פרופיל מוטציות DNA בקולטני גורם גדילה אפידרמלי בתאים נדירים במחזור באמצעות מערכת בידוד תאים ו-PCR דיגיטלי בטיפות

Yoon-Tae Kang; Srikanth Perike; Adam Corner; Elizabeth Dreskin; Nathan Knapp

doi:10.3791/70016

מאמר שיטה

פרופיל מוטציות DNA בקולטני גורם גדילה אפידרמלי בתאים נדירים במחזור באמצעות מערכת בידוד תאים ו-PCR דיגיטלי בטיפות

DOI:

10.3791/70016

⸱

23 ביוני 2026

Yoon-Tae Kang¹ , Srikanth Perike¹ , Adam Corner¹ , Elizabeth Dreskin¹ , Nathan Knapp¹

¹Bio-Rad Laboratories

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחשת הבידוד של תאי סרטן נדירים מדגימה מלאכותית המכילה דם מלא ועם זיקוקים בתאי סרטן הריאות. הפרוטוקול עושה שימוש בפלטפורמת בידוד תאים חצי-אוטומטית וללא תוויות. תאים מועשרים נבדקים לאחר מכן לאיתור מוטציות בקולטני פקטור גדילה אפידרמלי באמצעות PCR דיגיטלי של טיפות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטציות שנמצאות בגן פקטור הגדילה האפידרמלי (EGFR) הן קריטיות לקביעת הטיפולים היעילים ביותר לחולי סרטן הריאות. בדיקות שגרתיות למוטציות EGFR יכולות להתבטא בביופסיות גידול או בניתוח ctDNA מפלזמה של חולי סרטן ריאות. למרות שבדיקת דגימות דם של חולי סרטן ריאות מתבצעת באופן שגרתי כדי לספק תובנות לגבי נוכחות או הישנות סרטן הריאות, באמצעות זיהוי ctDNA או זיהוי CTC, לרוב היא אינה כוללת ניתוח מולקולרי נוסף של התאים שנלכדו. זיהוי מוטציות בודדות בתוך גן ה-EGFR הנמצא בתאי גידול נדירים (CTCs) יכול להציע תובנות נוספות לגבי היעילות הפוטנציאלית של טיפולים ממוקדים ומעבר לכך, פרוגנוזה של מטופלים, במיוחד בסרטן ריאות לא-תאים קטנים (NSCLC). למרבה הצער, נדירות תאי הגידול הזורמים הללו והיעדר פרוצדורות מדויקות לחקירת המידע הגנומי שלהם מהווים אתגר משמעותי בגילוי.

מטרת הפרוטוקול היא להמחיש את הפוטנציאל הריאלי של לכידת CTCs מדם מלא והערכת התוכן המולקולרי שלהם באמצעות ddPCR. פלטפורמת בידוד תאים חצי-אוטומטית מבוססת גודל שימשה ללכידת תאי גידול בסירקולציה, אשר לאחר מכן נאספו לניתוח מולקולרי במורד הזרם. כדי לקבוע את נוכחות מוטציות EGFR ספציפיות ב-DNA הגנומי של תאים שנלכדו, בוצעה ddPCR באמצעות בדיקות ל-EGFR pT790M ו-EGFR pL858R.

שני קווי תאי סרטן ריאות נפרדים (A549 ו-H1975) הועשרו באופן פעיל מדם מלא, וכימות מדויק של מוטציות הקיימות בקווי התאים H1975 בוצע באמצעות ddPCR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם המשך מחקר תרגומי על ערך הביופסיות הנוזליות, ופרסומים אחרונים המדגימים במיוחד את הערך הקליני של ניטור ctDNA בבחירת טיפול¹ , ביופסיות נוזליות מתבגרות. ביופסיות נוזליות מספקות שיטה חלופית, פחות פולשנית, למעקב ולפרוגנוזה של סרטן בהשוואה לשיטות ביופסיה רקמות קונבנציונליות. מחקרים נרחבים התמקדו ב-DNA מפורק שנמצא בדם (DNA ללא תאים, cfDNA), ובמיוחד בתת-המחוז שמקורו בגידול, הידוע כ-DNA גידול במחזור (ctDNA). ctDNA נחקר בהרחבה בעשרים השנים האחרונות והוכח כי הוא מכיל מוטציות גנטיות ספציפיות לגידול, כגון SNVs ווריאנטים מבניים, וכן סמנים מתילציה ודפוס מקטעים מובחן בהשוואה ל-cfDNA שאינו גידולי. תכונות ה-ctDNA הספציפיות הללו משמשות כיום למעקב אחר מצב המולקולרי של חולי סרטן בגילוי מוקדם, תגובה לטיפול, מחלה שאריתית מינימלית (MRD) ועמידות למצב הטיפול. באופן דומה, תאי גידול במחזור הדם, המנותקים מאתר הגידול הראשי אל כלי הדם, התפתחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים שקיומם וכמותם בדם הראו קשר הדוק להתקדמות המחלה ולפוטנציאל להישנות המחלה. בעוד שהמחקרים הראשונים הראשונים על CTCs הסתמכו בעיקר על ביטוי וספירת סמן החלבון שלהם²,חלה התקדמות משמעותית בחקר CTCs ברמה המולקולרית, כולל זיהוי מוטציות גנומיות בקולטן אסטרוגן 1 (ESR1) לסרטן השד, וגן פקטור גדילה אפידרמלי (EGFR) לסוגי סרטן שונים.

מוטציות ב-EGFR הן קריטיות לקביעת פתוגנזה ותחזית, והן לקביעת הטיפולים היעילים ביותר לחולי סרטן ריאות³. בדיקות שגרתיות למוטציות ב-EGFR יכולות להתבטא בביופסיות גידול מוצק באבחון או בהתקדמות, או לאחרונה בדגימת ctDNA מפלזמה של חולים^{עם סרטן} ריאות נשני/עמיד 4. עם זאת, בניגוד לגישות מבוססות ctDNA, ניתוח חומר גנומי שמקורו ב-CTC מאפשר הערכה ישירה של תאי גידול שלמים ופרופילי המוטציות שלהם. בנוסף למחקרי ctDNA MRD, זיהוי מוטציות בגן EGFR של CTCs נדירים יכול לספק הבנה נוספת לגבי היעילות הפוטנציאלית של משטרי טיפול ומעבר לכך, פרוגנוזה של מטופלים, במיוחד בסרטן ריאות לא קטן (NSCLC). הנדירות של CTCs והיעדר פרוטוקולים יעילים המשתמשים בכלים ידידותיים למרפאות מהווים מכשול חמור לאימוץ רחב יותר. מגבלה זו מדגישה את הצורך בזרימת עבודה סטנדרטית ונגישה שמאפשרת הן בידוד CTC יעיל והן ניתוח מולקולרי במורד הזרם. לכן, מטרת מחקר זה היא להציג תהליך עבודה שניתן לשחזר להעשרת תאי הגידול במחזור הפעולה ולגילוי מוטציות EGFR באמצעות שילוב של בידוד תאים וגישה דיגיטלית של PCR.

מערכת בידוד תאי הג'נסיס עם שקופיות לכידת תאים מיקרופלואידיים יכולה ללכוד CTCs בתהליך חצי-אוטומטי עם חיוניות גבוהה ויעילות לכידה גבוהה, בהתבסס על גודלם הגדול יותר ועיוותם המופחתת בהשוואה לאוכלוסיית תאי הדם הלבנים והאדומים הראשונית ^5,6. CTCs שנלכדו יכולים להילקח ממגלשי לכידת תאי מיקרופלואיד על ידי זרימה הפוכה מהמגלשה לניתוח גנומי נוסף במורד הזרם. כדי לקבוע את נוכחות מוטציות EGFR ספציפיות ב-DNA הגנומי של תאים שנלכדו, בוצע ddPCR על DNA גנומי שמקורו ב-CTC באמצעות בדיקות ל-EGFR T790M ו-L858R.

פרוטוקול זה, המשתמש בדגימת CTC מודלית ובבדיקות ddPCR זמינות מסחרית, נועד להמחיש נקודת כניסה לגילוי ממוקד של מוטציות הקשורות לסרטן ב-CTCs. פרוטוקול זה מספק גישה מעשית לאיתור מוטציות הקשורות לסרטן בתאי גידול במחזור הפעולה ועשוי לתמוך במחקר נוסף על יישומי ביופסיה נוזלית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרה אתית:

דגימות דם נאספו ממקורות מורשים לשימוש מחקרי, והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל התורמים לפני איסוף הדגימות. כל הפרוטוקולים הניסיוניים שכללו דגימות דם אנושיות נבדקו ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של ספק דם, Discovery Life Sciences (אלבמה, ארה"ב). כל ההליכים הכוללים דגימות דם אנושיות בוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת המחקר המוסדית ולהצהרת הלסינקי.

1. העשרת תאי סרטן באמצעות מערכת בידוד תאים חצי-אוטומטית

הערה: סעיף זה מתאר העשרת תאי גידול בסיבוב (CTCs) באמצעות פלטפורמת בידוד תאים חצי-אוטומטית, ואחריה זיהוי מוטציות EGFR באמצעות PCR דיגיטלי בטיפות. דגימת CTC מודלית משמשת להוכחת היתכנות, ומומלץ לבצע אימות מבחן לפני יישום קליני. שני קווי תאים של סרטן ריאות לא-תאים קטנים (NSCLC) שימשו: NCI-H1975 (מוטציות EGFR L858R/T790M) ו-A549 (EGFR wild-type), ששימשו כבקרה שלילית לזיהוי מוטציות.

דגימת דם
1. ודא שקבלת הסכמה מדעת מתורמי דם/מטופלים לפני איסוף הדם. לקבל אישור מוועדת הביקורת המוסדית (IRB), במידת הצורך, למחקר הכולל דגימות אנושיות, כולל דם.
2. לבדיקות היתכנות, קבלו דגימת דם^{מספק צד שלישי} מורשה לשימוש מחקרי בלבד.
3. איסוף דם היקפי בחצוצרות אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) ומעבד את הדגימה באמצעות פרוטוקול העשרת ג'נסיס בתוך 48 שעות.
  הערה. לניתוח במורד הזרם ופרוטוקול העשרת ג'נסיס, מומלץ להשתמש בצינורות EDTA. Streck וצינור EDTA יכולים לשמש לצביעת חיסון על שקופית באמצעות פרוטוקולי Genesis Enumeration (ישיר/עקיף).
4. אחסן דגימות דם שנאספו בצינורות EDTA בטמפרטורה של 2–8 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לצורך בידוד תאי ג'נסיס, אין צורך בטיפול מוקדם וניתן להשתמש בדם מלא עד 10 מ"ל לפרוטוקול ההעשרה.
דגימת CTC מודלית/הכנת דגימה קלינית
1. הכינו תמיסת מלאי תאים בריכוז של 100–1,000 תאים במדיה מתאימה לתרבות תאים של 10 מיקרוליטר או בופר מלח (PBS). דלג על שלב זה אם יש דגימות קליניות בשימוש.
  הערה: הריכוזים הגבוהים במחקר זה גבוהים יותר מרמות ה-CTC הקליניות הנצפות בדרך כלל ומיועדים רק לצורך הדגמת שיטה.
2. הוסף את 10 מיקרוליטר של תמיסת מאגר התאים לתוך עד 10 מ"ל דם מלא מתורם בריא להכנת דגימת CTC לדוגמה. לדגימות קליניות, אין לכלול תאי סרטן בדגימות הדם המלאות של מטופלים.
3. מערבבים את דגימת הדם עם נפח שווה של PBS (1x) וערבבו בעדינות על נדנדה בדם בטמפרטורת החדר עד לשימוש. אם האחסון עולה על שעה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
העשרת CTC
1. הפעל את מערכת בידוד תאי הג'נסיס והמתין לאתחול המערכת. זה יכול לקחת עד 5 דקות.
2. הניחו את צנצנת הפסולת בבסיס מפרצי התחנה וחברו את צינור הצנצנת לפסולת.
3. לחץ את הצינור לשסתום הצמידה עד שתרגיש שהוא מתחבר למקום, וחבר את צינור מערכת הג'נסיס ליציאת צנצנת הפסולת.
4. הרץ בדיקה עצמית על ידי לחיצה על "התחל" ממסך הבית ולחיצה על 'בדיקה עצמית' על המסך.
5. כאשר הבדיקה העצמית מסתיימת, בחרו ב'העשרת ערכות 2.0' מתוך אפשרויות בחירת הפרוטוקול.
6. עקוב אחרי ההוראות שעל המסך, מלא את שדות הזנת הנתונים הנדרשים והשלים את תהליך ההכנה וההרכבה. פריימינג מוצלח באמצעות 70% אתנול ו-1x PBS מניב את ביצועי לכידת התאים וההתאוששות הטובים ביותר להפקת ה-DNA. הפריימר לוקח בערך 20 דקות להשלמה.
7. ודאו שתוכנית ההעשרה הנכונה (העשרת ערכות 2.0) נבחרה וכל חיבורי הצינורות ומיקומי הסלייד מאובטחים כראוי לפני תחילת הריצה. הימנעו מהחדרת בועות אוויר במהלך טעינת הדגימה, שכן הדבר עלול להשפיע על עקביות הזרימה ויעילות הלכידה.
8. יש להעביר בעדינות את דגימת המודל שהוכנה משלב 1.2.3 (דגם CTC Sample/Clinical Sample Preparation Machine) אל משפך הכניסה והמשך את פרוטוקול ההעשרה על ידי לחיצה על 'Resume' במסך המערכת.
9. כאשר לכידת ה-CTC מסתיימת, מערכת בידוד התאים החצי-אוטומטית תבקש מהמשתמש להסיר את צנצנת הפסולת ולחבר מחדש את מיכל הפריימרינג.
10. נתק את צינור מערכת הג'נסיס מהצנצנת והפיפט של 4 מ"ל בופר דילול אל מאגר הפריימינג.
11. חבר את מתאם הזרימה החוזרת למאגר הפריימר וחבר מחדש לצינור מערכת הג'נסיס. לחץ על המשך על המסך כדי להמשיך בפרוטוקול ההעשרה. זה משחרר את התאים שנתפסו במגלש המיקרופלואידי אל משפך הכניסה על ידי הפעלת זרימה חוזרת.
12. אסוף תאים ששוחזרו על ידי פיפטינג משפך הכניסה לצינור אפנדורף בנפח 5.0 מ"ל. ודאו שאתם אוספים את כל דגימות המים במשפך הכניסה, שלרוב יכולות לעלות על 4 מ"ל.
13. צנטריפוגה את הדגימה שנתפסה ב-600 גרם למשך 5 דקות כדי לשחק את התאים שנתפסו לפני פירוק התאים.
14. הסר את הסופרנטנט בזהירות והמשך לפרוטוקול חילוץ DNA (סעיף 1.4).
חילוץ DNA
אזהרה: DNAzol BD מזיק אם הוא בא במגע עם העור או נצרך. הימנעו ממגע עם עור ועיניים. השתמש רק בסביבת מכסה אדים כימית ואל תנשום ערפל/אדים/תרסיס. במקרה של מגע עם עור, שטוף מיד במים.
1. הוסף 1 מ"ל DNAzol BD ישירות לצינור משלב 1.3.14.
2. העבר את כל נפח הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מסוג Eppendorf DNA LoBind בנפח 1.5 מ"ל ונער בעוצמה.
3. דגור את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הפעילו את הצינור בעוצמה ודגרו בטמפרטורת החדר לפחות 4 דקות.
4. ודאו ערבוב מלא במהלך שלבי הליזה והשקיעה כדי למקסם את שחזור ה-DNA. טיפול אופציונלי ב-RNase עשוי להיכלל אם זיהום RNA מהווה חשש.
5. הוסיפו 400 מיקרוליטר איזופרופנול לתערובת דגימת ליזאט של תאי BD של DNAzol ישירות.
6. צנטריפוגה את הצינור בעוצמה של 10,000 גרם למשך 6 דקות כדי להוציא את ה-DNA.
7. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט ומוסיפים בעדינות 0.5 מ"ל DNAzol BD ל-DNA הכדורי.
8. מערבולת את הצינור עד שכדור ה-DNA מתפזר לחלוטין.
9. צנטריפוגה את התערובת ב-10,000 גרם למשך 5 דקות.
10. הסר את הסופרנטנט ושוטף את כדור ה-DNA על ידי פיפטינג של 1 מ"ל של 75% אתנול.
11. חזור על שלבים 9–10 לסך הכל שתי שטיחות.
12. הסר שאריות אתנול בתחתית הצינור באמצעות מיקרופיפט.
  הערה: ודאו שהכדור לא יהפוך ליבש לחלוטין.
13. הוסיפו 20 מיקרוליטר של מים דה-יוניים (DI) ללא DNase-/RNase כדי להמיס את ה-DNA מדגימות ה-CTC.
14. כמת DNA דו-גדילי (dsDNA) בדגימה באמצעות ערכות/פלטפורמות בדיקת כימות dsDNA, כגון ערכת בדיקה רגישות גבוהה של קיוביט 1x dsDNA או ניתוח DNA ברגישות גבוהה ביואנלייזר.
15. אחסן דגימות DNA שהופקו בטמפרטורה של 4°C או -20°C כדי למנוע התדרדרות.
  נקודת הפסקה: דגימות ה-DNA שנלקחו יכולות להישמר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחסון קצר טווח או ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך טווח לפני המשך ניתוחים במורד הזרם.

2. ניתוח מוטציות EGFR באמצעות ddPCR

PCR דיגיטלי הוא שיטה מתאימה לזיהוי מוטציות נדירות עם רגישות ודיוק גבוהים. בדיקות גילוי מוטציות ddPCR המסופקות בצינור יחיד כוללות בדרך כלל גלאי מסומן ב-FAM המכוון לאלל מוטנטי וגלאי נוסף עם תווית HEX המכוון לאלל מסוג פראי.

הגדרת תגובה ויצירת טיפות
1. הפשרה של ddPCR Supermix, בדיקות גילוי מוטציות ddPCR על הקרח.
2. מערבולת לכל צינור כדי להבטיח שהתכולה הומוגנית, שכן ייתכן שנוצר גרדיאנט ריכוז במהלך האחסון בטמפרטורה של -20°C.
3. צנטריפוגה לזמן קצר לתכולת המשקעים בתחתית הצינור ומניחים את הצינור על קרח.
4. הכינו דגימות DNA שהופקו בריכוז הרצוי לפני הכנת תערובת התגובה לפי המתכון בטבלה 1.
5. הכינו פרה-מיקס המכיל סופר-מיקס, בדיקות ואנזימי הגבלה, וכן מים לכל הדגימות הנדרשות לבדיקה, והוסיפו DNA לדגימה בנפרד כרכיב התגובה האחרון. ודא שהריכוז הסופי של דגימות ה-DNA הוא 50 fg–100 ng.
  הערה: מומלץ לפירוק DNA באמצעות עיכול הגבלה לפני יצירת טיפות כדי לשפר את הדיוק, להפחית צמיגות ולהגברת נגישות התבניות. מומלץ עיכול ישיר באמצעות 2–5 U של אנזים הגבלה במהלך הגדרת ddPCR. לבדיקות מוטציה נקודתיות EGFR (T790M/L858R), מומלץ MseI; עיין בגיליונות נתונים של מבחן לאנזימים תואמים לפני ההתאמה האישית. דפי נתונים זמינים להורדה לבדיקות בודדות מפורטל הבדיקות הדיגיטליות Bio-Rad (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | בית)
6. הכינו בקרה שלילית לפחות לבאר אחת, הכוללת רק תבנית מסוג בר בריכוז דומה לריכוז דגימות לא ידועות.
7. מערבב את צינורות התגובה לערבוב יסודי וצנטריפוגה לזמן קצר כדי לשקע את כל הדגימות לתחתית כל צינור תגובה. תן לצינורות התגובה להתאזן בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
8. טעין 20 מיקרוליטר מכל תערובת תגובה לבאר דגימה של מחסנית מיקרופלואידית (DG8 Cartridge), ואחריה 75 מיקרוליטר שמן ייצור טיפות לגששים לבארות הנפט.
9. כסה את המחסנית באטם והנח אותו בגנרטור טיפות QX200.
10. לחץ על הכפתור בחלק העליון של מחולל הטיפות כדי לסגור את המכסה. כאשר המכסה סגור, יצירת הטיפות מתחילה אוטומטית. הליך זה משלב את הדגימות והשמן בתעלות המיקרו-ערוצים של מחסנית המיקרופלואיד ליצירת אמולסיה של ~20,000 טיפות בגודל ננוליטר לכל דגימה.
הגברת PCR (תנאי מחזור תרמי)
1. תכנן תנאי מחזור תרמי על מחזור תרמי כפי שמומלץ בטבלה 2
2. כאשר יצירת הטיפות מסתיימת, כל האורות במכשיר ירוקים לחלוטין. פתח את הכלי על ידי לחיצה נוספת על הכפתור בגנרטור הטיפות והסר את מחזיק המקלט והמחסנית.
3. הסר את האטם החד-פעמי ושאוף 45 מיקרוליטר טיפות מהמחסנית, תוך שמירה על זווית קלה בקצה הפיפטה כדי למנוע קריעת טיפות.
4. השחרר טיפות ללוחות ddPCR 96-Well ואטום את הלוח עם אטם חום ללוח PCR באמצעות איטום לוחות PX1.
5. לאחר איטום פלטת 96 הבארות המכילה טיפות, העבר בזהירות את לוח 96 הבארות למחזור התרמי שהוכן בשלב 2.2.1 והתחל את המחזור התרמי.
קריאת טיפות וניתוח נתונים
1. הפעל את מכשיר ddPCR Droplet Reader (QX200 Droplet Reader או QX600 Droplet Reader) ומחשב מחובר שעליו מותקנת ומוגדרת תוכנת QX Manager.
2. לאחר סיום שלב המחזור התרמי, העבר את לוח 96 הבארות האטום למכשיר Droplet Reader.
3. Open QX Manager Software להגדרת פריסת לוח חדשה המבוססת על עיצוב ניסיוני. לחצו על לשונית 'Add Plate' והתוכנה תפעיל את כפתור Configure Plate. לחץ על 'קונפיגור לוחית' כדי להקצות פרטי דגימה ללוחית.
4. מלא את פרטי הלוחית ומידע הבאר, בחר את הבארות, ציין את תנאי המדגם, סוג הניסוי, שם היעד, סוג היעד, והפניה: ch1 עבור FAM ו-ch2 עבור צבע HEX.
5. לחץ על 'Apply' כדי לטעון את הבאר וכשתסיים, בחר 'OK'.
6. כאשר סידור הצלחת הושלמה עבור כל הדגימות, בחר 'Run' כדי להתחיל את תהליך קריאת הטיפות.
7. לאחר רכישת הנתונים, בחרו דגימות בבורר בארות תחת 'ניתוח' וקבעו סף מתאים לבדיקת ddPCR Mutation Detection כדי להבחין בין אותות מוטנטים לאותות מסוג פראי.
8. בבדיקות מוטציה דו-כיפיות כמו אלו שבפרוטוקול זה, ניתן להגדיר ספים אוטומטית באמצעות הגדרות ברירת המחדל של תוכנת מנהל QX (הפניה ל-fig בתוצאות).
9. לחלופין, ניתן להגדיר את הספים ידנית באמצעות שיטת הצלב או הלסו, כדי להבטיח שהגבולות או הגבולות של הלאסו מפרידים בין אשכולות חיוביים ושליליים וממוקמים בהתאם למיקומי אשכולות המוגדרים על ידי בקרות חיוביות ושליליות בכל ריצה.
  הערה: יש להגדיר ספים בעקביות בין דגימות בתוך אצווה באמצעות בקרות חיוביות ושליליות כדי להבטיח קריאות מוטציה שחוזרות.
10. הריכוז המדווח הוא מספרי העתק למיקרוליטר של התגובה הסופית של 1x ddPCR.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת בידוד תאי ג'נסיס עם שקופיות לכידת תאים מיקרופלואידיים בודדה בממוצע 84% מתאי הסרטן עם קפיצות בדגימות דם בריכוז של 25–250 תאים·מ"^ל-1 (איור 3A). יעילות הלכידה הגבוהה הזו מדגימה את יעילות שלב ההעשרה לבידוד תאי גידול נדירים מדגימות דם מלאות. צביעת אימונוצבעים אופציונלית של תאים שנלכדו בשקופיות לכידת תאים מיקרופלואידיים באמצעות פרוטוקול המערכת Enumeration הדגימה זיהוי תאים נדירים באמצעות שני נוגדנים חיוביים נגד ציטוקרטין, DAPI לזיהוי תאים גרעיניים ונוגדן שלילי אחד נגד CD45 המתבטא ברוב תאי הדם הלבנים אך בדרך כלל לא מתבטא ב-CTCs (איור 3B). דפוס צביעה זה מאשר את הזיהוי המוצלח של תאי גידול במחזור תוך היעדרת תאי דם לבנים רקע.

בדיקות גילוי מוטציות ddPCR אפשרו זיהוי ופרופיל של מוטציות EGFR בתאי סרטן מועשרים. מחקר זה הדגים זיהוי מוטציות gDNA בתאים, שהועשרו תחילה על ידי פלטפורמת Genesis, באמצעות ddPCR ובדיקות גילוי מוטציות. גרפים ddPCR (איור 4) של קווי תאי הסרטן A549 (סוג EGFR פראי) ו-H1975 (L858R/T790M) עבור שתי המוטציות שנבדקו ב-EGFR הראו ש-ddPCR יכול לזהות ברגישות מוטציות בקו התאים H1975 לאחר שזינק בדם מלא והעשיר אותו באמצעות פלטפורמת Genesis. אותות מוטציה חיוביים נצפו בתאי H1975, בעוד שלא זוהו אותות מוטציה בתאי A549, מה שמאשר את ספציפיות הבדיקה. הדגימות שקיבלו את קו התאים הביקורת A549 לא הראו מוטציות שנמצאו טיפות המאשרות כי זיהוי מוטציות ב-L858R ו-T790M קשור ספציפית לקו התאים H1975. הדגמה זו של בידוד CTC בפלטפורמת Genesis ואחריה ניתוח מולקולרי באמצעות ddPCR יכולה להציע כלי אבחון מולקולרי עוצמתי למחקרי ביופסיה נוזלית ומחקרים פרה-קליניים המשתמשים בדגימות קליניות למעקב אחר התקדמות המחלה וטיפול מותאם אישית. בסך הכול, תוצאות אלו מראות כי שילוב של העשרה ותהליך ddPCR יכול לזהות ולכמת באופן אמין מוטציות EGFR בתאי גידול במחזור הדם.

figure-results-1
איור 1: תהליך ביופסיה נוזלית לפרופיל מוטציות ב-DNA ב-EGFR בסרטן הריאות. (א) המחשה של הטרוגניות גידול המציגה פרופילים שונים של מוטציות EGFR שזוהו באמצעות ביופסיית רקמה קונבנציונלית ותאי גידול במחזור (CTCs) מביופסיה נוזלית. (B) תהליך עבודה סכמטי לפרופיל מוטציות DNA ב-EGFR בתאי גידול במחזור באמצעות ביופסיה נוזלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: הדגמה של פרופיל מוטציות DNA ב-EGFR באמצעות דגימות מלאכותיות. (א) הכנת דגימת CTC מודלית על ידי הזנת קווי תאי סרטן ריאה עם סטטוס מוטציה מוגדרת של EGFR לדם מלא מתורם בריא. (ב) תהליך עבודה הממחיש זיהוי מוטציות DNA ב-EGFR בתאי גידול במחזור באמצעות פלטפורמות זמינות מסחרית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: בידוד ללא תוויות וזיהוי תאי גידול במחזור הדם. (א) יעילות לכידת קווי תאי סרטן הריאות (A549 ו-H1975) שזינקו לדגימות דם מלאות מתורמים בריאים באמצעות פלטפורמת בידוד תאים נדירים חצי-אוטומטית. (ב) צביעת חיסון של תאים שנלכדו המראים תאי גידול חיוביים לציטוקרטין. פס קנה מידה = 10 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4. פרופיל מוטציות EGFR באמצעות PCR דיגיטלי מבוסס טיפות. גרפים דו-ממדיים של אמפליטודה המציגים זיהוי מוטציות EGFR בתאי סרטן מועשרים לאחר ניתוק תאים וחילוץ DNA. תאי A549 (סוג פראי) מראים היעדר אותות ספציפיים למוטציה, בעוד שתאי H1975 מציגים אותות חיוביים למוטציות EGFR L858R ו-T790M. המבחן מאפשר גילוי וכימות רגיש של אוכלוסיות DNA מוטנטיות וסוגי טבע. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

רכיב	נפח לתגובה (μl)	ריכוז סופי
2x ddPCR Supermix ל-Probes (ללא dUTP)	10	1x
20x פריימרים/גלאי מטרה (FAM) ופראי מסוג פראי (HEX)	1	1x
אנזים הגבלה, מדולל (Msel)	1	2-5 U/תגובה
דגימת יעד ו/או מים ללא DNase (NTA)	משתנה	משתנה
נפח כולל	20	-

טבלה 1: הגדרת תגובה לזיהוי מוטציות PCR דיגיטלי מבוסס טיפות. הרכב וריכוזים סופיים של תגובות המשמשים לזיהוי מוטציות נדירות של EGFR בדגימות DNA שמקורן בתאי סרטן.

שלב מחזור תרמי*	טמפרטורה	זמן	קצב רמפה	מספר המחזורים
שלב מחזור תרמי*	(ºC)	זמן	(ºC/sec)	מספר המחזורים
הפעלת אנזימים	95	10 דקות	2	1
דנאטורציה	94	30 שניות	2	40
אנילינג/הרחבה	55	דקה אחת	2	40
השבתת אנזימים	98	10 דקות	2	1
קירור	4	30 דקות	2	1
החזקה (אופציונלי)	4	∞ (אינסופי)	1	1
השתמש במכסה מחומם על 105 מעלות צלזיוס והגדר את נפח הדגימה ל-40 מיקרולטר עבור C1000 Touch Thermal Cycler עם מודול תגובת באר בעומק 96.

טבלה 2: תנאי מחזור תרמי להגברה דיגיטלית של PCR. פרמטרי מחזור תרמי המשמשים להגברה של מטרות מוטציה של EGFR באמצעות מחזור תרמי עם מודול תגובה של 96 בארות.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוכחות תאי גידול במחזור דם של מטופלים עם גידולים מוצקים הייתה נושא מחקר כבר למעלה מ-60^שנה, והוכרה כביופסיה נוזלית ראשונית מאז שהכנסתם לראשונה למונח הקולקטיבי בשנת 2010. עם זאת, CTCs נדירים, וקשה לבודד אותם באופן סלקטיבי מדם מלא⁹. עם זאת, ישנן שיטות רבות ללכידת והעשרת CTCs, כפי שמודגם בסקירות^{הבאות 10,11}, המכסות גישות פיזיקליות/מיקרופלואידיות וכן שיטות לבחירת סמנים על פני שטח התא. רבות מהשיטות הללו גוזלות זמן רב, דורשות עבודה רבה ולעיתים כוללות מספר שלבים/מערכות להשגת הסלקטיביות הנדרשת.

לכידת CTCs מדם מלא בפרוטוקול זה תלויה בגודלם (> 8 מיקרון) ובהיעדר עיוותים ברקע תאי דם אדומים ולבנים תקינים, העוברים דרך נקבוביות המיקרופלואידיקה בתוך שקופיות לכידת התאים המיקרופלואידיים. לכן, טעינת דגימות נכונה, פריימר נכון לסלייד, ומניעת סתימות הם צעדים קריטיים לשמירה על יעילות הלכידה והשבת דגימות.

כדי שתהליך העבודה יצליח, ניהול דגימות הדם הוא הגורם המרכזי; הבטחת שימוש בדם טרי לעיבוד דגימות ושמירה על תנאי הובלה ואחסון נכונים למניעת המוליזה. התדרדרות תאי דם אדומים או לבנים תשפיע על איכות לכידת ה-CTC ועל הרגישות לזיהוי של וריאנטים גנומיים נדירים, בהתאמה. אם נצפתים המוליזה, קרישה או התדרדרות דגימה נראית לעין, אין לעבד את הדגימה, שכן תנאים אלו עלולים להפחית את ההתאוששות מ-CTC ואת רגישות גילוי מוטציות בהמשך.

מכיוון ש-CTCs יכולים להימצא ברמות מתחת ל-1 CTC לכל 10 מיליון תאי דם לבנים בדם מלא, חשוב לאסוף נפח גדול ככל האפשר להעשרה. מחסניות לכידת תאי מיקרופלואיד יכולות להכיל 10 מ"ל דם בקו עם צינורות לכידת דם סטנדרטיים כמו Streck ו-EDTA, שבדרך כלל מחזיקים ~7.5–10 מ"ל דם. ירידה בנפח הדם שנאסף תשפיע ישירות על רגישות ללכידת CTC ועל גילוי וריאנטים גנומיים לאחר מכן. קבלת כמויות מעבר לשגרה זו ממטופלים המטופלים המטופלים יכולה להיות מאתגרת הן מבחינה קלינית והן מבחינה אתית. מעבר להגדלת נפח של יותר מ-10 מ"ל או שימוש בדגימות לאוקפרזיס אבחנתיות להגדלת אוכלוסיות WBC/CTC^ב-12, הגברת הרגישות עם נפחים גדולים יותר היא מעבר להיקף פלטפורמת Genesis כיום.

הפרוטוקול בוצע כפי שמפורט ב-SOP הסטנדרטי, אך תוך זהירות להבטיח איסוף דם טרי, ערבוב מקיף של EDTA עם דם בעת האיסוף ואחסון זהיר של הדם שנאסף לפני השימוש, מה שממחיש את הפוטנציאל לשימוש בפרוטוקול זה בסביבה קלינית שבה נהלי פעולה שגרתיים נחשבים להערכה. עם זאת, מכיוון שפרוטוקול זה הוכח באמצעות דגימות מלאכותיות, נדרש אימות עם דגימות קליניות לפני יישום קליני שגרתי.

הרגישות לזיהוי מוטציות באוכלוסיית CTC תלויה הן בנוכחות CTCs בדגימת דם שלמה סטנדרטית והן בזיהוי מאוחר יותר של מוטציות סומטיות בתוך אותה אוכלוסיית CTC, התלויה בתדירות המוטציה בתת-אוכלוסיית ה-CTC. שני הגורמים המבלבלים הללו יגבילו בסופו של דבר את הרגישות הכוללת לזיהוי מוטציות באוכלוסיית CTC שנלכדה; השפעה גדולה יותר בדגימות גילוי מוקדם, בהשוואה לדגימות בשלב מאוחר שסביר שיהיו בעלות ספירות CTC גבוהות יותר ואוכלוסיות CTC נושאות מוטציות גבוהות יותר.

מחקרי ביופסיה נוזלית מבוססי דם קיימים נוטים מאוד לכיוון DNA גידול במחזור הקיים בפלזמה כאינדיקציה לנוכחות גידול. בדרך כלל, זיהוי ctDNA מבוסס על נוכחות סמנים גנומיים ספציפיים לגידול, כגון SNVs, וריאנטים מבניים, MSI-H, TMB ו-CGP. CTCs, כסמן ביולוגי פחות בשימוש אך יעיל באותה מידה בביופסיה נוזלית, ידוע כנשפך לזרם הדם כתוצאה מגידולים שגדלים ועלולים להפיץ גרורות⁸. הניתוח של CTCs מתמקד בעיקר בסמנים על פני שטח התאים המשמשים ללכידה או לאימות לאחר הלכידה, תוך שימוש בפאנלים מוכרים או מותאמים אישית כגון פאן-ציטוקרטין, וימנטין, PD-L1, EpCAM ועוד. לעומת זאת, ניתוח מולקולרי של CTCs מוגבל באימוץ בשל האתגרים של העשרת ולכידת CTCs באופן סלקטיבי מדם מלא ואחריו ניתוח מדויק של תת-אוכלוסיית ה-CTC. השיטה הנוכחית עושה שימוש בזרימת עבודה סטנדרטית הכוללת פרוטוקולים מבוססים ללכידת CTC, ואחריה ניתוח מולקולרי באמצעות ddPCR עם בדיקות מוכנות למוטציות גנומיות פתולוגיות רלוונטיות בדגימות דם מלאכות. גישה זו משמעותית משום שהיא מאפשרת פרופיל מוטציות ישירות מ-CTCs מועשרים, ומשלימה גישות ביופסיה נוזלית מבוססות ctDNA בפלזמה.

באמצעות הגישה הנוכחית, ניתן לחקור CTCs נדירים שנלכדו הן מבחינת נוכחותם בדם מלא והן מבחינת נוכחות של סמנים גנומיים רלוונטיים פתולוגית באוכלוסיית ה-CTC. מחקרים הראו את הערך של הערכת פרופיל ה-ctDNA של חולי סרטן ומאגר ה-CTC המסתובב במקביל ל-ctDNA¹³, כאשר הערכת שני מקורות המוטציות מרחיבה את הנוף המולקולרי הכולל של מטופלים בודדים. יש לכך פוטנציאל לפיתוח פרדיגמות בדיקת פתולוגיה במסגרת מחקר תרגומי בתחילה, אך בסופו של דבר בסביבה קלינית. הפרדיגמה החדשה תשלב הן את נוכחות ה-CTC כאינדיקציה לנוכחות/התקדמות הסרטן והן מוטציות פתולוגיות הקיימות בתאי ה-CTC שנלכדו, מה שעשוי להעיד על התרחבות קלונלית או עמידות טיפולית¹⁴. המשמעות לכך היא שהתפתחות גרורות והתרחבות קלונלית, ואחריה עמידות לתרופות לאחר מכן, יכולות להיות מנוטרות במקביל הן ברמת ה-ctDNA והן ברמת ה-CTC, ולהשפיע ישירות על בחירת הטיפול בשלב מאוחר יותר בסרטן.

יישומים עתידיים עשויים לכלול התאמת זרימת עבודה זו למוטציות נוספות הקשורות לסרטן ובדיקת ביצועיה בדגימות קליניות לאורך זמן.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לאביודון בודונרין, סינתיה שו, אג'יתה קריסטי-דיוויד, אנדרו פרנטנר ואריל פוסוד על עזרתם בניסויי ddPCR, טיפול בתאי סרטן וניסויי בידוד תאי סרטן עבור מחקר זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Refered as "Semi-automated cell isolation system")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrument
QX200 Droplet Reader or QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 or 12013328	Instrument (Refered as "Droplet Reader instrument ")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrument
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrument
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrument
Celselect Slides			Consumable (Refered as Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consumable
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagent
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	Reagent
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Assay
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Assay
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Assay kit
DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consumable
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consumable
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consumable (optional)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagent
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Pierceable foil seal
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Consumable
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consumable