בדיקת ממוספירה חושפת גבעול מושרה על ידי API 5 בקווי תאים אפיתליים של השד שאינם גידוליים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השיטה להקמת מבחן היווצרות הממוספירה לחקר גזע סרטן שנגרם על ידי מעכב אפופטוזיס 5 (Api5) בתאי אפיתל שד שאינם גידוליים. ליזטים שנאספו מממוספירות דור ראשוני מנותחים לסמנים שונים של גבעול כדי להעריך את השראת תכונות דמויות תאי גזע.

תקציר

סרטן השד נותר הסרטן השכיח ביותר בקרב נשים ברחבי העולם, עם שיעורי השכחה והתמותה הגבוהים ביותר לפי גיל. למרות ההתקדמות בטיפולים המיועדים לסרטן השד, 20% מהמטופלות מציגות הישנות של המחלה, דבר שניתן לייחס לאוכלוסיית תאי גזע סרטניים עמידים לטיפול (CSCs). CSCs אלו יכולים לשרוד טיפולים קונבנציונליים על ידי הישארות בשלב שקט או להישאר בשל כריתה לא מלאה של גוש הגידול, מה שמוביל להישנות בשלב מאוחר יותר. לכן, מחקרים עדכניים התמקדו בזיהוי, בידוד ומיקוד באוכלוסיית תאים עמידה זו. במבחנה, בדיקת יצירת הממוספירה משמשת כמערכת תרבית תלת-ממדית חזקה להעשיר ולהתרבות תאי גזע דמויי גזע בתוך אוכלוסיות אפיתל השד. כאן אנו מציגים גישה המשתמשת במבחן הממוספירה להערכת הפנוטיפ הדמוי תאי גזע של סרטן המאפשר בתאי אפיתל שד שאינם גידוליים על ידי ביטוי יתר של מעכב אפופטוזיס 5 (Api5). הפרוטוקול כולל הפצת ממוספירות דרך מעברים סדרתיים כדי להעריך את יעילות היווצרות הממוספירה ואת יכולת ההתחדשות העצמית. בנוסף, ליזאטים של חלבונים שנאספים מממוספירות נבדקים לסמנים מבוססים של גבעול באמצעות אימונובלוטינג. בדיקה זו מאפשרת חקירה של רגולטורים חדשים, כגון Api5, של תכונות דמויות תאי גזע סרטניים באוכלוסיות תאי אפיתל בשד. הגישה המתוארת ניתנת להתאמה למחקרים השוואתיים של התערבויות מולקולריות או לסינון סוכנים טיפוליים המכוונים ל-CSCs במבחנה.

מבוא

העלייה במספר סרטן השד העמיד לכימותרפיה הובילה לדגש גובר על זיהוי ומיקוד הגורם הבסיסי לעמידות לטיפול ולהישנות, אוכלוסיית תאי סרטן הידועים כתאי גזע סרטניים. תאים אלו מאופיינים ביכולתם להתחמק מהבחנה ולהישאר שקטים, מה שמאפשר להם לעמוד בפני שיטות טיפול שונות^{בסרטן 1,2}. ניתן להשתמש במספר שיטות לזיהוי תאי גזע של סרטן השד, כולל בדיקת יצירת הממוספירה ^3,4,5, מיון תאים על פי סמני פני התא ^6,7, בידוד על פי תכונות פליטה, בדיקות גידול in vivo ⁷, והערכת מודולטורים גרעיניים של תאי גזע כגון Oct4⁸, Nanog⁹, Sox2¹⁰ ו-BMI¹¹. בדרך כלל, זיהוי ובידוד תאי גזע סרטניים כולל שילוב של אחת או יותר מהגישות הללו.

מעכב אפופטוזיס 5 (Api5) הוא חלבון אנטי-אפופטוטי שנמצא כמשתפר במספר סוגי סרטן, כולל סרטן השד ^12,13,14, סרטן צוואר הרחם 15,16,17, לוקמיה לימפואידית כרונית של תאי B¹⁸, וסרטן ריאות לא קטן ¹⁹. רמות גבוהות של Api5 נמצאו קשורות לעמידות לכימותרפיה בסרטן צוואר^{הרחם 16} ולסרטן השד הטריפל-שלילי¹². ישנן עדויות גוברות לכך שעמידות וחזרה לטיפול מונעות לעיתים קרובות^{על ידי תאי} גזע סרטניים^. מחקר מעניין של סונג ואח^' גילה כי ביטוי יתר של Api5 בתאי סרטן צוואר הרחם גורם לרמות ננוג גבוהות, מה שתורם להגברת גזע הסרטן. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו הראו כי ביטוי יתר של Api5 מוביל לטרנספורמציה של תאי אפיתל שד שלא-גידוליים שגדלו בתרביות תלת-ממדיות הנתמכות על ידי Matrigel. תאים שעברו טרנספורמציה אלו מציגים קוטביות מופרעת, הגברת התתרבות, גדילה בלתי תלויה בעיגון, ופנוטיפ חלקי מאפיתל למזנכימלי (EMT). השינויים הפנוטיפיים שנצפו לאחר ביטוי יתר של Api5 בתרביות תלת-ממדיות נשמרו לאחר פירוק הספרואידים לתרביות חד-שכבתיות¹⁴. בהינתן ש-Api5 מווסת בסרטן שד משולש העמיד לכימותרפיה, אנו משערים ש-Api5 עשוי גם לווסת את תכונות הגזע הסרטני בתאי אפיתל בשד.

בהקשר זה, אנו מתארים את מבחן היווצרות הממוספירה לזיהוי תאי גזע סרטניים מתאי אפיתל שד תלת-ממדיים לא גידוליים שהשתנו על ידי ביטוי יתר של Api5, ואחריו בדיקת Western Bloting לסמנים של תאי גזע לאישור זהות התאים הללו. בדיקת הממוספירה כוללת תרבית תאי אפיתל בשד בתנאים שאינם דבקים ולא מתמיינים, מה שמאפשר העשרת תאי גזע/אב במבנים תלת-ממדיים הנקראים ממוספירות. תאי אפיתל בשד שאינם בעלי תכונות דמויות גזע עוברים בדרך כלל אנואיקיס; עם זאת, תאים בעלי מאפיינים דמויי גזע יוצרים ממוספירות ^4,5. שיטה זו פותחה במקור על ידי דונטו ואח'³ והיא בהשראת מבחן הנוירוספירה, המשמשת לחקר וזיהוי תאי גזע עצביים ואבותיהם²³. מבחן הממוספירה המתוארת כאן מאפשר הערכה של פעילות תאי גזע ויכולת ההתחדשות העצמית במדיה מינימלית המושלמת עם B27 ללא ויטמין A וגורם גדילה אפידרמלי אנושי (EGF) רקומביננטי. תאים תלת-ממדיים מנופצים מבוטאים יתר של Api5 מוזרעים בדליל על לוחות מצופים Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA). זה מאפשר לתאים לגדול בתנאים שאינם דבקים, כך שכל ממוספירה עוקבת היא ממקור קלוני. הממוספירות מורשות לגדול עד היום השביעי, ולאחר מכן מחושבת יעילות היווצרות הממוספירה. כדי להבחין בין תאי גזע אמיתיים לתאי גזע שאינם תאי גזע שמאבדים את יכולת ההתרבות שלהם עם הזמן, מתבצעים דורות נוספים של יצירת הממוספירה. מעבר סדרתי של ממוספירות כולל פירוק הכדורים שנאספו מהיצירה הראשונית וציפוי מחדש של התאים הבודדים ליצירת ממוספירות מדור משניות (ואחריו). זה קובע האם התאים יכולים להתחיל יצירת כדורים שוב ושוב והוא נמדד כיכולת ההתחדשות העצמית של התאים⁵.

שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי תאי גזע של סרטן השד בתאי אפיתל גידוליים או שעברו טרנספורמה. השיטה ניתנת גם להתאמה לבידוד תאי גזע של סרטן השד מדגימות מטופלות. המערכת יכולה לסייע בזיהוי מטרות חדשות נגד תאי גזע לסרטן השד שעשויים להיות קשורים לעמידות לכימותרפיה.

פרוטוקול

1. ציפוי לוחות תרבית רקמה ב-Poly(2 -hydroxyethyl methacrylate), pHEMA

1. המיס 1.2 גרם pHEMA (משקל מולקולרי ̴ 300,000) ב-100 מ"ל של 95% אתנול על ידי ערבוב מתמשך בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס להכנת תמיסת pHEMA של 1.2% (ראו טבלת חומרים).
2. ציפוי לוחות תרבית רקמה סטנדרטיים ב-pHEMA על ידי מריחת 1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות. נפח תמיסת ה-pHEMA ניתן לכוונון בהתאם לגודל כלי תרבית הרקמה.
3. אפשר לצלחות להתייבש בתנור בטמפרטורה של 40°C בתנאים סטריליים.
4. חשפו את הלוחות לאור UV למשך 15 דקות, ואחריהם שלושה שטיפות עם תמיסת מלח מפוזרת-פוספט (DPBS) של דולבקו, לפני השימוש בהן להכנת בדיקת היווצרות הממוספירה.

2. זריעת ממוספרות מהדור הראשוני

1. תרבית תאי MCF10A מפורקים בתלת-ממד (הבעה יתר של Control ו-Api5) שהושגו על ידי פירוק יום 16 של תרביות תלת-ממד במדיום גדילה¹⁴.
   הערה: הרכב מדיום הגידול: רמות רמות גבוהות של סוכר DMEM ללא פירובאט נתרן בתוספת 5% סרום סוס, 10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושי (EGF), 100 ng/mL רעלן כולרה, ו-200 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים).
2. הסר את המדיום המשומש, שטוף את התאים ב-1 מ"ל DPBS, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין-אדטה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנור לחות עם 5%_CO2 למשך 12-15 דקות עד שכל התאים מתפרצים.
3. לאחר שכל התאים משתחררים, הוסף 2 מ"ל של מדיום תלייה מחדש כדי לנטרל את פעילות הטריפסין וסובב את תליית התא ב-112 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הרכב מדיום ההשעיה מחדש: רמת רמות גבוהות של סוכר DMEM ללא פירובט נתרן בתוספת 20% סרום סוס, ו-200 יחידות למ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
4. שאיפת הסופרנטנט והשתה מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של תווך ממוספירה. מעביר את מתלה התא דרך מחט 25 G כדי לקבל מתלה חד-תאים.
   הערה: הרכב מדיום הממוספירה: DMEM/F12 עם תוספת של 20 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי (EGF), תוסף B27 אחד × ללא ויטמין A, ו-200 יחידות/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ( ראו טבלת חומרים).
5. באמצעות המוציטומטר, ספרו את מספר התאים ומחשבו את נפח ההשעיה התאית הנדרש לזריעה של 0.2 ×-^10-4 תאים בכל באר.
   הערה: לשמור על צפיפות זריעה נמוכה כדי לקבוע במדויק את יעילות היווצרות הממוספירה, ובכך למזער את השפעת הצטברות התאים. כאשר אוספים ליזאטים של חלבון לאימונובלוטינג, ניתן להגדיל את צפיפות התאים עד 2.5 ×-^10-5 תאים בכל באר.
6. מדלל את נפח המתלים התאים הנדרש ב-2 מ"ל של מדיום ממוספירה וזרע בכל באר של פלטת 6 בארות. תאי זרע בשלושה עותקים לכל מצב.
7. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%_CO2 למשך 7 ימים.
8. לאחר שבעה ימים בתרבית, יש לספור ידנית את מספר הממוספרות בקוטר העולה על 50 מיקרון בכל באר, באמצעות מיקרוסקופ מצויד בגרטיקול או באמצעות רשת רבעים תחת מיקרוסקופ אור.
9. דמיינו את הממוספירות באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 20.
10. חשב את יעילות היווצרות הממוספירה (MFE) באמצעות הנוסחה^{הבאה 5}
     

3. זריעת ממוספירות מדור משני

1. אסוף את הממוספירות שנוצרו בדור הראשון בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שאפו את הסופרנאנט, והשאירו מאחור את כדור הממוספירה.
3. שטוף את הכדור עם DPBS.
4. הוסיפו 200 מיקרוליטר 0.05% טריפסין-EDTA לגלגור הממוספירה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%_CO2 למשך 2-3 דקות. העבירו את הממוספירות בתמיסת הטריפסין דרך מחט 25 G שלוש פעמים כדי לקבל תלייה חד-תאית.
5. הוסיפו 0.5 מ"ל מדיום תלייה מחדש כדי לנטרל את פעילות הטריפסין וסובבו את תליית התא ב-112 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שאופי את הסופרנטנט והשלים מחדש את כדור התא ב-0.5 מ"ל של מדיום ממוספרה.
7. באמצעות המוציטומטר, סופרים את מספר התאים ומחשבים את נפח ההשעיה התאית הנדרש לזריעת 0.2 ×-^10-4 תאים לבאר.
   הערה: לשמור על צפיפות תאים נמוכה כדי להעריך את יכולת ההתחדשות העצמית, ובכך למזער את השפעת הצטברות התאים.
8. מדלל את נפח המתלים התאים הנדרש ב-2 מ"ל של מדיום ממוספירה וזרע בכל באר של פלטת 6 בארות. תאי זרע בשלושה עותקים לכל מצב.
9. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5%_CO2 למשך 7 ימים.
10. לאחר 7 ימים בתרבית, ספרו את מספר הממוספירות בקוטר מעל 50 מיקרון בכל צלחת באמצעות מיקרוסקופ המצויד בגרטיקול או רשת רבעים.
11. דמיינו את הממוספירות באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 20.
12. חשב את קיבולת החידוש העצמי באמצעות הנוסחה^{הבאה 5}
    

4. בלטינג מערבי לזיהוי שינויים בסמני פלוריפוטנטיות בעקבות ביטוי יתר של Api5

1. אסוף את הממוספירות שנוצרו בדור הראשון בצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שאפו את הסופרנאנט, והשאירו מאחור את כדור הממוספירה.
3. שטוף את הכדור עם DPBS.
4. לאסוף את הכדור בבופר קר של RIPA כדי לקבל את החלבון ליזאט ולבצע אימונובלוטינג לפי הפרוטוקול הסטנדרטי²⁴.
   הערה: הרכב בופר RIPA: 50 מ"מ טריס-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 1% טריטון X-100, 0.5% נתרן דה-אוקסיכולט, 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS), 1 מ"מ אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA), 1 מ"מ פנילמתיסולפוניל פלואוריד (PMSF), 10 מ"מ פלואוריד נתרן (1 מ"מ נתרן, 1 מ"מ נתרן אורתובנדט).
5. בדיקה לסמני גבעול - Oct3/4, Nanog, Sox2 ו-Bmi1, ובקרת עומס GAPDH (ראו טבלת חומרים לדילול נוגדנים).
6. כמת את רמות החלבון באמצעות ניתוח צפיפות ב-ImageJ. בחר את אזור העניין בתמונות Western Blot ויצר פרופיל צפיפות לכל נתיב.
7. נרמול הצפיפות היחסית של החלבון המעניין לאלו של GAPDH עבור כל נתיב. חשב את שינוי הקיפול עבור כל חלבון.
8. שרטט את שינוי הקיפול ברמות החלבון באמצעות כל תוכנת גרוטינג.

תוצאות

כדי להעריך את יעילות היווצרות הממוספירה בתנאים שאינם דבקים, הוזרעו תאי בקרה ותאי MCF10A תלת-ממדיים מפורקים ב-Api5 על לוחות מצופים פולי-HEMA בהתאם לפרוטוקול. תאים בעלי ביטוי יתר של Api5 הראו עלייה פי 1.58 ביעילות היווצרות הממוספירה הממוצעת לעומת תאי הביקורת (איור 1B,C). עלייה זו מראה כי ביטוי גבוה יותר של Api5 מגדיל את שיעור האבות הדמויי תאי גזע ששורדים ומתרבים בתנאים שאינם דבקים וחסרי סרום, מה שמוביל להיווצרות כדורים שמקורם בקלון.

הממוספירות הראשו...

דיון

בעוד שתרביות חד-שכבתיות של קווי תאי סרטן מבוססים או תאים שמקורם בגידול מספקות תובנות לגבי המסלולים המולקולריים השונים המווסתים את הפנוטיפים של סרטן, מחקר המתמקד בתאי גזע סרטניים אינו ניתן לבצע בתרביות דו-ממדיות. מכיוון שתאי גזע סרטניים נחשבים לגורם מרכזי להישנות לאחר אסטרטגיות טיפול עדכניות, יש צורך להקים בדיקות חזקות לחקר תאים אלו ^1,20,21. למרות שהבדיקה האמינה ביותר לחקר פעילות תאי גזע סרטניים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% Trypsin EDTA	Invitrogen	25300062
37 °C humidified incubator	New Brunswick	Galaxy 170 R
Anti-Bmi1 Rabbit pAb	ABclonal	A13472	1:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C
Anti-GAPDH antibody	Sigma	G9545-200UL	1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature
Anti-Nanog Rabbit mAb	ABclonal	A22625	1:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C
Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)	Santa Cruz	sc-5279	1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C
Anti-Sox2 Antibody (E-4)	Santa Cruz	sc-365823	1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	Invitrogen	12587010
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R
Cholera toxin	Sigma	C8052-1MG	1 mg/mL stock in dH2O
DMEM/F12	Thermo	11330032
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14190-144
Epidermal growth factor (EGF)	Sigma	E9644-0.2MG	100 mg/mL stock in dH2O
Ethanol absolute 99.9%	Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany	58051 L05
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	SRL	43272
High glucose DMEM without sodium pyruvate	Invitrogen	11965126
Horse Serum	Invitrogen	16050122
Hydrochloric acid (HCl)	Qualigens	Q29145	Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)
Hydrocortisone	Sigma	H0888	1 mg/mL stock in ethanol
ImageJ			Image processing software
ImageQuant LAS 4000	Cytiva
Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate	Merck	WBKLS0500
Insulin	Sigma	I1882	10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid
Nikon Eclipse TS-100 microscope	Nikon	BM-1919
MCF10A cells			Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E
Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)	Sigma	78830-5G
Plotting software	GraphPad Prism 10
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)	Santacruz	sc-253284	1.2% pHEMA in 95% ethanol
Sodium chloride (NaCl)	SRL	41721
Sodium deoxycholate	Amresco	0613-100G
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	SRL	54468
Sodium fluoride (NaF)	HiMedia	RM1081-500G
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508-10G
Tris buffer	SRL	71033
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML