מאמר שיטה

אסטרטגיית מיקרופלטה ו-HPTLC משולבת לקביעת ופרופיל של פנוליקה ופלבונלים כוללים בתמציות קליפות הדרים

DOI:

10.3791/70034

⸱

8 במאי 2026

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fitoquímica (LAFIT), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA), 2Herbario Juvenal Valerio, Escuela de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional (UNA), 3Laboratorio de Productos Naturales y Ensayos Biológicos (LAPRONEB), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג גישה משולבת של AlCl₃/Folin–Ciocalteu לפרופיל HPTLC וכימות של פלבונולים/5-הידרוקסיפלבונים ותרכובות פנוליות בקליפות הדרים, בתוספת ניתוח מיקרופלטות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרכובות פנוליות ופלבונואידים תורמים משמעותית לפעילות נוגדי החמצון ולערך התפקודי של תוצרי לוואי הדרים. עם זאת, בדיקות קולורימטריות קונבנציונליות, למרות שהן בשימוש נרחב, חסרות הפרדה כרומטוגרפית ועלולות להיות מושפעות מהפרעות כימיות. פרוטוקול זה מציג תהליך אנליטי משולב המשלב בדיקות ספקטרופוטומטריות מיקרופלטיות עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה (HPTLC) בעלת ביצועים גבוהים, לקביעת ופרופיל של תכולת פנולית כוללת (TPC) וסך הפלבנולים בתוספת תכולת 5-הידרוקסיפלבונים (TFHC) בתמציות קליפת הדרים. תמציות אתנוליות של קליפות סיד (Citrus aurantifolia) וקלמנדרין (Citrus reticulata) הוערכו באמצעות בדיקות Folin–Ciocalteu (FC) וכלוריד אלומיניום (AlCl₃) בפורמט מיקרופלטה של 96 בארות, ולאחר מכן ניתוח HPTLC המשתמש בשני שלבים ניידים עוקבים ונגזרת פוסט-כרומטוגרפית כפולה. מדידות מיקרופלט הניבו ערכי TPC של 74.2 mmol/g עבור סיד ו-72.8 mmol/g עבור מנדרין, בעוד שערכי TFHC היו 15.5 mmol/g ו-6.0 mmol/g, בהתאמה. הפרדה ב-HPTLC פתרה ארבעה רצועות פנוליות בסיד ושישה במנדרינה. שני רצועות סיד הוצגו באופן סלקטיבי לאחר נגזרת AlCl₃, בהתאם לפלבונולים או 5-הידרוקסיפלבונים. סך החומרים הרעים הפנוליים שהוערך על ידי HPTLC היה 22.0 ו-20.8 mmol/g חומר יבש עבור סיד ומנדרין, בהתאמה, בעוד ש-TFHC הגיע ל-13.4 mmol/g בסיד ולא זוהה במנדרינה. ממצאים אלו מראים כי בדיקות מיקרופלט מספקות הערכה מהירה ורגישה של התכולה הכוללת, בעוד ש-HPTLC משפרת את הסלקטיביות באמצעות הפרדת תרכובות ונגזרות ספציפיות לקבוצות פונקציונליות. האסטרטגיה המשולבת מאפשרת סינון בתפוקה גבוהה ואחריו אישור כרומטוגרפי, ומציעה פלטפורמה מעשית וניתנת לשחזור לאפיון פיטוכימי של מטריצות צמחים מורכבות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קליפות הדרים הן תוצר לוואי של תעשיית המיצים והראו נוכחות של תרכובות פונקציונליות כמו נוגדי חמצון1. הם שימשו כמזון נוירו-פרוטקטיבי2, נוגדי דלקת, אסתומים נגד אקנה3, ותוספי מזון4. חלק מהפעילויות הביולוגיות הללו מיוחסות לפלבנואידים5 ולתרכובות פנוליות6. שיטות כלליות להערכת כמות הפלבונואידים והפנולים הכוללת הוכחו בספרות7, כאשר הנפוצה ביותר היא פולין-צ'יוקלטאו לתכולת פנולית כוללת (TPC)8, וכלוריד אלומיניום לכלל תרכובות פלבונואידים (TFC)9 באמצעות ספקטרופוטומטריה. שיטת פולין-צ'יוקלטו פורסמה לראשונה ב-192710, בהתבסס על שינוי של תגובת פולין-דניס11, שניהם מבוססים על תגובת רדוקס של תרכובות פוספוטונגסטיות-פוספומוליביות. שיטת פולין-צ'יוקלטו מודדת יכולת הפחתת של תרכובות פנוליות12. מבחן כלוריד האלומיניום והפלבונואיד הוצע לראשונה בשנת 1960, בהתבסס על קומפלקסים בין הליגנדים המתכתיים והפלבונואידים13.

שתי הבדיקות הספקטרופוטומטריות הן כלים שימושיים להערכת והשוואת התכולה הכוללת של תרכובות פיטו הנפוצות בחומרי צמחים. עם זאת, הם כפופים למגבלות שונות. לדוגמה, מגבלות מסוימות נובעות מהשימוש בתקנים חיצוניים14, שבהם מניחים בדרך כלל שהאופי הכימי של התקן אינו משפיע באופן משמעותי על תגובת האות. בפועל, קשה לאמת הנחה זו, שכן הספיגה המולרית תלויה בגורמים כמו קונוגציה ותכונות מבניות אחרות שקשה לתקן אותן במוצרים טבעיים. לדוגמה, אפל ואח'15 העריכו את ה-TPC מאחד עשר מיני אלון ופיתחו את הגישה המכונה "סטנדרטית עצמית", שדיווחה על הבדלים של מעל 50% בשיפועי עקומות הכיול. שימוש עצמי סטנדרטי הוא אסטרטגיה שנועדה לייצג את אותה תערובת מורכבת של תרכובות כפי שנמצאת בדגימה, ובכך לספק התאמה קרובה יותר לתכולת הפנולית הכוללת (TPC) בפועל במדגם16. סטנדרטים עצמיים מספקים גם מידע מסוים על היחס בין קבוצות ריאקטיביות למשקל מולקולרי ממוצע; עם זאת, הוא מייגע וקשה לסטנדרטיזציה.

הבדיקה הכוללת של תרכובות פלבונואידים המבוססת על קומפלקס אלומיניום כלוריד הוערכה באופן ביקורתי במחקרים עדכניים17,18, שהסיקו כי AlCl₃ יוצר קומפלקסים עם שתי תת-קבוצות של פלבונואידים: פלבונולים ו-5-הידרוקסיפלבונים. בדרך כלל, פלבנולים מציגים ספיגה מרבית סביב 440 ננומטר, בעוד ש-5-הידרוקסיפלבונים סופגים בסביבות 415 ננומטר. בנוסף, פלבונואידים מסוימים עשויים להציג ספיגה פנימית בטווח 415–440 ננומטר גם בהיעדר גזירה, והעלייה בספיגה בעת קומפלקסציה משתנה בין תרכובות בודדות. יתרה מזאת, שתי הבדיקות הצבעוניות חסרות הפרדה ולכן אינן יכולות להבחין בין רכיבים פנוליים שונים; למרות שתכונה זו עשויה להיות יתרון להערכת תוכן כולל, היא גורמת לספציפיות מוגבלת. שיקולים אלו מדגישים את הצורך באסטרטגיה אנליטית שמבצעת פתרון רכיבים בודדים לפני גילוי קולורימטריה, ובכך מבחינה בין תגובות בדיקה אמיתיות להפרעות ספקטרליות או כימיות.

למרות מגבלות אלו, מבחנים כאלה נותרים כלים חשובים לסינון כללי של תרכובות פנוליות ביואקטיביות בתמציות צמחים ופירות19. להערכת הפרעות פוטנציאליות, השימוש בשיטת כרומטוגרפיה בשכבה דקה (HPTLC) בעלת ביצועים גבוהים, שנחשפה עם תגובות Folin–Ciocalteu ו-AlCl₃, מהווה גישה יעילה. הפרדה כרומטוגרפית מאפשרת זיהוי חומרים מפריעים עם תחומי ספיגה קיימים לפני הקומפלקסציה, בעוד שתיעוד צילום מאפשר ניתוח סימולטני של מקסימום ספיגה מרובה. בנוסף, ניתוח HPTLC מציע מספר יתרונות על פני טכניקות כרומטוגרפיות מקיפות יותר כגון HPLC–MS/MS, כולל צריכת ממס נמוכה יותר, זמן ניתוח קצר יותר עקב עיבוד סימולטני של מספר דגימות (עד 18 ללוח)20, והקלה על פרשנות תערובות מורכבות בזכות הסלקטיביות של גזירה פוסט-כרומטוגרפית21.

בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול משולב לקביעת התרכובות הספציפיות המרכיבות את התכולה הפוליפנולית הכוללת (TPC) וסך כל הפלבנולים בתוספת 5-הידרוקסיפלבונים (TFHC) בתמציות קליפת הדרים באמצעות הפרדה כרומטוגרפית בשכבה דקה (HPTLC) בעלת ביצועים גבוהים, יחד עם הערכת תוכן כללית המבוססת על מבחן קולורימטרי מיקרופלט. כימות כרומטוגרפי מישורי של תרכובות פנוליות מתבצע באמצעות תגובת פולין–צ'יוקלטאו, בעוד שגזירת כלוריד האלומיניום מיושמת אך ורק לזיהוי כרומטוגרפי של רצועות התואמות לפלבונונים ו-5-הידרוקסיפלבונים. בגישה זו, קביעת TFHC מתבססת על תגובת פולין–צ'יוקלטאו של תרכובות מפורקות כרומטוגרפית ומזוהות כימית, ולא על קומפלקס כלוריד אלומיניום לצורך כמות. ניתוח HPTLC מאפשר הפרדה והדמיה ספציפית לתרכובת, ומאפשר זיהוי רכיבים פנוליים בודדים וזיהוי הפרעות ספקטרליות פוטנציאליות. בנוסף, מוצגת שיטה ספקטרופוטומטרית מבוססת מיקרופלטה להערכה מהירה של TPC ו-TFHC כוללים, המספקת כלי סינון משלים בעל תפוקה גבוהה למטריצות צמחים מורכבות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת קליפות פירות

  1. הסר כ-50 גרם קליפות מכל פרי, והפריד אותן מהחלק האכיל. לתוצאות המייצגות שלנו, קמנדרינות נקנו בחנות מקומית (מיובאת מצ'ילה, זן איזבלין), וליים נאספו מעץ ליד סן חוזה, קוסטה ריקה (דגימת שובר JVR-16434).
  2. הניחו את הקליפות בשקית פלסטיק עם זיפ-לוק והקפאו אותן בטמפרטורה של מינוס 20°C למשך לפחות שעתיים.
  3. העבר את הקליפות הקפואות למייבש קפוא מקורר מראש, השאיר את השקיות פתוחות, ומרח ואקום (0.1 מ"בר) למשך הלילה עד שייבש לחלוטין.
  4. טחנו כל חומר יבש לכ-0.1 מ"מ באמצעות טחנת להב.

2. חילוץ

  1. שקלו כ-100 מ"ג של קליפת הדרים יבשה וטחונה (ליים או מנדרינה) והניחו אותה בצינור זכוכית בנפח 15 מ"ל.
  2. הוסף 3 מ"ל של 60% אתנול לצינור.
  3. סוניקציה של התערובת באמבט אולטרסוני למשך 10 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי להפריע לתאי הצמח ולהקל על שחרור פיטוכימיקלים.
  4. צנטריפוגה את הדגימה ב-850 × גרם למשך 10 דקות.
  5. העבר בזהירות את הסופרנטנט האתנולי לבקבוק נפחי של 10 מ"ל באמצעות פיפט פסטר, תוך הימנעות מהפרעות למשקע.
  6. הוסיפו עוד 3 מ"ל של 60% אתנול לצינור המכיל את שאריות המוצק הלח.
  7. חזור על שלבי הסוניקציה והצנטריפוגציה שתוארו לעיל בשלבים 2.3 ו-2.4.
  8. העבר את הסופרנטנט לאותו בקבוק נפחי ומשלב אותו עם התמצית הקודמת.
  9. בצע חילוץ שלישי על ידי חזרה על השלבים הקודמים (2.6–2.8).
  10. חומצי את התמצית המשולבת (≈9 מ"ל) עם שתי טיפות של 0.1 מול/ליטר HCl (כדי להגביר את יציבות האנתוציאנינים ותרכובות פנוליות אחרות) והביאו את הנפח ל-10 מ"ל עם מתנול.
  11. בצע את ההליך הזה בשלושה עותקים עבור כל דגימה.

3. תכולת פלבונלים כוללת ו-5-הידרוקסיפלבונים (TFHC) באמצעות ספקטרופוטומטריית מיקרופלטות

  1. הכינו תמיסת קוורצטין (100 מיקרוגרם/מ"ל) או תקן פלבונואיד מקביל.
    1. שקלו 10 מ"ג קוורצטין עם איזון מדויק של 0.1 מ"ג.
    2. המיס את הקוורצטין בכ-5 מ"ל של 95% אתנול והעבר את התמיסה לבקבוק נפחי בנפח של 10 מ"ל המסומן כתמיסה המקורית.
    3. שטוף את הבקבוק פעמיים עם 2 מ"ל של 95% אתנול והוסף את השטיפות לבקבוק.
    4. תביא את הנפח לרמה עם 60% אתנול.
    5. הכינו תמיסות סטנדרטיות (10–100 מיקרוגרם/מ"ל) וחלל ריק בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לפי טבלה 1.
    6. ודאו שכל הדגימות והתקנים נמצאים בטווח ספיגה של 0.2–0.8, תוך התאמת הריכוזים במידת הצורך.
    7. הכינו את פריסת המיקרופלטה על ידי זריקת 60 מיקרולטר של ריק, דגימה או סטנדרט לכל באר לפי איור 1. בצע שלושה שכפולים לכל דגימה או תקן.
    8. פזר תמיסות מימיות של 2% אלומיניום כלוריד, 5% נתרן אצטט ו-80% מתנול למאגרי תגובת נפרדים.
      הערה: טפל בזהירות בתמיסות כלוריד אלומיניום ומתנול. תמיסות כלוריד האלומיניום מגרות, ומתנול רעיל על ידי בליעה, שאיפה וספיגה בעור. הימנעו מקשר עור ועין ולבשו ציוד מגן מתאים
    9. באמצעות פיפטה רב-ערוצית בעלת 8 ערוצים, הוסף 10 מיקרוליטר תמיסת אלקל₃, 10 מיקרוליטר תמיסת נתרן אצטט, ו-200 מיקרוליטר של 80% מתנול לכל באר.
    10. נער את הצלחת בעוצמה בינונית במשך 10 שניות ודגר אותה בחושך למשך 30 דקות.
    11. מדדו את הספיגה ב-415 ננומטר. אם אין אפשרות לנער, יש לערבב ידנית עם מיקרופיפטה לפני הדגירה (איור 2).
    12. אינטרפולציה של ערכי ספיגת הדגימה מעקומת הכיול והחלה גורמי דילול, נפח ותיקון מסה לפי הצורך.

טבלה 1: כמויות תקני קוורצטין עבור עקומת כיול כוללת של פלבונולים ו-5-הידרוקסיפלבונים (TFHC). אנא לחצו כאן להורדת טבלה זו.

figure-protocol-1
איור 1: פריסת מיקרופלטות עבור ניתוח מיקרופלטות כולל של פלבונולים ותכולת 5-הידרוקסיפלבונים (TFHC). (א) סכמה של מיקרופלטה. (B) תוכנת פריסת Gen5. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-2
איור 2: הגדרת תוכנת מיקרופלטה לניתוח תכולת פלבונלים כוללים ו-5-הידרוקספלאבונים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. תכולת פוליפנולית כוללת (TPC) באמצעות ספקטרופוטומטריית מיקרופלטה

  1. הכינו עקומת תקן חומצה גאלית (0.000–0.120 מ"ג/מ"ל).
    1. שקלו כ-0.0123 גרם חומצה גאלית (98% טוהר) באמצעות איזון אנליטי והמיסה במים מזוקקים.
    2. העבר את התמיסה לבקבוק נפחי של 10 מ"ל, שטוף פעמיים, ומלא עד הסימן במים מזוקקים כדי לקבל את התמיסה המקורית.
    3. הכינו תמיסה עובדת על ידי דילול 1 מ"ל מהתמיסה ל-10 מ"ל עם מים מזוקקים.
    4. הכינו תקני כיול על ידי דילול נוסף של התמיסה הפועלת לפי טבלה 2.
    5. כוון את הריכוזים אם ערכי הספיגה יוצאים מטווח 0.2–0.8.
    6. הכינו את תגובת העבודה של פולין–צ'יוקלטו על ידי דילול המגיב המסחרי 1:14 עם מים מזוקקים.
      הערה: תמיסות פולין–צ'יוקלטו וחומצה כלורית הן קורוזיביות. הימנעו מהתזות ומגע ישיר. לבצע טיפול בחומרים במכסה אדים.
    7. פיפט 30 מיקרוליטר מכל דגימה, סטנדרטית או ריקה, למיקרופלטה של 96 בארות בהתאם לפריסה באיור 3A, תוך שימוש בשלושה שכפולים לכל דגימה.
    8. הוסף 215 מיקרוליטר של תגובת עבודה של פולין–צ'יוקלטאו לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    9. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת נתרן פחמתי 20% לכל באר וערבבו היטב עם מיקרופיפטה.
    10. דגרו את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 40°C עם ערבוב (איור 3B).
    11. מדוד את הספיגה ב-755 ננומטר.

טבלה 2: כמויות תקני חומצה גאלית לעקומת כיול תכולת פנולית כוללת (TPC). אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

figure-protocol-3
איור 3: פריסת מיקרופלטות והגדרת תוכנה לניתוח מיקרופלטות כולל של תוכן פנולי (TPC). (א) תכנון. (ב) תוכנה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. תנאים כלליים המשמשים לניתוח כרומטוגרפיה בשכבות דקות בביצועים גבוהים

  1. עקומות סטנדרטיות
    1. הכינו תמיסות מלאי של קוורצטין וחומצה גאלית (100 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד) כפי שתואר לעיל בסעיף 3 ובסעיף 4.
    2. מרחו חומצה גאלית על שישה נתיבים בנפחים של 2, 4, 6, 8, 10 ו-12 מיקרוליטר.
    3. מרחו 5 מיקרו ליטר חומצה גאלית וקוורצטין בנפרד לנתיבים נפרדים לזיהוי.
  2. פריסת הלוחות:
    1. השתמשו בלוח TLC סיליקה ג'ל בגודל 10 × 20 ס"מ עם גובה אלומיניום 60 F₅₄ כשלב נייח.
    2. הגדר את פרמטרי היישום כך: מיקום Y 7.0 מ"מ, אורך רצועה 6.0 מ"מ, מיקום X הראשון 14.0 מ"מ, מרחק בין המסלולים 9.4 מ"מ.
    3. מרחו 10 מיקרוליטר מכל תמצית בכל רצועה תוך שימוש בחנקן כגז ריסוס.
    4. כוון את מרחק החזית של הממס ל-70 מ"מ.
  3. פיתוח הלוחות:
    1. פתח לוחות בתא ידני המכיל 40 מ"ל פאזה ניידת, ואפשר 10 דקות לרוויה בתא באמצעות נייר פילטר במגע עם הפאזה הניידת וקיר התא כדי לסייע לאדי הפאזה הניידת לרווי את אטמוספרת החדר.
    2. פתח לוחות באמצעות MP1 או MP2, תוך ביצוע פיתוח כפול לפי הצורך. שלב נייד 1 (MP1), המורכב מאתיל אצטט: חומצה פורמית: חומצה אצטית: מים (100:11:11:26); ו-MP2 עשוי טולואן: אתיל אצטט: חומצה פורמית (5:4:1).
      הערה: פתח לוחות HPTLC בתוך מכסה אדים. רכיבי פאזה ניידים (אתיל אצטט, טולואן, חומצה פורמית וחומצה אצטית) נדיפים, וטולואן ואתיל אצטט דליקים מאוד. הימנעו משאיפת אדים והסרו מקורות הצתה.
    3. תן לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר.
  4. גזירה
    1. ריסוס פלטות עם תגובת פולין–צ'יוקלטאו (300 מיקרוליטר מתגובה + 600 מיקרוליטר של 50% אתנול), מייבשים לזמן קצר עם אקדח חום, וריססו 1 מ"ל פחמן נתרן 10% ב-50% אתנול.
    2. בנפרד, רססו לוחות אחרים עם 1% אלומיניום כלוריד ב-50% אתנול.
  5. לוחות חום מתחברים באופן אחיד עם אקדח חום עד שהצבע מתייצב והלוחות יבשים לחלוטין.

6. פיתוח לניתוח כולל של פלבונולים, תכולת 5-הידרוקסיפלבונים (TFHC) ותוכן פנולי כולל (TPC) באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה בעלת ביצועים גבוהים

  1. יש ליישם דגימות בנתיבים משולשים יחד עם נתיבי ייחוס חומצה גאלית וקורצטין (לזיהוי, כפי שמתואר בשלב 5.1.4).
  2. פתח לוח באמצעות MP1.
  3. תפתח את הלוח שוב באמצעות MP2.
  4. נגזר את הלוח באמצעות מגיב FC כפי שתואר קודם.
  5. תעד את הלוחית באמצעות תאורה לבנה, וכן תאורת UV של 254 ננומטר ו-366 ננומטר.
  6. חזרו על ההליך, והחליפו את השלב האחרון לגזירה של AlCl3 , כפי שמוצג באיור 4.

figure-protocol-4
איור 4: שלבי VisionCats לניתוח TPC ו-TFHC על ידי HPTLC. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תנאי חילוץ
פרוטוקול החילוץ הכללי המתואר כאן משתמש ב-60% אתנול, כפי שדווח קודםלכן על 22%. כאשר משלמים זאת למקורות צמחיים אחרים, תנאי ההפקה יכולים להיות אופטימליים מבחינת קוטביות הממס ומספר המחזורים. הסבר מקיף לבחירת הממס ומספר המחזורים פורט במקום אחר16. בחירת הממס עשויה להיות מונחית על ידי ספרות קודמת ומדדי קוטביות; באופן כללי, מומלץ להשתמש בתערובות הידרואלכוהוליות של אתנול או מתנול, וכן אצטון. המספר האופטימלי של מחזורי החילוץ (n) ניתן להערכה על ידי חלוקת נפח כולל קבוע של 10 מ"ל ל-1–5 מחזורים של 10/n מ"ל, ולאחר מכן איחוד התמציות הנוזליות. היעילות של מספרי מחזור חילוץ שונים משווים סטטיסטית כדי לזהות את המצב שמניב את הספיגה המרבית במבחן TPC.

מיקרופלטה וכימות HPTLC
עקומות הכיול הסטנדרטיות הן למבחן המיקרופלטה והן לניתוח HPTLC מוצגות באיור 5. לקביעת תכולת פנולית כוללת (TPC) בשיטת פולין–צ'יוקלטו מיקרופלטה וללוחות HPTLC שנגזרו מאותו תגובה, נקבעו עקומות כיול באמצעות חומצה גאלית כתרכובת ייחוס. חומצה גאלית נבחרה לא רק משום שהיא אחת התקנים הנפוצים ביותר לכימות TPC, אלא גם משום שניתן לשחרר אותה באותם תנאי פאזה ניידים המיושמים על דגימות הסיד והמנדרינה. קוורצטין הוערך גם כסטנדרט פוטנציאלי לבדיקת HPTLC; עם זאת, הוא התברר כלא מתאים למערכת כרומטוגרפית זו, שכן הוא השתחרר יחד עם חזית הממס ולא ניתן היה לכמת אותו באופן אמין. עם זאת, TFHC נקבע באמצעות קוורצטין כתקן ייחוס, שכן חומצה גאלית אינה יוצרת קומפלקס צבעוני עם כלוריד אלומיניום, שכן היא אינה פלבונול ואינה 5-הידרוקסיפלבון.

figure-results-1
איור 5: לוח HPTLC של סיד, מנדרין, חומצה גאלית וקוורצטין התפתח ברצף עם MP1 ואחריו MP2, ונגזר בנפרד עם תגובות כלוריד אלומיניום (AlCl₃) ופולין–צ'יוקלטו (FC). הפרופיל הכרומטוגרפי לאחר נגזרת AlCl₃ מוצג. קיצורים: FC, נגזרת פולין–צ'יוקלטו; AlCl₃, נגזרת כלוריד אלומיניום; W, הארה באור לבן; 366, תאורת UV ב-366 ננומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

התוצאות עבור תכולת הפנול הכוללת (TPC) ותכולת הפלבנואידים והחומצה ההידרוקסיצינמית הכוללת (TFHC) מוצגות בטבלה 3. כצפוי, ערכי TFHC היו נמוכים משמעותית מערכי TPC, נמוכים פי חמישה בדגימות סיד ופי שתים עשרה בדגימות מנדרינה.

טבלה 3: תוצאות לתכולת הפנולית הכוללת של מנדרין וסיד בשיטת מיקרופלט. קיצורים: Abs: ספיגה, CV: מקדם שונות, DF: גורם דילול, GAE: מקבילות לחומצה גאלית, IR: שכפול עצמאי, QE: שווי קוורצטין, Rep: חזרה, SD: סטיית תקן, TFHC: פלבונלים כוללים ותרכובות 5-הידרוקסיפלבון, TPC: תכולת פנולים כוללת, וממוצע figure-results-2 . *חושב על בסיס חומר יבש. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

באופן דומה, התוצאות שהושגו מניתוח HPTLC מסוכמות בטבלה 4. הפרדה כרומטוגרפית מאפשרת הדמיה של רצועות בודדות המתאימות לתרכובות שונות. זוהו ארבעה מרכיבים פנוליים בדגימות סיד ושישה בדגימות מנדרינה. אף אחד מהרצועות הללו לא תאם את גורמי השימור של תקני הייחוס (חומצה גאלית וקוורצטין), דבר התואם את הציפיות.

טבלה 4: תוצאות עבור תכולת פנולית כוללת ותחומים תואמים ל-AlCl3 חשפו תרכובות על ידי HPTLC נגזרות עם AlCl3. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 4 גם מדווחת על התכולה הפנולית הכוללת המוערכת מניתוח HPTLC, שחושבה כסכום התרכובות הבודדות שזוהו כרומטוגרפית (בדומה ל-TPC). בנוסף, הטבלה כוללת את התוכן המצטבר של הרצועות שהוקצו לפלבונלים או 5-הידרוקספלאבנים (Rf = 0.46 ו-0.62 בסיד; לא זוהה במנדרינית). רצועות אלו נראו צהובות לאחר גזירה עם AlCl₃ והפגינו פלואורסצנציה צהבהבת תחת תאורת UV של 366 ננומטר. עם זאת, לא נצפתה צביעה נראית לעין לפני הנגזרות, כפי שמוצג באיור 5.

לניתוח HPTLC, גזירה של פולין-צ'יוקלטו (FC) מספקת זיהוי מקיף של תרכובות פנוליות, אם כי עלולות להתרחש הפרעות קלות. כמו כן, נגזרת כלוריד האלומיניום (AlCl₃) צובעת באופן סלקטיבי תת-קבוצה של פלבנואידים. היישום המשולב של שני המגבים משפר את תקנון השיטה ומפחית חלק מהמגבלות הטבועות בשתי הגישות. ראוי לציין כי לא סביר שתרכובת לא-פלבונואידית תציג גם את הצבע הכחול האופייני תחת FC וגם את הספיגה הצהובה-אדומה תחת AlCl₃. בנוסף, כרומופורים קיימים מראש יכולים להיפסל כהפרעות אם הם נראים באותה עוצמה לפני הנגזרות.

כפי שמוצג באיור 5, תמצית הסיד הציגה שני רצועות ב-Rf 0.62 ו-0.46, שלא היו ניתנים לזיהוי על הלוח הלא מפותח אך הפכו לגלויות בבירור לאחר נגזרת פולין–צ'יוקלטו (FC) ו-AlCl₃. התנהגות זו תומכת בטבע הפלבנואידי שלהם, ייתכן שמתאימה לניאוריוציטרין והספרידין23. רכיבים פנוליים נוספים נצפו ב-Rf 0.21 ו-0.37 בסיד, וב-Rf 0.36, 0.39, 0.42, 0.46, 0.54 ו-0.89 במנדרינית. רצועות אלו היו ניתנות לזיהוי לאחר נגזרת FC אך לא לאחר טיפול ב-AlCl₃, מה שמרמז שהן עשויות להתאים לתרכובות פנוליות שאינן פלבונואידיות. לפי הספרות, הפנולים הלא-פלבונואידיים העיקריים המדווחים במנדרינית כוללים חומצה כלורוגנית וחומצה טרנס-פרולית24,25. בסיד, תרכובות נוספות שתוארו קודם כוללות חומצה קומארית וחומצה דיהידרוקסיפרולית23. עם זאת, אישור המשימות הללו דורש ניתוח עם תקני ייחוס נוספים.

השוואת שלבי ניידות ב-HPTLC
שני שלבי הניידות פותחו כשינוי של מערכות שדווחו בעבר 26,27,28. הפאזה הניידת הפולרית יותר (MP1, איור 6A) סיפקה הפרדה טובה יותר של רכיבים פנוליים לעומת MP2. לעומת זאת, הפאזה הניידת הפחות קוטבית (MP2) (איור 6B) אפשרה שמירה בו-זמנית של רכיבי הדגימה ותקני ייחוס באותה הריצה כרומטוגרפית. עם זאת, בתנאי MP2, ערכי ה-RF של רכיבי המדגם היו נמוכים יחסית, כאשר חלק מהתרכובות נשארו קרובות למקור, כפי שמוצג באיור 6. כדי להתמודד עם מגבלה זו, יושם הליך פיתוח כפול באמצעות MP1 ואחריו MP2. אסטרטגיה זו הבטיחה נדידה ורזולוציה משופרת של רכיבי הדגימה, תוך מתן אפשרות לכימות מול תקני חומצה גאלית על אותו לוח בתנאים כרומטוגרפיים זהים. קוורצטין הציג צבע צהוב חלש לפני הטיפול ב-AlCl₃, שהתחזק לאחר הגזירה. עבור תמציות סיד ומנדרינה, נצפו שתי רצועות מובחנות בנוסף לרצועה שנותרה במקור. יתרה מזאת, פס צהוב עם ערך Rf של 0.14 הפך לגלות בבירור לאחר נגזרת AlCl₃.

figure-results-3
איור 6: לוחות HPTLC של סיד, מנדרין, חומצה גאלית וקורצטין שפותחו עם שלב נייד 1 (A) ושלב נייד 2 (B). לכל לוחית, המסלולים משמאל לימין מתאימים ל: דגימות מפותחות (לא נגזרות), נגזרות פולין–צ'יוקלטו, ודגימות נגזרות על ידי AlCl₃. ההדמיה בוצעה תחת תאורה לבנה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסוף ואחסון דגימות הם שלבים קריטיים להבטחת שלמות הניתוחים הפיטוכימיים. לאחר האיסוף, יש להעביר דגימות בתנאי קירור ולייבש בהקפאה בהקדם האפשרי כדי למזער את ההתדרדרות. בעוד שחומרים ביולוגיים מיובשים בדרך כלל יציבים, התמציות בתמיסה רגישות הרבה יותר, גם כאשר הן מאוחסנות בקירור. לכן, עדיף שהקבעות האנליטיות מתבצעות על תמציות שהוכנו טריות. אחסון ממושך, אפילו למספר ימים בתנאים קרים ומוגנים באור, או למספר שעות בטמפרטורת החדר, יכול להוביל לשינויים נראים לעין בפרופילים הכרומטוגרפיים, כולל שינויים בעוצמת הרצועה והיווצרות משקעים. שינויים אלו בדרך כלל קשורים לטרנספורמציות כימיות כגון חמצון, הידרוליזה או תגובות קומפלקסציה. כתוצאה מכך, כל התמציות והתמציות יש לאחסן ולטפל בתנאים קרים וחשוכים כדי לשמור על יציבותם הכימית.

בהשוואה בין שתי הטכניקות (טבלה 3 וטבלה 4), ניכרים הבדלים כמותיים שיטתיים. גם בסיד וגם במנדרינה, ערכי TPC שהושגו על ידי מבחן המיקרופלטה היו גבוהים פי שלושה מאלו שהוערכו על ידי HPTLC. בסיד, TPC היה 74.2 mmol/g על ידי מיקרופלטה לעומת 22.0 mmol/g DM על ידי HPTLC, בעוד שערכי TFHC היו 15.5 mmol/g ו-13.4 mmol/g, בהתאמה. במנדרינה, TPC הגיע ל-72.8 mmol/g על ידי מיקרופלטה לעומת 20.8 mmol/g ב-HPTLC. ב-TFHC, שיטת המיקרופלטה הניבה 6.0 mmol/g, בעוד שלא זוהו רצועות מקבלות על ידי HPTLC.

הבדלים אלו ניתנים להסבר על ידי המגבלות הפנימיות ומנגנוני התגובה של כל שיטה. מבחן פולין–צ'יוקלטו (FC) ידוע בכך שהוא מגיב לא רק עם תרכובות פנוליות אלא גם עם חומרים מחזרים לא-פנוליים שונים, כולל חומצה אסקורבית, טירוזין, חומצה פורמית וחומצה אצטית29, וכן רדוקטנטים אחרים בעלי משקל מולקולרי נמוך. תרכובות כאלה תורמות לאות הספקטרופוטומטרי הכולל, מה שעלול להוביל להערכת יתר של TPC. בנוסף, רכיבים פנוליים מינוריים עשויים להגדיל יחד את הספיגה הכוללת במבחן המיקרופלט, גם אם הריכוזים האישיים שלהם נמוכים מדי כדי לייצר פסים מובחנים וכמותיים ב-HPTLC. חלק מהמטבוליטים הקטנים או הקוטביים מאוד עשויים גם לא להישמר, לפתור או להיראות תחת התנאים הכרומטוגרפיים המופעלים.

figure-discussion-1
איור 7: ייצוג סכמטי של קומפלקסים של AlCl₃ שנוצרו מפלבונולים ו-5-הידרוקסיפלבונים. (א) פלבונולים ו-(B) 5-הידרוקסיפלבונים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הבדלים מתודולוגיים בכימיה של גילוי תורמים עוד יותר לשינויים הנצפים. תגובת ה-FC גורמת לעלייה משמעותית בספיגה עקב הפחתת המגע, מה שמוביל לרגישות אנליטית גבוהה. לעומת זאת, שיטת AlCl₃ אינה ספציפית יחסית ומתבססת על יצירת מורכבים עם פלבונואידים מסוימים. פלבנולים בדרך כלל מציגים ספיגה מרבית סביב 410 ננומטר, בעוד ש-5-הידרוקסיפלבונים סופגים בסביבות 440 ננומטר18, והקומפלקסים שלהם עם אלמיניום3⁺ מוצגים באיור 7. עם זאת, העלייה בספיגה לאחר הקומפלקסציה היא מתונה יחסית, מה שהופך את מבחן AlCl₃ לפגיע יותר להפרעות מרכיבי מטריצה צבעונית, כולל הפלבנואידים עצמם.

למרות מגבלות אלו, השימוש המשולב בגזירת FC ו-AlCl₃ ב-HPTLC מייצג אסטרטגיה משלימה עוצמתית לניתוח פנולי. גישה זו מחברת את הרגישות הגבוהה של תגובת ה-FC עם ההבחנה המבנית שמספקת קומפלקס AlCl₃ והפרדה כרומטוגרפית. יתרה מזאת, ידוע כי מספר פלבונולים מציגים פסים צהבהבים אופייניים תחת תאורת UV30, מה שמחזק עוד יותר את הסיווג והאישור של תרכובות.

שיטות מיקרופלט הן יתרון מיוחד לסינון בתפוקה גבוהה. הם דורשים הכנת דגימה מינימלית, צריכת תגובות נמוכה, ומאפשרים ניתוח סימולטני של עשרות דגימות במקביל. בתנאי מעבדה טיפוסיים, ניתן לבצע בדיקת מיקרופלטה מלאה בכ-4 שעות באמצעות מכשור זמין באופן נרחב. מאפיינים אלו הופכים את מבחני המיקרופלט למתאימים במיוחד למחקרים השוואתיים מהירים, בקרת איכות שגרתית והערכה ראשונית של מערכי דגימות גדולים. לעומת זאת, HPTLC דורש יותר זמן ועבודה, עם זרימת עבודה אנליטית מלאה שדורשת בדרך כלל 7–8 שעות. היא גם מתבססת על מכשור מיוחד שעשוי שלא להיות זמין בכל המעבדות, ושימוש בלוחות ייעודיים ומגזירי גזירה מעלה את עלות הניתוח לכל ניתוח. מגבלה נוספת היא שמטבוליטים בריכוזים נמוכים מאוד עשויים להישאר בלתי ניתנים לזיהוי בתנאי ויזואליזציה סטנדרטיים. עם זאת, מגבלות מעשיות ורגישות אלו מתאזנות על ידי היתרון המרכזי של הפרדה כרומטוגרפית30,31. HPTLC מאפשר פתרון רכיבים בודדים במטריצות צמחים מורכבות, אישור תגובות בדיקה אמיתיות, וזיהוי תרכובות פוטנציאליות מפריעות. יתרה מזאת, גזירה פוסט-כרומטוגרפית סלקטיבית מאפשרת סיווג פשוט של תרכובות לקבוצות פונקציונליות (למשל, פלבונולים ו-5-הידרוקסיפלבונים), ומגבירה את הפרשנות הכימית מעבר להערכת תוכן כולל.

בהתאם לכך, במחקרים רחבי היקף, זרימת העבודה האנליטית עשויה להתחיל בבדיקות מיקרופלט כדי לזהות במהירות דגימות עם רמות גבוהות של תרכובות מטרה. דגימות נבחרות יכולות לעבור ניתוח HPTLC כדי להמחיש רכיבים בודדים, להעריך סלקטיביות ולהעריך הפרעות אפשריות באמצעות גזירה כפולה. אסטרטגיה משולבת זו (המוצג באיור 8) משלבת מהירות ותפוקה עם ספציפיות כימית ותובנה מבנית.

figure-discussion-2
איור 8: תהליך עבודה מוצע לסינון וניתוח דגם. (א) סקר מיקרופלט בתפוקה גבוהה של כמות גדולה של דגימות. (B) ניתוח HPTLC של דגימות נבחרות לצורך כימות בשיטת Folin–Ciocalteu ולזיהוי פלבונלים ו-5-הידרוקסיפלבונים באמצעות נגזרת AlCl₃. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בהשוואה ל-HPTLC, HPLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HPLC–HRMS) — האלטרנטיבה הנפוצה ביותר המדווחת בספרות — מציע רגישות שאין לה מתחרים וזיהוי מבני חד-משמעי של תרכובות בודדות32. עם זאת, ניתוחי HPLC–HRMS איטיים מטבעם, שכן כל ריצת כרומטוגרפיה חייבת להתבצע ברצף, והם כרוכים בעלויות גבוהות בהרבה הקשורות למכשירים, דרישות טוהר ממס וצריכת ממס. יתרה מזאת, סינון במחלקת פונקציונל דורש לעיתים עיבוד נתונים מורכב ופרשנות ספציפית לתרכובת, בעוד ש-HPTLC מאפשר קיבוץ חזותי ישיר של תרכובות לאחר הגזירה. כתוצאה מכך, HPTLC מהווה פלטפורמה ביניים יעילה בין סקר מיקרופלט מהיר לניתוח HPLC–MS מקיף, תוך איזון בין קצב תפוקה, עלות וסלקטיביות כימית.

לניתוח פלבונואידים ופנוליים יש יישומים רחבים במדעי המזון, נוטרסוטיקלים, תרופות, חקלאות ומחקר חומרים. במדעי המזון, הוא משמש להערכת קיבולת נוגדי חמצון, אותנטיות, חיי מדף ובקרת איכות של מוצרים כמו מיצים, יינות ותה, וכן לתמיכה במחקרים אגרונומיים, כולל קביעת זמן קציר אופטימלי בהתבסס על בשלות פנולית33. בתחום התזונה, פרופיל פנולי חיוני לסטנדרטיזציה והבטחת איכות של תמציות צמחיות ומוצרים מסחריים כגון קפסולות תמצית תה ירוק, תוספי תמצית גרעיני ענבים, טבליות קוורצטין ונוסחאות ביופלבונואידיות הדריות. במחקר פרמצבטי וביו-רפואי, ניתוחים אלו תומכים בסקר תרכובות ביואקטיביות עם פוטנציאל נוגד חמצון, אנטי-דלקתי ואנטי-מיקרוביאלי6. בחקלאות ובפיזיולוגיה של צמחים, קביעת פנולים מסייעת להעריך את תגובות הלחץ של הצמח ולהנחות אסטרטגיות שיפור גידולים. בנוסף, במדעי החומרים — במיוחד במחקרים של מעכבי קורוזיה שמקורם בצמחים34,35 — אפיון פנולי מסייע בקשר בין הרכב כימי להתנהגות ספיחה ויעילות הגנה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם חושפים ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסגן הרקטור של ההרחבה על הסיוע הנדיב להקלטת וידאו, במיוחד לסגנית הרקטור יולנדה פרס-קריו ולצלמת הווידאו נטליה סילבה-מאפיו. אנו מודים בהכרת תודה על "הקרן לתמיכה בהפצת ידע שנוצר ב-UNA" מסגן הנשיא למחקר על תמיכה בעלויות הפרסום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות אפנדורף 1.5 מ"לאפנדורף
בקבוקי נפח של 10 מ"למעבדות אייסקוCH0451B10/19 עוצר פוליפרופילן, זכוכית בורוסיליקט, ענבר - סימן סיום לבן, סבילות ופלוסמן; 0.025 מ"ל 
100 ומיקרו; L ו-1000 ומיקרו; קצות מיקרופיפט Lגנרי
100– 1000 ומיקרו; מיקרופיפטה Lאפנדורףריסרץ' פלוס
10– 100 ומיקרו; מיקרופיפטה Lאפנדורףריסרץ' פלוס
צינורות זכוכית עם כיסוי 15 מ"לגנרי
בקבוקים של 50 מ"לגנרי
מיקרופיפט רב-ערוצי בעל 8 ערוציםתרמו-מדעי
מיקרולוחות 96 בארותגריינר655891פוליציקלולפין, תחתית זכוכית, שחור
איזון אנליטי  &ועוד; 0.0001 גרם
דוגמית TLC אוטומטיתCAMAGATS4
צנטריפוגהתרמו-מדעיסורוול ST8R≥ 850 & פעמים; g
נייר פילטר ווטמןלרוויית תא
מייבש הקפאהLABCONCOדגם 10
מאגרי תגובת פלסטיקאפנדורף
מרית עם קצה שטוח וקצה כףמרק כימיקליםHS15906
קורא מיקרופלטות רב-גילוי Synergy HTביו-טק אינסטרומנטססינרג'י HT
לוחות סיליקה ג'ל TLC 60 F254 עם גב אלומיניום (10 פעמים 20 ס"מ)מרק
מרסס TLCסיגמא-אלדריץ'20 מ"ל
TLC VisualizerCAMAG2
אמבטיה/חומר ניקוי אולטרסוניעבודותZX-040עם בקרת טמפרטורה ב-40 ו-°G; C
UV לאמבUPVUVGL-58
תוכנת VisionCATSCAMAG
שקיות זיפ-לוקגנרירבע רבע גלון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kang, H. J., Chawla, S. P., Jo, C., Kwon, J. H., Byun, M. W. Studies on the development of functional powder from citrus peel. Bioresour Technol. 97 (4), 614-620 (2006).
  2. Furukawa, Y., et al. Isolation and characterization of neuroprotective components from citrus peel and their application as functional food. Chem Pharm Bull. 69 (1), 2-10 (2021).
  3. Kim, S. S., Lee, J. A., Kim, J. Y., Lee, N. H., Hyun, C. G. Citrus peel wastes as functional materials for cosmeceuticals. J Appl Biol Chem. 51 (1), 7-12 (2008).
  4. Shyu, Y. S., Lu, T. C., Lin, C. C. Functional analysis of unfermented and fermented citrus peels and physical properties of citrus peel-added doughs for bread making. J Food Sci Technol. 51 (12), 3803-3811 (2014).
  5. Hasnat, H., et al. Flavonoids: A treasure house of prospective pharmacological potentials. Heliyon. 10 (6), e27533(2024).
  6. Albuquerque, B. R., Heleno, S. A., Oliveira, M. B. P. P., Barros, L., Ferreira, I. C. F. R. Phenolic compounds: Current industrial applications, limitations and future challenges. Food Funct. 12 (1), 14-29 (2021).
  7. Khoddami, A., Wilkes, M., Roberts, T. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 18 (2), 2328-2375 (2013).
  8. Kupina, S., Fields, C., Roman, M. C., Brunelle, S. L. Determination of total phenolic content using the Folin-C assay: Single-laboratory validation, first action 2017.13. J AOAC Int. 102 (1), 320-321 (2019).
  9. Matić, P., Sabljić, M., Jakobek, L. Validation of spectrophotometric methods for the determination of total polyphenol and total flavonoid content. J AOAC Int. 100 (6), 1795-1803 (2017).
  10. Folin, O., Ciocalteu, V. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. J Biol Chem. 73 (2), 627-650 (1927).
  11. Folin, O., Denis, W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J Biol Chem. 12 (2), 239-243 (1912).
  12. Lamuela-Raventós, R. M. Folin-Ciocalteu Method for the Measurement of Total Phenolic Content and Antioxidant Capacity. Measurement of Antioxidant Activity & Capacity. , John Wiley & Sons. (2017).
  13. Christ, B., Müller, K. H. Zur serienmäßigen bestimmung des gehaltes an flavonol-derivaten in drogen. Arch Pharm. 293 (12), 1033-1042 (1960).
  14. Carter, J. A., Barros, A. I., Nóbrega, J. A., Donati, G. L. Traditional calibration methods in atomic spectrometry and new calibration strategies for inductively coupled plasma mass spectrometry. Front Chem. 6, 504(2018).
  15. Appel, H. M., Govenor, H. L., D’Ascenzo, M., Siska, E., Schultz, J. C. Limitations of Folin assays of foliar phenolics in ecological studies. J Chem Ecol. 27 (4), 761-778 (2001).
  16. Cubero-Román, E., Carvajal-Miranda, Y., Rodríguez, G., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P. Antioxidant and antimicrobial activity of two Costa Rican cultivars of ber (Ziziphus mauritiana): An underexploited crop in the American tropic. Food Sci Nutr. 11 (6), 3320-3328 (2023).
  17. Shraim, A. M., Ahmed, T. A., Rahman, M. M., Hijji, Y. M. Determination of total flavonoid content by aluminum chloride assay: A critical evaluation. LWT. 150, 111932(2021).
  18. Mammen, D., Daniel, M. A critical evaluation on the reliability of two aluminum chloride chelation methods for quantification of flavonoids. Food Chem. 135 (3), 1365-1368 (2012).
  19. Salih, A. M., et al. Optimization method for phenolic compounds extraction from medicinal plant (Juniperus procera) and phytochemicals screening. Molecules. 26 (24), 7454(2021).
  20. Loescher, C. M., Morton, D. W., Razic, S., Agatonovic-Kustrin, S. High performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) for the qualitative and quantitative analysis of Calendula officinalis–Advantages and limitations. J Pharm Biomed Anal. 98, 52-59 (2014).
  21. Attimarad, M., Mueen Ahmed, K. K., Aldhubaib, B. E., Harsha, S. High-performance thin layer chromatography: A powerful analytical technique in pharmaceutical drug discovery. Pharm Methods. 2 (2), 71-75 (2011).
  22. Dellapina, G., et al. Flavonoid-rich extracts from lemon and orange by-products: Microencapsulation and application in functional cookies. Foods. 14 (19), 3346(2025).
  23. Sanches, V. L., et al. Comprehensive analysis of phenolics compounds in citrus fruits peels by UPLC-PDA and UPLC-Q/TOF MS using a fused-core column. Food Chem X. 14, 100262(2022).
  24. Kaur, S., Singh, V., Chopra, H. K., Panesar, P. S. Extraction and characterization of phenolic compounds from mandarin peels using conventional and green techniques: A comparative study. Discover Food. 4 (1), 60(2024).
  25. Quispe-Fuentes, I., Uribe, E., López, J., Contreras, D., Poblete, J. A study of dried mandarin (Clementina orogrande) peel applying supercritical carbon dioxide using co-solvent: Influence on oil extraction, phenolic compounds, and antioxidant activity. J Food Process Preserv. 46 (1), e16116(2022).
  26. Tatkare, P. C., Jadhav, A. P. Development and validation of a novel high-performance thin-layer chromatography method for the quantitative estimation of neohesperidin from Citrus aurantium peel extract. JPC J Planar Chromatogr Mod TLC. 35 (6), 579-584 (2022).
  27. Wagner, H., Bladt, S. Plant Drug Analysis. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin. (1996).
  28. Apraj, V., et al. Pharmacognostic and phytochemical evaluation of Citrus aurantifolia (Christm) Swingle peel. Pharmacogn J. 3 (26), 70-76 (2011).
  29. Bastola, K. P., Guragain, Y. N., Bhadriraju, V., Vadlani, P. V. Evaluation of standards and interfering compounds in the determination of phenolics by Folin-Ciocalteu assay method for effective bioprocessing of biomass. Am J Anal Chem. 8 (6), 416-431 (2017).
  30. Sultana, S., et al. Investigating flavonoids by HPTLC analysis using aluminium chloride as derivatization reagent. Molecules. 29 (21), 5161(2024).
  31. Pawar, K. N., Kadam, S. P., Redasani, V. K. A systematic review on high performance thin layer chromatography (HPTLC). Int J Pharm Res Appl. 10 (3), 402-416 (2025).
  32. Saftić Martinović, L., Barbarić, L., Gobin, I. Qualitative and quantitative mass spectrometry approaches for the analysis of phenolic compounds in complex natural matrices. Appl Sci. 15 (23), 12529(2025).
  33. de Araújo, F. F., de Paulo Farias, D., Neri-Numa, I. A., Pastore, G. M. Polyphenols and their applications: An approach in food chemistry and innovation potential. Food Chem. 338, 127535(2021).
  34. Castro-Castro, V., Jiménez-Bonilla, P., Álvarez-Valverde, V., Rodríguez-Yáñez, J. Pichichio extracts (Solanum mammosum) as a corrosion inhibitor of low carbon steel in an acidic environment. Pure Appl Chem. 98 (2), 283-300 (2026).
  35. Evaluation of natural products as corrosion inhibitors: Pinus caribaea and Pachira quinata bark extracts on steel. Villalobos-Ugalde, A., Piedra-Marín, G., Rodríguez-Yañez, J., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P., Soto-Fallas, R. M. 6th IEEE International Conference on BioInspired Processing (BIP 2024), , (1109).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Total Phenolic ContentTotal FlavonolsMicroplate AssaysHPTLC AnalysisPhenolic ProfilingFlavonoid DeterminationFolin Ciocalteu AssayAluminum Chloride AssayPhytochemical Characterization
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים