הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העברה תוך-אפית של פוליפלקסי mRNA באמצעות אירוסולים של פריקת ריילי: שיטה במבחנה לשקיעת אף ובדיקות פונקציונליות

746 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70000

⸱

20 בינואר 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג את פירוק ריילי כתהליך קל לאירוסול וקטורי mRNA שאינם ויראליים. השקיעה אזורית עבור וקטורי mRNA אירוסוליים מוערכת על ידי מודל כניסת האף האידיאלית של אלברטה (AINI). ביטוי חלבון פלואורסצנציה ירוק (GFP) בתאי ריאה אנושיים מייצג שמירה על תפקודים פיזיקוכימיים וביולוגיים של וקטורי mRNA לאחר אירוסול.

תקציר

מתן תרופות mRNA דרך האף הוא אסטרטגיה מבטיחה לחיסונים ולטיפול במחלות נשימה, ומציעה הפעלה חיסונית ישירה באתר כניסת הפתוגן. עם זאת, שיטות אירוסוליזציה קונבנציונליות (למשל, נבולייזרים אולטרסוניים או בלחץ גבוה) משחיתה וקטורי mRNA לא-ויראליים עקב כוחות גזירה מופרזים, וגורמות ל-mRNA לאבד את שלמותם המבנית ואת פעילותם הביולוגית. נעשה שימוש באטומייזר אף לשבירת ריילי כדי לערבב בעדינות וקטורי פוליאתילנאמין (PEI)-mRNA לטיפות אחידות. mRNA מקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) נוסח לפוליפלקסים קטיוניים ואופיין לפני ואחרי אירוסוליזציה. תהליך פירוק ריילי יוצר מיקרו-סילון רציף של טיפות עם גזירה מינימלית, ובכך שומר על התכונות הפיזיקוכימיות של הננו-חלקיקים. נצפו גודל חלקיקים עקבי, מדד פולידיפרסיות נמוך ופוטנציאל זטה יציב לפני ואחרי האירוסוליזציה, מה שאישר כי התכונות הפיזיקוכימיות של פוליפלקסי mRNA נשמרו היטב באמצעות פירוק ריילי לאירוסוליזציה. באמצעות מודל של כניסת האף האידיאלית של אלברטה (AINI) של נתיב האוויר האף, סופקו אירוסולים של PEI-mRNA. ה-mRNA האירוסולי הושקעו בעיקר באזורים הטורבינה. נמצאו שברים זניחים בנזופרינקס או בחלקים המקבילים בריאות. בנוסף, פוליפלקסי mRNA לאחר אירוסול הועברו בהצלחה לתאי אפיתל ריאה אנושיים A549 ויצרו ביטוי GFP שניתן לזיהוי. פרוטוקול זה מדגים שיטת העברת mRNA תוך-אף לא הרסנית באמצעות אירוסוליזציה של פריקת ריילי. הוא שומר ביעילות על התכונות הפיזיקוכימיות והתפקודים הביולוגיים של וקטורי mRNA שאינם ויראליים, ומפרק את השלב המימי לטיפות בגודל מתאים להצטברות אף ממוקדת. פרוטוקול זה חושף גישה חדשנית לאירוסוליזציה יעילה של mRNA ולהערכת השקיעה האזורית שלהם בחלל האף.

מבוא

העברת חיסונים לריר האף (הפורטל למספר פתוגנים נשימתיים) יכולה לעורר חיסון מקומי חזק ולחסום זיהומים במקורם. הצלחת חיסוני השפעת התוך-אף והאישור האחרון של חיסוני COVID-19 תוך-אף מדגישים את יעילות המסלול האףי בגרימת תגובות חיסוניות ריריות ומערכתיות כאחד. אספקת חיסוני mRNA דרך האף מושכת עניין רב כאסטרטגיה למניעת זיהומים ויראליים בדרכי הנשימה. אתגר טכני מרכזי, עם זאת, הוא להמיר פוליפלקסים שבריריים של mRNA לאירוסול שניתן לשאוף, מבלי לפגוע ביציבותם.

אירוסוליזציה בשבירת ריילי מציעה חלופה עדינה בכך שהיא פועלת על עיקרון פיזיקלי שונה. במכשיר פירוק של ריילי, זרם נוזלי בלחץ נדחף דרך פתח בקנה מידה מיקרו ליצירת מיקרו-סילון רציף. הסילון נשבר באופן טבעי לטיפות בגודל אחיד בגלל חוסר היציבות של פלטו-ריילי2. מתח הפנים גורם לעמודת הנוזל להתפצל באורך גל אופייני בערך כפול מקוטר הפיה. בניגוד לנבוליזציה אולטרסונית, תהליך זה כמעט ואינו יוצר גזירה טורבולנטית; הטיפות נוצרות באופן טבעי מחוסר היציבות העצמית של הסילון, לא מכוחות שבירה חיצוניים. כתוצאה מכך, נוסחאות ננו-חלקיקים חוות לחץ מינימלי. הוכח כי שימוש בפירוק ריילי יכול לאירוסול mRNA של ננו-חלקיקי ליפידים (LNP) ללא שינוי משמעותי בגודלם, במטען פני השטח או ביעילות הכיסוי לפני ואחרי הריסוס 3,4,5. בשיטה זו, ה-PEI-mRNA נשאר שלם ומתפקד לאחר האירוסוליזציה, בניגוד להידרדרות שנראתה בטכניקות נבוליזציה קשות יותר.

יתרון נוסף של פירוק ריילי הוא השליטה בגודל הטיפות. הטיפות שנוצרות הן יחסית גדולות (בסדר גודל של 20-30 מיקרון). גודל הטיפה הזה אידיאלי להעברה דרך האף: חלקיקים בקוטר אווירודינמי >10 מיקרון נוטים לשקוע באף ובדרכי האוויר העליונות במקום לסטות לריאות3. על ידי ייצור טיפות בעיקר מעל סף זה, אטומייזר ריילי מכוון באופן טבעי לשקיעה בחלל האף. המיקוד משתפר עוד יותר באמצעות מודל ה-AINI האידיאלי של אלברטה (AINI) לאופטימיזציה של טכניקות הטיפול. ה-AINI הוא העתק של דרכי האוויר האףיות בהדפסה תלת-ממדית שחוזה במדויק דפוסי שקיעת תרסיס ב-vivo 6. באמצעות מודל זה, נמצא כי ריסוס בזווית של 45° לתוך הנחיר מגדיל במידה רבה את השקיעה בטורבינות7. זווית הניהול משפיעה משמעותית על דפוס ההפקדה7. הצטברות באזורים לא מטרה כמו האף או הריאות אינה רצויה, שכן היא עלולה לגרום לגירוי בגרון, טעם רעאו תופעות לוואי מערכתיות. בפרוטוקול זה, התנאים הללו שוכפלו (זווית ריסוס של 45° וזרימת אוויר מבוקרת בשאיפה) כדי למקסם את ההפקדה בטורבינות של תרסיס mRNA3. נתונים קודמים מראים שיותר ממחצית ממסת ה-mRNA המועברת יכולה להתמקד באזור הטורבינה בתנאים אופטימליים, בעוד ש-<10% מגיעים לנאזופרינקס או מעברל-3. אספקה ממוקדת זו צפויה לשפר את יעילות החיסון על ידי ריכוז המנה באתרים האינדוקטיביים של החיסון (שהם בעלי כלי דם ועשירים בתאי חיסון, ובמקביל מזעור הצטברות מחוץ למטרה שעלולה לגרום לבזבוז או תופעות לוואי).

במאמר זה מתוארת בפירוט ההליך הניסיוני לאירוסוליזציה של mRNA באמצעות פירוק ריילי, תוך הערכת הפקדות אזוריות במודל AINI, והערכת הפעילות הביולוגית של mRNA שהופקד במבחנה. mRNA מדווח המקודד GFP משמש להמחשת תוצאות טרנספקציה בתאים אנושיים. HEK293T תאים נבחרים כדי לבדוק את תפקוד הקומפלקסים האירוסוליים. כדי להגביר את קליטת ה-mRNA האירוסולי בתנאי מבחנה, ה-mRNA מתפצל עם PEI ליצירת פוליפלקסים של PEI-mRNA לפני שהוספתם לתאים. PEI הוא סוכן טרנספקציה פולימרי קטיוני שיכול לשפר את יעילות העברת ה-mRNA, ויחס מולר N:P (חנקן-פוספט) של 24:1 שימש כאן בהתבסס על אופטימיזציה קודמת להעברת גנים. PEI משמש רק לשלב אימות תרבית התאים במחקר זה ואינו חלק מהעברת האירוסולים לאף אמיתי (ב-vivo מסתמכים רק על LNP-mRNA, אך בתרבות תאים זה מסייע למקסם את ביטוי הגנים לזיהוי).

פרוטוקול זה מדגיש גישה חדשה למתן חיסון mRNA תוך-אף, המתמודדת עם בעיית היציבות של mRNA אירוסול. פירוק ריילי יושם רק לאחרונה להעברת חומצות גרעין בכמה מחקרים 3,4,5,9, ועבודה זו מספקת מדריך מתודולוגי מפורט ליישום טכניקה זו. על ידי ביצוע הליך שלב אחר שלב, חוקרים יכולים לשחזר את האירוסוליזציה העדינה של ננו-נשאי mRNA ולהעריך את מאפייני השקיעה והטרנספקציה שלהם. סעיף הפרוטוקול להלן מאורגן לחלקים עוקבים: (1) ניסוח PEI-mRNA; (2) אפיון ננו-חלקיקים (גודל ופוטנציאל זטה) לפני ואחרי אירוסוליזציה; (3) הפעלת אטומייזר פירוק Rayleigh והליך ההפקדה האנזלית AINI. שיקולים מרכזיים להצלחה, כגון שמירה על תנאים ללא RNase ויישור תקין של המכשירים, מצוינים. התוצאות והדיונים כוללים תוצאות מייצגות, יתרונות השיטה על פני גישות קונבנציונליות, יישומים פוטנציאליים (למשל, חיסוני אף לשפעת או COVID-19 10,11,12), וכן מגבלות וטיפים לפתרון תקלות. המתודולוגיה המקיפה הזו שואפת לאפשר ניסויי העברת mRNA תוך-אף ניתנים לשחזור ולהאיץ את פיתוח חיסוני RNA רירית ללא מחטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: תרבית HEK293T וקווי תאים A549 במדיום מלא הכולל את Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-2% פניצילין-סטרפטומיצין לפני העברת PEI-mRNA. עברו את שני קווי התאים בערך כל 48 שעות בהגעה לנקודת המפגש (CONNECT). תאי זרע בצפיפות של 40,000 תאים לסמ"ר ותרבות למשך ~48 שעות. הסר את מדיום התרבית ושוטף תאים עם סליין מפופר פוספט (PBS) מיד לפני ההעברה כדי להסיר סרום שאריתי וליישר תנאי טרנספקציה. אוטוקלב לכל בקבוקי תרביות התאים, לוחות 24 בארים, PBS, פיפטות וקצות פיפטות לפני השימוש.

1. ניסוח PEI-mRNA

  1. יצירת קומפלקסים של PEI-mRNA (לטרנספקציה במבחנה )
    הערה: שלב זה נדרש רק אם משתמשים ב-PEI להגברת טרנספקציה בתרבות תאים.
    1. חשב את כמות ה-PEI הנדרשת עבור יחס מולרי N:P הרצוי.
      הערה: נעשה שימוש ב-N:P = 24 (כלומר 24 מולים של אמינים טעונים חיובית לכל מול של פוספטים טעונים שלילית על mRNA); וכמות של 10 מיקרוגרם mRNA תדרוש ~31 מיקרוגרם PEI כדי ליצור PEI-mRNA ביחס N/P זה.
    2. הכינו תמיסת PEI מדוללת (למשל, מלאי של 1 מ"ג/מ"ל במים) ומאוטוקלבות.
    3. דילל את ה-mRNA לריכוז מתאים (למשל, 0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר).
    4. הוסף את תמיסת PEI לתמיסת ה-mRNA תוך ערבוב עדין (אל תבצע וורטקס).
      הערה: התערובת עשויה להיות בצינור קטן; תן פיפטה למעלה ולמטה בזהירות או תנענע את הצינור לערבוב.
    5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך ~20 דקות כדי לאפשר קישור אלקטרוסטטי של PEI ל-mRNA.
      הערה: אם לא משתמשים ב-PEI, ה-mRNA העירום יכול להיות מתריס ישירות. ה-PEI הנוסף שיפר משמעותית את ביטוי הגנים בתאי A549, אך הוא אופציונלי וייתכן שלא ישמש למשלוח בפועל ב-vivo בשל שיקולי רעילות.

2. אפיון ננו-חלקיקים (גודל ופוטנציאל זטה)

הערה: הגדר את פרמטרי המדידה בתוכנה ושמור כמשיטה לפני השימוש באנלייזר למדידת גודל או פוטנציאל זטה. הגדרת השיטה נדרשת להפעלת המכשיר, והפרמטרים תלויים בסביבת המדידה, בקובטה שבה השתמשו ותכונות הדגימה.

  1. פיזור אור דינמי (DLS) לפני אירוסוליזציה
    1. באמצעות מנתח גודל חלקיקים, טעינו דגימה מדוללת של הנוסחה לקובטה חד-פעמית (למשל, 500 מיקרוליטר ב-0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר).
    2. הפעל את האנלייזר ופתח את התוכנה13 במחשב המחובר.
    3. לחצו על כפתור המדידה בראש החלון.
    4. לחצו על סמל הקובץ הכחול בראש החלון כדי לבחור את שיטת גודל ההגדרה המוקדמת.
    5. שנה את שם הפרוטוקול כך שיתאים לשם הדגימה.
    6. לחץ על כפתור המכסה של האנלייזר כדי לפתוח את החדר.
    7. הכנס את הקובטה לתא המים.
    8. לחצו על כפתור הריצה הירוק בראש חלון התוכנה. חכה שהמדידה תסתיים13.
    9. לחץ על כפתור הניתוח בראש חלון התוכנה, ואז לחץ על כפתור הגודל בעמודהתוצאות 13.
    10. קבל את קוטר ההידרודינמי הממוצע (Z-average) ואת מדד הפולידיפרסיות (PDI) מטבלת הסטטיסטיקה.
    11. לחץ על כפתור המכסה של האנלייזר כדי לפתוח את החדר, להסיר את הקובט ולסגור את המכסה.
    12. השליכו את הקובט ושוטפים את האטומייזר במים ללא RNAase ועם 70% v/v אתנול לחיטוי ולהקל על הייבוש בין מדידות הגודל.
      הערה: עבור האטומייזר של ריילי, ודא שלא יישארו משקעים או שאריות מלח בפיה, שכן אלה עלולים להשפיע על ביצועי הריסוס.
  2. פוטנציאל זטה לפני אירוסוליזציה
    1. השתמש באותו מכשיר (או מנתח פוטנציאל זטה), טעין דגימה מדוללת של הנוסחה לתא נימי מקופל (למשל, 700 מיקרוליטר ב-0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר).
    2. הפעל את האנלייזר ופתח את התוכנה13 במחשב המחובר.
    3. לחצו על כפתור המדידה בראש החלון.
    4. לחץ על סמל הקובץ הכחול בראש החלון כדי לבחור את שיטת זטה המוגדרת מראש.
    5. שנה את שם הפרוטוקול כך שיתאים לשם הדגימה.
    6. לחץ על כפתור המכסה של האנלייזר כדי לפתוח את החדר.
    7. הכנס את הקובטה לתא המים.
    8. לחצו על כפתור הריצה הירוק בראש חלון התוכנה. חכה למכונה שפועלת13.
    9. לחץ על כפתור הניתוח בראש חלון התוכנה, ואז לחץ על כפתור זטה בעמודהתוצאות 13.
    10. השגת פוטנציאל הזטה (מטען פני השטח) על ידי התבוננות בטבלת הסטטיסטיקה.
    11. לחץ על כפתור המכסה של האנלייזר כדי לפתוח את התא, להוציא את הדגימה ולסגור את המכסה.
    12. שטוף את הקובטה ואת האטומייזר במים ללא RNAase ועם 70% v/v אתנול כדי לחטא ולהקל על הייבוש בין מדידות פוטנציאל זטה.
      הערה: עבור האטומייזר של ריילי, ודא שלא יישארו משקעים או שאריות מלח בפיה, שכן אלה עלולים להשפיע על ביצועי הריסוס.

3. אירוסוליזציה ושבירת ריילי ושקיעת אף

  1. מערכת אטומייזר ו-AINI
    1. הרכיבו את מכשיר האטומייזר האף Rayleigh Breakup ואת מודל ה-AINI (Alberta Idealized Nasal Inlet).
      הערה: מודל ה-AINI מורכב מחתכים חלולים מייצגים אנטומית התואמים לאזורים שונים בחלל האף האנושי (למשל, וסטיבול הנחירי, אזור הטורבינה, אזור הריח, הנזופרינקס).
    2. ודאו שכל רכיבי ה-AINI נקיים ויבשים לפני השימוש (שאריות עלולות לשנות את תוצאות ההשקעה). נקה על ידי שטיפה עם מים דה-יוניים9 ואז עם אתנול או ממס אורגני.
    3. חבר את ה-AINI למפגע דור הבא (NGI) שמחובר למשאבת ואקום ביציאה כדי למשוך זרימת אוויר דרך המעברים האףיים.
    4. הגדר את קצב הזרימה ל-7.5 ליטר לדקה - זרימה המייצגת שאיפה אפית איטית ועמוקה אצלבוגר 6. השתמש במד זרימה מכויל (או רוטמטר) שמחובר ליציאת האינדוקציה של NGI. כוון את המשאבה עד שמד הזרימה מראה 7.5 ליטר לדקה.
      הערה: השתמש במד זרימה כדי למדוד את זרימת האוויר בקצב הזרימה הנדרש לבדיקה.
    5. שמור על זרימת האוויר הזו לאורך כל תקופת הריסוס. השתמש ב-Parafilm כדי לאטום את המכשיר כראוי ל-AINI.
  2. מיקום האטומייזר
    1. הכנס את פיית האטומייזר של ריילי לתוך פתח הנחיר של AINI (קטע הווסטיבול) בזווית של 45°.
    2. אבטח את האטומייזר כך שלא יזוז במהלך הפעולה (כל החיבורים, מקטעי הדגם, הצינורות למשאבה) אטומים לאוויר.
  3. טעינת הדגימה
    1. ערבבו בעדינות את מתלה PEI-mRNA המוכן כדי להבטיח הומוגניות (להימנע מיצירת בועות).
    2. משוך את הדגימה למאגר האטומייזר.
      הערה: בהתאם לעיצוב המכשיר, זה עשוי לכלול מילוי מזרק או קצה פיפטה שמתחבר לאטומייזר (atomizer).
    3. טען את הדגימה למכשיר.
      הערה: לדוגמה, הסר פקק או תא מרכזי באטומייזר, הכניס את הדגימה בפיפטה פנימה, ואז הרכיב מחדש את המכשיר בצורה מאובטחת. ודא שאין דליפות ושהמכשיר מוכן כראוי אם יש צורך.
  4. יצירת האירוסול
    1. הפעל את זרימת האוויר (7.5 ליטר לדקה דרך ה-AINI) של משאבת האוויר לפני או במקביל להתחלת הריסוס, לפי הוראות המכשיר.
    2. הפעל את האטומייזר לפירוק ריילי כדי להתחיל באירוסוליזציה.
      הערה: עבור אטומייזר ידני המונע על ידי מזרק, לחץ בהדרגה על הבוכנה כדי לדחוף את הנוזל דרך הפתח. רסס את כל נפח הדגימה במכה רציפה אם אפשר. יש ללחוץ על הבוכנה בצורה חלקה כדי ליצור לחץ פעולה יציב, שכן הפורמולה מתפרצת רק לאחר שמופעלת בלחץ מוגבר וחשופה לקצב גזירה בקיר בתוך המיקרו-אוריפיס14. תנועות בומפה מהירות משנות את הלחץ ולכן משנות הן את קצב הגזירה והן את זמן החשיפה לגזירה14.
    3. ודאו שקצב הזרימה נשאר על 7.5 ליטר לדקה לאורך כל הדרך. טיפות האירוסול צריכות לעבור דרך מודל מעבר האף ולהושקע באזורים שונים בהתאם לגודל האווירודינמי שלהן.
    4. כבה את משאבת האוויר במהירות כדי למנוע מהטיפות שכבר שוקעו להיגרר למטה או להתייבש בצורה לא אחידה.
  5. איסוף דגימות מ-AINI
    1. פירקו בזהירות את מודל AINI למקטעים אנטומיים בודדים כדי לאסוף ננו-חלקיקים שהופקדו מכל אזור.
      הערה: לפני הפירוק, יש לציין או לסמן את הכיוון כדי לעקוב אחרי החלקים.
    2. איסוף משקעים משישה תאים: (i) מכשיר האטומייזטור, (ii) חתך הוסטיבול האף, (iii) החלק הטורבינתי, (iv) אזור הריח, (v) חתך הנזופרינקס, ו-(vi) כל לכידה במורד הזרם (למשל, שלבים של NGI מחובר או מסנן סופי המייצג חלק חודר ריאות)
    3. לכל תא, השתמשו בנפח מדוד של מדיום תרבית תאים כדי לשטוף את החומר שהצטבר.
      הערה: לדוגמה, כדי לאסוף את הפקדת הטורבינה, יש לנתק את חלק הטורבינות ולשטוף היטב את פניו הפנימיים עם 5 מ"ל של Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, באמצעות פיפטה חד-פעמית. שטפו בעדינות את כל המשטחים, ואז שפכו את השטיפה לצינור צנטריפוגה מתויג בנפח 15 מ"ל (השתמשו במשפך כדי לסייע בהעברה). במהלך השטיפה, הקטע הוחזק אופקית או מעט מוטה כדי להבטיח מגע מלא עם פני השטח תוך מניעת דליפת נוזלים. חזור על הפעולה באופן דומה עבור הווסטיבול, הריח, הנזופרינקס וכל אזור אחר, תוך שימוש ב-5 מ"ל DMEM טרי לכל אחד ואיסוף לצינורות מסומנים נפרדים.
    4. לשחזר כל דגימה שנותרה ממכשיר האטומייזר.
      הערה: לסוג מזרק, שטוף את המזרק והפיה לתוך צינור.
    5. שלפו את הנוזל משלב ה-NGI (פוגע קסקדה) אם ה-AINI היה מחובר ל-NGI כדי ללכוד חלקיקים דקים (למשל, על ידי שטיפת השלבים ב-DMEM).
    6. סגרו את הצינור עם הנוזל שנאסף.
      הערה: הימנעו מאובדן טיפות על משטחי ספסל או באמצעות אידוי.
  6. טיפול לאחר איסוף
    1. מיד לאחר האיסוף, דגימות ה-PEI-mRNA הונחו בנפרד על תאים לצורך טרנספקציה.
      הערה: ניתן להשאיר את דגימות ה-PEI-mRNA במקרר למשך ~1-2 שעות (עד 6 שעות מקסימום) לפני השימוש בהן לטרנספקציה. נפח מסוים (מקסימום 1 מ"ל) נמשך מכל דגימת PEI-mRNA שנאספה לצורך אפיון הווקטורים שלאחר האירוסול (כלומר, מדידות DLS וזטה).
  7. ניקוי המכשיר
    1. נקה היטב את האטומייזר ואת מודל ה-AINI לאחר כל הרצה כדי למנוע זיהום צולב בניסויים הבאים.
    2. שטוף את כל חלקי ה-AINI וחלקי האטומייזר במים דה-יוניים להסרת מדיה וננו-חלקיקים, ואז עם 70% אתנול לחיטוי והקלה על ייבוש.
      הערה: אם למכשיר או לדגם יש פתחים קטנים, שטפו אותם עם מזרק.
    3. ייבשו את כל החלקים לאוויר מלא (או הניחו בארון ייבוש בחום נמוך) לפני ההרכבה מחדש. עבור האטומייזר של ריילי, ודא שלא יישארו משקעים או שאריות מלח בפיה, שכן אלה עלולים להשפיע על ביצועי הריסוס.

4. הדמיית תאים

הערה: לאחר הטרנספקציה, הסר את מדיום הטרנספקציה והחליפו במדיום מלא טרי לסיום החשיפה. תרבית תאים למשך 48 שעות כדי לאפשר ביטוי מדווח והתאוששות תאים. ב-~80% קונגפלונס, מקבע תאים עם פורמלדהיד 4% למשך 8 דקות, ואז צביע גרעיני 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI; 300 ננומטר) למשך 5 דקות ואחריו שטיפה של PBS פעמיים לפני ההדמיה.

  1. הדמיית פלואורסצנציה
    1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מערכות פילטרים ל-DAPI ו-GFP.
    2. התחילו עם ערוץ הכחול (אורך גל עירור = 385 ננומטר, אורך גל פליטה = 477.5 ננומטר) כדי להמחיש גרעינים מוצבעים ב-DAPI.
    3. עבור לערוץ הירוק (אורך גל עירור = 488 ננומטר, אורך גל פליטה = 525 ננומטר) כדי להמחיש תאים חיוביים ל-GFP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ככתב יד ממוקד בשיטות, תוצאות מפורטות אינן המטרה העיקרית; עם זאת, מוצגים ממצאים מייצגים כדי להמחיש את התוצאות הצפויות של כל חלק בפרוטוקול. האיורים המוזכרים להלן מציגים נתוני דוגמה (כגון גרפים או תמונות) התומכים בתוקף השיטה, אך לא נכללו ניתוחים כמותיים חדשים מעבר להדגמה.

גודל הטיפה ודפוס ההפקדה:
אטומייזר השבירה של ריילי שמר על התכונות הפיזיקוכימיות של פוליפלקסי ה-mRNA, עם הבדלים קלים בין מדידות לפני ואחרי האירוסוליזציה כפי שמוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, לפני אירוסול הנוסחה, ה-mRNA מסועף עם PEI כדי לשפר את קליטת התאי. זה משמש כתחליף להעברת LNP-mRNA במהלך אימות חוץ גופי 10,15. PEI-mRNA שומר על רוב הפונקציות של נוסחאות LNP, כולל מאפיינים ביולוגיים ותפקודייםחשובים 10. קבוצות האמינים החיובית ב-PEI נקשרות mRNA שלילי דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות, ויוצרות הרכבות ננומטריות קטנות מ-200 ננומטר. עיבוי PEI-mRNA יציב מספיק כדי להעביר תאים ולהיות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים הכירו בתמיכה הכספית ממלגת המחקר לתואר ראשון של קינגס (KURF) ומקרן ההזדמנויות לסטודנטים שמספקת קינגס קולג' לונדון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה של 50 מ"לחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מCLS430829-500EA
50– 1000 & mu; קצות פיפטה Lחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מZ740031-1000EA
קו התאים A549אוסף תרבות הטיפוס האמריקאיתATCC CRM-CCL-185
מד זרימת אווירלא זמיןלא זמיןניתן להשתמש במד זרימת אוויר כללי.
מודל כניסת האף האידיאלית של אלברטה (AINI)TSI Incorporated (דרך קופלי סיינטיפיק, בריטניה)0001-01-8540
סרט אינדיקטור אוטוקלאבחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מZ744090
DAPIחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מD1306
DMEM (הנשר הבינוני המותאם של דולבקו)גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק11966025
אלכוהול אתילי, טהורחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מ32221-Mנרכש דרך מרק
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיקA5256701
פורמלדהידחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מF8775
HEK293T קו תאיםאוסף תרבות הטיפוס האמריקאיתATCC CRL-3216
ארון הבטיחות הביולוגית Heraeus HERAsafe HS 12הראוסלא זמין
הדור הבא של ImpactorMSPs, חטיבה של TSI0170-01-1000מוצר זה מופיע גם בקטלוג קופלי, מספר חלק 5201.
מצלמת מיקרוסקופ מונוכרום Nikon DS-Qi2ניקוןלא זמין
מנות מרובות מעובדות טופלו בתרבות תאים של Nuncתרמו פישר סיינטיפיק142475
Nunc EasYFlask עם תרבית תאים מטופליםתרמו פישר סיינטיפיק156340
פאראפילםחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מP7793-1EA
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)גיבקו, תרמו פישר סיינטיפיק15140148
טבליות מלח עם מאגר פוספט (PBS)תרמו פישר סיינטיפיק18912014
פוליאתילנימין הידרוכלורידחברת סיגמא-אלדריץ' בע"מ764965-1Gנרכש דרך SLS
אטומייזר אף של ריילי ג'טרסיקה BV אנשדהמתאם תרסיס אף רך
מים חופשיים מ-RNAseתרמו פישר סיינטיפיקJ60610. EQC
גודל קובטהמלוורן אנליטיZEN0040
התא הקפילרי המקופלמלוורן אנליטיDTS1070
Zetasizer Proמלוורן אנליטיZetasizer Pro
תוכנת Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorerמלוורן אנליטילא זמין

מקורות

  1. Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
  2. Van Hoeve, W., et al. Breakup of diminutive Rayleigh jets. Phys Fluids. 22 (12), (2010).
  3. Li, H. Y., et al. Targeted nasal delivery of LNP-mRNAs aerosolised by Rayleigh breakup technology. Int J Pharm. 672, 125335(2025).
  4. He, P., et al. Rayleigh-based soft mist inhalers preserve mRNA-LNP integrity for pulmonary delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 115, 107651(2026).
  5. Biesel, A., et al. Soft mist inhaler nebulization by Rayleigh-breakup largely preserves functional integrity of liposomal mRNA in respirable aerosols. Eur J Pharm Sci. 214, 107300(2025).
  6. Chen, J. Z., Finlay, W. H., Martin, A. In vitro regional deposition of nasal sprays in an idealized nasal inlet: comparison with in vivo gamma scintigraphy. Pharm Res. 39 (11), 3021-3028 (2022).
  7. Chen, J. Z., Kiaee, M., Martin, A. R., Finlay, W. H. In vitro assessment of an idealized nose for nasal spray testing: comparison with regional deposition in realistic nasal replicas. Int J Pharm. 582, 119341(2020).
  8. Hopke, P. K., Wang, Z. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. , Springer. US, Boston, MA. (2012).
  9. Wang, H., et al. Evaluation of Rayleigh jet atomizer for intranasal delivery of lipid nanoparticle-siRNA formulations: stability, deposition, and device performance. Int J Pharm. 683, 126084(2025).
  10. Moreno Herrero, J., et al. Compact polyethylenimine-complexed mRNA vaccines. Nat Nanotechnol. 20 (9), 1323-1331 (2025).
  11. Geall, A. J., et al. Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14604-14609 (2012).
  12. Xi, J., Lei, L. R., Zouzas, W., Si, X. A. Nasally inhaled therapeutics and vaccination for COVID-19: developments and challenges. MedComm. 2 (4), 569-586 (2021).
  13. Zetasizer Advance Series User Guide. , MAN0592-15-EN edn, Malvern Panalytical. (2023).
  14. Method of aerosolizing nanoparticle formulations. China patent. , CN116723892A (2023).
  15. Casper, J., et al. Polyethylenimine (PEI) in gene therapy: current status and clinical applications. J Control Release. 362, 667-691 (2023).
  16. Jin, Y., et al. A novel experimental approach to measure nebulized droplet deposition pattern and deposition fraction in an idealized mouth-to-throat model. Phys Fluids. 35 (8), (2023).
  17. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  18. Liu, J., et al. Turbinate-homing IgA-secreting cells originate in the nasal lymphoid tissues. Nature. 632 (8025), 637-646 (2024).
  19. Debus, H., Baumhof, P., Probst, J., Kissel, T. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: biophysical characterization and in vitro transfection properties. J Control Release. 148 (3), 334-343 (2010).
  20. Brandtzaeg, P. Potential of nasopharynx-associated lymphoid tissue for vaccine responses in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 183 (12), 1595-1604 (2011).
  21. Foley, R. A., et al. Lipid nanoparticles for the delivery of CRISPR/Cas9 machinery to enable site-specific integration of CFTR and mutation-agnostic disease rescue. bioRxiv. , (2025).
  22. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  23. D'Angelo, I., et al. Hybrid lipid/polymer nanoparticles for pulmonary delivery of siRNA: development and fate upon in vitro deposition on the human epithelial airway barrier. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 31 (3), 170-181 (2018).
  24. Movia, D., Bazou, D., Volkov, Y., Prina-Mello, A. Multilayered cultures of NSCLC cells grown at the air-liquid interface allow the efficacy testing of inhaled anti-cancer drugs. Sci Rep. 8 (1), 12920(2018).
  25. Waltl, E., Eckl-Dorna, J., Selb, R., Valenta, R., Niederberger, V. Characterisation and culture of primary human nasal epithelial cells and the influence of interferon-gamma. Clin Transl Allergy. 4 (2), P21(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

החדרה אינטראנזאלית של mRNAmRNA עם פוליאתילן-אימיןתאי A549כניסת האף של אלברטהביטוי GFPוקטורי mRNA לא-ויראלייםטרנספקציית mRNA בארסול
העברה תוך-אפית של פוליפלקסי mRNA באמצעות אירוסולים של פריקת ריילי: שיטה במבחנה לשקיעת אף ובדיקות פונקציונליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.