מאמר שיטה

פרופיל פנוטיפי של פנוטיפים התנהגותיים דמויי פרקינסון שנגרמו על ידי MPTP בזחלי דגי זברה בהתבסס על ניסוי התנהגותי

DOI:

10.3791/70041

⸱

15 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה קובע פרדיגמת פנוטיפ התנהגותית בזחלים של דגי זברה שטופלו ב-MPTP כדי להעריך ליקויים מוטוריים ולא מוטוריים הדומים למחלת פרקינסון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול פנוטיפינג התנהגותי ייחודי ורב-פרמטרי למחלת פרקינסון (PD) הנגרמת על ידי MPTP בזחל זברה. השראה כימית של פתולוגיה דמוית PD בדגי זברה מספקת מערכת בעלת תפוקה גבוהה וניתנת לטיפול גנטית, אך רוב המחקרים התמקדו בעיקר בבדיקות תנועה בסיסיות או במעברים פשוטים של אור-חושך. גישות מוגבלות כאלה אינן מצליחות ללכוד את הספקטרום הרחב יותר של דיספונקציות הקשורות לפרקינסון, החל מברדיקינזיה וליקויים סנסורימוטוריים ועד להתנהגויות דמויות חרדה והפרעות שינה. כדי להתמודד עם הפער הזה, המחקר פיתח סוללה משולבת של 6 בדיקות משלימות: בדיקת מוטוריקה להערכת הנעה המוטורית הכללית וההנעה החקירתית; הערכת תיגמוטקסיס לזיהוי התנהגויות העדפה קצוות הקשורות לחרדה; בדיקת תגובת בהלה לרישום ברדיקינזיה ופגיעה בתגובתיות מוטורית; בדיקות אתגר אור-חושך להערכת נטילת סיכונים ותגובה ללחץ; פרדיגמות תגובה פוטו-מוטוריות (כולל גירוי אור מהבהב) לכימות תנועה סנסורימוטורית ורפלקסיבית; וניטור ויסות שינה-ערות למדידת התנהגות שינה-ערות. דגי זברה זחלים נחשפים לריכוזים תת-קטלניים של MPTP מיום אחד לאחר ההפריה (DPF) ועד 5 DPF, כאשר הערכות התנהגותיות מתחילות בין 4 ל-6 dpf. מעקב אוטומטי ברזולוציה גבוהה מייצר מספר נקודות קצה התנהגותיות בכל מבחן. גישה זו חושפת שינויים דמויי פרקינסון שלא זוהו קודם, כגון ארכיטקטורת שינה לא מסודרת, פגיעה בלמידת ההרגל, תנועה סנסורית-מוטורית ורפלקסיבית, המשקפת תסמינים לא מוטוריים מוקדמים. על ידי שילוב בדיקות אלו, החוקרים מקבלים תסמין התנהגותי מקיף שמשקף יותר את המורכבות של הפרקינסון האנושי. פרוטוקול זה מרחיב את הפרדיגמה לחקר פתוגנזה של PD, סינון טיפולים מועמדים וחקר מודולטורים סביבתיים. הוא ממחיש את מטרת האוסף להציג מודלים חדשניים של בעלי חיים שמגבירים רלוונטיות תרגומית באמצעות פנוטיפינג חזק ורב-פנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון (PD) היא ההפרעה הניוונית הנוירודגנרטיבית השנייה השכיחה ביותר אחרי מחלת אלצהיימר1. שכיחותו ומספר האנשים שנפגעו עלו בהתמדה בשנים האחרונות, ומציבים אתגר בריאותי משמעותי ברחבי העולם2. שיעור השכיחות של PD עולה באופן בולט בגיל 3.4. קלינית, פרקינסון מתבטא הן בתסמינים מוטוריים – כמו דיסקינזיה, ברדיקינזיה, רעד במנוחה וחוסר יציבות יציבה – והן במגוון תסמינים לא מוטוריים, כולל פגיעה קוגניטיבית, חרדה והפרעות שינה. נכון להיום, האבחנה של פרקינסון תלויה בעיקר בנוכחות תסמינים מוטוריים6; עם זאת, עד שהתסמינים הללו מתגלים, מעל 60% מנוירוני הדופמין ב-substantia nigra כבר אבדו7. למרות שתסמינים לא מוטוריים מופיעים לעיתים קרובות מוקדם יותר, היעדר קריטריונים ספציפיים ואובייקטיביים מסבך את האבחון המוקדם וההתערבות8. כיום, הטיפול העיקרי בפרקינסון כולל מתן לבודופה9, שמומרת לדופמין במוח, ובכך משחזרת את רמות הדופמין בסטריאטום. בעוד שטיפול זה יכול להקל זמנית על התסמינים, הוא אינו עוצר את התקדמותהמחלה. כתוצאה מכך, מחקר נוסף על הפתוגנזה של PD ובדיקות סמים הוא חיוני.

בניית מודלים מתאימים לבעלי חיים היא קריטית למחקר על פתוגנזה של PD ובדיקות תרופות נגד PD. כעת, ישנם שלושה מודלים עיקריים למחקרי PD: מודל השראה כימית11, מודל עריכת גנים12, ומודל xenotransplantationאנושי 13. בעלי חיים מודליים נפוצים כוללים מכרסמים, כמו עכברים14, ופרימטים לא-אנושיים כמו קופים15. לאחרונה, דגי זברה (Danio rerio) זכו לתשומת לב גוברת במחקרי PD בזכות יתרונותיהם כגון גודל קטן, גדילה מהירה, הומולוגיה גנטית גבוהה עם בני אדם, ועוברים שקופים16. שימוש בנוירוטוקסין MPTP (1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרהידרופירידין) לגרימת נזק לנוירון דופמין17,18, הוא שיטה קלאסית לבניית מודל PD. דגי זברה שנחשפו לריכוזי MPTP תת-קטלניים מציגים פנוטיפים התנהגותיים שונים הדומים ל-PD19.

עם זאת, רוב מחקרי פרקינסון דגי הזברה כיום מתמקדים בעיקר בהתנהגויות מוטוריות בסיסיות או במעברים פשוטים בין אור לחושך16,20, ובדיקות התנהגותיות חד-ממדיות קשות לשקף במלואן את המאפיינים ההתנהגותיים המורכבים של פרקינסון, במיוחד שינויים התנהגותיים בתפקוד לא מוטורי. בהתחשב בכך שפרקינסון היא מחלה המערבת מערכות נוירו-התנהגותיות רבות שמעבר לשליטה מוטורית 21,22,23, יש צורך דחוף בשיטת הערכת פנוטיפ התנהגותי רב-פרמטרי כדי ללכוד את הפנוטיפים הרב-מערכתיים שלה.

בהתאם לכך, מחקר זה בונה פרוטוקול מבחן פנוטיפ התנהגותי פרמטרי ומהיר, כדי לתאר בצורה מקיפה יותר את הפנוטיפים ההתנהגותיים הדומים לפרקינסון בזחלי דגי זברה שטופלו ב-MPTP. מינון תת-קטלני של MPTP (50 מיקרומ'25) הוחל על הזחלים בין יום לחמישה ימים לאחר ההפריה (DPF)16,20,26. מ-4 עד 6 dpf 16,20,24, ערכנו 6 בדיקות התנהגות: ניטור ויסות שינה-ערות, פרדיגמות תגובה פוטו-מוטוריות, הערכת תיגמוטקסיס, הערכת תנועה, מבחן תגובה בהלהלה, ובדיקות אתגר אור-חושך. הערכות התנהגותיות אלו מכסות היבטים מוטוריים ולא מוטוריים, כגון ליקויי תנועה, סנסורימוטור, למידת הרגל, לקיחת סיכונים, תגובת לחץ וקצב שינה-ערות.

באמצעות מערכת מעקב וידאו בתפוקה גבוהה של Zebrabox ושיטת ניתוח כמותית, חילצנו וכימינו פרמטרים התנהגותיים שונים והשווינו את ההבדלים ההתנהגותיים בין קבוצת ה-MPTP לקבוצת ה-WT (WT) באמצעות סטטיסטיקה. בהשוואה לבדיקות PD קיימות של דגי זברה, סוללה התנהגותית רב-פרמטרית זו לוכדת פנוטיפים מוטוריים ולא מוטוריים במסגרת סטנדרטית. מערכת המעקב האוטומטית מבטיחה רכישת נתונים התנהגותיים אובייקטיביים ויכולת שכפול גבוהה. בנוסף, גודל הגוף הקטן של הזחלים מאפשר למקם בעלי חיים בודדים בלוחות מרובי בארות, מה שמאפשר הערכה בתפוקה גבוהה. היתרונות הנ״ל מועילים לניתוח מעמיק של המנגנון הפתולוגי של פרקינסון, סקר התרופות או התרכובות המועמדות לחקר השפעת גורמים סביבתיים על הופעת או התפתחות המחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה שכלל דגי זברה נערך בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים, ואושר על ידי הוועדה האתית של בית הספר למדעי הפרמצבטיקה, אוניברסיטת שאנדונג (מס' YXDW2025-0056). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ל-MPTP

  1. הכינו מדיום 1× E3 על ידי דילול תמיסת E3 בגודל 100× 1:100 עם מים אולטרה-טהורים (למשל, מערבבים 5 מ"ל של 100× E3 עם 495 מ"ל מים אולטרה-טהורים כדי לקבל 500 מ"ל של מדיום E3 1×).
    הערה: הכינו E3 מדיום טרי ביום השימוש.
  2. הכינו תמיסת מצק MPTP של 1 מ"מ על ידי הוספת 5.0 מ"ג אבקת MPTP לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל והוספת מדיום E3 לנפח סופי של 25 מ"ל (השתמשו בצינור הצנטריפוגה כמיכל ערבוב, אך אין צורך בצנטריפוגה). סמן את התמיסה כפתרון מקורי של 1 mM MPTP. אחסן את התמיסה המקורית בחושך.
  3. הכנת תמיסת MPTP של 50 מיקרומול: העבר 2.5 מ"ל מתמיסת המאגר של 1 מ"מ MPTP למיכל נקי ומדלל עם 47.5 מ"ל מדיום E3 כדי לקבל נפח סופי של 50 מ"ל בריכוז סופי של 50 מיקרומולר MPTP. החלק הנותר של תמיסת המלאי המשיך להישמר בחושך.
    אזהרה: MPTP הוא נוירוטוקסין חזק ויש לטפל בו בזהירות רבה. תמיד לבש ציוד מגן אישי (PPE) מתאים, כולל כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי מגן. סילוק פסולת MPTP בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית.

2. הכנת וקיבוץ עוברי דגי זברה

  1. בחרו זכרים ונקבות דגי זברה בוגרים בוגרים מינית ומבצעים רבייה מבוקרת באמצעות אקווריומי רבייה עם מחיצות ניתנות להסרה. בשעה 20:00, מניחים דגי זברה זכרים ונקבות בנפרד במיכלי הרבייה ביחס של 2:3, והפרדו אותם עם מחיצות.
  2. ביום הבא, יש להסיר את המחיצות בשעה 8:00 בבוקר כדי לאפשר הזדווגות, וכך להתחיל את ההתרבות. לאסוף עוברים אחרי שעה, ולשטוף אותם שלוש פעמים במים נקיים של המערכת.
  3. עוברים בבית בצלחות פטרי בגודל 100 מ"מ עם מדיום E3 טרי, ודגרו אותם בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במחזור של 14 שעות אור / 10 שעות חושך (אורות דלוקים מ-08:00 בבוקר עד 22:00).
    הערה: אין לעלות על 50 עוברים בכל מנה עם מדיום של 20 מ"ל כדי להבטיח התפתחות תקינה.
  4. ב-1 DPF, יש להסיר בזהירות את העוברים הלא מופריים, המעוותים והלא תקינים באמצעות פסטר פיפט, ולהחליף את התמיסה המכילה עוברי דג זברה. לקבוצת WT, החליפו את המדיום הקיים במדיום עובר E3 טרי. עבור הקבוצה שטופלה ב-MPTP, יש להחליף את התווך בתמיסת MPTP של 50 מיקרומולר (איור 1A), ואז להחזיר את שתי הקבוצות לאינקובטור.
  5. בשתי הקבוצות, החלף את התמיסה והסירו עוברים מתים או לא בריאים כל 24 שעות. עבור קבוצת ה-MPTP, החלף את תמיסת ה-MPTP מדי יום מהבוקר של 1 DPF ועד הבוקר של 4 DPF (איור 1A). לאחר מכן, להעביר את קבוצת הטיפול ב-MPTP ל-E3 בינוני החל מהבוקר של 5 dpf ועד לסיום הניסוי.
    הערה: החליפו בעדינות את התמיסה באמצעות פיפט פסטר. שאיבו את המדיום באיטיות מקצה צלחת הפטרי והוסיפו תמיסה טרייה לאורך דופן הצלחת כדי למזער הפרעה לעוברים.

3. ניטור ויסות שינה - ערות

  1. ב-4 DPF, בחרו זחלי דגי זברה מכל קבוצה בשעה 18:00, והעבירו אותם לפלטת עם 96 בארות באמצעות פיפט פסטר מותאם בנפח 3 מ"ל עם הקצה מנותק, זחל אחד לכל באר (איור 1B). ארבע השורות הראשונות מייצגות את קבוצות WT, וארבע השורות האחרונות מייצגות את קבוצות MPTP (48 דגי זברה בכל קבוצה).
    הערה: כדי להימנע מגירוי או נזק לדגי זברה, שנו את פיפטות פסטר על ידי חיתוך הקצה (10 מ"מ) כדי לספק קדח רחב גדול מגודל זחלי דגי זברה במשקל 4 DPF (אורך הגוף עולה על 3.7 מ"מ27,28).
  2. צפו בכל באר עם מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שמראה כל זחל דג זברה בריא, שהסנפירים פתוחים ומתנדנדים בקביעות, הגוף זקוף, ושלפוחית השחייה מנופחת29. לאחר שווידא שדגי הזברה בכל באר במצב בריא, מלאו כל באר ב-E3 בינוני.
    הערה: מלאו כל באר ב-E3 בינוני עד כמעט בולט, כדי להבטיח שמתח הפנים נשמר. הוסיפו בזהירות את הנוזל כדי למנוע בועות וגלישת באר חוצה.
  3. לאחר העברת הדג והנוזל ללוח עם 96 בארות, הניחו אותם בתא זברה כדי להסתגל ל-30 דקות לפני מבחן ההתנהגות של שינה-ערות.
    הערה: לפני שמניחים את צלחת ה-96 בארות בתא זברבוקס, נקה בקפידה את תחתית הלוח כדי למנוע לכלוך שישפיע על תוצאות מעקב הווידאו.
  4. פתח את תוכנת מעקב הווידאו של Zebralab, בחר במצב קוונטיזציה , וודא שלוח 96 הבארות ממוקם במרכז בתחתית תא Zebrabox.
  5. כוון את התאורה לכבות את האור בשעה 22:00 ולהדליק את האור בשעה 8:00 בבוקר, מה שמתאים לתנאי התאורה כאשר דג הזברה מגדל. במהלך היום, אור לבן בדרך כלל סביב 1000 לוקס. הגדר את פרמטרי התוכנה כדלקמן:29: סף גילוי, 40; burst, 25 (סף לתנועה מתקדמת); הקפאה (סף לתנועה), 4; גודל מיכל, 60 שניות; זמן המעקב הכולל, 52 שעות (20:00 ביום הראשון ועד 00:00 ביום השלישי). התחילו את תהליך השינה-ערות בשעה 20:00.
    הערה: לאחר תחילת ההליך, יש לאסור כל רעש ורעידות מבחוץ לאורך כל הניסוי, כדי לא להשפיע על קצב השינה-ערות הרגיל של דגי הזברה. כדי למנוע אידוי מים במהלך ניטור ארוך טווח, כסה את לוח 96 הבארות בניילון נצמד שקוף.
  6. אחרי 52 שעות, עצור את ניסוי השינה-ערות, ושמור את קובץ הנתונים. הסר את פלטת 96 הבארים מה-ZebraBox.
    הערה: באמצעות MATLAB ו-Excel, פרמטרים נחוצים כגון מספר התקפי שינה (תקופות שינה מוגדרות כתקופות של חוסר פעילות שנמשכות לפחות דקה אחת)29, אורך השינה הממוצע (משך השינה הממוצע), משך השינה הכולל (כל משך השינה במהלך תקופת המעקב), זמן השהייה בשינה (זמן ממעבר קל ועד תחילת פרק השינה הראשון), פעילות ממוצעת (מוגדרת כפעילות מוטורית לאורך כל תקופת המעקב), ופעילות ערות (מוגדרת כפעילות תנועה בלבד בתקופת הערות, למעט פרקי השינה) הופקו ונותחו מקובץ הנתונים.
    1. השתמשו במבחן t של תלמיד כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת ה-WT לבין קבוצת ה-MPTP. בנוסף, צייר את עקומת השינה, עקומת הפעילות הערות ועקומת הפעילות הממוצעת של דגי זברה במשך 52 שעות באמצעות תוכנת MATLAB.

4. פרדיגמות תגובה פוטו-מוטוריות

הערה: פרדיגמות תגובה פוטו-מוטוריות (כולל אור מהבהב) הן מבחני התנהגות בעלי תפוקה גבוהה בזחלים של 5 DPF כדי לכמת שינויים סנסורימוטוריים ורפלקסיביים בתגובה למעבר פתאומי של האור. מבחן זה בוצע באמצעות פלטת 96 בארות, שכללו 2 פרדיגמות: (1) מעבר אור מדקה של חושך לדקה אחת של אור קבוע (1000 lx), ו-(2) תגובת אור מהבהבת הכוללת מעבר מדקה של חושך לדקה אחת של אור מהבהב בתדר 10 הרץ.

  1. הניחו את הזחלים עם 5 dpf בצלחת עם 96 בארות (זחל אחד לכל באר) (איור 1B), ומלאו כל באר במדיום E3. חלק בסך הכל 96 זחלים לקבוצת WT ולקבוצת MPTP בממוצע.
  2. פרדיגמת אור קבוע-חושך:
    1. הניחו את הפלטת עם 96 בארות עם זחלים של 5 dpf בתוך תיבת הזברה ותנו לזחלים להסתגל ל-5 דקות בחושך לפני הבדיקה.
    2. פתח את מצב הניתוח של מעקב מקוון.
    3. הגדר את תוכנית מעבר האור כך: 0-60 שניות: כהה, 60-120 שניות: אור קבוע (1000 lx).
    4. התחל את הפרוטוקול, אסוף פרמטרי תנועה קשורים כל 6 שניות במהלך הבדיקה של 120 שניות.
    5. עצור את הפרוטוקול ב-120שנייה, יצא את קובץ הנתונים. הניחו את הזחלים בחושך מוחלט למשך 5 דקות כדי להתרגל לסביבה, ולהכין אותם לבדיקה הבאה של אור כהה-מהבהב.
  3. פרדיגמת אור כהה-מהבהב:
    1. הגדר את תוכנית מעבר האור כך: 0-60 שניות: כהה, 60-120: אור מהבהב (1000 lx) ב-10 הרץ.
      הערה: סטרוב של 10 הרץ מתייחס ל-10 פולסי אור בשנייה. ב-ZebraLab, יש ליישם זאת על ידי החלפת עוצמת האור מ-0 ל-1000 lx כל 100 מילישניות.
    2. לאחר סיום ההתאמה החשכה של 5 דקות, התחילו את בדיקת האור מהבהיר של החושך. אסוף פרמטרי תנועה כל 6 שניות במהלך הבדיקה של 120 שניות.
  4. ניתוח נתונים: לאחר סיום הבדיקה, ייצא את קובץ הנתונים. השתמש בתוכנת MATLAB כדי לחלץ את מרחק השחייה כל 6 שניות. שרטט את המרחק הכולל (ערך ממוצע ל-6 שניות) ששתה בתקופת ה-2 דקות עבור שתי הבדיקות. חשב את מדד הקיפאון על ידי חיסור המרחק הכולל שנעבר בדקה אחת בחושך מהמרחק הכולל שנעבר באור30.
    הערה: מדד הקפאה < 0 מציין התנהגות הקפאה; מדד הקפאה > 0 מציין בריחה; מדד הקפאה = 0 פירושו שאין תגובה. השתמשו במבחן t של סטודנט וב-ANOVA דו-כיווני כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת ה-WT לבין קבוצת ה-MPTP. בסך הכל נעשה שימוש ב-48 זחלי דגי זברה (n = 48) בכל קבוצה.

5. הערכת תיגמוטקסיס

  1. בחר שתי פלטות עם 6 בארות, מלא כל באר ב-4 מ"ל E3 בינוני.
  2. ב-5 dpf, זחלי דגי זברה מקבוצת WT וקבוצת ה-MPTP נאספו והונחו בשתי לוחות של 6 בארות (אחת היא קבוצת WT, והשנייה היא קבוצת ה-MPTP, זחל אחד לכל באר) (איור 1C).
    הערה: ודא שהמיקום ההתחלתי של הזחלים נמצא במרכז הבארות.
  3. לפני הערכת התיגמוטקסיס, יש למקם את לוחות הבאר במיקום המתאים של זבראבוקס 15 דקות מראש כדי להתאים את עצמו.
  4. איסוף וניתוח נתונים: באמצעות פונקציית אזור המשיכה , צייר שני מעגלים קונצנטריים באזור התצפית של כל באר (רדיוס המעגל המרכזי מהווה 1/2 מרדיוס החור) (איור 1C), והפרמטרים הנותרים מוגדרים להיות זהים להערכת תנועה. תתחיל את הפרוטוקול להערכת תיגמוטקסיס של 5 דקות, ותבצע ניסוי מקביל.
    הערה: לאחר סיום התוכנית, תוכנת Zebralab תיצור את מסלול זחלי דגי הזברה בתוך 5 דקות ופרמטרי תנועה שונים קשורים. בקובץ הנתונים, an1 מייצג את כל שטח כל באר, ו-an2 מייצג את האזור הפנימי של כל באר. לכן, סך כל dis(an1) וסך dur(an1) מסמנים את סך מרחק השחייה ואת סך הזמן שהושקע בבאר כולה, בעוד ש-total dis(an2) ו-total dur(an2) מייצגים את המרחק והזמן שהושקעו באזור הפנימי, בהתאמה.
    1. חשב את התיגמוטקסיס באמצעות הנוסחאות הבאות:
      חשב את אחוז מרחק השחייה באזור החיצוני:
      figure-protocol-1
      חשב את אחוז הזמן שנמצא באזור החיצוני:
      figure-protocol-2
    2. השתמשו במבחן t של סטודנט כדי להשוות את ההבדלים בתיגמוטקסיס בין קבוצת WT לקבוצה שטופלה ב-MPTP. בסך הכל נעשה שימוש ב-24 זחלי דגי זברה (n = 24) לכל קבוצה.

6. הערכת תנועה

  1. ב-5 dpf, נבחרו זחלי דגי זברה מקבוצת WT וקבוצת MPTP, ומועברים בהתאמה לשני לוחות עם 12 בארות (אחד הוא קבוצת WT, והשני הוא קבוצת ה-MPTP, זחל אחד לכל באר, עם 2 מ"ל E3 בינוני) (איור 1D).
    הערה: ודאו שגדלי זחלי דגי הזברה דומים, והזחלים שנבחרו צריכים להיות בעלי סנפירים פתוחים, יציבה זקופה, התרחבות טובה של שלפוחית השחייה ותנועה סדירה.
  2. לפני הערכת המנוע, הניחו את פלטת הבאר במצב הבדיקה של הזברוקס 15 דקות מראש כדי להסתגל.
    הערה: ודא שתנאי התאורה במהלך ההתאמה תואמים לתנאי התאורה במהלך הבדיקה.
  3. לאחר תקופת הסתגלות של 15 דקות, בחרו במצב המעקב - ניתוח מקוון, רשמו את פעילות התנועה של כל זחל במשך 5 דקות באמצעות מערכת מעקב וידאו אוטומטית ממוחשבת. שימוש בתוכנת Zebralab לאיסוף מסלולי תנועה ומגוון פרמטרים קשורים כל 60 שניות, ייצוא קובץ הנתונים המלא ושימוש ב-MATLAB לניתוח המרחק הכולל והמהירות הממוצעת של כל זחל תוך 5 דקות.
    1. השתמשו במבחן t של סטודנט וב-ANOVA דו-כיווני כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת ה-WT לבין קבוצת ה-MPTP. בסך הכל נעשה שימוש ב-24 זחלי דגי זברה (n = 24) לכל קבוצה.

7. מבחן תגובת בהלה

הערה: מבחן זה מודד את תגובת ההבהלה הוויזואלית (VSR), הידועה גם כבהלה שנגרמה מהבזק חושך, הנגרמת ממעברים פתאומיים לחושך. מבחן תגובת ההפתעה הזה בוחן הלם חזותי המופעל על ידי הבזקים אפלים פתאומיים בקנה מידה של מילישניות. בניגוד לפרדיגמת אור כהה-סטרוב (dark-strobe), הכוללת פולסים חוזרים של אור להערכת תגובות התנהגותיות מתמשכות, מבחן זה מתמקד בתגובות מוטוריות מהירות ורפלקסיביות לגירוי חזותי חריף.

  1. הכנות: ב-5 dpf, לבחור זחלי דגי זברה מקבוצת WT ומקבוצת ה-MPTP, ולהעביר אותם בהתאמה לשתי לוחות של 12 בארות (אחת היא קבוצת WT, והשנייה היא קבוצת ה-MPTP, זחל אחד לכל באר, עם 2 מ"ל E3 ביום) (איור 1D).
  2. לפני מבחן תגובת ההבהלה, הניחו את פלטת הבאר במצב הבדיקה של הזברה בוקס 5 דקות מראש כדי להסתגל.
  3. הגדר את פרמטרי הגירוי: פתח את תוכנת Zebralab , הרץ את מצב הניתוח Tracking-online , פתח את ממשק הפעלת האור , בחר השתמש באחת משלוש שיטות ההפעלה למטה, הפעל גירויים משופרים, הגדר ל- When Session מתחיל; בלוח הזמנים של המעבר, קצב ההבזק האפל מוגדר כך (התוכנית מתחילה להפעיל לאחר 21 שניות): מעבר 1: 5 מילישניות, עוצמת אור 100%; מעבר 2: 2890 מילישניות, עוצמת אור 100%; מעבר 3: 5 מילישניות, 0% עוצמת אור; מעבר 4: 100 מילישניות, 0% עוצמת אור; חזור על רשימת המעברים כדי להבטיח פלאשינג תקופתי.
  4. פרוטוקול התחל: ודא שפונקציית הקלטת הווידאו Numeriscope מופעלת, מעקב אוטומטי עם תפוקה גבוהה ייצור מערך נתונים רב-ממדי הכולל 30 נקודות קצה התנהגותיות במבחן זה של 90 שניות.
  5. ניתוח נתונים: לאחר סיום מבחן תגובת ההפתעה, ייצא את קבצי הנתונים הגולמיים וייבא אותם לתוכנת MATLAB לניתוח. חשב את מרחק השחייה של כל זחל במרווחי 3 שניות, יחד עם מהירות השחייה הממוצעת.
    1. זהה את מרחק התנועה השיא, מהירות השיא או השהיית התגובה לאחר גירוי ההבזק עבור כל קבוצה. השתמשו במבחן t של סטודנט וב-ANOVA דו-כיווני כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת ה-WT לבין קבוצת ה-MPTP. בסך הכל נעשה שימוש ב-24 זחלי דגי זברה (n = 24) לכל קבוצה.

8. מבחן אתגר אור-חושך

  1. ב-5 dpf, העבר את זחלי דג הזברה בנפרד לשני לוחות של 24 בארות (איור 1E), עם זחל אחד לכל באר ו-1 מ"ל E3 בינוני לבאר. כל לוחה הכילה 24 זחלים, ושתי הלוחות עם 24 בארות חולקו באופן שווה לקבוצת WT ולקבוצת ה-MPTP (n = 24 לכל קבוצה).
  2. לפני הבדיקה, יש להניח את לוח ה-24 בארות באזור הבדיקה המיועד בתוך זברבוקס לתקופת הסתגלות אור של 5 דקות כדי להתאים את סביבת הבדיקה. הפעל את מצב ניתוח המעקב המקוון. הגדר את תוכנית האור כך: 6 דקות של אור קבוע ואחריה 4 דקות של חושך מוחלט (איור 1E). זמן הבדיקה הכולל הוא 10 דקות, וזמן האינטרוול לאיסוף נקודות נתונים הוא 60 שניות.
    הערה: 6 דקות האור הגלובליות מיועדות להסתגלות והסתגלות, ומבטיחה יציבות של תנועת בסיס ותגובות מיוחדות של אור-חושך31,32.
  3. בדקה העשירית, עצור הקלטה התנהגותית ושמור נתונים. הסר בזהירות את הצלחת מתיבת הזברה.
  4. לכל זחל, יש להוציא את מרחק השחייה בכל מרווח של 60 שניות. חשב את המרחק שנעבר במהלך שלב האור (0 דקהעד 6 דקות), השלב האפל (7 עד 10 דקות), וסך התקופה של 10 דקות. כמת את התנהגות התיגמוטקסיס ואת ביצועי הלמידה של ההרגל בשלב האפל.
    הערה: למידת ההתרגלות מוגדרת כהפחתת תגובה התנהגותית כאשר בעל חיים נחשף לגירוי/סביבה רציף 33,34, והיא הוערכה על ידי השוואה סטטיסטית של המרחק הכולל הממוצע שהועבר (mm) במהלך הדקה הראשונהוהדקה הרביעית לאחר המעבר מהאור לחושך. השתמשו במבחן t של סטודנט וב-ANOVA דו-כיווני כדי להשוות את ההבדלים בין קבוצת ה-WT לבין קבוצת ה-MPTP. בסך הכל נעשה שימוש ב-24 זחלי דגי זברה (n = 24) לכל קבוצה.

9. סילוק פסולת MPTP

הערה: לאחר כל ניסוי התנהגותי, רססו ונגבו משטחים עם מגע MPTP (למשל, ספסלי מעבדה ו-ZebraBox) עם נתרן היפוכלוריט טרי (אקונומיקה; ≥10% v/v).

  1. אסוף את הפסולת הנוזלית (כולל תמיסות חשיפה שנותרו וחומרי שטיפה) ופסולת מוצקה (למשל, פיפטות פסטר, כפפות, צלחות פטרי וצלחות רב-בארות) של MPTP. תייג אותם בבירור כפסולת נוירוטוקסית מסוכנת.
  2. לטפל בפסולת נוזלית מזוהמת ובחומרים מוצקים עם נתרן היפוכלוריט טרי (אקונומיקה; ≥10% v/v) למשך לפחות 24 שעות כדי להבטיח דה-קונטמינציה, ולאחר מכן השלכה בהתאם לתקנות המוסדיות.
  3. המית את זחלי דגי הזברה שטופלו ב-MPTP על ידי הטבילה בתמיסת נתרן היפוכלוריט מדוללת (למשל, יחס 1:5 של 6% אקונומיקה למים) למשך 5 דקותו-35 דקות. מוות מאושר מחוסר תנועה ודופק. לטפל בזחלים ובמדיה המטוהים כפסולת ביולוגית מסוכנת להשמדה מוסדית (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניטור ויסות שינה וערות
ניטור ויסות השינה-ערות במשך 52 שעות החל ב-4dpf ובוצע באמצעות לוח 96 בארות. דגי זברה שטופלו ב-MPTP הראו הפרעות משמעותיות במבנה השינה בהשוואה לקבוצת WT. עקומות שינה מייצגות, גרפים של פעילות הערות ועקבות פעילות ממוצעות מוצגים באיור 2. פרמטרים של ניתוח ויסות שינה-ער בזחלי דגי זברה מוצגים באיור 3. זמן השינה הכולל עלה באופן משמעותי בקבוצת MPTP ביחס ל-WTs (p < 0.01, מבחן ה-t של הסטודנט). מספר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה פיתח ואימת פרוטוקול מקיף להערכת וניתוח פנוטיפ התנהגותי דמוי פרקינסון המושרה על ידי MPTP. פרוטוקול זה שילב 6 מבחנים שונים: הערכת מוטורי, בדיקת תיגמוטקסיס, בדיקת תגובת בהלה, פרדיגמות תגובה פוטו-מוטוריות (כולל גירוי אור מהבהב), בדיקת אתגר אור-חושך, וניטור ויסות שינה-ערות, כדי להעריך ולהציג את הפגמים המוטוריים והלא-מוטוריים של PD. התוצאות הצביעו על כך שבהשוואה לקבוצת ה-WT, זחלי דגי זברה שטופלו ב-MPTP הראו שינויים התנהגותיים מוטוריים ולא מוטוריים, כולל ירידה בתנועה, פגיעה בתגובה סנסור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 21906095), חסות תוכנית העתיד של אוניברסיטת שאנדונג, קרן המדע הטבעי של שאנדונג (מס' ZR2019BB018), קרנות המחקר הבסיסיות של אוניברסיטת שאנדונג (מס' 2017GN0030), קרן הפוסט-דוקטורט למדעי סין (מס' 2018M640640). הוא גם נתמך על ידי קרן המחקר הפתוחה לשנת 2025 מהמכון הדיגיטלי של פוג'יאן לנתונים גדולים לשיקום וסיעוד קשישים (מענק מס' BDRI202502) וקרן המחקר הפתוחה לשנת 2025 מהמעבדה המרכזית לחומרים ביואקטיביים, משרד החינוך, אוניברסיטת ננקאי (מענק מס' SWHX-202503). פרויקט מחקר של מעבדת הביו-רפואה מיקרואקולוגית של שאנדונג בג'ינאן (מענק מס' JNL-2023002KF). המחברים רוצים להודות למרכז בעלי החיים במעבדה, בית החולים צ'ילו של אוניברסיטת שאנדונג, ולד"ר סון צ'נגשי מהמחלקה למעבדה קלינית, בית החולים קילו באוניברסיטת שאנדונג, על עזרתם במהלך הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 פעמים; פתרון המלאי E3ביוטכנולוגיה פיישי בשנגחאילא זמיןמכיל 34.8 גרם NaCl, 1.6 גרם KCl, 5.8 גרם CaCl2· 2H2O, ו-9.78 גרם MgCl2· 6H2O לליטר
לוח תרבית תאים 12 בארותביוטכנולוגיה NEST712011לא מטופל, לא פירוגני, סטרילי, פוליסטירן. משמש לבדיקות התנהגות של זחלי דגי זברה
לוח תרבית תאים עם 24 באריםביוטכנולוגיה NEST702011לא מטופל, לא פירוגני, סטרילי, פוליסטירן. משמש לבדיקות התנהגות של זחלי דגי זברה
3 מ"ל פסטר פיפטביולוגיקס30-0238A1
פלטת תרבית תא 6 בארותביוטכנולוגיה NEST703011לא מטופל, לא פירוגני, סטרילי, פוליסטירן. משמש לבדיקות התנהגות של זחלי דגי זברה
לוח תרבית תאים 96 בארביוטכנולוגיה NEST701011לא מטופל, לא פירוגני, סטרילי, פוליסטירן. משמש לבדיקות התנהגות של זחלי דגי זברה
MATLAB R2020aMathWorks, ארה"ב  לא זמיןMATLAB R2020a, רישיון כלל-קמפוס שהושג מפורטל התוכנה של אוניברסיטת שאנדונג (softms.sdu.edu.cn). משמש לניתוח סטטיסטי של נתוני התנהגות זחלי דגי הזברה.
מיקרוסופט אקסלמיקרוסופטלא זמיןMicrosoft Excel (חלק מ-Microsoft Office), גרסה שהותקנה דרך פורטל תוכנה מורשה של אוניברסיטת שאנדונג (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-מתיל-4-פניל-1,2,3,6-טטרהידרופירידין) ביוטיים411252815 מ"ג
פטרי דישביוטכנולוגיה NEST704202100 מ"מ, סטרילי, ידית לאחיזה קלה, מטופלת ב-TC
תמיסת נתרן היפוכלוריטמקליןS817439תמיסת אקונומיקה ביתית (6-14% על בסיס כלור פעיל), מדוללת ל-&GE; 10% V/V לניקוי שטח וזיהום פסולת; כמו כן, מדולל 1:5 (6% אקונומיקה: מים) להמתת חסד של זחלי דגי זברה שטופלו ב-MPTP.
מיקרוסקופ סטריאואולימפוססדרת SZX2
מערכת מעקב וידאו ברזולוציה גבוהה של Zebrabox ויופוינט, צרפת לא זמין
Zebralab Software ויופוינט, צרפת לא זמיןגרסה (3,52,3,87)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elbaz, A., Carcaillon, L., Kab, S., Moisan, F. Epidemiology of Parkinson's disease. Rev. Neurol. (Paris). 172 (1), 14-26 (2016).
  2. Elgueta, D., et al. Analyzing the Parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human alpha-synuclein. J Vis Exp. (185), e63313(2022).
  3. Peng, S. Y., Liu, P., Wang, X. W., Li, K. Y. Global, regional and national burden of Parkinson's disease in people over 55 years of age: a systematic analysis of the global burden of disease study, 1991-2021. BMC Neurol. 25, 178(2025).
  4. Zhu, J. Q., et al. Temporal trends in the prevalence of Parkinson's disease from 1980 to 2023: a systematic review and meta-analysis. Lancet Healthy Longev. 5 (7), 464-479 (2024).
  5. Goldman, J. G. Non-motor symptoms and treatments in Parkinson's disease. Neurol Clin. 43 (2), 291-317 (2025).
  6. Kobylecki, C. Update on the diagnosis and management of Parkinson's disease. Clin Med. (Lond). 20 (4), 393-398 (2020).
  7. Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7, 116(2021).
  8. Tolosa, E., Garrido, A., Scholz, S. W., Poewe, W. Challenges in the diagnosis of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 20 (5), 385-397 (2021).
  9. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. J. Parkinsons Dis. 3 (3), 255-269 (2013).
  10. Kalia, L. V., et al. Disease-modifying therapies for Parkinson's disease: Lessons from multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 20 (12), 724-737 (2024).
  11. Thirugnanam, T., Santhakumar, K. Chemically induced models of Parkinson's disease. Comp. Biochem. Physiol C Toxicol Pharmacol. 252, 109213(2022).
  12. Crabtree, D. M., Zhang, J. H. Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res. Bull. 88 (1), 13-32 (2012).
  13. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 16 (3), 269-274 (2015).
  14. Dovonou, A., et al. Animal models of Parkinson's disease: bridging the gap between disease hallmarks and research questions. Transl. Neurodegener. 12, 36(2023).
  15. Potts, L. F., et al. Modeling Parkinson's disease in monkeys for translational studies: A critical analysis. Exp. Neurol. 256, 133-143 (2014).
  16. Doyle, J. M., Croll, R. P. A critical review of zebrafish models of Parkinson's disease. Front. Pharmacol. 13, 835827(2022).
  17. Bagwell, E., Larsen, J. A. A review of MPTP-induced Parkinsonism in adult zebrafish to explore pharmacological interventions for human Parkinson's disease. Front. Neurosci. 18, 1451845(2024).
  18. Feng, X. -Z., et al. Behavioral assessments of spontaneous locomotion in a murine MPTP-induced Parkinson's disease model. J Vis Exp. 143, e58653(2019).
  19. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Y. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front. Neurosci. 18, 1432102(2024).
  20. Brinez-Gallego, P., et al. Experimental models of chemically induced Parkinson's disease in zebrafish at the embryonic larval stage: A systematic review. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 26 (4), 201-237 (2023).
  21. Xu, Z. H., et al. Deep clinical phenotyping of Parkinson's disease: Towards a new era of research and clinical care. Phenomics. 2 (5), 349-361 (2022).
  22. Tinaz, S. Functional connectome in Parkinson's disease and Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 21, 24(2021).
  23. Costa, H. N., et al. Parkinson's disease: A multisystem disorder. Neurosci Bull. 39 (1), 113-124 (2023).
  24. Christensen, C., Thorsteinsson, H., Maier, V. H., Karlsson, K. Æ Multi-parameter behavioral phenotyping of the MPP⁺ model of Parkinson's disease in zebrafish. Front Behav Neurosci. 14, 623924(2020).
  25. Zhang, S., et al. Anti-Parkinson's disease activity of phenolic acids from Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts and their autophagy activation mechanism. Food Funct. 11 (2), 1425-1440 (2020).
  26. Maleski, A. L. A., et al. Integrated behavioral and proteomic characterization of MPP⁺-induced early neurodegeneration and Parkinsonism in zebrafish larvae. Int J Mol Sci. 26 (14), 6762(2025).
  27. Vauti, F., et al. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PLoS One. 15 (8), e0237167(2020).
  28. Parichy, D. M., et al. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Lee, D. A., Oikonomou, G., Prober, D. A. Large-scale analysis of sleep in zebrafish. Bio Protoc. 12 (3), e4313(2022).
  30. Shen, Q., et al. Rapid well-plate assays for motor and social behaviors in larval zebrafish. Behav Brain Res. 391, 112625(2020).
  31. Rock, S., et al. Detailed analysis of zebrafish larval behaviour in the light-dark challenge assay shows that diel hatching time determines individual variation. Front Physiol. 13, 827282(2022).
  32. Hillman, C., Kearn, J., Parker, M. O. A unified approach to investigating 4 dpf zebrafish larval behaviour through a standardised light/dark assay. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 134, 111084(2024).
  33. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacol. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  34. Gomez-Laplaza, L. M., Gerlai, R. Latent learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 208 (2), 509-515 (2010).
  35. Winn, A. A., Prestia, K. A., Peneyra, S. M. Testing alternative surface disinfection agents for zebrafish (Danio rerio) embryos. J Am Assoc Lab Anim Sci. 60 (5), 510-518 (2021).
  36. Wagle, M., Nguyen, J., Lee, S., Zaitlen, N., Guo, S. Heritable natural variation of an anxiety-like behavior in larval zebrafish. J Neurogenet. 31 (3), 138-148 (2017).
  37. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: a critical review. Behav Brain Res. 214 (2), 157-171 (2010).
  38. Schnorr, S. J., Steenbergen, P. J., Richardson, M. K., Champagne, D. L. Measuring thigmotaxis in larval zebrafish. Behav Brain Res. 228 (2), 367-374 (2012).
  39. Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish. EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).
  40. Lee, H. B., et al. Key HPI axis receptors facilitate light adaptive behavior in larval zebrafish. Sci Rep. 14 (1), 7759(2024).
  41. Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients. Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).
  42. Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldua, D. Neurotoxicity assessment in adult Danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank. J Vis Exp. 201, e65869(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MPTP

מאמרים קשורים