציים כדי לחשוף תרביות חיידקים לזרימה רציפה ויציבה של מדיה, כולל ציר סויה טריפטי (TSB) או מרק אנאירובי מינימליסטי מותאם (FAB) עם ריכוזי פחמן משתנים, ובכך מדמה את התנאים הקיימים בסביבה הקלינית. במהלך תקופה של 24 שעות, הדמיה אוטומטית בזמן אמת לוכדת את הצמיחה והבגרות של ביופילמים בצורת כיסוי שטח פנים, עובי וחספוס פני השטח בצורה שחזורית מאוד. מטרת הניסוי היא להשתמש בתוצאות כדי להראות שהיווצרות ביופילם בשני הזנים מושפעת באופן משמעותי משינויים בהרכב חומרי הזנה. מטרת הפרוטוקול המוצג הזה היא לספק שיטה לחוקרים לחקור דינמיקת ביופילם בתנאי זרימה למינרית יציבה, והתובנות שנרכשו יכולות לשמש לפיתוח אסטרטגיות אלטרנטיביות, לא-אנטימיקרוביאליות, להכחדת ביופילמים מוקדמים של P. aeruginosa בסביבות נוסוקומיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת שיטה זו היא לבחון את השפעתם של שתי מדיות תרביות שונות, כלומר ציר סויה טריפטי (TSB) ומרק אנאירובי מינימליסטי מותאם (FAB), על צמיחת הביופילם של שני זני Pseudomonas aeruginosa , כלומר PAO1 ו-PA14. למרות ש-P. aeruginosa PAO1 ו-PA14 הם שניהם זני ייחוס נפוצים במעבדה, זן PA14 מדביק חלק גדול יותר מהמארחים מצמחים ועד חסרי חוליות1. מרק החומרים התזונתיים של TSB הוא מדיום תרבית רב-שימושי עם 2.5 גרם לליטר גלוקוז כמקור פחמן, ומסוגל לגדל מגוון רחב של חיידקים בזכות הרכבו של קזאין ופפטונים סויה לחנקן אורגני ומלאי סוכר טבעי, וכן נתרן כלוריד לשמירה על שיווי משקל אוסמוטי2. לעומת זאת, מדיום ה-FAB המינימלי מנוסח בריכוזים מינימליים (הפחתה פי 50) של מקור פחמן יחיד, ברמות של 0.05 גרם לליטר כדי לחקור את דרישות הגדילה של חיידקים אנאירוביים. שני המתחמים PAO1 ו-PA14 נחשפו לזרימה חד-כיוונית ולמינרית, מה שגרם למתח גזירה נמוך בדפנות של 0.01 פסקל. ערך הגזירה הזה נמצא לעיתים קרובות במקומות שהתיישבו על ידי P. aeruginosa, כולל הברונכים של חולי סיסטיק פיברוזיס ומערכת העיכול. גידול הביופילם נמדד במשך תקופה של 24 שעות על ידי הערכת אחוז כיסוי שטח הפנים, עובי וממוצע אריתמטי של חספוס פני השטח בזמן אמת.

ביופילמים של P. aeruginosa אחראים לאחוז משמעותי מזיהומים נוזוקומיים ומהווים גורם מוביל למוות בקרב אנשים עם סיסטיק פיברוזיס 3,4,5. מחקרים קודמים על השפעת רמות מקור הפחמן על התפתחות ביופילם חיידקי הזניחו את התפקיד הקריטי של זרימת ההידרודינמית במהלך התפתחות הביופילם, השתמשו בערכי מאמץ גזירה שאינם מייצגים אתרי זיהום ב-P. aeruginosa, או ביצעו רק ניתוח קינטי ומורפולוגי של ביופילם לאחר הניסוי 6,7. מגבלות אלו מטופלות בשיטה זו באמצעות הדמיה בזמן אמת של התפתחות הביופילם, בתנאי זרימה במצב יציב בתוך ערוץ מיקרופלואידי המדמה במדויק סביבות פיזיולוגיות שנמצאות אצל חולי סיסטיק פיברוזיס.

שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות חלופיות המשמשות לחקר התפתחות ביופילם. יישום הדמיה בזמן אמת במהלך תקופת הצמיחה של 24 שעות הביופילם מבטיח שהביופילם המתפתח לא יופרע, שכן אין צורך בייבוש או שינויים כימיים, מה שמונע שינויים בהרכבו ומניב תוצאות מייצגות יותר מאשר שיטות שדורשותמניפולציה של דגימה. בנוסף, על ידי יישום תנאי זרימה הידרודינמיים יציבים ושינוי ריכוזי מקור הפחמן בעוצמה גדולה, הליך זה משחזר בצורה מדויקת יותר את הסביבות הפיזיולוגיות שנמצאות באתרים של זיהומי P. aeruginosa nosocomial. דבר זה הופך אותה לשיטה מייצגת יותר בהשוואה לשיטות המשתמשות בבדיקות סטטיות, כגון לוחות מיקרוטיטר של 96 בארות או קופונים, שאינם מצליחים ללכוד את ההשפעה הקריטית של זרימת נוזלים על התפתחות ביופילם 9,10,11.

המכשיר המיקרופלואידי שבו השתמשו נבחר במיוחד משום שממדיו דומים לחלקים בריאותיים, כמו ברונכיולות וברונכים12. יתרה מזאת, זיהומי P. aeruginosa מהווים דאגה מרכזית למטופלים עם פציעות כוויות חמורות, כאשר רמות הגלוקוז יכולות להשתנות משמעותית מהטווח התקיןשל המטופל 13,14.

בעוד שפרוטוקול זה עושה שימוש ספציפי בשני זנים של P. aeruginosa, השיטה רלוונטית גם לחקירות בשלב מוקדם של התפתחות חיידקים אחרים הגורמים לזיהומים או מתיישבים באזורים בתנאים דומים. בנוסף, ניתן גם לחקור הרכבים נוספים של מדיומים תזונתיים וכן תנאי זרימה (למשל, זרימות פועמות ומתנדנדות, או ערכי גזירה גבוהים יותר בדפנות) באמצעות אותה שיטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ניקוי כלי זכוכית

  1. טבלו שני בקבוקי זכוכית בנפח 200 מ"ל לשימוש כמדיה ואגר, ושלושה בקבוקי זכוכית של 1 ליטר באמבט חומצה כלורית (HCl) של 10% למשך כ-5 דקות בטמפרטורת החדר.
    אזהרה: חומצה כלורית היא קורוזיבית. בצע את כל הטיפול בחומצה עם מכסה אדים כימי תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על עיניים).
  2. לאחר מכן, הוציאו את כלי הזכוכית מאמבטיית ה-HCl ושטפו פעמיים במי ברז ופעם אחת במים מזוקקים (dH2O).

2. הכנת חומר למרק סויה טריפטי

  1. הכינו את תמיסת ה-TSB, שקלו 6 גרם ל-200 מ"ל אבקת TSB באמצעות סירת שקילה נקייה, ולשמור על איזון מדויק.
    הערה: הרכב אבקת ה-TSB המשמש הוא כדלקמן: דקסטרוז (2.5 גרם∙L-1), פוספט דיאשלגן (2.5 גרם L-1), עיכול לבלב של קזאין (17 גרם∙L-1), עיכול פפאי של קמח סויה (3.0 גרם∙L-1), ונתרן כלוריד (5.0 גרם∙L-1).
  2. מדוד 200 מ"ל dH2O באמצעות גליל מדידה ושפך אותו לאחד מבקבוקי הזכוכית שנוקו קודם.
  3. הוסיפו את 6 גרם TSB לבקבוק זכוכית נקי שמכיל 200 מ"ל dH2O, אטמו את הבקבוק היטב וערבבו במשך כ-2 דקות כדי להמיס את האבקה, וליצור את מדיום תמיסת TSB.
  4. אוטוקלב תמיסת מדיה TSB למשך 15–20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ולחץ של 1.5 אטמוספירה, כדי לחטא את התמיסה.
    הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן את תמיסת TSB בטמפרטורת החדר (כ-20 מעלות צלזיוס) בין השימושים ולהשתמש בה בניסויים עתידיים.

3. הכנת חומר ציר אנאירובי קפדנית

  1. הכינו תמיסת FAB Media למתכות עקבות.
    1. יש להשתמש בסירות שקילה נפרדות ונקיות ובמרית, ובאיזון מדויק בעת שקילת מסות בין 0.5–210 גרם, ובאיזון אנליטי בעת שקילת מסות בין 0.001–0.5 גרם. מדדו את הרכיבים הבאים ואת כמותיהם: CaSO4.2H 2O (200 mg∙L-1), FeSO 4.7H2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4.5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4.7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4.7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1),ו-H 3BO3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. הוסף כל רכיב לבקבוק זכוכית נקי בנפח 1 ליטר שמכיל 1 ליטר dH2O ומערבב היטב עם ה-dH2O.
    3. הוסיפו 1 מ"ל מהתערובת לכל אחד משני בקבוקי הזכוכית המעוטאים של 1 ליטר עם ליטר אחד של dH2O וערבבו היטב.
  2. הכינו 20 מ"מ תוספי נתרן ציטראט FAB לתרביות לילה
    1. מדוד את הרכיבים הבאים ואת כמויותיהם באמצעות סירות שקילה נפרדות ונקיות ומרית, איזון מדויק בעת שקילת מסות בין 0.5-200 גרם ואיזון אנליטי בעת שקילת מסות בין 0.001-0.5 גרם,: נתרן ציטראט (20 מ"מ), (NH4)2SO4 (2 גרם∙L-1), Na2HPO4.2H 2O (6 גרם∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) ו-CaCl2 (11 mg∙L-1) 7,9.
    2. הוסף את כל הרכיבים לאחד מבקבוקי הזכוכית המעוטרים הנותרים בנפח 1 ליטר המכיל 1 ליטר dH2O עם 1 מ״ל תמיסת מתכת עקבות.
    3. ערבב היטב.
  3. הכינו 0.3 מ"מ FAB עם תוספת גלוקוז לצמיחת ביופילם.
    1. החליפו את 20 המילימטר של נתרן ציטראט ב-0.3 מ״מ גלוקוז. השתמשו באותם רכיבים ומסות שצוינו בשלב 3.2.1.
    2. בבקבוק הזכוכית המנוקה שנותר בנפח 1 ליטר, הוסף את רכיבי ה-FAB של 0.3 מ״מ גלוקוז ל-1 מ״ל dH2O עם 1 מ״ל תמיסת מתכת עקבות וערבב היטב.
  4. אוטוקלב למשך 15-20 דקות בטמפרטורת קיטור של 121 מעלות צלזיוס ולחץ של 1.5 אטמוספירה, כדי לחטא את המדיה.
    הערה: (נקודת הפסקה) תמיסת מדיום FAB יכולה להיאחסן בטמפרטורת החדר (כ-20 מעלות צלזיוס) בין שימושים ולהשתמש בה בניסויים עתידיים.

4. הכנת אגר TSB

  1. מדדו 8 גרם ל-200 מ"ל של אגר TS באמצעות מאזן מדויק וסירות שקילה שוטפות ומרית.
  2. מדוד 1 גרם ל-200 מ"ל של אגר בדרגת בקטריולוגיה רוחבית, על סירת שקילה נפרדת, תוך שימוש באותו מאזן דיוק.
  3. באמצעות גליל מדידה, מדדו 200 מ"ל dH2O ושפכו אותם לבקבוק הזכוכית הסופי שכבר נוקה מראש.
  4. שפוך את שני רכיבי האגר לתוך 200 מ"ל של dH2O וערבב טוב.
  5. אוטוקלב למשך 15–20 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ולחץ של 1.5 אטמוספירה, כדי לחטא את המדיום.
    הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן אגר TSB בטמפרטורת החדר (כ-20 מעלות צלזיוס) בין שימושים ודורש חימום מחדש לפני השימוש בניסויים עתידיים.

5. גידול צלחת פטרי Pseudomonas aeruginosa

  1. המיס את האגר במיקרוגל למשך כ-5 דקות, או עד שהתמיסה נוזלית.
  2. פתח וחטא משטח ארון בטיחות מסוג II עם תמיסת אתנול של 70%, מוכן לשימוש. בצע את כל השלבים להלן בסעיף זה בתוך ארון הבטיחות מסוג Class II.
  3. מדוד 25 מ"ל תמיסת אגר לתוך בקבוקון של 50 מ"ל ושפוך לתוך צלחת פטרי של 90 מ"מ, וחכה שהאגר יתייצב.
  4. שלפו מלאי P . aeruginosa PAO1 ו-PA14 מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C. הניחו את המלאי באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-5 דקות, או עד שהתכולה מפשירה לחלוטין.
  5. טבלו את לולאת החיסון בתוך אחד מהמאגרים המופשרים של P. aeruginosa ופזרו את הדגימה על פני האגר.
  6. חזרו על שלב 5.5 לזן השני של P. aeruginosa , ויוצרים שתי תרביות נפרדות של צלחת פטרי של P. aeruginosa , אחת עם זן PAO1 והשנייה עם זן PA14.
  7. יש לסמן כל צלחת פטרי את הזן של P. aeruginosa שבתוכה, תאריך ההתחדשות וראשי התיבות שלו, ואז הניחו באינקובטור ל-16–18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: (נקודת הפסקה) צלחות פטרי P. aeruginosa PAO1 ו-PA14 יכולות להיאחסן בטמפרטורה של 4°C לתקופת אחסון של עד 4 שבועות ולשימוש בניסויים עתידיים.

6. מלאי גליצרול Pseudomonas aeruginosa PAO1 ו-PA14

  1. פתח וחיטוי ארון בטיחות מסוג II לשימוש, בחר שמונה בקבוקים בנפח 50 מ"ל כדי להכיל את התרביות הליליות.
  2. באמצעות מדיום ה-FAB של TSB ונתרן ציטראט (סעיף 3), שפכו 5 מ"ל מדיום TSB לארבעה מתוך שמונת הבקבוקים ואת מדיום ה-FAB המינימלי של נתרן ציטראט לארבעת הבקבוקים הנותרים.
  3. באמצעות צלחות פטרי שכבר היו מודגרות ולולאת חיסון, נוגע בחמש מושבות נפרדות בצלחת פטרי P. aeruginosa PAO1 והעבר לאחת מבקבוקי TSB. חזור על כך עבור מדיום הנתרן ציטראט FAB ולצלחת פטרי של זן P. aeruginosa PA14.
  4. טבלו לולאת חיסון נקייה ישירות לארבעת הבקבוקים הנותרים של TSB ו-sodium citrate FAB, ויוצרים את הבקרות.
  5. דגרו את כל שמונת הבקבוקים באינקובטור מנענע למשך 16–18 שעות ב-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס ותסמנו בבירור.
  6. השב את בקבוקי התרבית, וודא שהבקבוקים שמחוסנים ב-P. aeruginosa עכורים ושהבקבוקים המשמשים כבקרה נשארים נקיים.
  7. צנטריפוגה את ארבעת הבקבוקים המחוסנים ב-P. aeruginosa בעוצמה של 4000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי להפריד את P. aeruginosa ממדיית התרבות. ודא שהצנטריפוגה מאוזנת.
  8. התעלם מהסופרנטנט והחזיר את כדור P. aeruginosa לאחר הצנטריפוגה עם 1 מ"ל תמיסה המכילה 15% גליצרול, עם 150 מיקרוליטר גליצרול ו-850 מיקרוליטר TSB טרי או נתרן ציטראט FAB.
  9. העבר תרביות תלויות לבקבוקים של 1 מ"ל והנח במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: (נקודת הפסקה) מלאי גליצרול ניתן לאחסן בטמפרטורה של -80°C לאחסון ארוך טווח ולהשתמש בהם לניסויים עתידיים.

7. מדידת צפיפות אופטית של תרביות לילה

  1. חזרו על שלבים 6.1–6.5, עבור שני בקבוקי TSB בינוניים בלבד, כאשר אחד כבקרה והשני עם זן PAO1 P. aeruginosa .
  2. פיפט 1 מ"ל מדיום TSB לתוך בקבוקון ספקטרופוטומטר בנפח 1 מ"ל, בתוך ארון בטיחות מסוג II, והעבר 0.9 מ"ל מדיום TSB לבקבוקון השני, בתוספת 0.1 מ"ל של תרבית הלילה.
  3. כוון את הספקטרופוטומטר לאורך גל אור של 600 ננומטר, ובאמצעות בקבוקון ספקטרופוטומטר TSB בנפח 1 מ"ל לכיול המכונה, מדדו את הצפיפות האופטית של בקבוק ההתלייה של 0.1 מ"ל15.
    1. אם הספיגה הנמדדת אינה 0.1, יש לחשב מחדש את נפח המתלים הנדרש.
      הערה: נפח המתלה הנדרש להשגת קריאת ספיגה של 0.1 (V1) ניתן לחישוב באמצעות קריאת הספיגה הראשונית של בקבוק המתלה של 0.1 מ"ל, C 1, הספיגה הרצויה שהמתלה מכוון אליה, C2, ונפח המתלה המרוכז הרצוי, V2:
      C1V1 = C2V2
      בדוגמה למעלה, אם C1 = 3.59, C2 = 0.1 ו-V2 = 10 מ"ל, נפח המתלים הלילית הרצוי יהיה 0.279 מ"ל בתמיסה של 10 מ"ל.
  4. מדוד 10 מ"ל מדיום TSB לתוך בקבוקון של 50 מ"ל והסיר את אותו נפח של מדיום TSB כמו נפח המתלים הנדרש ליצירת מתלה של 10 מ"ל 0.1 OD 600 ננומטר. באמצעות תרבית הלילה, הוסף את נפח המתלים המחושב ואת המערבובת לכ-5 שניות לערבוב.
  5. העבר 1 מ"ל מהמתלה המותאם בנפח 10 מ"ל לבקבוק ספקטרופוטומטר ומדוד מחדש את הספיגה כדי לוודא שהיא 0.1.
  6. חזור על ה-7.1–7.5 לעיל עבור מדיום PA14 ו-TSB ועבור שני הזנים P. aeruginosa ועבור מדיום הנתרן ציטראט FAB.

8. ספירת תאים ברת קיימא

  1. העבר dH2O לצלחת פטרי מרובעת בתוך ארון בטיחות מסוג II והשתמש בפיפטה רב-ערוצית להעברת 180 מיקרו ליטר לעמודות 2–9 של לוח פוליסטירן שקוף עם 96 בארות16.
  2. העבר את מתלה 0.1 OD 600 בנפח 10 מ"ל לצלחת פטרי מרובעת נפרדת, ובאמצעות הפיפטה הרב-ערוצית, העבר 200 מיקרוליטר מהמתלה לעמודה 1 של לוח פוליסטירן עם 96 בארות.
  3. העבר מעל 20 מיקרוליטר של מתלים באמצעות הפיפטה הרב-ערוצית מעמודה 1 של לוח הפוליסטירן עם 96 בארות לערוץ 2, ולאחר מכן העברת 20 מיקרוליטר של מתלה מדולל בערוץ 2 לערוץ 3, וחזרה על הפעולה לערוץ 9, מה שיוצר דילול מתלים מ-10-1 ל-10-8.
  4. העבר 50 מ"ל אגר TS (סעיף 4 ושלב 5.1), בארון בטיחות מסוג II באמצעות בקבוקון, לתוך צלחת פטרי מרובעת והשאר עד שהאגר הופך לעכור.
  5. העבר 10 מיקרו-ליטר מכל אחת מהבארות לאורך עמודות 2–9 אל צלחת פטרי אגר של TS במבנה עמודות, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, כדי להבטיח שהעמודות לא ייגעו זו בזו.
  6. דגרו אגר TS למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לאחר המתנה עד שהדילול המועבר יירגע.
  7. חשב יחידות יוצרות מושבות (CFU) לכל מיליליטר (מ"ל) על ידי קביעת האם צלחת פטרי ניתנת לספירה (בין 30 ל-300 מושבות).
  8. קבעו את מקדם הדילול של המתלה בנפח 10 מ"ל; במקרה זה, המתלה דולל ל-1/10 (0.1 OD 600).
  9. חשב את גורמי הדילול האישיים של כל עמודה מצופה. זוהי כמות התלייה המדוללת שמוסיפה לכל עמודה חלקי הנפח הכולל של העמודה לאחר הוספת המתלוי. במקרה של עמודה 2 של לוח 96 בארות (עמודה 1 של צלחת פטרי), 20 מיקרוליטר/200 מיקרוליטר = 1/10.
  10. חשב את מקדם הדילול הכולל בסדרה על ידי הכפלת כל אחת מגורמי הדילול הבודדים של כל עמודה יחד.
    הערה: במקרה זה, מכיוון ש-20 מיקרוליטר הועברו מכל עמודה לעמודה הבאה, מה שהפך את הנפח הכולל של כל עמודה ל-200 מיקרוליטר, כל דילול בסדרה בודד היה 1/10. סך הדילול בסדרה הוא 1 × 10-8.
  11. קבעו את מקדם הדילול בציפוי כאשר הדילול מועבר מלוח 96 בארות לצלחת פטרי. כדי לקבוע CFU/mL, חלק את נפח כל עמוד מצופה (10 מיקרוליטר) ב-1 מ"ל. במקרה זה: figure-protocol-1.
  12. קבעו את מקדם הדילול הסופי על ידי הכפלת מקדם הדילול המקורי של המתלה (0.1) בגורם הדילול הסדרתי הכולל (1 × 10-8) ומקדם הדילול של הציפוי (figure-protocol-2).
  13. חשב את CFU∙mL-1 בדגימה המקורית, מכפיל את ה-CFU על הלוח בהפכי של מקדם הדילול הסופי.
    הערה: במקרה זה, אם נספרים 200 CFU, זה אומר ביצוע 200 × 1/1 × 10-8 , מה שגורם ל-CFU/ml להיות 2 × 1010 CFU∙mL-1 17.

9. הקמת מערכת מיקרופלואידית והרצה ניסיונית

  1. החרינו 5 מ"ל מרק של מדיום תרבית עם כל זן של P. aeruginosa ליצירת תרבית לילה ודגרו במשך 16–18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. הגדר את מערכת המיקרופלואידיק והתוכנה הנלווית.
    1. הפעל את רכיבי מערכת המיקרופלואיד בסדר הבא: ספק כוח, בקר מערכת מיקרופלואידית, מצלמת CMOS, מחממי מארז, מיקרוסקופ, מחשב ומוניטורים נלווים.
    2. הפעל את תוכנת המיקרופלואיד והתחל את ממשק מודול הבקרה הנלווה על ידי הזנת ברקוד 48 בארות 0–2 Pa המשויך ללוח רב-ערוצי כאשר מתבקשים, שנמצא בצד הפלטת הרב-ערוצית.
  3. קבעו פרוצדורת חיסון באר לוח רב-ערוצי של P. aeruginosa .
    1. כוון את הצפיפות האופטית של התרבית הלילית ל-0.1 OD600.
    2. להעביר 50 מיקרוליטר של מתלים 0.1 OD 600 אל תוך באר היציאה של כל אחד מששת הערוצים במקביל בתוך ארון בטיחות מסוג II.
      הערה: שישה ערוצים הופעלו במקביל בכל רגע נתון כדי למקסם את הסבירות לזיהוי תוצאה חריגה.
    3. החלף את כיסוי הלוח הרב-ערוצי בעל 48 בארות והעבר אותו לשלב הנייד הממוקם בתוך האינקובטור של המערכת ואבטח אותו.
  4. קבעו את פרוצדורת החיסון לתעלות לוח רב-ערוצי P. aeruginosa .
    1. זרע את תעלות המיקרופלואיד באמצעות מודול הבקרה של מערכת המיקרופלואידיק על ידי בחירה: עמודות ידניות > 1–4 > נוזל: TSB בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס > גזירה מקסימלית (Pa): 0.1 (1 דיין∙ס"מ-2 = 0.1 פסקל) ובחירת באר יציאה של דיאגרמת לוחות רב-ערוצית של 48 בארות 0–2 פסקל.
    2. בחר את כפתור הביטול כדי לעצור את הזרימה לאחר 2–4 שניות והשאיר את הפלטה למשך 30 דקות, כדי להבטיח שהתאים יתחברו למצע התעלה לפני תחילת הזרימה הרציפה.
      הערה: משך של 30 דקות מאפשר לכוח הכבידה לסייע בהדבקת חיידקי P. aeruginosa הפלנקטוניים לדופן התעלה התחתונה. הזמן הזה ישתנה בהתאם לחיידק ולסוג החומר התזונתי.
    3. הסר את הלוח הרב-ערוצי משלב האינקובטור הנייד והעבר 1 מ"ל של TSB טרי אל באר הכניסה של כל אחד מששת הערוצים בארון בטיחות מסוג II.
    4. העבר את הלוח הרב-ערוצי לשלב הנייד בתוך האינקובטור וקבע אותו במקומו.
  5. הגדר AutoRun.
    1. ודאו שהזרימה המשמשת במהלך 24 השעות רלוונטית למיקום P. aeruginosa בטבע, על ידי ניווט למאמץ גזירה ידני >: 0.01 פסקל, ורישום קצב הזרימה הנפח (μL⋅h-1) המוצג. ודא שערך זה, עבור לוח מיקרו-ערוץ עם 48 בארות, הוא 8.2 מיקרוליטר⋅h-1.
    2. המור את קצב הזרימה הנפחל-m 3∙s-1, חשב את שטח החתך של התעלה (m2), וקבע את מהירות הזרימה כאשר במתח גזירה הידרודינמי של 0.01 פסקל.
      הערה: על ידי שימוש וסידור מחדש של משוואת קצב זרימת נפח הנוזל, ניתן לחשב את מהירות הנוזל דרך התעלה:
      figure-protocol-3
      כאשר U היא מהירות הנוזל (m∙s-1) ו-A הוא שטח חתך המיקרו-ערוץ (m2) של התעלות בלוח הרב-ערוצי.
    3. חשב את מספר הזרימה של ריינולדס באמצעות הצפיפות, ρ והצמיגות הדינמית, μ, של תווך TSB, וודא שנמצא בטווח זרימת הנוזלים שבו נמצאים ביופילמים של P. aeruginosa . למאמץ גזירה הידרודינמי של 0.01 פסקול, יש לוודא שמספרי ריינולד הם 0.0117 ו-0.0165 עבור מדיום TSB ו-FAB, בהתאמה. אם זה מחוץ לטווח הזה, בדוק שתנאי הנוזל מוגדרים ל-TSB.
      figure-protocol-4
      כאשר Dh הוא הקוטר ההידראולי של התעלה המיקרו-שימושית, מתקבל באמצעות:
      figure-protocol-5
      כאשר w, ו-h מייצגים את הרוחב (m) והגובה (m) של המיקרו-ערוץ שבו משתמשים.
    4. חשב את אורך התפתחות הנוזל כדי להבטיח שזרימת הנוזל באזור רכישת התמונה מפותחת במלואה.
      הערה: אורך ההתפתחות של נוזל למינרי דרך תעלה ניתן לחישוב באמצעות מספר ריינולדס, Re, והקוטר ההידראולי של התעלות, Dh:
      Ldev = 0.06ReDh
    5. הגדר את הריצה האוטומטית: ערוך AutoRun > Protocol הגדרה > משך זמן: 24 שעות, עם חזרה של 1 ומתח גזירה של 0.01 Pa. שמור את הפרוטוקול.
    6. צור רצף חדש בלשונית Sequence Setup על ידי יישום הפרוטוקול החדש עם חזרה אחת, לערוצים 1–6 ובחר נוזל: TSB ב-37 °C. שמור את הרצף הזה.
  6. הגדר רכישת תמונות באמצעות חלון רכישת רב-ממדית .
    1. בחר ברכישה רב-ממדית באמצעות תוכנת המערכת, ואז בכפתור החיים (בפינה השמאלית התחתונה של חלון רכישה רב-ממדית ). ניווט בשלב המיקרוסקופ כדי לצפות בערוצים 1–6 באמצעות כפתור התצוגה החיה והגדלות מצלמה ב-5× עד 40× על מסך המגע של המיקרוסקופ, ומציג ערוץ אחד בשדה הראייה של המצלמה בכל פעם.
    2. הכינו את המצלמה לרכישת תמונה: רכישה רב-ממדית > שמירה: בחרו תיקייה לתמונות שיש לשמור עד > טיימלפס: משך: 24 שעות, אותו משך כמו זרימת ההידרודינמית > מרווח זמן: זמן בין כל תמונה שנרכשה, מוגדר ל-10 דקות.
    3. הזן את הגדרות המצלמה על ידי בחירת אורך גל > תאורה: שדה בהיר 50% מצלמה 50%: שחור-לבן > חשיפה אוטומטית: כל רכישה > רכישה: כל נקודת זמן > פוקוס אוטומטי: לעולם לא.
    4. קבעו את מיקום המצלמה ללכידת תמונות הביופילם על ידי הגדרת ההגדלה ל-20×, יצירת שדה ראייה במידות 665.6 מיקרון × 665.6 מיקרון, והעברו למרכז אזור הצפייה בערוץ, שם ייחרט מספר הערוץ במרכז.
    5. הוסף את מיקום הבמה כך שהמצלמה תיתפס, נווט ל-Stage , תייג את המיקום, ובחר את כפתור התוספת כדי להוסיף אותו לתיקייה.
      1. חזור על כך עבור נקודות מעלה הזרם 0.9984 מ"מ ונקודות במורד הזרם במרחק 3.0016 מ"מ מהכניסה של אזור הצפייה בערוץ, שם המיקום מייצג את נקודת האמצע של שדה הראייה של המצלמה.
        הערה: מיקומי ההדמיה הללו נבחרו כדי לספק ייצוגים של צמיחת ביופילם לאורך אזור הצפייה, תוך הבטחת פיתוח מלא של הזרימה בתוכו. כתוצאה מכך, שלוש תמונות נרכשות עבור כל מיקרו-ערוץ, ובמקרה זה מצולמות 18 תמונות כל 10 דקות.
  7. בצע ריצה ניסיונית
    1. בחלון מודול הבקרה של המערכת בחר AutoRun > Run Setup > Sequence: בחר את רצף 0.01 Pa שנוצר, ואז בחר התחל.
    2. מיד לאחר מכן, עברו לחלון הרכישה הרב-ממדית > Acquire. זה מתחיל ברכישת 18 התמונות כל 10 דקות במהלך הליך הניסוי של 24 שעות, ויוצר 2610 תמונות בסיום הניסוי.
      הערה: החלק לעיל שוחזר על פני שישה מיקרו-ערוצים נוספים כ-48 שעות לאחר הניסוי הראשוני עם תנאים זהים.

10. הצטברות מחסנית Z

  1. בסוף כל הרצה ניסיונית, בחר שלושה ערוצים וקבל ערימות z של שלושה חלקים לאורך התמונה בהגדלה של 40×, על ידי פתיחת הרכישה הרב-ממדית > Main: בטל את כל האפשרויות פרט לסדרת 'Z'.
  2. נווט לסדרת Z לאחר שקטע לאורך ערוץ נבחר בתוך רכישת רב-ממדית , משנה > הגדרות אינטראקטיביות: הסכמה: 0.5 והסר את סימון שתי התיביות.
  3. השתמש בכפתור המיקוד של המיקרוסקופ וסובב אותו רק עד שהביופילם יוצא מהפוקוס, והזן את מרחק ה-z על ידי בחירת 'Set Top To Current'. חזור על ההליך, אך על ידי סיבוב כפתור המיקוד בכיוון ההפוך ובחירת הגדרה לזרם. זה נותן למיקרוסקופ את הטווח ללכוד את ערימת ה-z.
  4. בחר תיקייה בתוך חלון השמירה כדי לשמור את ערימת ה-z, ובחר ב-Acquire בפינה הימנית התחתונה של החלון כדי להתחיל רכישה.

11. ניתוח תמונה ונתונים לאחר הניסוי

  1. קבל נתוני כיסוי שטח פנים בביופילם.
    1. טעין את התמונות שנרכשו לתוכנת המערכת על ידי בחירה: כלי ניתוח > סקירת נתונים רב-ממדיים > בחירת קובץ בסיס > בחירת תיקייה: לנווט ולבחור את התיקייה עם התמונות השמורות > View > Wavelength 1, ובחלק הריבועי המרכזי המציג אופקית את מספר התמונות שנאספו, לחץ קליק ימני על התיבה הקטנה והאפורה בחלק העליון, הפינה השמאלית.
    2. טען את התמונות של כל קטע ערוץ, אחת אחת, בחר מיקום במה: בחר את המיקום לצפייה > טעינת תמונה. שמור את סדרת התמונות כקובץ TIFF.
    3. סף את התמונה על ידי בחירת סף תמונה > סף אוטומטי לאובייקטים כהים המדגישים את הביופילם, ואז גבול את התמונה באמצעות כלי אזור מלבני .
      הערה: ניתן להזיז את הסליידר בצד שמאל של התמונה הספית כדי לשנות את עוצמת הסף ולהבדיל טוב יותר בין ביופילם לרקע. אם לתמונה יש צללים, גבול את החלק שלא, כי ייתכן שהצללים הודגשו כברירת מחדל, מה שישנה את ערכי המדידה.
    4. השגת נתונים על אחוז כיסוי שטח הפנים של הביופילם בתמונה במהלך ניסוי של 24 שעות על ידי בחירת מדידות MM Standard > Measure > Region Measures בחלון תוכנת המערכת ליצירת טבלת נתונים על הביופילם המודגש בתוך הגבול המלבני, כולל אחוז שטח הסף. בחר ב-Open Log כדי לפתוח ולשמור קובץ לוג, ו-F9: Log Data כדי להזין את הנתונים לקובץ הלוג.
    5. פתח גיליון אלקטרוני ובאמצעות נתוני הביופילם של 24 שעות לכל קטע ערוץ, צור גרף שמראה את כיסוי אחוזי שטח הביופילם לאורך 24 שעות.
  2. קבל עובי ביופילם ומחוספסות שטח ממוצעת אריתמטית.
    1. שמרתי את ערימת ה-z בפיג'י (ImageJ) על ידי גרירת קובץ השמור לסרגל הבקרה של פיג'י והמרת לתמונה 8-ביט: Image > Type > 8-ביט.
    2. הגבירו את הניגודיות בין הביופילם למשטח הערוץ כדי למנוע רעש לא רצוי: > תמונה > כוונן בהירות/ניגודיות.
    3. סף התמונה, הגדרת ערך הפיקסל של הביופילם ל-255 (לבן) וערך הפיקסל ברקע 0 (שחור): תמונה > כוון > סף.
    4. הגדר את קנה המידה של התמונה, ניתוח > הגדר קנה מידה > מרחק בפיקסלים: 2048 > מרחק ידוע: 332.8 > יחס גובה-רוחב פיקסלים: 1.0 > יחידת אורך: מיקרומטר.
      הערה: המרחק הידוע הוא 332.8 מיקרון, שכן למצלמת המאמאצו יש שדה ראייה של 2048 × 2048 פיקסלים, כאשר כל פיקסל בגודל 6.5 מיקרון והתמונות צולמו בהגדלה של 40 ×.
    5. נתחו את ערימת ה-Z באמצעות מאקרו18 מותאם אישית (קובץ משלים 1) שמחשב ומסכם את שטח הפנים של הביופילם על כל פרוסת z-stack ומשתמש בערכי קנה המידה הקלט כדי לחשב את עובי הסדרה, מה שמאפשר מציאת הנפח. חלופה נוספת היא למצוא את עובי הביופילם על ידי חלוקת הנפח המחושב בשטח הפנים.
    6. קבל את ערכי המשטח הממוצעים האריתמטיים של הביופילם מכל סדרת z על ידי הורדת תוסף SurfCharJ של ImageJ (לא Fiji) ושמור אותו בתיקיית התוספים .
    7. העלאת ה-z-stack ל-ImageJ על ידי גרירת המחסנית השמורה לסרגל הבקרה והמרתה לתמונה 32 ביט: Image > Type: 32 ביט.
    8. צור גרף שטח, המציג את השונות בערכים האפורים על פני השטח של המחסנית: ניתוח פרופיל > > עוד: גרף ברזולוציה גבוהה. המרו את גרף הרזולוציה הגבוהה ל-32 ביט.
    9. השגת ערך השטח הממוצע המחוספס האריתמטי על ידי הפעלת תוסף SurfCharJ: פלאגינים > SurfCharJ > חישוב חספוס: אורך דגימה ממוצע (): 10.
      הערה: תוסף SurfCharJ משתמש בערכים האפורים השונים לאורך פני השטח של ערימת ה-z כדי לחשב את החספוס הממוצע של פני השטח האריתמטית. תיופק טבלה המכילה פרמטרים של מחוספסות פני השטח, והפרמטר היחיד שמעניין הוא היחס האריתמטי למחוספסות פני השטח, Ra. ערכי הטבלה יצטרכו להיות מומרים למיקרומטר מפיקסלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה מפרט את התוצאות המייצגות בעת יישום הליך הפרוטוקול הנ״ל. כל הניסויים בוצעו עם לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, כל אחד מורכב משש ערוצים מקבילים, והנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ±. פסי השגיאה בכל הגרפים מייצגים סטיית תקן, כפי שמוגדרת באגדות האיור.

הגידול של מתחי PAO1 ו-PA14 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, במדיה TSB, ומתחת למתח גזירה הידרודינמי בקיר מתחת ל-0.01 פסקול לאורך תקופה של 24 שעות מוצגת באיור 1. התרשים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים הרבים שמרכיבים יחד את הפרוטוקול הזה מאפשרים ניתוח מקיף ומדויק יותר של היווצרות ביופילם מאשר שיטות חלופיות ומסורתיות יותר. מרכיב מרכזי הוא השימוש בלוח מיקרו-ערוץ עם 48 בארות, עם תעלות בקנה מידה מיקרו במידות 350 מיקרון × 70 מיקרון × 4 מ"מ (רוחב × H × L). ממדים אלו משחזרים במיוחד את תנאי הזרימה והמיקרו-סביבות שנמצאות בבתי חולים, כגון קטטרים לשתן או סימפונות הריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס 12,21,22,23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לבית הספר להנדסה מכנית, אווירונאוטית ואזרחית (MAC) באוניברסיטת שפילד על המימון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(NH4)2SO4אקרוס אורגניקס7783-20-2למדיום FAB מותאם
פלטת מיקרו-ערוץ 48 באר 0-2 Pa - כיסוי זכוכיתמיקרוסיסטמות תאים910-0047-5Packמיקרו-תעלות לזרימת מדיה וצמיחת ביופילם
עם דימות בזמן אמת
-80 ו-deg; מקפיא Cתרמו פישר סיינטיפיק1.16057E+15לאחסון מלאי גליצרול עד לשימוש נוסף
אגר, דרגת בקטריולוגיהאקרוס אורגניקס443570010ללוחות אגר - גידול חיידקים
איזון אנליטיVWRVWRI611-2297למדוד רכיבי מדיה בשימוש
אוטוקלאבפריורקלייב4304לחיטוי כלי זכוכית
BioFlux 1000HTI & L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000HT-
shear-flow-system/ 		לניסויים בזרימת מיקרו-תעלה וביופילם
מודול בקרה של BioFluxI & L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
Microsystems/device/BioFlux-1000HT- shear-flow-system/ 		להקים ולנטר את זרימת המדיה וצמיחת הביופילם בתוך המיקרו-תעלות
תוכנת מונטאז' ביופלקסI & L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		להקים ולנטר את זרימת המדיה וצמיחת הביופילם בתוך המיקרו-תעלות
CaCl2פישר סיינטיפיק10043-52-4למדיום FAB מותאם
CaSO4.2H2OChemCruzA1719לפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
לוח פוליסטירן שקוף עם 96 בארותקורנינג, קוסטארCLS7007לספירת תאים ברת קיימא
CoSO4.7H2Oסיגמא-אלדריץ'10026-24-1לפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
CuSO4.5H2Oהוניוול209198-100Gלפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
צינורות אפנדורף 3810Xאפנדורף30125150עבור מלאי גליצרול של P. aeruginosa
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005Eלפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
פיג'י (ImageJ)המכונים הלאומיים לבריאותhttps://imagej.net/software/fiji/downloa
DS		עיבוד תמונות ב-Z-stack
גלוקוזסיגמא-אלדריץ'50-99-7עבור מדיום FAB מותאם לגלוקוז
גליצרולסיגמא-אלדריץ'56-81-5עבור מלאי גליצרול של P. aeruginosa
H3BO3פישר סיינטיפיק10043-35-3לפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 מצלמה דגם C11440-
42U		המאמאצוC11440-42Uלצורך זרימת מיקרו-ערוץ וצמיחת ביופילם
ניסוי דימות בזמן אמת
KH2PO4פישר ביוריאגנטים7778-77-04למדיום FAB מותאם
רוח מתילציהסיגמא-אלדריץ'2857לניקוי ארון מיקרוביולוגיה לפני ואחרי<בר/>
MgCl2סיגמא-אלדריץ'M8266-100Gלמדיום FAB מותאם
ארון מיקרוביולוגיה דרגה IIתרמו פישר סיינטיפיק42111226לביצוע שלבי הפרוטוקול בלי
מזהם חיידקים, מרק או אגר
מיני אינקובטורלבנט אינטרנשיונלSN03171014להפשיר PAO1 ו-PA14 אחרי -80 ו-deg; מקפיא C ו
לצמיחה ראשונית של 24 שעות ללוח אגר חיידקי
MnSO4. H2Oסיגמא-אלדריץ'10034-96-5לפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
Na2HPO4.2H2Oסיגמא-אלדריץ'10102-40-6למדיום FAB מותאם
NaClסיגמא-אלדריץ'S5886-500Gלמדיום FAB מותאם
NaMoO4. H2Oסיגמא-אלדריץ'10102-40-6לפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר
איזון מדויקVWRVWRI611-2299למדוד רכיבי מדיה בשימוש
צנטריפוגה מקוררתהראוס40289841הפרדת תרבית P. aeruginosa מ-
סופרנטנט למלאי גליצרול
קובטות חצי-מיקרומעבדות אלפאX72053למדידות צפיפות אופטית
חממת רעידהINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- שייקרים/סטנדרט מולטיטרוןלתרבויות לילה
נתרן ציטראטסיגמא-אלדריץ'71498-250Gעבור נתרן ציטראט עם מדיום FAB מותאם
לולאות חיסון סטריליות מפלסטיקמיקרוספקט15782105עבור P. aeruginosa, חיסון PAO1 ו-PA14 ללוחות אגר וצינורות בז
טריפטית סויה אגר, ווגיטונהמיליפור14432-500G-Fללוחות אגר - גידול חיידקים
ציר סויה טריפטיסיגמא-אלדריץ'T8907מדיום תרבית מיובש - 6 גרם ל-200 מ"ל
מפזר מים מסוג 1תרמו פישר סיינטיפיקSN42103311למים מטושטשים
ZnSO4.7H2Oפישר סיינטיפיק7446-20-0לפתרון מתכת מינימלי של 1 ליטר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
  2. T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from: https://www.merckmillipore.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/275/615/t8907dat.pdf (2018).
  3. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 7 (2), 277-281 (2001).
  4. Pseudomonas Aeruginosa - Biofilm Formation, Infections and Treatments. , IntechOpen. (2021).
  5. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A Review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  6. She, P., et al. Effects of exogenous glucose on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. MicrobiologyOpen. 8 (12), e933(2019).
  7. Klausen, M., et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. Mol Microbiol. 48 (6), 1511-1524 (2003).
  8. Preda, V. G., Săndulescu, O. Communication is the key: biofilms, quorum sensing, formation and prevention. Discoveries (Craiova). 7 (3), e100(2019).
  9. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  10. Seneviratne, C. J., Yip, J. W. Y., Chang, J. W. W., Zhang, C. F., Samaranayake, L. P. Effect of culture media and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis. Arch Oral Biol. 58 (10), 1327-1334 (2013).
  11. Rajewska, M., Maciąg, T., Narajczyk, M., Jafra, S. Carbon source and substrate surface affect biofilm formation by the plant-associated bacterium Pseudomonas donghuensis P482. Int J Mol Sci. 25 (15), 8351(2024).
  12. Goswami, S., Dey, C. COVID-19 and SARS-CoV-2: The Science and Clinical Application of Conventional and Complementary Treatments. , CRC Press. Boca Raton. (2022).
  13. Jeschke, M. G. Clinical review: Glucose control in severely burned patients - current best practice. Crit Care. 17 (4), 232(2013).
  14. Badoiu, S. C., et al. Glucose metabolism in burns—What happens. Int J Mol Sci. 22 (10), 5159(2021).
  15. Wacogne, B., et al. Concentration vs. optical density of ESKAPEE bacteria: A method to determine the optimum measurement wavelength. Sensors. 24 (24), 8160(2024).
  16. Meyer, C. T., et al. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nat Microbiol. 8 (12), 2304-2314 (2023).
  17. Allen, T. Serial Dilution Problem Help. , The University of Vermont. Available from: https://www.uvm.edu/~btessman/calc/serhelp.html (2012).
  18. Blog Post: Loading and Measurement of Volumes in 3D Confocal Image Stacks with ImageJ. , VISIKOL. Available from: https://visikol.com/blog/2018/11/29/blog-post-loading-and-measurement-of-volumes-in-3d-confocal-image-stacks-with-imagej/ (2024).
  19. Kasetty, S., Katharios-Lanwermeyer, S., O'Toole, G. A., Nadell, C. D. Differential surface competition and biofilm invasion strategies of Pseudomonas aeruginosa PA14 and PAO1. J Bacteriol. 203 (22), e0026521(2021).
  20. Shen, Y. Role of biofilm roughness and hydrodynamic conditions in Legionella pneumophila adhesion to and detachment from simulated drinking water biofilms. Environ Sci Technol. 49 (7), 4274-4282 (2015).
  21. Sankari, A., Sharma, S. Cystic Fibrosis. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  22. Cameron, K., Jarvis, K. Urinary Catheterisation for Adults Clinical Guideline. , Available from: https://www.rightdecisions.scot.nhs.uk/media/2210/urinary-catheterisation-adultsfinal.pdf (2022).
  23. IV access improvement project guidelines: choosing catheter sizes. , Children's Hospital of Philadelphia. Available from: https://www.chop.edu/clinical-pathway/iv-access-improvement-project-guidelines-choosing-catheter-sizes (2017).
  24. Casadevall, A., Fang, F. C. Reproducible science. Infect Immun. 78 (12), 4972-4975 (2010).
  25. Sutlief, A. L., et al. Live cell analysis of shear stress on Pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system. J Vis Exp. (143), e58926(2019).
  26. Shear Flow BioFlux Plates. , Cell Microsystems. Available from: https://cellmicrosystems.com/wp-content/uploads/2024/09/BioFlux-Brochure_v6-Single-page.pdf (2024).
  27. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Med Princ Pract. 28, 28-35 (2019).
  28. Jahid, I. K., Lee, N. -Y., Kim, A., Ha, S. -D. Influence of glucose concentrations on biofilm formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J Food Prot. 76 (2), 239-247 (2013).
  29. De Plano, L. M., Caratozzolo, M., Conoci, S., Guglielmino, S. P. P., Franco, D. Impact of nutrient starvation on biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: An analysis of growth, adhesion, and spatial distribution. Antibiotics. 13 (10), 987(2024).
  30. Tan, X., et al. Alkaline phosphatase LapA regulates quorum sensing-mediated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 under phosphate depletion stress. Microbiol Spectr. 11 (6), e0206023(2023).
  31. Quan, K., et al. Water in bacterial biofilms: pores and channels, storage and transport functions. Crit Rev Microbiol. 48 (3), 283-302 (2022).
  32. Green, A. S. Modelling of peak-flow wall shear stress in major airways of the lung. J Biomech. 37 (5), 661-667 (2004).
  33. Lee, K., Han, J. Analysis of the urine flow characteristics inside catheters for intermittent catheter selection. Sci Rep. 14, 13273(2024).
  34. Wang, C., et al. Carbon starvation induces the expression of PprB-regulated genes in Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 85 (22), e01705-e01719 (2019).
  35. Sarinas, P. S. A., et al. Inspiratory flow rate and dynamic lung function in cystic fibrosis and chronic obstructive lung diseases. Chest. 114 (4), 988-992 (1998).
  36. Franca, M. J., Valero, D., Liu, X. Turbulence and Rivers. Treatise on Geomorphology. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  37. Shroder, J. F. Treatise on Geomorphology. , Elsevier Science & Technology. San Diego. (2022).
  38. Narciso, D. A. C., Pereira, A., Dias, N. O., Melo, L. F., Martins, F. G. Characterization of biofilm structure and properties via processing of 2D optical coherence tomography images in BISCAP. Bioinformatics. 38 (6), 1708-1715 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים