Method Article

שיטת קו-קולטורציה תלת-ממדית לחקר אינטראקציות עקיפות בין סוגי תאים שונים על פני ממברנת בסיס מחודשת

DOI:

10.3791/70027

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מפרט שיטה פשוטה לקו-קולטורה תלת-ממדית של שני סוגי תאים, המופרדים על ידי ממברנת בסיס משוחזרת, שדורשת מעט ציוד מיוחד וניתנת לניתוח בקלות באמצעות מגוון טכניקות ניסויות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קו-קולטורציה תלת-ממדית (3D) היא טכניקה המתפתחת במהירות עבור חוקרים המעוניינים לחקור במדויק אינטראקציות תא-תא באמצעות ניסויים במבחנה . המגבלות של תרבית תאים חד-שכבתיים, כולל אינטראקציות מוגבלות בין הסביבה התאית לסביבה החוץ-תאית ומורפולוגיית תא מופרעת, מטופלות על ידי סימולציה של סביבה תאית בתוך החיים . באמצעות פיגום לתמיכה מבנית וכולל רכיבים ביולוגיים של מטריצה חוץ-תאית פעילה, תרביות תלת-ממדיות מציגות התנהגויות ומורפולוגיות התואמות יותר לרקמה. שילוב סוגי תאים מרובים בסביבה תלת-ממדית כזו מאפשר חקר אינטראקציות תא-תא בתוך מערכת מודלים ביוממטית. מגוון רחב של טכנולוגיות קו-קולטורה תלת-ממדית צצו, שלכל אחת מהן יתרונות ואתגרים משלה. לעיתים קרובות טכנולוגיות אלו דורשות ציוד ייעודי, מבנה מורכב או ידע טכני ספציפי. כמו כן, קיימות מספר שיטות סטנדרטיות לחקר אינטראקציות עקיפות בין תאים בין שני סוגי תאים המופרדים על ידי ממברנת בסיס מחודשת. כאן, אנו מתארים שיטת קו-קולטורציה תלת-ממדית שדורשת רק מיומנויות טכניות בסיסיות ומשתמשת בחומרים רחבים יותר כדי לשחזר בהצלחה אינטראקציות עקיפות בין תאים לתא דרך ממברנת הבסיס. שכבה מונו-שכבתית של תאים מכוסה בשכבה של מטריצה חוץ-תאית, בצורת מטריג'ל, וסוג תא שני מוזרע מעליה. הקו-קולטורה המתקבלת נשמרת במשך חמישה ימים, אז התאים מנותחים לשינויים מורפולוגיים באמצעות אימונופלואורסצנציה או מופקים מהקו-קולטורה לניתוחים גנומיים, טרנסקריפטומיים או פרוטאומיים מפורטים יותר. פרוטוקול זה אידיאלי לחקר השפעת התקשורת בין תאים לתא על התנהגות התא כאשר מגע פיזי אסור על ידי ממברנת הבסיס. ככל שהחוקרים ממשיכים לבחור בשיטות תרביות תאים רלוונטיות לחיות , יש צורך בגישה יעילה כדי להימנע ממחסומי כניסה גבוהים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרבית תאים במבחנה היא טכניקת מחקר חזקה, מהירה ונפוצה. למרות ששיטות תרביות תאים מסורתיות הן חזקות, הן שונות מאוד מסביבה בתוך החיים. הטבע המוגבל במרחב של תרבית תאים חד-שכבתית מוביל לשינויים בביטוי גנים, במורפולוגיה ובביוכימיה 1,2,3. טכניקות תרביות תלת-ממדיות (3D) מתמודדות עם הפער הזה, כאשר תאים גדלים בתוך פיגום המדמה את המטריצה החוץ-תאית (ECM) הנמצאת באיברים וברקמות. בתרבות תלת-ממדית, תאים מציגים מורפולוגיה והתנהגות דומה יותר לאלו שנראים ב-vivo 4,5. עם זאת, תרבית תלת-ממדית לבדה אינה משקפת במלואה את המרכיבים הרבים של מיקרו-סביבה בתוך החיים, משום שחסרה לה תרומות מסוגי תאים אחרים6.

אינטראקציות ישירות (מגע בין תאים) ועקיפות בין תאים ממלאות תפקיד מרכזי בהתנהגות התאים ב-vivo 7,8. סיכום אינטראקציות אלו דורש מודלים של קו-קולטורה תלת-ממדית, שבהם מספר סוגי תאים מתרבתים יחד בסביבה תלת-ממדית. באמצעות טכניקות אלו, ניתן להקים סביבה דמוית גידול ב-in vivo in vitro, מה שמשפר את הרלוונטיות הביולוגיתשל התוצאות. עם זאת, ככל שהסביבה הנדרשת לניסוי מסוים ספציפית יותר, כך המתודולוגיה הופכת למורכבת יותר. אין מערכת מודלים סטנדרטית שניתן להשתמש בה לחקר אינטראקציות תא-תא בין תאים המופרדים על ידי מטריצת ממברנה בסיסית. לכן, פרוטוקול זה תוכנן לדמות אינטראקציות תא-תא המתרחשות במטריצת ממברנה בסיסית בצורה חזקה וניתנת לשחזור. הטכניקה, שהותאמה ממודל תרבית תלת-ממדי11 שהוקם בעבר, משתמשת בשכבת מטריג'ל, המכונה בג'ל ECM, כדי להפריד פיזית בין שני סוגי תאים שונים בתרבית תוך מתן אפשרות לגורמים המופרשים לעבור. הוא תוכנן במקור לחקור את ההשפעה העקיפה של שומניות על תאי סרטן השד המזנכימליים, אך ניתן להתאים אותו בקלות כדי להתאים למגוון סוגי תאים. יש לשקול היטב האם שיטה זו מתאימה לעיצוב ניסוי מסוים. שיטה זו אינה מאפשרת אינטראקציה ישירה בין תא לתא, ולכן יש להגביל אותה למידול תרחישים ב-vivo הכוללים תקשורת עקיפה בין תאים דרך מטריצת ממברנה בסיסית. לדוגמה, מערכת זו אינה אידיאלית למידול האינטראקציות בין תאי T ציטוטוקסיים לתאי גידול, שכן הם בדרך כלל מתקשרים ישירות. במקום זאת, שקלו תרחישים ביולוגיים שבהם ממברנת בסיס מפרידה באופן טבעי בין שני סוגי התאים הרלוונטיים. לדוגמה, שיטה זו יכולה לשמש ללימוד אינטראקציות בין תאי גידול לתאי אנדותל וסקולריים לפני הכניסה לתוך-וותל.

שיטת קו-קולטורציה תלת-ממדית נפוצה כוללת שימוש בשבבים מיוחדים למיקרופלואידיקה, או "איבר-על-שבב (OoC)". מערכות OoC הן עוצמתיות וניתנות להתאמה לניסויים בודדים, אך דורשות זמן ומשאבים משמעותיים שהושקעו בתכנון שבבים, בחירת חומרים, ציוד היקפי, אופטימיזציה ואיסוף נתונים12,13. בנוסף, כיום אין חומר או שיטה סטנדרטית שיכולה לספק את הרמזים הביולוגיים והפיזיקליים של מטריצת ממברנת הבסיס מבלי להפריע לזרימה מיקרופלואידית14. לכן, יישום טכנולוגיית OoC במחקרים של אינטראקציות תא-תא ברחבי ממברנת הבסיס מציב אתגרים נוספים. השיטה המפורטת בפרוטוקול זה שואפת להציע חלופה סטנדרטית השומרת על רלוונטיות ביולוגית ונגישות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה (איור 1A) מתאר מערכת קו-קולטורציה תלת-ממדית שנועדה לשחזר אינטראקציות תא-תא על פני מטריצת ממברנה בסיסית. ניתוח במורד הזרם אפשרי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1B) או על ידי איסוף תאים מתוך הקו-קולטורציה (איור 1C). באמצעות מבנה 'סנדוויץ', שבו שכבת ג'ל ECM מונחת בין שתי אוכלוסיות תאים, הפרוטוקול אינו דורש מכשיר מיוחד וניתן לבצע אותו עם ידע בסיסי בטכניקות תרבית תאים מודרניות.

1. 3D הכנה לקוקולטורה

הערה: הפרוטוקול המתואר מיועד להיות יישום מייצג של שיטת התרבות המשותפת התלת-ממדית המשתמשת בשומנים 3T3-L1 ותאי סרטן השד MDA-MB-231. השימוש בסוגי תאים שונים ידרוש אופטימיזציה של צפיפות הזריעה של התאים ובדיקות מוקדמות של חלקי ג'ל ECM כדי להבטיח יעילות. פרוטוקול זה מתייחס לשימוש בבקרת ללא שומן ושליטה במדיה מותנית. ייתכן שיידרשו יותר בקרות בהתאם למטרה הניסויית.

  1. תרבית תאים והכנת תמיסה
    1. לרכוש ולהקים תרביות של קווי תאי סרטן השד 3T3-L1 פרה-אדיפוציטים ו-MDA-MB-231. לגדל ולתחזק באופן עצמאי את כל התאים באמצעות טכניקת אספטיקה בארון בטיחות ביולוגי מסוג II ובשיטות תרבית תאים סטנדרטיות15. לשמור על תאי 3T3-L1 ב-Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM) בתוספת 10% (v/v) לסרום עגל (NBCS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL). לשמור על תאי MDA-MB-231 ב-RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL).
      הערה: לעולם אל תאפשר לתאי 3T3-L1 לעבור את המפגש של 80% במהלך התחזוקה, ואל תשתמש בתרביות מעבר למספרהמעבר ה-20.
    2. רכוש או הכין תמיסה מלאית של 1x מלח עם בופר פוספט (PBS) עם 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4.
    3. הכינו 50 מ"ל של תמיסת שטיפת PBS-גליסין על ידי הוספת 0.375 גרם גליצין ל-50 מ"ל PBS לריכוז גליציני סופי של 100 מ"מ. יש לאחסן תמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים.
    4. הכינו 10 מ"ל של בופר חדירות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר טריטון X-100 ל-9.5 מ"ל PBS. מלא עד 10 מ"ל לריכוז סופי של 0.5% (v/v) טריטון X-100. אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך חודש.
    5. יש להכין 50 מ"ל של בופר אימונופלואורסצנציה (IF) על ידי הוספת 50 מיקרוגרם אלבומין סרום בקר (BSA), 100 מיקרו-ליטר טריטון X-100, ו-25 מיקרוליטר של טווין-20 עד 45 מ"ל של PBS. מלא עד 50 מ"ל לריכוז סופי של 0.1% (עם v) BSA, 0.2% (v/v) טריטון X-100, ו-0.05% (v/v) Tween-20. אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך חודש.
    6. הכינו 10 מ"ל של בופר חוסם על ידי הוספת 1 מ"ל סרום בעלי חיים ל-9 מ"ל של בופר IF לריכוז סופי של 10% סרום. אחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך חודש.
      הערה: זיהוי המין של הסרום תלוי במין המארח של הנוגדנים הפלואורסצנטיים המשניים (ראו 2.2.4).
    7. הפשיר ג'ל ECM (ריכוז חלבון כולל ~9-9.5 מ"ג/מ"ל) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. הכינו 500 מיקרו-ליטר אליקווטים בצינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 20°C.
      הערה: ג'ל ECM משתנה מאוד ויש לאמת אותו כדי לעורר את ההתנהגות הצפויה בכל סוג תא. סוגי תאים שונים עשויים לדרוש ריכוזי חלבון שונים או קשיחות מטריצית שונה.
      הערה: תמיד השתמש בקצוות ומיכלים מקוררים מראש בפיפטה בעת טיפול בג'ל ECM כדי למנוע פולימריזציה בטמפרטורת החדר. תמיד תשמור את ג'ל ה-ECM על הקרח בזמן הטיפול.
  2. הבדלת שומן
    1. זרעו 50,000 עד 80,000 פרה-אדיפוציטים 3T3-L1 ב-0.5 מ"ל של מדיום גדילה סטנדרטי לתוך 2 בארות של סלייד תא 4 בארות. הבארות הריקות ישמשו לבקרות ללא שומן ומדיה מותנית.
      הערה: תרביות תאי סלייד תא חשופות להפרעות מכניות. הימנעו משאיפת ואקום של מדיה והשתמשו בטכניקת פיפטינג עדינה עם פיפטורים ידניים.
    2. זרעו 50,000 עד 80,000 פרה-שומן 3T3-L1 ב-0.5 מ"ל של מדיום גדילה סטנדרטי לבאר אחת עם פלטת תרבית רקמה בת 24 בארות. זה ישמש לאיסוף מדיה מותנית לשליטה במדיה מותנית.
    3. אפשר לשתי התרבויות להגיע למפגש של 100% במשך 24 שעות.
    4. התחל אדיפוגנזה על ידי החלפת מדיום הגידול במדיום התחלת אדיפוגנזה, הכולל DMEM בתוספת 10% FBS, 0.5 mM 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX), ו-1 מיקרומום דקסמתאזון. דגרו את התאים במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5%CO2 .
    5. לאחר 48 שעות, החליפו את המדיום המנוצל במדיום התקדמות אדיפוגנזיס טרי, הכולל DMEM עם 10% FBS ו-10 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין. דגרו תאים במשך עוד 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5%CO2 .
    6. לפני שממשיכים בתרבות משותפת תלת-ממדית, יש לאשר ויזואלית את נוכחות טיפות השומן ב->60% מהתאים. אם הצטברות טיפות השומן איטית, החלף את מדיום ההתקדמות ב-DMEM עם תוספת של 10% FBS ועקוב אחרי תכולת השומנים כל 24 שעות.
  3. שכבה ותחזוקה של קו-קולטורה תלת-ממדית
    1. הפשרו את ג'ל ה-ECM בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני שממשיכים עם השכבה.
      הערה: כדי להימנע מהשפעות של שונות בין כמות, מומלץ להשתמש באותה כמות של ג'ל ECM לכל הניסויים במחקר אחד.
    2. לאחר התמיינות מוצלחת של 3T3-L1s, יש להסיר את המדיה המותשת, ומשאירים בופר קטן של ~50 מיקרוליטר של מדיום.
    3. הוסיפו בזהירות 110 מיקרוליטר ג'ל ECM לכל באר המכילה דיפוציטים במחסנית התא, תוך זהירות שלא להפריע לשכבת הדיפוציטים המונולרית.
      הערה: ג'ל ECM מתקשה במהירות בטמפרטורת החדר. כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת של מטריצה, תמיד שמרו את ג'ל ה-ECM על קרח והשתמשו בקצוות מקוררים מראש בטמפרטורה של -20°C.
    4. הוסיפו 110 מיקרוליטר ג'ל ECM לבאר הבקרה הריקה ללא שדיפוציטים. כדי להבטיח פיזור אחיד של מטריג'ל, הוסיפו בדרופ בפינות הבאר ובאמצע הבאר. השתמש בקצה הפיפטה כדי לפזר בעדינות את המטריגל על פני שטח התרבית מבלי לגרד.
    5. דגרו את הסלייד לשעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לג'ל ה-ECM לפולימריז.
    6. במהלך שלב הדגירה, איסוף וספירה של תאי MDA-MB-231
      אופציונלי: ראו שלב 1.4 לפרטים על סימון פלואורסצנטי של תאים אלה.
    7. הכינו תלייה מדוללת של תאי MDA-MB-231 ב-30,000 תאים/מ"ל במדיום גדילה של שד המכיל 2% ג'ל ECM (v/v).
      הערה: צפיפות הזריעה האופטימלית של תאים משתנה בין סוגי התאים ויש לאופטימיזציה לפני הניסוי. הערה: מדיום גידול שד הוא מדיום תרבית תאים זמין מסחרית המותאם לתאי אפיתל של שד. הוא מכיל 0.4% תמצית יותרת מוח בקר, 10 ng/mL גורם גדילה אפידרמלי (רקומביננטי אנושי), 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין (אדם רקומביננטי), ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון. יש לבחור את מדיום הקו-קולטורה בקפידה כדי להתאים לצרכים של שני סוגי התאים.
    8. לאחר שג'ל ה-ECM פולימר, הוסף בעדינות 450 מיקרוליטר של תלייה MDA-MB-231 לכל באר. זה מוביל לספירת תאים כוללת של 13,500 תאים לבאר.
      הערה: שכבה לא אחידה של תליית התא מעל הג'ל היא אפשרות בשלב זה. העריכו ויזואלית את צידי התא והקישו בעדינות על כל צדדי התא כדי לפזור באופן אחיד.
    9. לתרבות השומן על לוח 24 הבארות, הוסף 450 מיקרוליטר של מדיום גדילה חזה המכיל 2% ג'ל ECM (v/v). קצור והחלפת מדיה כל 48 שעות.
    10. שמרו על הקו-קולטור למשך מקסימום 5 ימים, עם החלפות מדיה כל 48 שעות.
      הערה: הימנעו משאיפת ואקום והשתמשו בפיפטינג עדין. ניתוק ג'ל ה-ECM הוא בעיה אפשרית שעלולה להתעורר במהלך תחזוקת הקו-קולטורה.
    11. לשליטה במדיה מותאמת בלבד, הדיפוציטים המדוללים (משלב 1.3.9) התכוננו 1:1 עם מדיה טרייה לפני החלפת מדיה קו-תרבותית משוממת בימים 2 ו-4.
      הערה: בשלב זה, תקופת הקו-קולטורציה הסתיימה ויש לנתח אותה או על ידי קיבוע וצביעה של התרביות כדי לקבוע את המורפולוגיה והביטוי של הסמנים (ראו סעיף 2) או על ידי חילוץ תאים מסביבת הקו-קולטורה והכנת תאים לניתוח בהמשך הזרם (ראו סעיף 3).
  4. תיוג תאים פלואורסצנטיים (אופציונלי)
    הערה: ניתן לבצע תיוג תאים מונחים לפני שלב 1.3.7 כדי לסייע בזיהוי תאים מונחים במהלך צילום תמונות אימונופלואורסצנטיות.
    1. הכינו תמיסת מלאי של 5 מ"מ של קרבוקסיפלואורסאין דיאצטט סוקסינימידיל אסטר (CFSE) על ידי המסה של 10 מ"ג CFSE ב-4.22 מ"ל DMSO. לאחסן ב-500 מיקרוליטר אליקווטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, מוגן מאור.
    2. לאחר ספירת תאים משלב 1.3.6, שטוף תאים פעם אחת עם 5 מ"ל PBS. החזירו את הכדור שנוצר ב-1x PBS לריכוז סופי של 1,000,000 תאים/מ"ל.
    3. הוסף 1 מיקרוליטר של 5 מילימטר CFSE לכל מ"ל של מתלה תא כדי להגיע לריכוז עבודה סופי של 5 מיקרומון. דגר את המתלה התא למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מאור.
    4. הכיבוי את צביעת ה-CFSE על ידי הוספת 5 נפחים של מדיום תרבית. דגרו עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. תאי פלט ושטפו פעמיים עם PBS כדי להסיר שאריות CFSE. החזירו את התאים למדיום גידול שד שהתחמם מראש. דגרו עוד 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לוודא שלא יישאר צבע.
    6. תאים מתויגים פלואורסצנטית בזרעים כפי שמתואר בשלב 1.3.7. שאר הפרוטוקול יכול להתבצע כפי שתואר.

2. אימונופלואורסצנציה

  1. קיבוע
    הערה: כדי למנוע דה-פולימריזציה של ג'ל ECM ואובדן דגימות במהלך הכביסה, אפשר לכל החומרים להתאזן לטמפרטורת החדר למשך ~30 דקות לפני השימוש.
    1. לאחר 5 ימי קו-קולטור, החליפו את המדיה ב-500 מיקרוליטר PBS.
      הערה: שלבים 2.1.2 עד 2.3.7 יכולים להתבצע בתנאים לא סטריליים.
    2. הסר את PBS והחלף ב-2% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-PBS (מוכן טרי) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      הערה: ג'ל ECM רגיש ל-PFA ועלול לגרום להיפרדות שכבת הג'ל.
      אזהרה: PFA מתפרק לפורמלדהיד עם הזמן. הימנעו משאיפת אדים, וודאו אוורור מספק, ותמיד לבשו ציוד מגן אישי מתאים (כגון כפפות, חלוק מעבדה, מגן עיניים) בעת טיפול ב-PFA.
    3. הסר PFA ושוטף בארות עם 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה PBS-Glycine למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין.
      הערה: השימוש בשטיפת PBS-Glycine הוא קריטי למניעת יצירת פלואורסצנציה רקעית על ידי אלדהידים חופשיים. אין לשטוף ב-PBS בלי גליצין.
    4. חזור על שלב 2.1.3 פעמיים לסך הכל שלוש שטיפות בלבד. ראה 2.1.5 לתנאי אחסון, דלג לשלב 2.2.2 אם לא צריך.
    5. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול עד שבוע אחד, וניתן לאחסן את המחסנית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדי לאחסן את המחסנית, מלא את כל הבארות ב-1 מ"ל PBS, ואטום את מכסה המגלשה בסרט דק של פאראפילם. הניחו את המחסנית שטוחה במיכל עמיד לאור, מעל טישו עדין רטוב כדי להבטיח שהתרביות לא יתייבשו.
  2. צביעת נוגדנים
    1. הביאו את הסליידס שהיו מאוחסנים לטמפרטורת החדר, הסרו PBS, ושטפו בארות עם 500 מיקרוליטר PBS טרי למשך 15 דקות עם ערבוב עדין. דלג על שלב זה אם ממשיך ישר מהשלב 2.1.4.
    2. פרמיאביליזציה של תאים עם 500 מיקרוליטר של בופר פרמיאביליזציה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב.
    3. שטוף בארות עם 500 מיקרוליטר של PBS, עם 15 דקות של ערבוב עדין. חזור על זה פעמיים לסך הכל 3 שטיחות.
    4. הוסיפו 500 מיקרוליטר של בופר חוסם לכל באר ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין.
      הערה: ודא שמין המקור של הסרום בבופר החוסם תואם למין המארח של נוגדן משני. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בסרום חמור ובנוגדנים משניים לחמור.
    5. לדלל נוגדנים ראשוניים שמעניינים ב-IF buffer, לפי המלצות היצרן. הסר את בופר החוסם והוסיף 300 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים מדוללת לכל באר.
    6. אטום את מכסה מחסנית התא עם פרפילם והניח את המחסנית במיכל עמיד לאור. דגרו לילה בטמפרטורה של 4°C עם ערבוב עדין.
    7. שטוף בארות עם 500 מיקרוליטר של בופר IF, עם 15 דקות של ערבוב עדין. חזור על זה פעמיים לסך הכל 3 שטיחות.
    8. לדלל נוגדנים משניים מסומנים פלואורסצנטיים בבופר IF, בהתאם להמלצות היצרן. הוסף 300 מיקרוליטר של דילול נוגדנים משני לכל באר ודגר במשך שעה בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין.
      הערה: הימנעו מחשיפה ממושכת לאור לאחר שלב זה כדי להגביל את הפוטוליצ'ינג.
    9. חזור על שלב 2.2.7.
    10. דילל תמיסה של 300 מיקרומום של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) 1:800 ב-PBS. הוסף 300 מיקרוליטר לכל באר ודגר במשך 20 דקות, בטמפרטורת החדר, עם ערבוב עדין.
    11. שטוף תאים עם 500 מיקרוליטר PBS למשך 5 דקות עם ערבוב עדין. חזור על זה פעם אחת.
  3. התקנת מחסנית
    1. הסר כמה שיותר שארית PBS מבלי להפריע לתרבויות. החלף את המכסה והפרד את התא ממחסנית הזכוכית באמצעות הכלי שסופק על ידי יצרן מחסניות התא.
    2. באמצעות טישו עדין, נגב את קצוות הסלייד כדי להסיר שאריות PBS מבלי להפריע לג'ל ה-ECM.
    3. הזרקו לאט חומר איטום סיליקון סביב קצוות המחסנית באמצעות מזרק ומחט 18G. תן 3 דקות לסיליקון להתייצב.
    4. בזמן שהסיליקון מתייצב, הוסף 1-2 טיפות של מדיית הרכבה נגד פייד לכל באר. הימנע מבועות. אם נוצרות בועות, השתמש בפיפטה כדי להסיר אותן בזהירות מבלי לפגוע בתרבית.
    5. לאחר שהסיליקון התייצב, הורד בעדינות כיסוי זכוכית בזווית רדודה. השתמש במלקחיים או בקצה פיפטה כדי להוציא בועות אוויר בזמן שהכיסוי מוריד. השתמש בלחץ עדין כדי לא לשבור את הכיסוי.
    6. הניחו את הסלייד במיכל עמיד לאור בטמפרטורת החדר ותנו לה להתייצב ללילה. ניתן לאחסן את המחסנית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והפרוטוקול עוצר עד שבוע.
      הערה (אופציונלי): כדי לאטום טוב יותר את הסלייד, מרחי לק שקופ על קצוות הכיסוי שעה לאחר ההחלקה של הכיסוי.
    7. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקלי בהגדלה של 10-20x. ללכוד חמישה שדות ראייה אקראיים כדי למזער הטיית אופרטורים.

3. קצירת קו-תרביות לניתוח במורד הזרם

הערה: איסוף תאים או ביומולקולות אינו תואם לאימונופלואורסצנציה. מומלץ לגדל קו-קולטורטורים המיועדים לניתוחים אחרים במורד הזרם בצלחות תרבית סטנדרטיות של 24 בארות, תוך שימוש באותם ריכוזי תאים ונפחים כפי שמפורטים בסעיפים 1 ו-2.

  1. חילוץ תאים
    1. הסירו את המדיה המשומשת ושטפו בעדינות בארות עם PBS קר כקרח. חזור על הפעולה פעם אחת לסך הכל שתי שטיפות רגילות.
    2. באמצעות קצה פיפטה רחב-קינה, הוסף 1 מ"ל של תמיסת התאוששות קרה, הנקראת כאן תמיסת התאוששות. הפיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריע לשכבת הג'ל של ה-ECM. העבר נוזל לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: תמיסת שחזור תאים היא תמיסה לא-אנזימטית זמינה מסחרית, שנועדה לשחרר בעדינות תאים הטבועים בג'ל ECM. זהו הרכב קנייני ועלול להיות לא תואם לסוגי תאים מסוימים. כחלופה, ניתן לשקול דה-פולימריזציה אנזימטית של ג'ל ה-ECM באמצעות חלבונים עדינים כמו דיספאז או אקוטאז. זה ידרוש דגירה של 37 מעלות צלזיוס יחד עם אופטימיזציה של זמן הדגירה.
    3. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת התאוששות קרה לכל באר כדי לאסוף תאים שנותרו. העבר לצינור המיקרוצנטריפוגה המתאים.
    4. הפוך צינורות 4-5 פעמים לערבוב.
    5. העבר את הצינורות לקרח ודגר במשך 60 דקות עם ערבוב עדין. כל 10 דקות, הפכו את הצינורות 2-3 פעמים כדי למנוע שקיעת תכולת הצינורות.
    6. צינורות צנטריפוגה ב-300 x g למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס
    7. אמת את נוכחות כדור תא גלוי גלוי. הסר בזהירות את הסופרנטנט והוסיף 1 מ"ל של 1x PBS קר כקרח. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. חזור על הפעולה פעם אחת לסך הכל שתי שטיפות רגילות. צפו שהכדור יכיל 80-90% מהתאים הזרעים בתחילה, כאשר הפרופורציות של כל סוג תא יישארו קבועות.
      הערה: בשלב זה, ניתן לעבור ליזה של כדור התא לאיסוף חלבונים או חומצות גרעין. כדורי לייזד יכולים להיאחסן בטמפרטורה של -80°C, והפרוטוקול יכול להיות מושהה למשך 3 חודשים. Lysis אינו תואם לגרסה 3.2.
  2. הכנת מתלים חד-תאיים
    1. החזירו את הכדור ב-200 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 דקות.
    2. הוסף 600 מיקרול של מדיום גדילה מלא כדי להרגיע את עיכול הטריפסין.
    3. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט והוסיף 500 מיקרוליטר של PBS בטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה פעם אחת לסך הכל שתי שטיפות רגילות.
    5. השעתי כדור ב-80 מיקרוליטר PBS עם 0.04% BSA, מתלה מסנן באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרון.
    6. מדלל 5 מיקרוליטר של מתלים ב-5 מיקרוליטר של כחול טרייפן. לספור תאים ולהעריך את הקיימות על המציטומטר. התאים מוכנים כעת לניתוח במסגרת הזרם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את יעילות הפרוטוקול הזה בחקר השפעות האינטראקציות בין תאים לתא על פני ממברנת הבסיס, איור 2 ואיור 3 שונו מפרסום קודם (Pallegar et al.16) כתוצאות מייצגות. איור 4 ואיור 5 הם נתונים חדשניים שנוצרו כדי להראות את יכולת ההסתגלות של הפרוטוקול לתאי סרטן שאינם בשד ואת היכולת לקצור תאים מסביבת הקו-קולטורה לשימוש במורד הזרם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעדר אינטראקציות מורכבות בין תאים בתרבות תאים מסורתית מדגיש את הצורך במודלים משופרים של איברים ורקמות כדי לחקור בצורה מדויקת יותר את תגובות התרופות והתקדמות המחלה ב-vivo. פיתוח מערכות קו-קולטורה תלת-ממדית תרם למילוי הפער הזה בכך שאפשר לימוד ההשלכות של אינטראקציות תא-תא ללאצורך במחקרים בחיים 9,12. עם זאת, רבות מהשיטות הללו יכולות להיות מורכבות מבחינה מכנית, ודורשות משאבים, זמן וניסיון טכני משמעותיים, כדי להקים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח השיטה מומן בחלקו על ידי אגודת מחקר הסרטן. GRK נתמכה במימון מתוכנית הסטודנט לתארים מתקדמים קרול אן קול של האגודה הקנדית לסרטן דרך תוכנית ההכשרה למחקר סרטן של מכון ביאטריס האנטר למחקר סרטן. PMMB נתמך על ידי מענק תוכנית MOBILITAS (2024) מהמכון למחקר בריאות של איי הבלארים (IdISBa). איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
לוח תרבית רקמת באר 24קורנינג3524
זכוכית כיסוי 24 x 60 מ"מאולטידנט סיינטיפיק170-C2460
4% פאראפורמלדהיד ב-PBSInvitrogenJ61899. AKמדולל ל-2% ב-1x PBS
שקופיות תרביות עם 4 תאיםפלקון354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment חמור אנטי-עז IgG (H+L)מעבדות ג'קסון אימונוריאסרץ' בע"מ.705-607-003
המציטומטר קווי בהירהאוסר סיינטיפיק3120
ערכת התרבות CFSE של CellTraceInvitrogenC34570
פתרון לשחזור תאיםקורנינג354253
DAPIחברת סיגמא-אלדריץ' קנדהD9542
נוגדן משני מוצלב IgG (H+L) נגד עכבר חמור (H+L), DyLight 594InvitrogenSA5-10168
נוגדן משני שנספח מאוד נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, ללא פנול אדוםגיבקו21041025
מדיום הנשר המותאם של דולבקו, רמות סוכר גבוהות, פירובטגיבקו11995-065
סרום בקר עוברי, מקור קנדיגיבקו12483-020
מסנני תאי פלומי, 40 ומיקרו; Mבל-ארט136800040
חלון ודלת סיליקון מתקדם של GE, שקופיםהנקל אינטרנשיונל2811093
אנטי-ZO-1 פוליקלונלי עזסנטה-קרוז ביוטכנולוגיהSC8146נוגדן ראשוני, הופסק
עכברוש מונוקלונלי אנטי-ZO-1סנטה-קרוז ביוטכנולוגיהSC33725נוגדן ראשוני חלופי שיחליף את SC8416 נגד ZO-1 שהופסק
מדיום בסיסי של תא אפיתל שדיפרומוסלC-21210
מטריג'ל, פנול אדום חופשי, גורם גדילה מופחת, ללא LDEVקורנינג356231ריכוז חלבון: 9-9.6 מ"ג/מ"ל
אנטי-וימנטין מונוקלונלי עכברחברת סיגמא-אלדריץ' קנדהV2258נוגדן ראשוני
סרום עגל שזה עתה נולד, מוצא ניו זילנדיגיבקו16010159
פניצילין-סטרפטומיציןגיבקו15140-122
סליין ממוגן בפוספט, pH 7.4גיבקו10010023
מתקן אנטי-פייד ProLong GoldInvitrogenP36934
עכבר מטוהר אנטי-אי-קדריןBD ביוסיינסס610181נוגדן ראשוני
אנטי-קלודין פוליקלונלי ארנב 7 אבקאםAB27487נוגדן ראשוני
RPMI 1640, גלוטמיןגיבקו11875-093
SupplementMixפרומוסלC-39115
Trypan Blue Stain (0.4%)גיבקו15250-061
Trypsin 0.25%-EDTAגיבקו25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of medical science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  5. Lagies, S., et al. Cells grown in three-dimensional spheroids mirror in vivo metabolic response of epithelial cells. Communications Biology. 3 (1), 246(2020).
  6. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Developmental Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  7. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 9 (1), 196(2024).
  8. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Current biology: CB. 30 (16), R921-R925 (2020).
  9. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G., Husseini, G. A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. Journal of Biomedical Science. 31 (1), 7(2024).
  10. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7 (1), 45270(2017).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Leung, C. M., et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 33(2022).
  13. Srivastava, S. K., Foo, G. W., Aggarwal, N., Chang, M. W. Organ-on-chip technology: Opportunities and challenges. Biotechnology Notes. 5, 8-12 (2024).
  14. Gu, P., Xu, A. Interplay between adipose tissue and blood vessels in obesity and vascular dysfunction. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 14 (1), 49-58 (2013).
  15. Noel, V., Berry, M. D. Culture of Adherent Cancer Cell Lines. Cancer Cell Biology: Methods and Protocols. , 19-29 (2022).
  16. Pallegar, N. K., Garland, C. J., Mahendralingam, M., Viloria-Petit, A. M., Christian, S. L. A Novel 3-Dimensional Co-culture Method Reveals a Partial Mesenchymal to Epithelial Transition in Breast Cancer Cells Induced by Adipocytes. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 24 (1), 85-97 (2019).
  17. Martin, T. A., Ye, L., Sanders, A. J., Lane, J., Jiang, W. G. Cancer Invasion and Metastasis: Molecular and Cellular Perspective. Madame Curie Bioscience Database [Internet]. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK164700/ (2013).
  18. Ma, W., Tavakoli, T., Derby, E., Serebryakova, Y., Rao, M. S., Mattson, M. P. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC developmental biology. 8, 90(2008).
  19. Kim, Y. J., Lee, H. S., Kim, D., Byun, H. K., Koom, W. S., Koh, W. Bilayer 3D co-culture platform inducing the differentiation of normal fibroblasts into cancer-associated fibroblast like cells: New in vitro source to obtain cancer-associated fibroblasts. Bioengineering & Translational Medicine. 10 (1), e10708(2024).
  20. Sourouni, M., et al. Establishment of a 3D co-culture model to investigate the role of primary fibroblasts in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Reports. 6 (4), e1771(2023).
  21. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Materials Today Bio. 15, 100301(2022).
  22. Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3760(2012).
  23. Ooi, J. Y. Y., Tsang, Y. S., McMahon, L. P., Wong, L. Protocol for in vitro immunofluorescence staining in a Transwell co-culture system. STAR protocols. 6 (4), 104162(2025).
  24. Wallisch, S., et al. Protocol for establishing a coculture with fibroblasts and colorectal cancer organoids. STAR Protocols. 4 (3), 102481(2023).
  25. Ildiz, E. S., Gvozdenovic, A., Kovacs, W. J., Aceto, N. Travelling under pressure - hypoxia and shear stress in the metastatic journey. Clinical & Experimental Metastasis. 40 (5), 375-394 (2023).
  26. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. 202 (1), 1-8 (1992).
  27. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1387(2021).
  28. Ahmad, Z., et al. Versatility of Hydrogels: From Synthetic Strategies, Classification, and Properties to Biomedical Applications. Gels. 8 (3), 167(2022).
  29. Jinka, R., Kapoor, R., Sistla, P. G., Raj, T. A., Pande, G. Alterations in Cell-Extracellular Matrix Interactions during Progression of Cancers. International Journal of Cell Biology. 2012, 219196(2012).
  30. Short, A. R., Czeisler, C., Stocker, B., Cole, S., Otero, J. J., Winter, J. O. Imaging Cell-Matrix Interactions in 3D Collagen Hydrogel Culture Systems. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  31. Zeng, F., Yang, W., Huang, J., Chen, Y., Chen, Y. Determination of the lowest concentrations of aldehyde fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging and quantification. Histochemistry and Cell Biology. 139 (5), 735-749 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Co CultureBasement MembraneIndirect Cell InteractionsCell Cell CommunicationExtracellular MatrixBiomimetic ModelImmunofluorescence AnalysisMorphological ChangesIn Vitro Cell CultureMatrigel Scaffold
Video Coming Soon

Related Articles