ניתוח רציונטרי כמותי של חיישני ביולוגיים מבוססי FRET ב-Arabidopsis thaliana מאפשר מדידה חיה של אנליטים בתאים תת-תאיים

Aditi Subramani Raju; Wayne K. Versaw

doi:10.3791/70028

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח רציונטרי כמותי של חיישני ביולוגיים מבוססי FRET ב-Arabidopsis thaliana מאפשר מדידה חיה של אנליטים בתאים תת-תאיים

365 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

24 בפברואר 2026

Aditi Subramani Raju¹ , Wayne K. Versaw¹

¹Department of Biology, Texas A&M University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח כמותי של מולקולות או יונים במחלקות תת-תאיות של תאים חיים באמצעות חיישני ביולוגיים מבוססי העברת אנרגיית תהודה פורסטר (FRET). הוא כולל הדמיה סטנדרטית, עיבוד מסכה בינארית, וניתוח רציונטרי עם רגרסיה ליניארית המיושמת על פוספט ב-Arabidopsis thaliana (A. thaliana), אך ישים באופן רחב גם על חיישנים ביולוגיים ואורגניזמים אחרים.

תקציר

חיישנים ביולוגיים פלואורסצנטיים מספקים גישה לא פולשנית ורב-שימושית למעקב אחר שינויים דינמיים בריכוזי מטבוליטים או יונים בתוך תאים חיים. באופן ספציפי, חיישנים ביולוגיים מבוססי FRET מאפשרים מדידות רציומטריות המדווחות על רמות אנליט תת-תאיות תוך שהם עצמאיים מרמות הביטוי של החיישנים הביולוגיים. אנו מתארים פרוטוקול מקיף וסטנדרטי לניתוח קצבי כמותי של חיישנים ביולוגיים מבוססי FRET בצמחים. הפרוטוקול מדריך את המשתמשים בהכנת דגימה חיה, רכישת תמונה קונפוקלית של תורמים, ערוצי FRET ומקבלים, יצירת מסכה בינארית לאזורים תת-תאיים מעניינים, ואחריהם ניתוח נתונים רציונטרי מבוסס רגרסיה. הפלט העיקרי הוא קריאה רציומטרית שמקורה ברגרסיה, המאפשרת השוואות כמותיות בין גנוטיפים, רקמות, שלבי התפתחות ותנאי טיפול. באמצעות החיישן הביולוגי cpFLIPPi-5.3m עבור פוספט אנאורגני כדוגמה, אנו מדגימה מדידה של רמות פוספט אנאורגני בסטומה הכלורופלסט של A. thaliana. מסגרת אנליטית זו ישמה באופן רחב על חיישנים ביולוגיים ומערכות מודל מבוססות FRET, ומאפשרת כימות מדויק במרחב-זמן של מטבוליטים ויונים ב-vivo. אסטרטגיה זו מספקת תובנות מדידות על הדינמיקה התת-תאית של מטבוליטים ויונים, ותומכת בהשוואות בהקשרים ניסיוניים מגוונים.

מבוא

ניטור דינמיקת מטבוליטים ויונים בתאי צמחים חיים הוא חיוני להבנת האופן שבו מסלולים מטבוליים ורשתות איתות מתואמים במרחב ובזמן כדי לתמוך בצמיחה והתפתחות ^1,2. רמות המטבוליטים התאים משתנות במהירות בתגובה לסימנים סביבתיים כגון זמינות חומרים מזינים, עוצמת אור ולחץ³. מבין אלה, רמת הפוספט האנאורגני (Pi) חשובה במיוחד עם תפקידים מרכזיים בהעברת אנרגיה, איתות וויסות מטבולי, אך הדינמיקה התת-תאית שלו עדיין^{קשה למדידה}.

בדיקות קולורימטריות סטנדרטיות ותהודה מגנטית גרעינית של פוספורוס-31, (³¹P)-NMR, יכולות להעריך את פי הכולל או האזורי, אך חסרות רזולוציית תא יחיד ויש להן דיוק זמני מוגבל ^5,6. בעוד שספקטרומטריית רנטגן סינכרוטרון ודימות רדיוטרייסר מספקים מידע תת-תאי או שטף, הם אינם יכולים להבחין באופן אמין בין Pi למטבוליטים מפוספורילים ולעיתים קרובות פולשניים. פרקציה לא-מימית ובדיקות קינטיות מבוססות אנזימים מציעות הערכות עקיפות של Pi סטרומלי וציטוזולי, אך גישות אלו דורשות עבודה רבה ורגישות לזיהום ^7,8. יחד, מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות לא הרסניות עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה למעקב אחר מטבוליטים כמו Pi, כגון הדמיה חיה של חיישנים ביולוגיים מבוססי FRET.

חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מבוססי FRET הם כלים רבי עוצמה לניתוח in vivo של דינמיקת יונים ומטבוליטים תוך-תאיים. מחקרים מוקדמים הראו את השימושיות של חיישנים ביולוגיים כאלה במעקב אחר ריכוזי גלוקוז, סוכרוז ו-ATP בתאים ^9,10,11. התקדמות עדכנית יותר הרחיבה גישה זו למעקב אחר סידן, ניטראט, פוספט, אוקסין, חומצה אבסיסית וגיברלין, ומספקת תובנות חשובות על ויסות חומרים מזינים והורמונים 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m הוא חיישן Pi מבוסס FRET, מותאם למעקב אחר רמות ה-Pi התת-תאיות בתאי הצמח¹⁷. החיישן הביולוגי הזה מורכב מחלבון קישור ציאנובקטרי ל-Pi, מוקף בתורם FRET (eCFP, חלבון פלואורסצנטי ציאני משופר) ומקבל FRET (cpVenus, וריאנט מותאם של חלבון פלואורסצנטי צהוב של נוגה), והוא עובר שינוי קונפורמציה בעת קישור ה-Pi. שינוי זה משנה את אות הפלואורסצנציה התלוי ב-Pi שמקורו ב-FRET, שנקלט באמצעות הדמיה קונפוקלית, כך שעלייה בריכוז ה-Pi גורמת לירידה ביחס FRET/תורם. ניתוח יחס תלוי-פאי מתבצע במהלך עיבוד התמונות לאחר מכן על ידי השוואת עוצמות הפליטות של המקבל והתורם¹⁸.

ניתוח FRET רטוריטורי כמותי ברקמות צמחים חיות דורש תיקון עבור דילוף ספקטרלי ועירוור צולב של פלואורופורים של התורם (CFP) והמקבל (cpVenus), בהתאמה¹⁸. הדליפה מתרחשת כאשר פליטת CFP מזוהה בערוץ ה-FRET, בעוד שגירוי צולב נוצר מגירוי cpVenus במהלך עירור CFP. ארטיפקטים ספקטרליים אלו עשויים להשתנות בין תאים ומחלקות תת-תאיות, במיוחד ברקמות צמחים פיגמנטיות, ולכן מבלבלים מדידות רציומטריות. כדי לקבל פליטת FRET מתוקנת או רגישה, מחסרים תרומות של blee-through ו-cross-ercut מהאות הגולמי של ה-FRET כדלקמן:

פליטת FRET רגישה = פליטת FRET גולמית - דילוף דרך - גירוי צולב

גורמי תיקון לדליפה דרך וגירוי צולב נקבעים על ידי הדמיית צמחים המבטאים CFP או cpVenus בנפרד באותם מיקומים תאיים ותת-תאיים כמו החיישן^{הביולוגי 18}. פליטת FRET רגישה מחושבת כך:

פליטת FRET רגישה = פליטת FRET גולמית - (פליטת CFP × מקדם תיקון דליפה) - (פליטת ונוס × גורם תיקון עירור צולב)

היחס בין פליטת FRET רגישה לפליטת תורם (יחס FRET) מדווח על שינויים יחסיים בריכוז הליגנדים ואינו תלוי ברמות הביטוי של החיישנים^{הביולוגיים 19}.

החיישן הביולוגי cpFLIPPi-5.3m כוון בהצלחה לאזורים תת-תאיים מובחנים של A. thaliana ומינים נוספים, מה שמאפשר הדמיה של דינמיקת Pi 18,20,21,22. חיישן ביולוגי זה חשף הטרוגניות בהתפלגות והעברה של Pi ציטוזולי ברקמות, וקישר תנודות ב-Pi סטרומלי כלורופלסט לפעילות המובילים ולביצועי פוטוסינתזה^20,21. מכיוון שהחיישן הביולוגי מדווח על שינויים בטווח דינמי מוגדר, הפרשנות דורשת שהטווח יכלול רמות Pi בתנאי דימות יציבים. תאורה לא אחידה או שפע ביוחיישנים נמוך מאוד יכולים להשפיע על מדידות יחס מטריות, מה שמדגיש את חשיבות הגדרות רכישה סטנדרטיות ובקרות שליליות מתאימות כמו חיישן הבקרה Pi^{insensance 20}. כאשר שונות ביחס ה-FRET בין אזורי עניין (ROIs) היא מינימלית, ניתוח רגרסיה עשוי שלא להיות מתאים, ומומלץ לאחד ממוצעים של ROI.

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח רציומטרי כמותי של cpFLIPPi-5.3m ב-A. thaliana, כולל דימות קונפוקלי, סגמנטציה של תמונה באמצעות מסכות בינאריות, וחישובי יחס FRET למעקב דינמי אחר פי בתאים חיים. שיטה זו מספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור לניתוח אותות ביוסנסורים מבוססי FRET, כאשר נתוני יחס מנותחים באמצעות רגרסיה ליניארית והשוואות סטטיסטיות בתנאים ניסיוניים. נתונים מייצגים מוצגים באמצעות הצטברות Pi של סטרום כלורופלסט משתנה ב-pht2; 1, מוטנט של נשא כלורופלסט Pi המבטא את חיישן cpFLIPPi-5.3m ^21,23. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים ליישם דימות רציונטרי מבוסס FRET על מערכות ניסוי אחרות על ידי פירוט תיקוני ספקטרל בחיישנים ביולוגיים, הגדרות הדמיה ושלבים של ניתוח כמותי. על ידי סטנדרטיזציה של רכישת תמונות וניתוח מבוסס רגרסיה בהקשרים ניסיוניים מוגדרים, זרימת העבודה תומכת בהשוואה עקבית של תגובות FRET בין דגימות שנותחו בתנאים תואמים. היא מתאימה למי שמבקש למדוד שינויים מהירים וספציפיים לתחום ברמות האנליטים ברקמות צמחים חיים, כולל מוטנטים או קווים טרנסגניים עם העברת מטבוליטים או חילוף חומרים משתנים. גישה סטנדרטית זו תקל על שחזור מחקרי הדמיה כמותית של תאים חיים בביולוגיה של צמחים. בנוסף לחיישה ביולוגית של Pi ממוקדת בכלורופלסטים המתואר כאן, ניתן להתאים את האסטרטגיה האנליטית לחיישנים ביולוגיים מבוססי FRET ולרקמות ייחודיות לאורגניזמים, בתנאי שנקבעו מדידות כיול ושליטה ספציפיות לחיישנים ביולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: קווים טרנסגניים של ארבידופסיס המבטאים cpFLIPPi-5.3m ו-cpFLIPPi-null (וריאנטים ציטוזוליים ומיועדים לפלסטידים) נוצרו בעבר^17,18, ו-pht2; 1-1 (CS19883) התקבל ממרכז המשאבים הביולוגיים של Arabidopsis, מדיום MS, משקפי כיסוי, פרפלואורודקלין, מיקרוסקופ קונפוקלי ומטרה לטבילה בשמן 40x (צמצם מספרי 1.3), לייזרי עירור (CFP/445 ננומטר ו-cpVenus/515 ננומטר או אורכי גל פליטה מתאימים למכשיר), מסנני פליטה ל-CFP, cpVenus/FRET, ומקבל cpVenus, מצלמה או גלאים, תחנת ניתוח תמונות, FIJI²⁴ ו-Excel.

1 . הכנת דוגמאות

יצירת קווי A. thaliana טרנסגניים
1. שכפל את הביוחיישן cpFLIPPi-5.3m, ובקרות בקרה לא רגישות ל-Pi (cpFLIPPi-Null), תורם בלבד (CFP) ובקרות הקבלה בלבד (cpVenus) לתוך וקטורי ביטוי צמחים¹⁷.
2. לביטוי יציב, המרה של צמחי A. thaliana ברקע המוטנטי של sgs3-13 באמצעות Agrobacterium tumefaciens פרחוניים, קציר זרעי T1 ובחירת טרנספורמנטים על לוחות אגר של 0.5x Murashige & Skoog (MS) המכילות את חומר הבחירה המתאים, כגון פוספינוטריצין (10 מיקרוגרם/מ"ל).
3. סטריליזציה של זרעי A. thaliana שמבטאים את הביוסנסורים על ידי טבילה ב-70% אתנול למשך דקה, העבר ל-50% אקונומיקה למשך דקה, ואז שטוף 6-10 פעמים במים סטריליים.
  אזהרה: אתנול ואקונומיקה הם מגרים ויש לטפל בהם תוך לבישת ציוד מגן אישי (PPE) מתאים. בצע חיטוי זרעים במכסה אדים כימי או באזור מאוורר היטב כדי למנוע שאיפת אדים ולעולם לא לערבב אקונומיקה ואתנול ישירות. להשליך את תמיסות הפסולת בהתאם להנחיות הבטיחות הכימית המוסדיות.
4. יש לשכב זרעים בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך 2-3 ימים לסנכרון הנביטה, ואז להעביר זרעים למדיום נוזלי 0.5x MS שמוצק באגר או נוזלי המכיל 0.25% סוכרוז והריכוז הרצוי של Pi (250 מיקרומון) לעיצוב הניסוי. כלול את סוכן הבחירה אם בוחרים טרנספורמנטים.
5. העברה של לוחות לתא גדילה מבוקרת ב-21°C, 16 שעות אור: 8 שעות אור כהה, עוצמת אור 120 מיקרומול·מ⁻²·שניות⁻¹, ו~60% לחות יחסית. גדלו שתילים למשך 4-7 ימים כדי לצלם שורשים או העבירו שתילים לאדמה למשך 21 ימים כדי לצלם עלים.
6. אם בודקים טיפולי Pi, העבירו את השתילים למדיה הרצויה של Pi (למשל, 250 מיקרומולר Pi ל-Pi מלא; 10 μM Pi ל-Pi חסר) ושומרים על הטיפול לתקופה המוגדרת (למשל, 48 שעות למחסור חריף ב-Pi).
7. אם אפשר, יש לשחק צמחים לביטוי חיישנים מספק באמצעות הדמיה לפלואורסצנציה של תורם או מקבל (עירור בעוצמה נמוכה) באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה של 7-10x).
8. העריכו קווים באותו רקע גנטי שמבטאים cpFLIPPi-null כבקרות חסרות רגישות לליגנטיות.

2 . הדמיה קונפוקלית

לשורשים, התקן שתילים במים סטריליים או במדיום הצמיחה שלהם על מגלשת זכוכית. שכב בעדינות עם כיסוי קטן כדי לשטח את השורשים ללא דחיסה. תמונה מיידית.
לעלים, כרתו את העלה היעד (למשל, העלה השלישי או הרביעי בצמחים בני 21 יום), ומניחים את המשטח האדוקסאלי למטה במגלשה.
חדרו עם 10-15 מיקרוליטר פרפלואורודקלין לפינוי חללי אוויר במידת הצורך, ושכבו בעדינות משקולת זכוכית קטנה כדי לשטח את הדגימה. תמונה מיידית.
השתמש באובייקטיב עם NA גבוה המתאים לתאים חיים (למשל, 40× / 1.2-1.3 NA). השתמש באותה מטרה לכל הדגימות כדי לשמור על השוואה.
באמצעות תוכנת Metamorph, הגדר את ערוצי העירור והפליטה וצילום תמונות (איור 1).
הערה: ללכידת פליטת התורם (CFP): ניתן להשתמש בעירורים ב-~445 ננומטר (או קו CFP מתאים למכשיר) ואיסוף פליטת התורם (למשל, פס פס 470-500 ננומטר). לדוגמה, עוררות של לייזר 445 ננומטר ב-70% (איור 1A) עם זמן חשיפה של 1000 מילישניות (איור 1B) שימשה ללכידת פליטת ה-CFP. ללכידת ה-FRET (פליטת מקבל רגישה): עירור באורך גל תורם (445 ננומטר) ואיסוף תחום פליטת המקבל (למשל, 530-560 ננומטר). ללכידת ערוץ המקבל הישיר: גירוי בהתרגשות המקבל (למשל, 500-515 ננומטר) ואיסוף של אותו תחום פליטה של המקבל כמו ב-FRET.
רכשו תמונות ברצף: ללכוד גירוי תורם/פליטת תורם, גירוי תורם/פליטת FRET, ואז גירוי/פליטת מקבל. שמור על זמן הדמיה לכל שדה קצר כדי להגביל את הבהנת הפוטובליקה (500-1000 מילישניות).
הערה: עבור כל מיקום תא (ציטוזול שורש, ציטוזול מזופיל עלים, סטרום כלורופלסטים), קבעו את עוצמת הלייזר האופטימלית, רווח הגלאי וזמן החשיפה (איור 1) כך שעוצמות הפיקסל הממוצעות יהיו מעל הרקע המקומי אך מתחת לרוויית הגלאי. שמרו על הגדרות לכידה זהות לערוצים שמקורם בגירוי תורם (תורם ו-FRET) עבור מיקום נתון. פרמטרי ההדמיה תלויים בדגימה, במיקרוסקופ, במקור האור ובמערכת הגילוי, ולכן יש לקבוע אותם אמפירית, כאשר טווחים מקובלים מוערכים ומתועדים באמצעות ניתוח רגרסיה כפי שמתואר בפרוטוקול זה. תוכנת לכידת התמונה כאן היא גרסה 7 של Metamorph.
השתמש באותה רגישות גלאי (למשל, כאן, רווח של 2.4x והשתמשו ב-0 offset) בכל התמונות עבור מיקום יעד. אם משתמשים במספר גלאים, אפיין תגובות ספקטרליות לכל גלאי ותעד אותן.
לרכוש תמונות בקרה לכל רקמה/גנוטיפ שמעניין אותו.
1. תמונה של רקמת טבע מסוג פרא לא שעברה טרנספורמציה כדי לקבוע אוטופלואורסצנציה ברקע לכל ערוץ.
2. צמחי תמונה המבטאים תורם בלבד (CFP) ומקבל בלבד (cpVenus) באותן הגדרות לכידה לכל מיקום כדי לגזור מקדמי תיקון ספקטרליים (blee-through ו-cross-exit). צלם תמונות ממספר פרטים (≥6-8) עם טווח עוצמות פליטה.

3 . עיבוד תמונה

פתחו את התמונות הגולמיות של ערוצי התורם (המכונים CC לגירוי/פליטה של תורם), FRET (המכונים CY לגירוי/פליטת מקבל), ומקבלים (YY עבור גירוי/פליטה של מקבל) בתוכנות ניתוח כמו FIJI או ImageJ. (איור 2).
קבעו את עוצמת הרקע הממוצעת לכל ערוץ על ידי דגימה מרובה (5-10) ROIs במיקומים שווים מצמחים לא שעברו טרנספורמציה שצולמו באותן הגדרות. מחסר את ערך הרקע הממוצע מכל תמונת ערוץ מתאימה.
שלבים שיש לעקוב אחריהם בפיג'י
1. לחץ על Tab Analyze> הגדר מדידות > בחר ערך אפור ממוצע. מדוד את עוצמת הרקע על ידי בחירת ROI מסוים או ממוצע של כל התמונה.
2. לחץ על Tab Analyze> Measure. שמור את הערכים בגיליון אקסל וחשב ערכי רקע ממוצעים לכל ערוץ. סף תמונת התורם (CFP) כדי להגדיר את הגבול המרחבי של הביוסנסר (לתורם בדרך כלל יש את האות הנמוך ביותר). המרו את תמונת התורם הספית למסכה בינארית (איור 3 א).
3. לחצו על תמונת הלשונית (Tab Image> Adjustment> Threshold.
4. חלון לסף ייפתח. בחר בשיטת מקסימום אנטרופיה לסף. קבע את הגבול המרחבי, במקרה זה, הסטרומה של כלורופלסטים, והחלו את הסף. זה יוצר תמונה בינארית בשחור-לבן (איור 3 B).
5. לחץ על לשונית מתמטיקה> חלוק> הזן ערך 255. התמונה תהפוך ללבנה לחלוטין. שמור את תמונת המסכה הבינארית הזו כקובץ .tiff.
6. הכפל את המסכה הבינארית בכל שלוש התמונות המופרעות ברקע כדי ליצור תמונות עם מסכה לניתוח (איור 3C).
7. פתח את קובץ המסכה הבינארית ב-FIJI.
8. לחצו על תהליך הכרטיסיות> Math>Multiply.
9. בחר את המסכה הבינארית כאחת מהתמונות ואת תמונת CC שהופחתה ברקע כתמונה השנייה.
10. חזור על השלבים של CY ו-YY.
11. משוך ROI על תמונות מוסתרות ההתאמה למבנה הנבדק (תא שלם, ציטוזול, סטרומל כלורופלסטים). עבור כל ROI, יש להפיק את עוצמות הפיקסל הממוצעות עבור ערוצי תורם, FRET וערוצי קבלה ישירים. שמור מטא-נתוני ROI (שם תמונה, קואורדינטות, תנאי ניסוי, זיהוי שכפול) לניתוח סטטיסטי בהמשך.
12. פתחו תמונות CC, CY ו-YY.
13. לחץ על Tab Math> החסר> הזן ערך רקע ממוצע. חלופה נוספת היא לעשות זאת ממש לפני חישוב FRET רגיש באקסל.
14. פתח את קובץ ה-CC עם המסכה.
15. לחץ על Tab Process > מחשבון תמונה. כפל את CC עם קובץ התמונה המוסתר CC. זה יפתח קובץ תמונה חדש בגודל 32 ביט.
16. משוך ROI באמצעות כלי FIJI המתאימים בסרגל המשימות הראשי. לדוגמה, כאן נבחרת הסטרומה של כלורופלסט באמצעות כלי ROI "אובל". הוסיפו את ה-ROI למנהל ROI (ctrl+T). בחר 5-10 החזר השקעה לתמונה. בדוק "הצג הכל". ניתן לאחסן את ה-ROIs הללו כמטא-קובץ נפרד (איור 3D). אל תסגור את מנהל התשואה על ההשקעה.
17. לחץ על Tab Analyze> הגדר מדידות> בחר ערך אפור ממוצע.
18. לחץ על "מדידה" במנהל התשואה (ROI).
19. ערכי הפיקסלים הממוצעים של ה-ROIs שנבחרו יופיעו כרשימה בחלון נפרד.
20. העתק את הנתונים האלה ל-Excel. אל תסגור את מנהל התשואה על ההשקעה.
21. חזור על ההכפלה של קובץ ה-CC המומוסך עם תמונות CY ו-YY כדי לקבל מדידות של אותם ROI באמצעות מנהל התשואה בכל ערוץ בנפרד. אחסן את הערכים ב-Excel.

4. ניתוח יחסי

פתח את Microsoft Excel לביצוע הפעולות הבאות (איור 4).
חישוב מקדמי התיקון.
1. לכל מיקום תאי, השווה את עוצמות ערוץ ה-FRET (ציר Y) מצמחים תורמים בלבד מול עוצמות התורם (ציר X). להתאים רגרסיה ליניארית. השיפוע הוא מקדם המעבר של התורם (המסומן כ-a).
2. חזור על כך על ידי העתקה של עוצמות ערוץ FRET מצמחי קולט בלבד (ציר Y) מול עוצמות המקבל הישירות (ציר X). השיפוע הוא מקדם העירור הצלב של המקבל (המסומן כ-b).
3. השתמש ב-≥15-20 ROIs ממספר מפעלים כדי לקבל מקדמים חזקים. לסטומה של כלורופלסטים נבחרים 50-60 כלורופלסטים.
חשב FRET רגיש לכל ROI כ-
FRET רגיש = FRET גולמי - ( תורם ×) - (b × מקבל)
כאשר a ו-b הם מקדמים ספציפיים למיקום שנגזרו לעיל (איור 4).
גרף רגיש ל-FRET (ציר Y) לעומת עוצמות ערוץ תורם (ציר X) עבור ROIs מאוגדים. מתאים רגרסיה ליניארית ואקסל יספק התאמה בפורמט y = mx + c, כאשר y מתאים לעוצמות ה-FRET הרגישות, x לעוצמות התורם, c ל-ycept, ו-m לשיפוע הרגרסיה. שימו לב R² עבור הרגרסיות המותאמות. בדרך כלל, R² נע בין 0.8 ל-1, ומייצג התאמה טובה (איור 4).
למדידות ציטוזוליות וסטרומליות, יש לחשב ולהשתמש בשיפוע של FRET/תורם (FRET רגיש ÷ תורם) כקריאת היחס הרציאומטרי המכונה גם יחס FRET.
הערה: שגיאת ההתאמה של הרגרסיה מייצגת את השגיאה הסטנדרטית של השיפוע (השתמש בפונקציית LINEST באקסל). השתמש בברירה ספציפית למיקום באופן עקבי בין דגימות וגנוטיפים רלוונטיים. רגרסיה ליניארית המיושמת על נתונים ממספר ROIs ומפעלים עצמאיים מאשרת שיחס ה-FRET אינו תלוי בשפע החיישנים.
כיול, בקרות והבחנה בין השפעות לא ספציפיות.
1. השתמש ב-cpFLIPPi-null (וריאנט שאינו רגיש לליגנד) המובע במקביל ומעובד באותו אופן כדי להבחין בין שינויים פוטנציאליים לא ספציפיים ביחס FRET (pH, עוצמה יונית, פוטופיזיקה) לבין שינויים ספציפיים ל-Pi.
2. איסוף נתוני ברמת ROI עם שדות: גנוטיפ, תא, מזהה שכפול של הצמח, מזהה ROI, תורם, מקבל, FRET גולמי, FRET רגיש, יחס מותאם (לפי הצורך). שמור על עוצמות גולמיות.
3. להשוואות אוכלוסייה יש להשתמש במדרונות שמקורם ברגרסיה כסטטיסטיקות ראשוניות; דיווח על שיפועים ±SE ו-% שגיאה יחסית.
4. יישם סטטיסטיקות אינפרנציאליות מתאימות (למשל, מבחן t של סטודנט או ANOVA) על פרמטרים שמקורם ברגרסיה. השתמש במבחנים לא פרמטריים אם התפלגויות מפרות נורמליות. תקן השוואות מרובות כשרלוונטי.
רשימת בקרת איכות (לפני קבלת נתונים)
1. אשר שכל שלושת הערוצים לכל תמונה נמצאים מתחת לרוויית הגלאי ויש להם יחס אות לרעש מתאים (>רקע 2-10x).
2. אשר כי בקרות פלואורופור בודדות של תורם ומקבל צולמו בהגדרות זהות והניבו קשרים ליניאריים לגזירת מקדמי תיקון a ו-b.
3. וודא שרישום התמונה מדויק ושהמסכות מגדירות נכון אזורים המכילים חיישנים ביולוגיים.
4. אשר שלטת cpFLIPPi-null מראה חוסר צפוי ברגישות ל-Pi.
מדדי בקרת איכות מייצגים לסיוע בהחרגת תמונות
1. קצב רוויה: פחות מ-1-2% מהפיקסלים מגיעים לעוצמה המקסימלית (65,535) עבור תמונות באורך 16 ביט.
2. רמת רקע: העוצמה הממוצעת באזורים ללא תאים נעה בין ~50-200 יחידות.
3. טווח עוצמת הפיקסלים: העוצמות הממוצעות גבוהות מהרקע אך נשארות מתחת לרוויה (~2,000-20,000 יחידות).
4. יחס אות לרעש (SNR): הערכים צריכים לעלות על 2-10.

5. מבחן סטטיסטי להבדל בין שני שיפועי רגרסיה

קבעו האם שני שיפועים (יחס FRET שמקורם ברגרסיה משני גנוטיפים או טיפולים) שונים באופן משמעותי²⁵.
חשב את סטטיסטיקת המבחן ודרגות החופש כך

עם דרגות חופש df = n1 + n2 - 4. m₁ ו-m₂מתאימים למדרונות מהרגרסיה הליניארית, s_b₁ו-s_b₂מתייחסים לשגיאת תקן של כל שיפוע (מתקבל מ-LINET או פלט רגרסיה) ו-n₁ו-n₂הם גודל המדגם (מספר התשואה (ROIs המשמשים לכל רגרסיה).
קבל ערך p דו-זנבי עבור t עם df (למשל, השתמש בטבלת התפלגות t, או במחשבון מקוון²⁶). כאשר משתמשים במחשבון המקוון (איור 5C), הזן את s_b1 _{ו-s b2} ו-n1 ו-n2 שהתקבלו בשלב הקודם כדי לחשב את ערך p וסטטיסטיקות מבחן.
הפרשנות תהיה לדחות את ההשערה האפסית (המדרונות אינם שונים באופן משמעותי) אם p < α (למשל, α = 0.05). דוח b₁, b₂, s_b1, s_b2, t, df ו-p.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדמיה קונפוקלית

באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת מטמורף, נרכשו ערוצים נפרדים להמחשת אותות התורם והמקבל של FRET ברקמות עלי A.thaliana של ה-WT (WT) וב-pht2; מוטנט של מוביל פאי כלורופלסט אחד (איור 2). תמונות מייצגות ממחישות מיקום תת-תאי ברור של חיישן ה-Pi, כאשר כלורופלסטים ניתנים להבחנה לא רק בתוך תאים בודדים אלא גם בין סוגי רקמות שונים (איור 3). תמונות אלו מאשרות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית לכימות של מטבוליטים או יונים בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי FRET. היתרונות המרכזיים כוללים מדידה לא פולשנית של יחס מטרי ויישום על מספר תאים תת-תאיים 17,20,21,22. השימוש במסכות בינאריות ורגרסיה ליניארית משפר את הדיוק והשחזוריות. בעוד שמודגם כאן עבור Pi תת-תאית ב-A. thaliana, המסגרת ניתנת להתאמה לאנליטים אחרים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.

תודות

אנו מכירים בתרומתם של חברי מעבדת W.K.V. לשעבר, שמאמציהם תמכו בפיתוח פרוטוקול זה. תמיכה כספית ניתנה על ידי משרד האנרגיה של ארה"ב, משרד המדע, תוכנית טכנולוגיית הדמיה ביולוגית (DE-SC0014037) ומדעי האנרגיה הבסיסיים (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. נתמכה בחלקה על ידי מימון מכון הגלר ללימודים מתקדמים, אוניברסיטת טקסס A&M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטרת טבילה בשמן 40X	אולימפוס	https://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P	עדשה אובייקטיבית להדמיה
משקפי כיסוי / כיסויי כיסוי	VWR	48393-081	כיסוי למיקום דגימה
פיג'י (ImageJ)	קוד פתוח	2.9.0	תוכנת ניתוח תמונות
מיקרוסקופ אולימפוס IX81 הפוך	אולימפוס	http://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf	מערכת הדמיה קונפוקלית
מצלמת iXon3 897 EMCCD	אנדור טכנולוגיה	https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897	חלק ממערכת הדמיה קונפוקלית
תוכנת MetaMorph V7	מכשירים מולקולריים. LLC	גרסה 7	תחנת עבודה לניתוח תמונות
Microsoft Excel	Microsoft Suite	v16.68	תוכנת ניתוח נתונים
מורשיגה & סקוג (MS) בינוני	קייסון	MSP11-10LT	מדיום צמיחת צמחים
פרפלואורודקלין (אקרוס אורגני)	אקרוס אורגניקס	P9900-25G	מדיום הדמיה
פוספינוטריצין	סיגמא	77182-82-2	אנטיביוטיקה
תא צמיחת הצמח	Conviron	מנהג	תא הצמיחה
יחידת קונפוקלית דיסק מסתובב Yokogawa CSU-X1	יוקוגאווה	https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/	חלק ממערכת הדמיה קונפוקלית

מקורות

Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FRET