פיתוח ויישום של מודלים של בעלי חיים מפציעות עור הנגרמות מקרינה המבוססים על קרני β סטרונציום-90

Zhenguo Yang; Jiawei Song; Fenghao Geng; Shuai Qu; Bin Song; Xiaoqian Li; Yulu Gan; Daojiang Yu; Shuyu Zhang

doi:10.3791/70010

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיתוח ויישום של מודלים של בעלי חיים מפציעות עור הנגרמות מקרינה המבוססים על קרני β סטרונציום-90

437 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70010

⸱

27 בינואר 2026

Zhenguo Yang¹ , Jiawei Song¹ , Fenghao Geng² , Shuai Qu¹ , Bin Song³ , Xiaoqian Li¹ , Yulu Gan¹ , Daojiang Yu³ , Shuyu Zhang¹^,³^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Radiation Medicine, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, ²Precision Radiation in Oncology Key Laboratory of Sichuan Province, Radiotherapy Center, Sichuan Clinical Research Center for Cancer, Sichuan Cancer Hospital & Institute, Affiliated Cancer Hospital of University of Electronic Science and Technology of China, ³The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, China National Nuclear Corporation 416 Hospital, ⁴School of Medicine, Southwest University of Science and Technology, ⁵Transformation Foundation of Tianfu Jincheng Laboratory

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לקביעת מודלים בעלי חיים ניתנים לשחזור של פגיעות עור שנגרמו מקרינה באמצעות קרינת β סטרונציום-90 (⁹⁰Sr). פרוטוקול זה מאפשר חקירת השפעות מינון ותגובות דלקתיות בנזקי קרינה שטחיים, ומספק בסיס למחקרים מכניים עתידיים.

תקציר

פגיעת עור הנגרמת מקרינה היא סיבוך חמור הנפוץ במקרי חירום של תאונות גרעיניות או במקצועות הקשורים לקרינה, ומחייב הקמת מודלים סטנדרטיים של פציעות ממוקדי ספציפיות למחקר מכניסטי. צילומי גמא או רנטגן אנרגטיים קונבנציונליים, עם יכולת חדירה חזקה, גורמים לנזק לעור אך בהכרח גורמים לתגובות עמוקות מורכבות, ומפריעות לחקירות השפעות שטחיות על העור. בהינתן הסיכון לנזק שטחי בולט לרקמות מקרינת β בתרחישים כמו נפילה גרעינית, פיתחנו מודל בעלי חיים מבוסס מקור β סטרונציום-90 (⁹⁰Sr) לפציעה עורית הנגרמת מקרינה כדי להתמודד עם אתגר זה. מודל זה מנצל את התכונה הפיזיקלית של קרני β, שמפקידות אנרגיה בעיקר ברקמות שטחיות, ומאפשר סימולציה מדויקת של השפעות ביולוגיות מקומיות הנגרמות ממגע חומרי קרינה עם העור, תוך הימנעות מתגובות מערכתיות פוטנציאליות הנגרמות מקרינה חודרת עמוק. מחקר זה מתאר באופן שיטתי את כל תהליך העבודה, כולל פרמטריזציה של מקור קרינה ^ב-90Sr, פרוטוקולי הקרנה לבעלי חיים, ושיטות איסוף והערכה פתולוגיות של דגימות שונות. מודל זה מספק כלי בעלי חיים אמין להבהרת המנגנונים הפתופיזיולוגיים של פגיעות עור הנגרמות מקרינה ולעידוד פיתוח חקירות מכניות או אסטרטגיות טיפוליות.

מבוא

קרינה מייננת נמצאת בשימוש נרחב במגוון תחומים, כולל אנרגיה, רפואה, תעשייה וחקלאות. למרות שהיא מביאה יתרונות משמעותיים, היא גם מהווה איום ישיר ופוטנציאלי על בריאות האדם, במיוחד עבור עובדים מקצועיים וחולי סרטן ^1,2. בהינתן שהעור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף ויוצר את הכיסוי החיצוני שלו, הוא משמש בהכרח כמטרה העיקרית בחשיפה לקרינה מייננת. העור מורכב מהאפידרמיס, הדרמיס והרקמה התת-עורית, ומבצע פונקציות פיזיולוגיות חיוניות. עם זאת, המנגנונים העומדים בבסיס פגיעות עור הנגרמות מקרינה והאסטרטגיות היעילות למניעתה וטיפולה טרם הובהר מספיק. לכן, יש צורך קריטי במודל ניסויי סטנדרטי וניתן לשחזור שמכוון במיוחד לפגיעות עור הנגרמות מקרינה בשכבה השטחית ומתאים למחקרים מכניים והתערבותיים. כתוצאה מכך, כדי לקדם את המחקר בתחום זה, הצלחנו להקים מודל חדש של בעלי חיים לפגיעת עור מקרינה.

במחקרים קונבנציונליים, קרינה באנרגיה גבוהה, כגון קרני רנטגן או קרני γ, משמשת לעיתים קרובות להשראת מודלים של פגיעות עור ^3,4. סוגי קרינה אלו בעלי יכולת חדירה גבוהה, מה שמאפשר להם לקיים אינטראקציה בקלות עם רקמות ואיברים תת-עוריים ועמוקים יותר. כתוצאה מכך, בעוד שהם גורמים לנזק לעור, הם גם מפעילים תגובות נרחבות ברקמות עמוקות יותר, מה שפוגע בספציפיות המודל למחקר ממוקד עור ומסבך משמעותית את פרשנות התוצאות⁵. היעדר ספציפיות הרקמה הזה מהווה מגבלה משמעותית כאשר מטרת המחקר העיקרית היא לחקור פגיעות קרינה מגבלות עור ולא השפעות קרינה מערכתיות.

לעומת זאת, פיתחנו מודל פגיעות עור ספציפי ומעודן יותר, תוך שימוש במאפייני קרינת β סטרונציום-90 (⁹⁰Sr), כלומר אנרגיה נמוכה וחדירה מוגבלת לרקמות. מחקרים הראו כי הנזק הנגרם על ידי קרני β מוגבל בעיקר לשכבות האפידרמליות והדרמליות^{של העור}, ובכך מצמצם את ההפרעות מתגובה עמוקה של הרקמות. בהשוואה למודלים של קרינה עם חדירה גבוהה, גישה זו מאפשרת מיקום מדויק של הפציעה, הפחתת מעורבות האיברים הפנימיים ושיפור הפרשנות של שינויים פתולוגיים ודלקתיים ספציפיים לעור. בנוסף, שימוש בקרני β ליצירת מודל רדיודרמטיטיס מוצדק גם הוא על ידי שיקולים קריטיים של איומים פוטנציאליים בעולם האמיתי. לקחים מתאונת הגרעין בצ'רנוביל מראים שחשיפה חיצונית במינון גבוה לחלקיקים β עלולה להוביל לכוויות β חמורות ואף לפציעות קטלניות⁷. יתרה מזאת, קיימים גם סיכונים בריאותיים פוטנציאליים ארוכי טווח הנובעים מקרינת β ממזהמי ^קרינה.

כדי לחקור מנגנונים אלו, בחירת בעל חיים מתאים לקרינת קרני β היא גם קריטית. בעוד שמיני פיגים שימשו בהצלחה לבניית דגמי פגיעות עור שנגרמו מקרני β^10,11, היישום הכללי שלהם במחקר מוגבל יותר בהשוואה לעכברים. יתרה מזאת, מאפיין מרכזי של עור העכבר הוא צפיפות זקיקי השיער הגבוהה, מה שהופך אותו למודל מתאים לחקר השפעות הקרינה על גפיים בעור בחקר פגיעות עור מקרינה. לכן, השימוש במודל עכבר מעניק יתרונות משמעותיים. בנוסף, מודלים של עכברים מציעים יתרונות מעשיים, כולל עלות נמוכה יותר, תפוקה גבוהה יותר, מניפולציה גנטית ותאימות רחבה יותר לניתוחים מולקולריים ואימונולוגיים, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד למחקרים מכניים וסקר התערבויות.

ציטוקינים דלקתיים הם מולקולות קטנות או חלבונים פעילים ביולוגית המופרשים על ידי תאים חיסוניים ולא חיסוניים, ומסווגים באופן כללי כפרו-דלקתיים או אנטי-דלקתיים. בנזקי עור הנגרמים מקרינה מייננת, הציטוקינים הללו הם מניעים מרכזיים. למעשה, נזק כזה הוא בעצם מחלה דלקתית בלתי מבוקרת, שמופעלת בעיקר על ידי רשת של ציטוקינים וכמוקינים¹². IL-6 הוא מתווך מפתח פרו-דלקתי ואחד הציטוקינים הקריטיים המעורבים בתגובות דלקתיות חריפות לקרינה וזיהומים 13,14,15. מחקרים עדכניים הראו כי הקרינה מפעילה את מסלול האיתות של IL-6/STAT3 ואת הזדקנות התאית, ובכך מקדמת חדירת תאי מערכת החיסון ותורמת לדרמטיטיס קרינתית, דלקת עור^ונשירת שיער. מעניין לציין שהוא גם מציג השפעות רדיופרוטקטיביות בהקשרים ספציפיים^17,18. לעומת זאת, IL-10 הוא רגולטור אנטי-דלקתי חשוב. תפקידיו כוללים הגבלת תגובות דלקתיות מופרזות, חיזוק מערכת החיסון המולדת, קידום מנגנוני תיקון רקמות, ושמירה על הומאוסטזיס רקמתי בזמן זיהום ודלקת^19,20. IL-10 פועל לעיתים קרובות בשיתוף פעולה עם IL-6, ומדגים השפעות מועילות בקידום ריפוי פצעים עוריים, הפחתת היווצרות צלקות ושיפור מצבים דרמטולוגיים מסוימים 21,22,23. בעוד שמחקרים קיימים הראו כי IL-6 ו-IL-10 מגיבים לחשיפה לקרינה ולאולטרה סגול, בהתאמה 16,24,25, תגובותיהם לקרינת β נותרות לא ברורות.

לסיכום, מחקר זה שואף לקבוע מודל עכבר יציב וניתן לשכפול של פגיעת עור הנגרמת מקרינה על ידי ^{קרינה β של 90}Sr. מודל זה מתאים במיוחד למחקרים המתמקדים בפגיעות קרינה עורית, תרחישי חשיפה לקרינה β, ויסות דלקתי, נזק לגפיים בעור ועיצוב רקמות ממושך. עם זאת, היא אינה מיועדת לשכפל הקרנות גידול עמוק או מוצק, אשר בדרך כלל דורשת קרינה חדירה מאוד כמו קרני רנטגן או γ. אנו מציגים את הנהלים להקמת המודל ולאימות שיטתי של היתכנותו באמצעות הערכות רב-רמתיות, כולל ציון פגיעות קרינה, בדיקה היסטולוגית והבעה מולקולרית של ציטוקינים מרכזיים (IL-6 ו-IL-10). ניתוח דינמי של פרמטרים אלו יסייע להבהיר את תפקידי הרגולציה של IL-6 ו-IL-10 בתהליך הפציעה, ובכך יספק בסיס ניסויי מוצק והפניה תיאורטית לפיתוח אסטרטגיות התערבות ממוקדות בעתיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים שעסקו בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה בניסויים בבעלי חיים של בית הספר למדעי הרפואה הבסיסיים והפורנזית של מערב סין (צ'נגדו, סין).

1. הכנת בעלי חיים

מגורי בעלי חיים וקיבוץ
1. הקצו שתים-עשרה עכברים נקביים בדרגת SPF מסוג C57BL/6J (טווח משקל: 18–25 גרם, גיל: 3 חודשים) לארבעה כלובים מאווררים סטנדרטיים והקצו אותם באקראי לארבע קבוצות (n=3) לחשיפה למינונים משתנים של הקרנה חיצונית (קבוצת ביקורת לא מוארת ו-3 קבוצות הקרנה ניסיונית).
2. שמרו על כל בעלי החיים במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית לאוכל מכרסמים רגיל ומים רגילים.
3. השתמש בתגי אוזניים ממוספרים כדי לזהות כל עכבר באופן ייחודי ולהבחין בין קבוצות ניסוי.
4. אפשר לבעלי החיים הניסיוניים להסתגל לסביבה החדשה למשך 3 ימים לפני ההליכים הבאים.
5. הניחו חולדה אחת של ספרג דולי (SD) (גיל: 2 חודשים; משקל: כ-160 גרם) בתנאים זהים.
הרדמה
1. הרדמו את העכברים באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של תמיסת טריברומואתנול 1.25%. כדי להבטיח הרדמה בטוחה, יש לחשב את נפח ההזרקה לפי משקל הגוף, תוך מתן 15–20 מ"ל/ק"ג של משקל גוף, בהתאם לתקני ייחוס שנקבעו.
הכנת אתר הקרינה
1. לאחר ההרדמה, הסר פרווה מעל אתר ההקרנה הגבי המיועד באמצעות קוצץ חשמלי.
2. באמצעות עט טוש אדום ותבנית קשיחה מוכנה מראש בקוטר של כ-3 ס"מ, סמנו אזור עגול לקרינה על העור הגבי המגולח.
  הערה: קרמים להסרת שיער אינם בשימוש, שכן הם עלולים לגרום לגירוי בעור ולשנות את המבנה ההיסטולוגי, ובכך לבלבל את תוצאות הניסוי.

2. חישוב מינון להקרנה

הערה: ⁹⁰Sr פולט קרני β באנרגיה גבוהה דרך דעיכתו ^ל-90Y (איור 1A). לקרני β יש ביצועים חלשים בחדירה, בדרך כלל משפיעים רק על האפידרמיס. קביעה מדויקת של זמן ההקרנה לעכברים דורשת חישוב קצב המינון הנספג (D, cGy/s).

חשב את קבוע הדעיכה (λ) ממחצית החיים הפיזית (T1/2) באמצעות הנוסחה:
T1/2 ≈ 0.693/λ
בהינתן שמחצית החיים של ⁹⁰Sr היא כ-28.6 שנים, λ ≈ 0.02423 ^שנה-1.
חשב את מספר הרדיונוקלידים (N) באמצעות הנוסחה הבאה:
A = λ N
כאשר:
ת: רדיואקטיביות (mCi)
N: מספר הרדיונוקלידים לאחר זמן t (שנים)
עם רדיואקטיביות התחלתית A₀= 30 mCi (1 Ci = 3.7x10¹⁰ Bq) ו-λ ≈ 0.02423,
N₀= A₀/λ = 1238.13454
לאחר מכן, יש ליישם את חוק דעיכת הקרינה הכללי, כלומר מספר הרדיונוקלידים פוחת באופן מעריכי עם הזמן:
dN/dt = -λ N
אינטגרציה מניבה:
N = N₀ ^е-λ^t
כאשר:
N₀: מספר התחלתי של רדיונוקלידים ב-t = 0
N: מספר הרדיונוקלידים שנותרו לאחר הזמן t
לבסוף, חשב את קצב המינון הנספג, D, ב-cGy/s באמצעות הנוסחה הבאה:
נוסחת המרה לקצב המינון הנספג של מכשיר יישום ⁹⁰ ^Sr-90Y:
D = [(A×1770/S) ×(E⁹⁰_Y/E³²_P) ×Fm] /3600 = (A/S) ×0.6347
כאשר
D: קצב ספיגת מינון (cGy/s)
ת: מיליקיורי (mCi)
S: שטח (ס"^{מ 2})
1770: קבוע יינון עבור ³²P
E⁹⁰_Y:אנרגיה ממוצעת = 0.93 MeV
E³²_P:אנרגיה ממוצעת = 0.693 MeV
FM: מדד המרה מחשיפה למינון (0.962)
3600: מקדם המרה שעה לשנייה
הערה: החישובים של ⁹⁰פרמטרי Sr מסוכמים בטבלה 1. חישוב לדוגמה מוצג להלן:
ב-3 במרץ 2023:
קוטר חיצוני של האפליקטור = 3 ס"מ, קוטר פנימי = 2.47 ס"מ, רדיוס = 1.235 ס"מ, רדיואקטיביות A = 30 mCi
S = π ×1.235²
D=(A/S) ×0.6347 ≈ 3.9738 cGy/s
ב-3 בנובמבר 2023 (t = 0.583 שנים לאחר מכן):
N(t) = N₀ ^е-λt= 1238.13454×^{e-0.02423×0.583}≈ 1220.7675
A(t) = λN(t) = 0.02423×1220.7675 ≈ 29.579 mCi
D = (A/S) ×0.6347 ≈ 3.918 cGy/s
לאחר t = 2.25 שנים:
N = N₀ ^е-λt≈ 1238.13454×^{e-0.02423×2.25}≈ 1172.4391
A = λN ≈ 0.02423×1172.4391 ≈ 28.408 mCi
D = (A/S) ×0.6347 ≈ 3.7629 cGy/s
חשב את זמן ההקרנה של כל קבוצת מינון בהתבסס על הנתונים שהתקבלו (ראו טבלה 2).

3. הקרנה

הערה: למרות שקרני β הנפלטות ^{על ידי 90}Sr חדירות באופן מוגבל, בדרך כלל משפיעות רק על שכבת האפידרמל (איור 1D), הן עדיין מהוות סיכון פוטנציאלי לבריאות האדם. ודאו שכל הנהלים הכוללים מקורות ⁹⁰Sr פועלים לפי אמצעי הגנה מתאימים למזעור חשיפה לקרינה למפעילים ולסביבה. המפעילים חייבים לעבור הכשרה מיוחדת בטיפול במקורות קרינה. הנהלים לטיפול ושימוש במקורות קרינה עמדו בקפדנות בסטנדרטים הבינלאומיים המפורטים בהמלצות 2007 של הוועדה הבינלאומית להגנה רדיולוגית (ICRP פרסום 103).

הכנה לשימוש מוקדם: יש להגיש בקשה לשימוש במקור ^{של 90}Sr. לאחר אישור המפקח, אספו את מפתח המעבדה ואת קוד פירוק מערכת האזעקה.
הכינו את כל החומרים הנדרשים, כולל עכברים עם אזורי גב מגולחים ומסומנים, מזרקים של 1 מ"ל, תמיסת טריברומואתנול, עטיפת פלסטיק בדרגת מזון, טיימרים, סרט וקרני קצף.
טיפול מקדים בעכבר
1. הרדמת עכברים באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של תמיסת טריברומואתנול (ראו שלב 1.2).
2. לאחר הרדמה מלאה, מניחים את הגב העליון של העכבר על לוח קשיח, כסו את פני הגב בניילון נצמד, וקבעו את העטיפה עם סרט דבק.
הליך הקרנה
1. היכנסו לחדר מקור הקרינה, נטרלו את מערכת האזעקה, לבשו ציוד מגן (חליפת מגן, כובע, משקפי מגן ודוזימטר אישי), ואז שלפו את מקור ^ה-90Sr מהמגן המוביל.
2. חבר מוט מתכת לידית העליונה של המקור כדי להרים ולהזיז את האפליקטור.
3. כדי לדמות פגיעת עור הנגרמת מקרינה β הרלוונטית לתאונות גרעיניות או חשיפה תעסוקתית, מקמו את משטח הפולט (איור 1B) של האפליקציה ⁹⁰Sr מעל האזור הגבי המגולח המסומן של העכבר המורדם (איור 1C). התחל את הטיימר מיד עם ההצבה. בדיוק לאחר משך הזמן שנקבע מראש, משוך את האפליקטור ואחסן אותו זמנית במיכל המקורי.
  אזהרה: לעולם אל תפנה לתחתית האפליקציה כלפי כוח אדם.
4. החזר את מקור ^ה-90Sr למגן העופרת לאחר השימוש.
  הערה: עבור קבוצת 10 Gy×5, יש להקרין פעם ביום במשך 5 ימים רצופים כדי להגיע למינון כולל של 50 Gy.
שלבי פוסט-הקרנה
1. השלים את רישום בדיקת מקור הקרינה ואת יומן השימוש במקורות הקרינה, הפעל מחדש את מערכת האזעקה, נעל את הדלת, החזיר את המפתח ודווח על מצב המקור.
2. לאסוף את כל הפסולת הרדיואקטיבית שנוצרת במהלך התהליך ולהיפטר ממנה בהתאם להנחיות המוסדיות.

4. ציוני פגיעות קרינה

העריך את התקדמות נזק העור בעכברים על ידי בדיקת אתר ההקרנה כל 2–3 ימים בשלב הראשוני. לאחר תצפית על מראה עור חריג, יש להגדיל את תדירות ההערכה ליומית. לאחר שההתקדמות של הנגע התייצבה, יש להחזיר את מרווח ההערכה לכל 2–3 ימים.
הערה: לאורך כל התהליך, קבוצת הביקורת הלא מוקרנת עברה הליכים זהים לאלו של הקבוצות המוקרנות, כולל ניקוד ואיסוף רקמות. נקודות הזמנים לדגימה לקבוצות הביקורת מתוכננות לחופף לשלב ההתקדמות של פגיעת העור בקבוצות המוקרנות.
צלם מדי פעם את אזורי העור המוקרנים והעריך את מצב הדרמטיטיס הנגרמת מקרינה בגב העכבר.
לדרג תגובות עור בשדה המוקרן באמצעות סולם מאומת (ראו טבלה 3).
הערה: בעת ציון הפציעות, שלושה חוקרים יבצעו הערכות עיוורות באופן עצמאי ללא ידיעה על מינון ההקרנה. הניקוד מבוסס על תכונות הפצע הדומיננטיות בהתאם לקריטריונים שנקבעו. קבע ציון סופי בהסכמה, תוך הכרה בכך שחלק מהפצעים עשויים לא להתאים באופן מושלם לכל תיאור במערכת הניקוד אך עדיין משקפים את הפתולוגיה החיונית.

5. דגימה וצביעה

השגת רקמת עור: בימים 13, 19, 27 ו-32 לאחר ההקרנה, אספו ביופסיות עור בעובי מלא סדרתיות מעכברים בכל קבוצת טיפול, בתוך שדה ההקרנה המעגלי המסומן מראש.
1. הרדמו את העכברים על ידי הזרקה תוך-פריטונלית של תמיסת טריברומואתנול (15–20 מ"ל/ק"ג) כפי שהיה בשלב 1.2.
2. חטא את אזור הניתוח עם 75% אלכוהול. לאחר מכן, השתמשו במלקחיים דקים וסטריליים כדי לייצב את העור המטרה.
3. יש להוציא דגימת עור בעובי מלא של כ-0.5 ס"מ² אנכית באמצעות מספריים כירורגיים לאורך אזור המעבר בין רקמות פגועות, כדי להבטיח הכללת האזור הפגוע המרכזי. החזק את המספריים בניצב לפני העור והאריך את החתך עד לשכבת הפאשיה התת-עורית.
4. הניחו את הרקמה שנאספה מיד ב-4% פאראפורמלדהיד לקיבוע הרקמה.
5. לחץ בעדינות על הפצע לצורך המיסטזיס. בכל סשן דגימה, יש לבצע אסטרטגיה של תנועה מאחד מארבעת הכיוונים לעבר מרכז שדה הקרינה.
צביעת היסטולוגיה ואימונופלואורסצנציה
הערה: צביעת H&E ואימונופלואורסצנציה בוצעה בסיוע ספק שירות מסחרי (Servicebio Biotechnology, ווהאן, סין) בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים המותאמים שלהם.
1. בצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) על דגימות העור שנאספו בכל ארבע נקודות הזמן (ימים 13, 19, 27 ו-32 לאחר ההקרנה).
  1. ראשית, הטמיעו את דגימות הרקמה הקבועות בפרפין וצרו חתכי רקמה.
  2. בצע הסרת שעווה והידרציה על ידי הטבלת החלקים ברצף בנוזל שקוף Friendly Environmental Dewaxing Transparent Liquid I (20 דקות), Environmental Friendly Dewaxing Transparent Liquid II (20 דקות), אתנול חסר מים I (5 דקות), אתנול חסר מים II (5 דקות) ו-75% אתנול (5 דקות), ואז שטוף במי ברז.
  3. טפל בכל החלקים עם תמיסת צביעה קבועה של HD למשך דקה. לאחר מכן, צבעו עם תמיסת ההמטוקסילין למשך 3–5 דקות, ואחר כך שטפו במי ברז.
  4. לאחר מכן, טבלו את החלקים בתמיסת התמיינות המטוקסילין ושוטפים שוב במי ברז. לאחר מכן, לטפל בהם בתמיסת המטוקסילין בלוינג ואחריה שטיפה נוספת.
  5. לאחר מכן, מניחים חתכים באתנול 95% למשך דקה וצבעי נגד עם צבע אאוזין למשך 15 שניות.
  6. לאחר מכן, ייבשו את החלקים באמצעות סדרה של אתנול מוחלט (שלוש החלפות, 2 דקות כל אחד), בוטנול רגיל (שני החלפות, 2 דקות כל אחד), וקסילן (שני החלפות, 2 דקות כל אחד), ולבסוף אוטמים אותם עם מסטיק נייטרלי.
2. בצע צביעת אימונופלואורסצנציה כדי להמחיש את הציטוקינים הדלקתיים IL-6 ו-IL-10.
  הערה: בהתבסס על התקדמות הפציעה הכוללת, רקמות נבחרות התקבלו ביום ה-13, כאשר החלו להופיע נגעים נראים לעין, וביום ה-27, שבו התקדמות הפציעה מתייצבת ומראה סימני החלמה, לצורך צביעת אימונופלואורסצנציה כדי להמחיש את הציטוקינים הדלקתיים IL-6 ו-IL-10.
  1. דה-פרפין והיבש מחדש את החלקים באמצעות קסילן (שלוש החלפות, 10 דקות כל אחד) ואתנול מדורג (שלוש החלפות אתנול טהור, 5 דקות כל אחד), ואז שטוף אותם במים מזוקקים.
  2. לצורך שאיבת אנטיגן, חממו את הסליידסים בתמיסת תיקון אנטיגן של חומצה ציטרית 1× (pH 6.0) בטמפרטורה של 70°C למשך 20 דקות. תן לסליידס להתקרר באופן טבעי, ואז שטוף אותן ב-PBS (pH 7.4) על שייקר שמבהיר צבע (שלוש שטיפות 5 דקות כל אחת).
  3. לאחר מכן, מרח 3% BSA כדי לחסום את הקישור הלא ספציפי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. הכינו ומרחו תמיסת נוגדנים ראשונית מעורבת המכילה אנטי-IL-6 (1:3000) ואנטי-IL-10 (1:2000), ואז דגרו את החתכים בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה בתא לח.
  5. למחרת, שטפו את השקופיות ב-PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחת) ודגרו עם נוגדנים משניים מתאימים בטמפרטורת החדר למשך 50 דקות בחושך.
  6. אחרי שטיפה ב-PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחת), צבעי גרעינים עם DAPI למשך 10 דקות בחושך. לאחר מכן, שטוף שוב ב-PBS (שלוש פעמים, 5 דקות כל אחת), טפל בכיבוי אוטופלואורסצנציה במשך 5 דקות, ושוטף במים זורמים במשך 10 דקות.
  7. לבסוף, להתקין כיסויי כיסוי באמצעות מדיום הרכבה נגד דעיכה.
ניתוח כמותי
1. השתמש בתוכנת Image J כדי לכמת את עובי האפידרמלה מאזורים מוצבעים ב-H&E.
  1. כיייל את סולם התמונה בתמונה J על ידי מעקב אחרי פס הקנה מידה עם כלי הקו הישר וקביעת האורך הידוע ב-Analyze > Set Scale.
  2. לאחר מכן, עבור לניתוח כלים > > ROI Manager כדי לבחור את האזורים שמעניינים אותם ולהוסיף אותם למנהל ההשקעה.
  3. לבסוף, לחץ על Measure במנהל התשואה כדי לקבל את האורכים המדויקים.
2. השתמש בתוכנת Image J למדידת עוצמת האימונופלואורסצנציה הממוצעת של IL-6 ו-IL-10.
  1. ייבא את התמונה ופצל ערוצים דרך תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים. לאחר מכן בחר את הערוץ המתאים לפלואורסצנציה של היעד (למשל, אדום עבור IL-6, ירוק עבור IL-10).
  2. החלו סף אוטומטי תחת Image > Adjust >-Auto-Threshold > Try All בחלון הסף, בחר את האלגוריתם האופטימלי וכיוון ידנית את הסליידר כך שיתאים לפלואורסצנציה האמיתית.
  3. הגדר מדידות תחת ניתוח > מדידות סט על ידי בדיקת ערך אפור ממוצע והפעלת גבול לסף.
  4. לבסוף, בצע ניתוח > מדידה כדי לקבל נתוני עוצמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ממצאי הבדיקה הגופנית
עכברים נחשפו לקרינת β ממקור ^{של 90}Sr בשלושה מינונים שונים: 0 Gy, 25 Gy, 10 Gy×5 fraction, ו-50 Gy. בוצעו הערכות מקבילות באתר כדי לתעד את התקדמות נזק העור עד שההתקדמות של הפציעה התייצבה. תוצאות הניסוי הראו כי ⁹⁰Sr β קרינה פגיעה בעור שנגרמה מקרינה בכל הקבוצות, ומידת הפציעה תלויה במינון ההקרנה. ללא קשר למינון או לפיצול, החלו להופיע נגעים נראים לעין בין הימים 12 ל-14, ואחריהם התקדמות מהירה. המאפיינים הראשוניים מייצגים נשירת שיער ודסקוואמציה (dequamation). הנזק הגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהקמת מודל חייתי לפגיעת עור קרינה, השתמשנו ברדיונוקליד ⁹⁰Sr ארוך ימים כמקור לקרינת β. חישוב מדויק של קצב מינון הקרינה וזמן ההקרנה היווה שלב קריטי בפיתוח המודל המוצלח. היישום הקליני של ⁹⁰Sr בטיפול גידולים תועד, כאשר אמינותו קיבלה אימות חלקי^{מסוים 27,28}. בעוד רדיונוקלידים אחרים של קרני β (למשל ³²P ^ו-204Tl) יכולים לשמש כמקורות קרינה פוטנציאליים, ⁹⁰Sr נבחר בשל תפוקת הקרינה היציבה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים ידועים או מערכות יחסים אישיות שיכולות להיראות כמשפיעות על העבודה המדוונת במאמר זה.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U25A20151, 82473574 ו-82203973), פרויקט חדשנות מרכזית ממחוז שיזאנג (XZ202501ZY0131), וקרן הטרנספורמציה של מעבדת טיאנפו ג'ינצ'נג (2025ZH006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנטי-IL-6 ארנב pAb	סרוויסביו	GB11117	צביעת אימונופלואורסצנציה
אנטי-IL-10 ארנב pAb	סרוויסביו	GB11108	צביעת אימונופלואורסצנציה
תמיסת תיקון אנטיגן לחומצה ציטרית (PH6.0)	סרוויסביו	G1202	צביעת אימונופלואורסצנציה
מייבש	דיאפת	דונטלו	H& E ואימונופלואורסצנציה כתמים
דיגיטלי מצלמה	קאנון	EOS 70D	תעד את התקדמות פגיעות העור במהלך הניסוי
מזרק חד-פעמי מעוקר	יצרן מקצועי של מכשירים רפואיים סטריליים חד-פעמיים.	GB20163140107	להזרקה תוך-צפיקית
כפפת לטקס חד-פעמית	מדיקום	1186	הגנה
נוזל שקוף להסרת שעווה ידידותי לסביבה	סרוויסביו	G1128-1L	H& E ואימונופלואורסצנציה כתמים
פלטפורמה קפואה	ווהאן ג'ונג'יה אלקטרוניקס בע"מ	JB-L5	H& E כתמים
המטוקסילין-אאוזין (H& ה) ערכת צבע קבועה HD	סרוויסביו	G1076	H& E כתמים
תמונה J	מכונים לאומיים	עיבוד תמונה	אפשר כימות מדויק של נתוני צביעת היסטולוגיה
סינר עופרת	חברת שנדונג אוריקסין להנדסת הגנה מפני קרינה בע"מ.	לא זמין	להגן על הצוות מחשיפה לקרינה
עט PAP חוסם נוזלים	סרוויסביו	G6100	צביעת אימונופלואורסצנציה
סרט רפואי	3M	10163337409520	מניעת זיהום מקור הקרינה על ידי משטחים ביולוגיים
מסטיק נייטרלי	SCRC	10004160	H& E כתמים
Nuclear קרינה גלאי	FNIRSI	100128262296	ניטור בזמן אמת של רמות הקרינה הסביבתית סביב המפעיל כדי להבטיח את בטיחות הצוות
פאראפורמלדהיד מקבע (4%)	ביושארפ	BL539A	תיקון דגימות רקמת עור
חותך פתולוגיה	שנגחאי לייקה אינסטרומנט בע"מ	RM2016	H& E ואימונופלואורסצנציה כתמים
מכונת הטמעת פרפין	ווהאן ג'ונג'יה אלקטרוניקה	JB-P5	H& E ואימונופלואורסצנציה כתמים
סטרונציום-90	מכון קלופין רדיום חברת מניות (Radium Institute JSC, רוסיה)	לא זמין	ספק קרני &בטא;
טריברומואתנול	נאנג'ינג אייביי ביוטכנולוגיה בע"מ	M2910	הרדמה של עכברים
מייבש מגלשת לאמבט מים	ציוד כלי נגינה של ג'ג'יאנג ג'ינחואה קדי	KD-P	H& E ואימונופלואורסצנציה כתמים

מקורות

Talapko, J., et al. Health effects of ionizing radiation on the human body. Medicina (Kaunas). 60 (4), 653(2024).
Wucherer, M., Loose, R. occupational exposure to radiation. Radiologe. 45 (3), 291-302 (2005).
Du, Y., et al. Heavy ion and x-ray irradiation alter the cytoskeleton and cytomechanics of cortical neurons. Neural Regen Res. 9 (11), 1129-1137 (2014).
Jameus, A., Kennedy, A. E., Thome, C. Hematological changes following low dose radiation therapy and comparison to current standard of care cancer treatments. Dose Response. 19 (4), 15593258211056196(2021).
Chen, X., et al. Autophagy gene atg7 regulates the development of radiation-induced skin injury and fibrosis of skin. Skin Res Technol. 29 (6), e13337(2023).
Hopewell, J. W., Sieber, V. K., Heryet, J. C., Wells, J., Charles, M. W. Dose- and source-size-related changes in the late response of pig skin to irradiation with single doses of β-radiation from sources of differing energy. Radiat Res. 133 (3), 303-311 (1993).
Samoylov, A. S., Bushmanov, A. Y., Galstyan, I. A. Medical management: Major lessons learned from the Chernobyl accident (the review). J Radiol Prot. 41 (3), (2021).
Junk, A. K., et al. long-term radiation damage to the skin and eye after combined beta- and gamma- radiation exposure during the reactor accident in chernobyl. Klin Monbl Augenheilkd. 215 (6), 355-360 (1999).
Kim, G., Choi, S. D., Lim, J. M., Kim, H. Strontium-90 levels in seawater southeast of jeju island during 2021-2023. Mar Pollut Bull. 193, 115258(2023).
Kim, J. S., et al. β-irradiation (166ho patch)-induced skin injury in mini-pigs: Effects on NF-κB and COX-2 expression in the skin. J Vet Sci. 16 (1), 1-9 (2015).
Burnett, L. R., et al. Biomolecular analysis of beta dose-dependent cutaneous radiation injury in a porcine model. Radiat Res. 192 (2), 145-158 (2019).
Ryan, J. L. Ionizing radiation: The good, the bad, and the ugly. J Invest Dermatol. 132 (3 Pt 2), 985-993 (2012).
Müller, K., Meineke, V. Radiation-induced alterations in cytokine production by skin cells. Exp Hematol. 35 (4 Suppl 1), 96-104 (2007).
Nishimura, N., Tohyama, C., Satoh, M., Nishimura, H., Reeve, V. E. Defective immune response and severe skin damage following uvb irradiation in interleukin-6-deficient mice. Immunology. 97 (1), 77-83 (1999).
Tanaka, T., Narazaki, M., Kishimoto, T. Il-6 in inflammation, immunity, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (10), a016295(2014).
Paldor, M., et al. Single-cell transcriptomics reveals a senescence-associated il-6/ccr6 axis driving radiodermatitis. EMBO Mol Med. 14 (8), e15653(2022).
Huang, E. Y., Peng, C. T., Wang, C. C. Effects of radiation response modifiers given after lethal whole-abdominal irradiation. Int J Radiat Biol. 94 (3), 289-294 (2018).
Kumari, N., Dwarakanath, B. S., Das, A., Bhatt, A. N. Role of interleukin-6 in cancer progression and therapeutic resistance. Tumour Biol. 37 (9), 11553-11572 (2016).
Ouyang, W., O'garra, A. Il-10 family cytokines il-10 and il-22: From basic science to clinical translation. Immunity. 50 (4), 871-891 (2019).
Saraiva, M., Vieira, P., O'garra, A. Biology and therapeutic potential of interleukin-10. J Exp Med. 217 (1), e20190418(2020).
Singampalli, K. L., et al. The role of an il-10/hyaluronan axis in dermal wound healing. Front Cell Dev Biol. 8, 636(2020).
Short, W. D., et al. Interleukin-10 producing t lymphocytes attenuate dermal scarring. Ann Surg. 274 (4), 627-636 (2021).
Weiss, E., et al. The role of interleukin 10 in the pathogenesis and potential treatment of skin diseases. J Am Acad Dermatol. 50 (5), 657-675 (2004).
Kang, K., Hammerberg, C., Meunier, L., Cooper, K. D. Cd11b+ macrophages that infiltrate human epidermis after in vivo ultraviolet exposure potently produce il-10 and represent the major secretory source of epidermal il-10 protein. J Immunol. 153 (11), 5256-5264 (1994).
Piskin, G., Bos, J. D., Teunissen, M. B. Neutrophils infiltrating ultraviolet b-irradiated normal human skin display high il-10 expression. Arch Dermatol Res. 296 (7), 339-342 (2005).
Kinoshita, K., et al. Cell and tissue damage after skin exposure to ionizing radiation: Short- and long-term effects after a single and fractional doses. Cells Tissues Organs. 200 (3-4), 240-252 (2014).
Niu, B., Zheng, C., Hu, F. Strontium 90 combined with surgery for a patient with giant subungual glomus tumor. Asian J Surg. 46 (10), 4549-4551 (2023).
Russak, O. M., Verganti, S., Berlato, D. Strontium 90 plesiotherapy for the treatment of eyelid squamous cell carcinoma in eight cats. J Feline Med Surg. 24 (6), 524-529 (2022).
Garcia, H., Shubik, P. Epilation and hair greying in hamsters following one single application of beta rays. J Invest Dermatol. 57 (2), 94-99 (1971).
Ungvari, A., et al. Irradiation-induced hair graying in mice: An experimental model to evaluate the effectiveness of interventions targeting oxidative stress, DNA damage prevention, and cellular senescence. Geroscience. 46 (3), 3105-3122 (2024).
Yang, X., Ren, H., Guo, X., Hu, C., Fu, J. Radiation-induced skin injury: Pathogenesis, treatment, and management. Aging (Albany NY). 12 (22), 23379-23393 (2020).
Xiao, Y., et al. Ionizing radiation induces cutaneous lipid remolding and skin adipocytes confer protection against radiation-induced skin injury. J Dermatol Sci. 97 (2), 152-160 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות