מאמר שיטה

הקלטות פוטומטריה רב-סיבים דו-צבעוניות של רשת ההתנהגות החברתית בעכברים

DOI:

10.3791/70049

⸱

17 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטומטריית סיבים היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר לתיעוד פעילות סידן באוכלוסיות עצביות במוח העמוק. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להדמיה דו-צבעונית רב-אתרית מותאמת אישית של פעילות סידן ואותות פלואורסצנטיים דינמיים אחרים מאוכלוסיות עצביות במוח העמוק בעכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטומטריה סיבית, הקלטה נרחבת של אותות דרך כבל סיב אופטי, היא שיטה שימושית לרישום פעילות סידן מקבוצות נוירונים במכרסם הנע בחופשיות. במיוחד, שיטה זו הופכת את המיקוד באוכלוסיות קטנות של נוירונים גנטיים באזורים גחניים ופחות נגישים במוח לבעיה ניתנת לפתרון, שכן עדיין קשה לתעד ברזולוציה תאית. טכניקה זו יכולה להיות מורחבת להקלטה ממספר אתרים בו-זמנית באמצעות גישה מרובת סיבים משולבת, ויכולה למקד סוגי תאים מרובים באמצעות אסטרטגיות גנטיות בכל אתר מתועד. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבניית והכנסת מערכי רב-סיבים מותאמים אישית למיקוד ברשת ההתנהגות החברתית של העכבר (עד 12 אתרים). פרוטוקול זה מפרט את ההליכים הכירורגיים הנדרשים למיקוד מוצלח של אתרים מרובים באמצעות מערכי רב-סיבים מותאמים אישית שלנו והגישה הוויראלית להעברת אינדיקטורים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים של פעילות סידן להדמיה סימולטנית של שתי אוכלוסיות עצביות מזוהות גנטית בכל אתר. אנו מראים כיצד להקליט מאזורים אלו באמצעות מערכת מצלמת CMOS (CMOS) הזמינה מסחרית במהלך התנהגות חברתית. בנוסף, פרוטוקול זה מדגים שיטות לבקרת איכות ומפרט צינור עיבוד מקדים לתיקון רעש ותקנון. לבסוף, נדון ביישומים פוטנציאליים של הכלי כדי לחשוף ממצאים חדשים על רשתות מוח בקנה מידה גדול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטומטריית סיבים, ההקלטה המונית של אותות פלואורסצנטיים באמצעות כבלי סיבים אופטיים, הפכה לטכניקה עוצמתית למדידת פעילות אוכלוסיות עצבית באזורים עמוקי המוח. לעיתים קרובות, אזורים אלו אינם נגישים בקלות באמצעות מיקרואנדוסקופיה או גישות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות 1,2,3. מטרה מרכזית במדעי המוח המערכתיים העכשוויים היא לזהות ולפענח את החישובים המשמשים רשתות מוח בקנה מידה גדול, ספציפי לסוגי תאים, המעורבות ביצירת התנהגות. גשושי נוירופיקסל וטבעות רב-סיבים מסחריות מצטיינים בהקלטה מאוכלוסיות עצביות מיושרות ליניארית 4,5,6,7, בעוד שהדמיה קורטיקלית רחבת שדה מספקת כיסוי מצוין של דינמיקת הקורטקס השטחית 8,9. עם זאת, הקלטה בו-זמנית מאוכלוסיות עצביות תת-קורטיקליות מפוזרות במרחב אך מחוברות פונקציונלית נותרה מאתגרת טכנית 5,10,11,12. יתרה מזאת, בעוד שניתן למקד מבנים רבים במוח העמוק באמצעות מספר פרולים חד-סיביים לפוטומטריה, גישה זו מוגבלת לאוכלוסיות עצביות המרוחקות מספיק זו מזו כדי להשתיל מספר פרולים12. מערכי פוטומטריה מולטי-סיבים מותאמים אישית מתמודדים עם פער זה על ידי אפשרות הקלטות סימולטניות מאזורים תת-קורטיקליים רבים בבעלי חיים חופשיים עם מגבלות מינימליות, ומספקים חלון ייחודי לתיאום ברמת הרשת במהלך התנהגויות מורכבות.

רשת ההתנהגות החברתית (SBN) מייצגת מערכת אידיאלית לחקירת דינמיקות רשתות מוח בקנה מידה גדול. ה-SBN הוא מערך מבנים תת-קורטיקליים, מחובר ומשומר אבולוציונית, המעורבים ביצירת התנהגות חברתית, אשר זוהה בכל מחלקות החולייתנים 13,14,15. מבנים אלו כוללים, אך לא מוגבלים ל, המחיצה הצדדית, האזור הפרה-אופטי, גרעין המיטה של הסטריה טרמינליס, גרעיני ההיפותלמוס הקדמיים והוונטרומדיאליים, האמיגדלה המדיאלית, הגרעין אקומבנס, והאפור הפריאקוודוקטלי 13,14,15. בתוך SBN, אוכלוסיות עצביות ספציפיות המוגדרות על ידי סמנים מולקולריים ממלאות תפקידים קריטיים בוויסות התנהגות חברתית. נוירונים SBN ɣ-אמינובוטיריק חומצה-ארגיים (GABAergic) (המסומנים על ידי ביטוי של מוביל GABA הוזיקולרי, או VGAT) ונוירונים גלוטמטרגיים (המסומנים על ידי ביטוי של מוביל הגלוטמט הוזיקולרי, או VGlut) מייצגים את סוגי התאים המעוררים והמעכבים העיקריים ברשת וסביר שהם ממלאים תפקידים דיסוציאליים בוויסות הפעולה החברתית 16,17,18,19 . מעבר למערכות הנוירוטרנסמיטרים הקלאסיות הללו, איתות הורמוני המין ממלא תפקיד קריטי בתפקוד הרשת. לדוגמה, התנהגויות חברתיות רבות של גברים ונשים דורשות ביטוי של קולטני אסטרוגן אלפא, ופעילות בנוירוני SBN המבטאים קולטנים אלה מניעה באופן סיבתי את ההתנהגויותהללו 16,20,21,22,23,24,25,26 . בנוסף, אוכלוסיות עצביות SBN מועשרות בליגנדים וקולטנים של מערכות נוירומודולטוריות רבות, כולל דופמין, ארגינין וזופרסין, אוקסיטוצין, אופיאטים, טאכיקינין, נוירופפטיד Y, פרולקטין, אורקסין, פפטיד הקשור לאגוטי, מלנוקורטינים, קיספפטין והורמון משחרר גונדוטרופין 17,18,19,27,28,29,30,31, והתקדמות אחרונה בחיישנים מקודדים גנטית מאפשרת כיום מעקב אחר רבות מהמולקולות המגוונות הללו 32,33,34,35,36,37,38. מכיוון שאוכלוסיות העצבים של SBN מפוזרות במרחב במבנים תת-קורטיקליים, הכנות ניסיוניות מסורתיות (למשל, אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית, דימות פני שטח קורטיקלי, וגישות מוקדמות יותר לפוטומטריה רב-סיבית) אינן מצליחות ללכוד את דינמיקת הפעילות הרגעית ברשת המוח הרחבה הזו. עם זאת, על ידי ניטור דינמיקת סידן באוכלוסיות עצביות מוגדרות גנטית לצד דפוסי שחרור נוירומודולטורים, פלטפורמות פוטומטריה רב-אתרים מותאמות אישית יכולות לחשוף אילו סוגי תאים ומולקולות איתות ספציפיים מקודדים תכונות מסוימות של התנהגות חברתית, ולספק תובנות מכניות חדשניות.

כאן פיתחנו פלטפורמה מותאמת אישית לפוטומטריית סיבים דו-צבעונית, שמאפשרת הקלטה סימולטנית מ-12 אזורי מוח בעכברים הפועלים בחופשיות. באמצעות גישה זו, ביצענו הקלטות פוטומטריה דו-צבעוניות של פעילות סידן מ-22 אוכלוסיות עצביות מזוהות, המפוזרות על פני 11 אזורי מוח SBN, לצד מדידות של תנודות דופמין בגרעין האקומבנס באמצעות חיישן DA מבוסס הפעלה GPCR (GRAB-DA1m)33 (טבלה 1). פרוטוקול זה (איור 1) מפרט את בניית מערכי מולטיפייבר מותאמים אישית, הליכים כירורגיים למיקוד באתרים מרובים במוח העמוק, אסטרטגיות העברת וירוס לביטוי אינדיקטורים כפולים של סידן (GCaMP39 ו-RCaMP40), איסוף נתונים באמצעות מערכת פוטומטריה סיבים מבוססת מצלמת CMOS מסחרית, שיטות בקרת איכות, וצינור עיבוד מוקדם לתיקון רעש וסטנדרטיזציה של אותות. חשוב לציין, צינור הקדם-עיבוד שלנו כולל הקלטות בקרה איזוסבסטיות באורכי גל שמאפשרות לנו לבצע תיקון ארטיפקטים בתנועה. אנו נוקטים בגישה מבוססת רגרסיה41 לתיקון ארטיפקטים בתנועה, תוך הבטחת נאמנות האות במהלך התנהגויות חברתיות נמרצות כמו רכיבה או קרבות. מכיוון ששיטת הפוטומטריה הרב-סיבית המותאמת שלנו יכולה בו-זמנית לנטר פעילות המפוזרת הן במבנים פרוקסימליים והן במבני מוח עמוק רחוקים, תוך שמירה על ספציפיות סוג התא של ההקלטות באמצעות מיקוד גנטי42,43, היא מציעה יתרונות משמעותיים על פני גישות חלופיות לתיעוד דינמיקת פעילות עצבית ברשתות מוח עמוקות בקנה מידה גדול.

פרוטוקול זה מתאים באופן מיטבי לניסויים הדורשים הקלטות סימולטניות מאזורים תת-קורטיקליים מפוזרים במרחב (≥4 אתרים) בבעלי חיים חופשיים, במיוחד כאשר חוקרים דינמיקה ברמת רשת בין סוגי תאים מוגדרים גנטית או מעקב אחר שחרור נוירומודולטורים לצד פעילות עצבית. הגישה חשובה במיוחד ללימוד התנהגויות טבעיות הכוללות תנועה נמרצת (למשל, אינטראקציות חברתיות), שבהן צינור תיקון פריטי התנועה שלנו מבטיח נאמנות אות. עם זאת, חוקרים המחפשים רזולוציה של תא יחיד, הבחנה בין אותות סומטיים לאקסונליים, או הקלטות מאזורים קורטיקליים שטחיים עשויים למצוא גישות חלופיות (למשל, מיקרוסקופיה מיניאטורית, נוירופיקסלים או הדמיה רחבת שדה) מתאימות יותר. שיקולים מעשיים מרכזיים כוללים מורכבות ניתוחית, הצורך בייצור מערך רב-סיבים מותאם אישית, והקמת תשתית חומרים נדרשת (יכולות הדפסה תלת-ממדית, כלי סיבים אופטיים).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה נבדק ואומת באמצעות עכברים בוגרים בגילאי 8–25 שבועות. העכברים אוחסנו בטמפרטורה של 21–26 מעלות צלזיוס ולחות של 30%-70% במחזור אור כהה-אור הפוך של 12 שעות (כיבוי: 10:00 בבוקר; ON: 22:00). הניסויים התקיימו אך ורק במהלך השלב הפעיל הסובייקטיבי (האפל). אוכל ומים סופקו בחופשיות. כל ההליכים לבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פרינסטון והיו בהתאם לסטנדרטים של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. מערך רב-סיבים וייצור חוטי פאץ' (איור 1A)

  1. ייצור חבל טלאים (איור 2A).
    1. קבל כבל תיבה עם 12 סיבים והדפס את מחבר הטאצ'קורד ואביזרי קידוח סטריאוטקטיים (קובץ משלים 1, תיק משלים 2, תיק משלים 3) באמצעות שרף (חוזק מתיחה: 8.7 קילופאונד/אינץ' רבוע [ksi], מודול אלקטרוני: 377 קילו-סיב, סטיית חום: 138 °F, הארכה: 8%).
    2. בנה את דיסק הליטוש שסופק (קובץ משלים 4) מתוך מוט נירוסטה בקוטר 2 אינץ' וכלול חיתוך בגודל של מערך הרב-סיבים במרכז הפאק.
    3. נקה ידנית את השרף העודף מהחורים של פין הדיבל במערך המולטיפייבר עם מקדח בגודל 1.22 מ"מ x 11 מ"מ. אפילו בהדפסה תלת-ממדית מדויקת, חורי סיכות הדיבל מעט קטנים מדי בשביל שהדיבל יוכל לעבור דרכם.
    4. קדחו חורים לסיבים.
      1. הכנס פיני דיבל מפלדת סגסוגת (1.19 מ"מ x 12.7 מ"מ) לכל ארבעת חורי הפינים באביזר הקידוח הסטריאוטקטי והנח את מחבר הטאצ'קורד מלמטה כלפי מעלה בתוך אביזר הקידוח הסטריאוטקטי כאשר פיני הדיבל עוברים דרך חורי פין המקל של מערך המולטיפייבר.
      2. הדק את הברגים בגודל M4 בחורי הברגים המוברגים כדי לקבע את מחבר ה-patchcord במקומו ולחבר את אביזר הקידוח הסטריאוטקטי למסגרת הסטריאוטקטיקה.
      3. הכנס מקדח בגודל 0.25 מ"מ x 5.5 מ"מ למקדחה הסטריאוטקטית וחבר את המקדחה למסגרת הסטריאוטקטית. באמצעות מקדח זה, יישר את הסיבוב, הזווית והגלגול של מערך הרב-סיבים עם סבילות סטייה מקסימלית של ±0.03 מ"מ.
        הערה: יישר סחבוב וזווית במיקומים הקדמיים והאחוריים ביותר של ההדפסה התלת-ממדית, גלגול ישר בארבע פינות מערך המולטיפייבר.
      4. מקדח במרכז מעל אחד מחורי הסיבים המודפסים בתלת-ממד והגדר את קואורדינטות המסגרת הסטריאוטקטית X/Y לקואורדינטות ML (X) ו-AP (Y) של אזור המוח המשויך (טבלה 1). העבר את המקדח לקואורדינטות החדשות (0, 0) במסגרת הסטריוטקטית כדי למרכז את המקדחה מעל חור פין הדאבל הקדמי.
      5. השתמשו במקדח 0.25 מ"מ x 5.5 מ"מ כדי לקדוח כל חור סיב לעומק של 5.5 מ"מ בקואורדינטות הסטריאוטקטיות המוגדרות (טבלה 1).
        הערה: השתמש בחתיכה ארוכה של סיב עודף כדי לוודא שכל החורים נקיים לחלוטין לפני הסרת מערך המולטיפייבר מהמסגרת הסטריאוטקטית. זה יגביל את מספר הפעמים שהמערך המולטיפייבר יצטרך ליישר ולקדח כדי לפנות את החורים.
    5. חבר את מחבר ה-patchcord וכבל הפיצול המתפצל
      1. חשפו >10 ס"מ מסיבי הטאצ'קורד. גזמו סיבים עם כתב סיבים כדי להבטיח שאורכם שווה. לאחר מכן, הנח חתיכה אחת של צינורות התכווצות חום בקוטר 3/16" ו-5/16" סביב 12 הסיבים בחוט הטאצ'.
        הערה: הצינור יגן על הסיבים החשופים לאחר שהם מודבקים למחבר.
      2. הכנס כל סיב לאחד החורים במחבר הטאצ'קורד כך שכ-0.3 מ"מ של סיב ייחשף בתחתית השטח. לאחר הכנסת כל הסיבים, השתמשו בקצה מחט 21–27 גרם כדי להדביק דבק על המשטח העליון של מחבר הטאצ'קורד כדי לקבע את הסיבים במקומם.
      3. מרחו אפוקסי על פני השטח העליון של מחבר הטאצ'קורד בצורת פירמידה בגובה 0.5–1 ס"מ. ודא שאין אפוקסי מכסה כל אזור מלבד המשטח העליון שבו הוכנסו הסיבים. תן לאפוקסי להתייבש בטמפרטורת החדר במהלך הלילה.
      4. השתמש באקדח חום בהגדרה הנמוכה ביותר כדי להקטין את צינור ההתכווצות מעל האפוקסי והסיבים החשופים מעליו (<3–5 ס"מ).
        הערה: הימנעו מלגעת בצינור ההתכווצות בזמן זה כדי למנוע כוויות.
      5. חתכו חתיכת צינור פלסטיק רך בקוטר פנימי של 3 מ"מ לאורך הסיבים החשופים שנותרו, חתכו חריץ לאורך קצה הצינור, וסגרו את הסיבים החשופים שנותרו בתוך הצינור.
      6. צבעו את הצינור השקוף בטוש שחור אטום כדי להבטיח שהסיבים כבר לא יהיו גלויים, וכך למזער את האור מהסיבים החשופים במהלך ניסויי הדמיה.
    6. ללטש את חבל הטאצ'.
      1. אבטח את מחבר ה-patchcord מתחת לפני השטח למטה בדיסק הפוליש המותאם אישית. לטש את מחבר ה-patchcord על דפי ליטוש גרגיר של 6 מיקרון, 3 מיקרון, 1 מיקרון, ואז 0.01 מיקרון עם 10–20 תנועות בצורת סמל/גיליון אינסוף. עבור לוחות הגריט של 1 מיקרון ו-0.01 מיקרון, יש להניח 5 טיפות מים מזוקקים לפני הליטוש.
      2. נגב את פני השטח של המחבר כדי להיפטר מעודפי מים מזוקקים. בדוק אם יש פגמים או סדקים סיבים בצד המלוטש של מחבר ה-patchcord באמצעות מיקרוסקופ Brightfield, ואם קיימים, חזור על הליטוש.
    7. בדוק את יציאת כבל התיק.
      1. חבר את קצה המחבר של ה-Patchcord בגרסה התת-מיניאטורית A (SMA) למערכת הדמיית פוטומטריה סיבית מבוססת מצלמת CMOS. באמצעות תוכנת קידוד ויזואלית, עקוב אחרי המדריך של מערכת הדימות הפוטומטרית ומקד את מצלמת CMOS בקצה ה-SMA של כבל התיקון.
        הערה: המדריך מתעדכן באופן קבוע כדי להתאים לעדכוני תוכנה. מכיוון שהקוד הוויזואלי של מערכת הפוטומטריה משתנה לעיתים קרובות עם גרסאות תוכנה חדשות, מדריך זה מכיל את המידע העדכני ביותר עבור גרסאות תוכנה עדכניות.
      2. מדוד יציאת כבל תיקון 470 ננומטר בעוצמה של 20% עם מד עוצמה אופטי. חזור על שלב 1.1.7 אם יציאת כבל הפאץ' היא < 2.5 mW.
  2. ייצור מערך רב-סיבים.
    1. הדפיסו את מערך הרב-סיבים שסופק (קובץ משלים 5, קובץ משלים 6) באמצעות שרף עם המפרטים הטכניים המתוארים בשלב 1.1.1.
    2. הכינו מערך רב-סיבים.
      1. הכנס אגוזי משושה מבראס M0.6 לכל אחד מארבעת החריצים בפינות הצדדיות של מערך הרב-סיבים ויישר את חור האום המשושה למרכז הפתח.
      2. מרחו טיפה אחת של דבק סופר מצד כל חריץ אגוז משושה עם קצה מחט במשקל 21–27 גרם, והוסיפו טיפות נוספות לחיזוק במידת הצורך. תן לדבק להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפני שעוברים לשלב הבא.
      3. גלח כל דבק בצידי מערך המולטיפייבר באמצעות להב גילוח כדי לוודא שהוא נכנס לדיסק הליטוש.
      4. אם דבק יתר התייבש על פני השטח של מערך הרב-סיבים, יש ללטש את פני מערך ה-multifiber באמצעות דיסק ליטוש מותאם אישית ודיליונות ליטוש גריט 30 מיקרון עד שהדבק מוסר ומשטח מערך המולטיפייבר יהיה שטוח.
      5. נקה ידנית את עודפי השרף מהחורים של פין הדאבל במערך הרב-סיבים עם מקדח 1.22 מ"מ.
    3. קדחו חורים לסיבים (איור 2B-C).
      1. הכנס פיני דיבל מפלדת סגסוגת (1.19 מ"מ x 12.7 מ"מ) לכל ארבעת חורי הפינים באביזר הקידוח הסטריאוטקטי ומניחים את צד השטח של מערך המולטיפייבר (צד שטוח) כלפי מעלה אל אביזר הקידוח הסטריאוטקטי, כאשר פיני הדיבל עוברים דרך חורי פין המקל של מערך המולטיפייבר.
      2. חזור על שלב 1.4.2– שלב 1.4.5.
    4. הכינו סיבים למערך הרב-סיבים.
      1. הסר את מעטפת הפלסטיק מקטע של 200 מיקרון, 0.39 NA סיב אופטי באמצעות מפרק סיבים. נקה את הסיבים עם אתנול.
      2. חתוך את הסיבים לקטעים באורך ~3–5 ס"מ באמצעות חותם סיבים. חתוך עוד את החלקים הללו לשניים באמצעות כתב סיבים. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לוודא שלפחות קצה אחד של החלקים החתוכים נקי מסדקים או פגמים. השתמש רק בסיבים עם לפחות קצה אחד נקי.
      3. הדביקו סרגל מדויק באורך של לפחות 15 מ"מ תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. הניחו את הצד הנקי של הסיב במיקום 0 מ"מ על הסרגל (איור 2D). חתכו סיבים לאורך הרצוי לכל אזור יעד (טבלה 1).
        הערה: אורך הסיב מחושב על ידי הוספת 6 מ"מ לקואורדינטת D/V הסטריוטקטית עבור הסיב העמוק ביותר, ואז התאמת הערך לכל הסיבים כך שיתאים להבדל בין קואורדינטת D/V שלהם לבין קואורדינטת D/V של הסיב העמוק ביותר.
    5. הכנס סיבים למערך הרב-סיבים.
      1. הנח את מערך הרב-סיבים בתוך מחזיק הייצור כלפי מטה. יישר וקבע את החלק באמצעות פינים של דיבל.
      2. התאימו את אורך הסיבים לאתר (טבלה 1) והכניסו סיבים מנותקים לחורים המתאימים במערך הרב-סיבים כאשר הצד הנקי פונה כלפי מעלה. ודא שכל הסיבים נדחפים פנימה עד הסוף לפני השלב הבא.
      3. מרחו דבק סופר עם קצה מחט של 21–27 גרם כדי להדביק את כל הסיבים למקום. תן לדבק לפעול לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני שממשיכים.
    6. לטש את מערך הרב-סיבים על ידי חזרה על שלב 1.1.6 עם מערך רב-סיבים על פני השטח כלפי מטה (איור 2E).
    7. בדוק יעילות מערך רב-סיבים.
      1. נקה את המשטח המלוטש של מערך הרב-סיבים עם אתנול ואז מרח עליו ג'ל תואם אינדקס. הכנס 4 פינים של דיבל למחבר ה-patchcord וקבע אליו את מערך הרב-סיבים באמצעות ברגי מנוע G5 ומברג נלווה (איור 2F).
      2. השתמש במד כוח כדי למדוד פליטת LED של 470 ננומטר ו-560 ננומטר מהמערך המולטיפייבר. חישוב יעילות באמצעות הערכים הבאים:
        figure-protocol-1
      3. אם היעילות היא <75%, חזור על צעדים 1.2.7.1–1.2.7.2.
        הערה: אם ליטוש מחדש לא משפר את היעילות ואין פגמים בסיבים, ייתכן שהסיבים במערך הרב-סיבים אינם מיושרים למחבר הטאצ'קורד.
    8. הכינו מערך רב-סיבים לשימוש (איור 2G).
      1. הכנס 4 פיני דיבל לתוך החורים במערך הרב-סיבים. ודא שפיני הדאבל אינם בולטים יותר מ-1 מ"מ מצד המוח של מערך הרב-סיבים.
      2. הנח דבק סופר-גלו בצד המוח על פיני הדאבל. תן לדבק להתייבש לפחות 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש במערך המולטיפייבר.

2. ניתוח (איור 1B)

  1. הכינו את מרחב הניתוח והכלים.
    1. מסגרת סטריאוטקטית נקייה כדי להבטיח אזור עבודה אספטי.
    2. קבל תפר סטרילי נספג.
    3. אוטוקלב עם זוג מלקחיים דקים, מספריים עדינים ושני קליפסי בולדוג.
    4. ודאו שהמאדה מלא באיזופלורן. ודא שהצינורות של קווי האיזופלורנס, הוואקום והחמצן מחוברים היטב לאדוי, לתא ההשראה ולחרוט האף של מסגרת הסטריאוטקטיקה.
  2. השגת וירוסים jRCaMP1b, GCaMP6f ו-GRAB-DA1m עם וירוסים אדנולוגיים.
    זהירות: תמיד יש ללבוש ציוד מגן אישי בעת טיפול בווירוסים.
    1. לדלל וירוסים לריכוז עבודה של בין 1x10,13 ו-4x10,13 חלקים למיליליטר במידת הצורך.
    2. הכינו תערובת 1:1 של וירוסים jRCaMP1b ו-GCaMP6f עם אדנו.
    3. הנח אליקו של תערובת ויראלית 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f ואליקו של וירוס GRAB-DA1m על הקרח כדי לשמור על טמפרטורה של 4°C.
  3. השרה הרדמה.
    1. הכניסו את העכבר לתא האינדוקציה וסגרו את דלת התא. התחילו את זרימת החמצן לתוך האידוי בקצב של 1 ליטר לדקה.
    2. כוון את זרימת הגז לתא ההשראה והפעיל את קו הוואקום כדי להסיר גזים עודפים מהתא. כוון את האידוי לריכוז איזופלורן בין 3% ל-5%.
  4. העבר את העכבר למסגרת סטריאוטקטי.
    1. ברגע שהנשימה של העכבר האטה לנשימה אחת/שנייה, העבר את העכבר למסגרת הסטריאוטקטית. חבר את החותכות הקדמיות של העכבר לחריץ בפיה של חרוט האף והדק את חרוט האף מעל האף של העכבר.
    2. העבר את זרימת הגז למסגרת הסטריאוטקטית עם ריכוז איזופלורן מוגדר ל-1%–2% כדי לשמור על ההרדמה. החלף את קו הוואקום כדי להוציא גז מקונוס האף.
      הערה: יש לעקוב אחרי נשימת העכבר לאורך כל הניתוח ולהתאים את ריכוז האיזופלוראן לפי הצורך כדי לשמור על הרדמה עמוקה עם קצב נשימה של נשימה אחת לשנייה. יש לאשר הרדמה עמוקה מדי פעם לאורך כל הניתוח על ידי הבטחת חוסר תגובה לעקיצה באצבע.
    3. כוון את מערכת החימום לשמור על טמפרטורת גוף של 35 מעלות צלזיוס ומרח משחה אופטית על עיני העכבר כדי למנוע התייבשות.
    4. הכנס מוטות אוזניים סטריאוטקטיים כך שידחפו משני צידי הגולגולת, מעט גב וקדמי לתעלות האוזן. הדק את מוטות האוזניים וודא שהגולגולת של העכבר קבועה במקומה על ידי הפעלת לחץ עדין על ראש העכבר.
  5. הכינו את הקרקפת לחתך.
    1. גזם או גלח את השיער מעל ראש העכבר עד שהוא קצר. מרחו ג'ל להסרת שיער על ראש העכבר ותנו לו לשבת בערך דקה. הסר את הג'ל שנותר עם מטלית כותנה נקייה.
    2. חזור על 2.5.1 לפי הצורך עד שכל השיער בחלק העליון של הראש יוסר.
    3. חטא את העור שעל הראש באמצעות מטשי כותנה למריחת בטדין (10% תמיסת פובידון-יוד) ואחר כך תמיסת 70% אתנול.
  6. חשפו את הגולגולת.
    1. חתכו חתך לאורך קו האמצע של הגולגולת, שמתחיל מעט אחורי של הלמדה ועד מעט קדמי לווריד הרוסטרלי של הנחיתות.
      הערה: וריד הנזף הרוסטרלי הוא כלי הדם היושב על פני השטח הגבי של המוח בין פקעת הריח לקורטקס הפרה-פרונטלי.
    2. חתכו והסירו את העור המגולח סביב צידי החתך הזה ליצירת חתך בצורת טיפה הדמעה שחושף את עצמות הפריאטל, הקצה הקדמי של עצם העצם התוך-פריאטלית, ואת החלק הקדמי של עצמות האף שנמצא לפני וריד הנזף הרוסטרלי (איור 2H).
    3. נקה בעדינות את משטח הגולגולת עם תמיסת מלח של 0.9% ומקלון כותנה נקי.
  7. תיישר את הגולגולת.
    1. מצא את המקום שבו וריד הרוסטרל פוגש את התפר הסגיטלית. סמן נקודה זו עם להב סכין סטרילי.
    2. הכנס מקדח קרביד #92 למקדחה הסטריאוטקטית והתקן את המקדחה על מסגרת הסטריאוטקטיקה. השתמש במניפולטור הסטריאוטקטי כדי למקם את קצה המקדחה על פני הגולגולת בנקודה המסומנת ואפס את קואורדינטות X, Y ו-Z של המקדחה.
    3. גובה גובה ישר של הגולגולת על ידי מדידת עומק Z בנקודה המסומנת ו-8.25 מ"מ אחורי שלה. יישור הסיבוב של הגולגולת על ידי מדידת המרחק הצידי בין הנקודה המסומנת למיקום -8.25 אחורית. גלגול שטוח על ידי מדידת עומק Z במיקומים ±2.0–2.5 מ"מ מקו האמצע במיקומים -2.0, -4.5 ו--7.0 מ"מ ביחס לנקודה המסומנת.
  8. בצע קרניוטומיות ודורטומים.
    1. החליפו את מקדח המקדח במקדח #76 או #78 קרביד. מאפס את המקדח במיקום המסומן בצומת התפר הסגיטל, וריד הנזף הרוסטרלי ומשטח הגולגולת.
    2. העבר את המקדח לקואורדינטות A/P ו-M/L של כל אזור מוח (טבלה 1). בכל אתר, קדחו קרניוטומיה והסירו בזהירות את הדורה מאטר בכל קרניוטומיה באמצעות קצה מזרק ריק של 27G או פחות.
  9. הזריק את הווירוס.
    1. משוך מיקרופיפטות זכוכית כך שהקצה שלהן יתדדל לפחות ל-7 מ"מ ויש לו פתח קצה של 10–30 מיקרון.
      הערה: יש להפעיל מחדש את צעדי 2.9.2–2.9.12 אם המיקרופיפטה מכילה בועות אוויר לאחר כל אחד מהשלבים הבאים.
    2. מלא מחדש קצה זכוכית ריק של מיקרופיפטה בשמן מינרלי. הכנס ואבטח את קצה המיקרופיפטה לתוך מזרק הננוליטרים. השתמש בממשק מזרק הננוליטר כדי להוציא כמה שיותר שמן מינרלי מהמיקרופיפטה.
    3. התקן את מזרק הננוליטר על המסגרת הסטריוטקטית. חתכו חתיכה קטנה של יריעת שעווה פרפין והניחו אותה על ראש העכבר.
    4. פיפטה של 1 מיקרוליטר מתערובת הווירוס jRCaMP1b:GCaMP6f על שעוות הפרפין. הורידו את קצה מזרק הננוליטר כך שקצה המיקרופיפטה הזכוכית יהיה בתערובת הווירוס וממלאים את המיקרופיפטה בווירוס באמצעות הממשק של המזרק.
    5. חזור על 2.9.4 עד שכל הווירוס שישמש יועבר למזרק הננוליטר (טבלה 1). הסר והשליך את שעוות הפרפין במיכל פסולת ביולוגית.
    6. אפס את קצה המיקרופיפטה של המזרק במיקום המסומן במפגש התפר הסגיטלית, וריד הנזף הרוסטרלי ומשטח הגולגולת.
    7. מתחילים מאתר ההזרקה הגחוני ביותר עד הגבי ביותר (טבלה 1), הזזים את קצה המיקרופיפטה לכל אתר, הורידו אותו כך שיגעו במשטח המוח, ואפסו את מיקום ה-Z במסגרת הסטריאוטקטית.
    8. בכל אתר, הורידו את קצה המיקרופיפטה לתוך המוח עד שהוא 0.1 מ"מ בטונטרלי ביחס לאתר ההזרקה. לאחר מכן, הרם את קצה המיקרופיפטה 0.1 מ"מ לאתר ההזרקה הסופי. תן לרקמה הסובבת להתיישב סביב קצה המיקרופיפטה למשך 30 שניות.
    9. באמצעות ממשק מזריק הננוליטרים, הזרקו 300 ננוליטר מתערובת וירוס jRCaMP1b:GcaMP6f ביחס 1:1 בקצב של 1–2 ננוליטר לשנייה כדי לפזר את התערובת באתר ההזרקה הנוכחי.
    10. אפשר לקצה המיקרופיפטה להישאר באתר ההזרקה לפחות 5 דקות לאחר סיום ההזרקה. להרים לאט את קצה המיקרופיפטה החוצה מהמוח כדי להפחית את הסיכון להתפשטות הווירוס בגב לאורך מסלול ההזרקה.
    11. לאחר הזרקת תערובת הוויראלית jRCaMP1b:GcaMP6f 1:1 בכל אתר, השתמשו בממשק הזרקת הננוליטר כדי להחזיר את הבוכנה של מזרק הננוליטר למקומו המקורי. הסר את המיקרופיפטה והשליך אותה במיכל פסולת ביו-סיארד שאפרס.
    12. אם יש צורך, חזרו על שלבים 2.9.2–2.9.11 עבור כל אזור מוח המיועד לביטוי GRAB-DA1m. בכל אתר יעד, הזרקו 150 ננוליטר במקום 300 ננוליטר ששימשו לתערובת הווירוס.
  10. מערך רב-סיבי שתל.
    1. אבטח את מערך הרב-סיבים למסגרת הסטריוטקטית באמצעות כל חיבור שיכול להחזיק את מערך המולטיפייבר באמצעות פיני המקל כדי לשמור על יציבותו במהלך ההשתלה (איור 2I).
    2. כוונו את מיקום מערך הרב-סיבים כך שכל סיב יתיישר עם מרכז הקרניוטומיה שלו ועם הסיב הארוך ביותר המונח על פני המוח. האפס את המניפולטור הסטריאוטקטי במיקום זה והוריד לאט את מערך הסיבים הרב-סיבים עד שהוא מגיע ל-0.25 מ"מ מעל מיקום ה-D/V של הזרקת הווירוס העמוקה ביותר (טבלה 1, איור 2J).
    3. מניחים תבנית ערבוב קרה על קרח והוסיפו אליה כף אבקת מלט, 4 טיפות בסיס נוזלי וטיפה אחת של זרז. ערבב ל-20 שניות.
      הערה: חזור על שלב זה בכל פעם שמשתמשים במלט נוזלי ונדרש עוד.
    4. השתמש במזרק ובמחט 23–31 גרם להעברת מלט נוזלי במרווח שבין מערך הרב-סיבים לגולגולת.
    5. מרחו מלט נוזלי באמצעות מחט פלסטיק דקה או מחט מזרק, כדי לכסות במלואם את ארבעת הצדדים של מערך הרב-סיבים, ובכך יוצרים צורה פירמידה מהגולגולת (איור 2K). תן למלט להתייבש לפחות 15 דקות.
    6. תפרו את העור יחד לאורך החתך כדי לוודא שאין גולגולת חשופה.
  11. תן לעכבר להתאושש.
    1. הפחיתו את ריכוז האיזופלורן לאפס.
    2. העבר את העכבר מהמסגרת הסטריוטקטית לכרית חימום והמתין שהעכבר יהיה ערני ונייד לפני שמעביר אותו חזרה לכלוב.
    3. אפשר לעכבר להתאושש לפחות שבועיים לפני תחילת הניסויים.

3. הדמיית סידן רב-אזורית, דו-צבעונית (איור 1C)

  1. הגדר את מכשיר רכישת הנתונים (DAQ).
    1. חבר את ה-GND ליציאת ה-AGND מעל יציאת ה-Ch7 באמצעות חוט חשמלי.
    2. חבר את ה-DIO0 ליציאת ה-Ch0 באמצעות חוט חשמלי.
  2. חבר את מערכת הפוטומטריה ל-DAQ.
    1. חבר את קצה מחבר Baby Neill Constant (BNC) של כבל BNC מפוצל (מחבר BNC בקצה אחד, חוטים חשמליים אדומים ושחורים בקצה השני) ליציאת הכניסה במערכת הפוטומטריה. חבר את קצה מחבר ה-BNC של כבל BNC מפוצל אחר ליציאת היציאה במערכת הפוטומטריה.
    2. קח את כבל ה-BNC המפוצל שמחובר ליציאת הכניסה של מערכת הפוטומטריה וחבר את קצה החוט האדום שלו ליציאת DIO1 ב-DAQ. קח את כבל ה-BNC המפוצל שמחובר ליציאת מערכת הפוטומטריה וחבר את קצה החוט האדום שלו ליציאת Ch1 ב-DAQ.
    3. חבר את חוטי ההארקה השחורים משני כבלי BNC מפוצלים ליציאת GND של DAQ.
  3. סנכרן התנהגות ומצלמות פוטומטריה.
    1. חיברו יחד מספר מצלמות התנהגות בשרשרת דייזי להקלטות סימולטניות של התנהגות מזוויות שונות.
      1. חבר את היציאה המבודדת באופטו (פין 4, חוט לבן) של מצלמת ההתנהגות הראשית לכניסה הלא-מבודדת של המצלמה המשנית (פין 1, חוט ירוק) באמצעות נגד של 3.3 KΩ. חבר את יציאת ה-3.3 וולט של המצלמה הראשית (פין 3, חוט אדום) לאותו נגד 3.3 KΩ ול-Ch2 ב-DAQ.
      2. חבר את היציאה המבודדת באופטו של כל מצלמה משנית ליציאה של 3.3 וולט באמצעות נגד של 3.3 KΩ.
      3. חבר את הארקה של המצלמה הראשית (פין 6, חוט חום) להארקה של כל מצלמה משנית. חבר את כל חוטי הארקת המצלמה ליציאת DAQ AGND מעל יציאת Ch2 ולהארקת היציאה של מערכת הפוטומטריה.
  4. הגדר את הגדרות ההתנהגות של המצלמה באמצעות תוכנת ההדמיה המתאימה.
    1. הגדר את "קצב רכישת הפריימים" ל-45 הרץ ואת הרווח ל-1.
    2. הגדר את זמן החשיפה ל-2998 מיקרושניות, את הגבול התחתון של החשיפה ל-100 מיקרושניות, ואת הגבול העליון של החשיפה ל-150000 מיקרושניות.
      הערה: "קצב פריימים רכישה" עשוי שלא להיות קצב הפריימים האמיתי שייתפס. בהתאם לזמן החשיפה ולרוחב הפס המבוקש, ייתכן שיהיה צורך להגדיר ערך זה גבוה יותר מתדר ההדמיה הסופי. אם צריך, כוונן את "קצב רכישת הפריימים" כך ש"קצב פריימים מתקבל" המוצג יהיה 40 הרץ.
  5. הגדר תוכנת DAQ (קובץ משלים 7).
    1. בתוכנת DAQ, הוסף את ה-DAQ כ'מכשיר' ועבר ל'לוח ההגדרות'.
    2. בלשונית 'ערוצים', תחת 'קלט אנלוגי', הפעל ערוצים 0–2. תחת 'דיגיטלי', הפעל ערוץ 0.
      הערה: Ch0 מתאים לאות לוגיקת טרנזיטור-טרנזיטור (TTL), Ch1 למערכת הפוטומטריה, ו-Ch2 למצלמות השרשרת הדייזי.
    3. תחת 'קלט אנלוגי', יש לקרוא לערוץ 0 "TTL", לערוץ 1 "Photometry_system" ולערוץ 2 "Behavior_cameras" שמייצג "Transitor-Transistor Logic". תחת 'דיגיטלי', שם ערוץ 0 "TTL_trigger".
    4. בלשונית 'טריגרים', הגדר את הטריגרים למצב ידני. בלשונית 'קצבי דגימה', הגדר את קצב הדגימה ל-350 הרץ.
    5. עברו ל'לוח התצוגה' והכניסו את חלונות 'Strip', 'Scalar' ו-'Output' בממשק המשתמש הגרפי.
  6. הגדר תוכנת מערכת פוטומטריה (קובץ משלים 8).
    1. פתח תהליך עבודה בתוכנת הקידוד הוויזואלי שיקבל פולס 5V TTL שיפעיל את ההקלטות ולשמור את חותמת הזמן לכל פריים, את פליטות הפלואורסצנציה של הערוצים האדומים והירוקים לכל סיב, ואת הווידאו הגולמי, כפי שמפורט במדריך מערכת הפוטומטריה.
    2. באמצעות הצומת של מערכת הפוטומטריה בתהליך העבודה, ודא שהמערכת מוגדרת להקליט פריימים מתחלפים של 560, 470 ו-415 ננומטר LED ב-120 הרץ לקצב פריימים פונקציונלי של 40 הרץ.
      הערה: שיטת ריבוי חלוקת הזמן (TDM) זו מתמודדת עם חפיפה ספקטרלית בין GCaMP ל-RCaMP על ידי הפרדה זמנית בין ההתרגשות שלהם, ומבטיחה שכל אינדיקטור יורה באופן עצמאי בין פריימים עוקבים. מערכת ההקלטה כאן משתמשת במסנני פליטת פס אופטימליים (ערוץ ירוק: 500–530 ננומטר; ערוץ אדום: >580 ננומטר לונג פאס) שממזערים עוד יותר את הדיבור הספקטרלי על ידי הגבלת פוטונים שזוהו לאורכי גל הנפלטים בעיקר מכל מד. אורך הגל האיזוסבסטי של 415 ננומטר מעורר גם GCaMP וגם RCaMP באופן שווה, אך מייצר שינויים פלואורסצנטיים מינימליים התלויים בסידן, ומספק אות שליטה בתנועה. יחד, גירוי TDM וסינון ספקטרלי מבטיחים שמסגרות של 470 ננומטר לוכדות בעיקר פעילות GCaMP (איור 3A), מסגרות 560 ננומטר לוכדות בעיקר פעילות RCaMP (איור 3B), ומסגרות 415 ננומטר מספקות אותות ייחוס בלתי תלויים בסידן לתיקון תנועה.
  7. בצע הקלטות פוטומטריה ב-vivo .
    1. קבל עכבר שעבר הזרקות ויראליות והשתלת מערך רב-סיבי כפי שמתואר בשלב 2.
    2. נקה את משטחי החיבור של חבל הטלאים והמערך המולטיפייבר המושתל עם אתנול ומקלון כותנה. באמצעות הצומת של מערכת הפוטומטריה בזרימת הקידוד הוויזואלית ובפוטומטר, הגדר כל אחד מרמות ההספק של 415, 470 ו-560 לפלט כ-1.2 mW של תאורה מהפאצ'קורד.
    3. מרח ג'ל התאמת אינדקס על פני החיבור של כבל הפאץ'. יישר את חוט הטאצ'ק למערך המולטיפייבר המושתל בעכבר עם פיני הדיבל של המערך, והחליק את חבל הטאצ'קורד כלפי מטה עד שיהיה שטוח עם פני מערך המולטיפייבר המושתל.
    4. הדק ברגי Patchcord כדי לקבע את מערך המולטיפייבר לתוך כבל ה-patchcord. תנו לעכבר להתרגל לפני תחילת הניסויים (איור 2L–M).
    5. הגדר שמות קבצים.
      1. לכל מצלמת התנהגות, לחצו על כפתור העיגול האדום 'הקלטה' כדי לפתוח את חלון ההקלטה בתוכנת הקלטת מצלמת ההתנהגות ולציין את שם הקובץ שלה.
      2. פתח את תוכנת DAQ, לחץ על כפתור הילוך ונווט ל'אפשרויות לידום', וציין את שם הקובץ.
      3. לחץ על הצומת 'PhotometryWriter' בתהליך הקידוד הוויזואלי של מערכת הפוטומטריה כדי לציין את שם הקובץ.
    6. בתוכנת מצלמות ההתנהגות שמקליטה חלונות, לחץ על 'התחל הקלטה' עבור כל מצלמה. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה בתהליך הקידוד הוויזואלי של מערכת הפוטומטריה, ולחץ על הקלטה בתוכנת DAQ.
    7. לחץ על מתג ה-TTL כדי להתחיל להקליט באופן סינכרוני בכל המצלמות.
    8. סיום הקלטה.
      1. לחץ על מתג TTL כדי לסיים הקלטות מצלמה סינכרוניות
      2. לחץ על כפתור העצירה בתהליך הקידוד הוויזואלי של מערכת הפוטומטריה, "עצור הקלטה" בתוכנת ההתנהגות של מצלמת ההקלטה של חלונות.
    9. חזור על השלבים 3.7.5–3.7.8 עד לסיום הניסויים, ונתק את העכבר.
      הערה: לאחר הניסויים, זרמי נתוני מצלמות פוטומטריה והתנהגות יכולים להיות מיושרים עם קוד מותאם אישית באמצעות פלט תוכנת DAQ. במיוחד, (1) השינוי במתח ה-TTL מציין את זמן תחילת והזזת TTL, (2) שינויים במתח ההתנהגות של המצלמה מציינים מתי תריס המצלמה נפתח ונסגר כדי ללכוד כל פריים של וידאו התנהגותי, ו-(3) השינוי הראשוני במתח מערכת הפוטומטריה שהוקלט ב-DAQ ניתן להשוואה לזמן ההתחלה של TTL ולחותמות הזמן של מצלמת הפוטומטריה שפלט מתוכנת הקידוד הוויזואלי כדי לקבוע את חותמות הזמן של מצלמת הפוטומטריה.

4. עיבוד נתונים (איור 1D, קובץ משלים 9)

  1. עיבוד מקדים של נתוני הדמיית סידן.
    1. הפרת מסגרות של נתוני הדמיית סידן ליצירת זרמי אות נפרדים שהוקלטו בתגובה לנורות LED של 415 ננומטר, 470 ננומטר ו-560 ננומטר.
    2. השתמש באלגוריתם ה-Adaptive Adaptive Repeated Reweighted Penalized Least Squares (airPLS)44 כדי לתקן סטייה בקו הבסיס.
    3. חשב ΔF/F באמצעות:
      figure-protocol-2
      הערה: תקופת הבסיס צריכה להיות תקופה יציבה לפני מניפולציה ניסויית (למשל, לפני הצגת שותף חברתי). אם תקופת הבסיס קצרה מדי (<2–3 דקות) או מציגה תנודות גדולות שעלולות להיות מזוהמות על ידי ארטיפקטים של תנועה, שקול לנרמל באמצעות הפלואורסצנציה הממוצעת לאורך כל הסשן במקום תקופת בסיס מוגבלת.
  2. נכון לארטיפקטים של תנועה (איור 4A).
    1. השתמש בגישה מבוססת רגרסיה, אם כי שיטות חלופיות מתאימות (ראו טבלה 2)
    2. אותות ΔF/F בציון Z המשתמשים במדיאן לנרמול עוצמת האות בין אזורים:
      figure-protocol-3
    3. הפעילו רגרסיה של לאסו עם רגולריזציה של L1. Lasso (אופרטור ההתכווצות והבחירה המוחלטת המינימלית) מבצע בחירת תכונה אוטומטית על ידי הקטנת מקדמי מנבאים לא אינפורמטיביים לעבר האפס.
      1. בצע חיפוש רשת בין פרמטרי רגולריזציה (α = 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 10). חיפוש הרשת מזהה את האיזון האופטימלי בין מורכבות המודל להתאמה יתר. שלב זה יכול להיות אוטומטי לחלוטין באמצעות שגרות אימות צולב הזמינות בספריות למידת מכונה סטנדרטיות (למשל, scikit-learn בפייתון).
      2. לפוטומטריה דו-צבעונית (הגישה המומלצת שלנו), השתמשו בכל ערוצי הבקרה האיזוסבסטיים הזמינים של 415 ננומטר ב-12 אזורי ההקלטה כמנבאים (ראו איור 4B–C ותוצאות לסיבוב). בפוטומטריה בצבע יחיד (רק GCaMP או RCaMP בלבד), יש להגביל את מטריצת המנבא רק לאות האיזוסבסטי מאותו סיב שבו מתוקן אות הסידן.
      3. בחר את המודל שממזער את השגיאה הריבועית הממוצעת בין האות החזוי לאות הנצפה.
    4. הפחת את רכיב התנועה החזוי מהאות כדי לקבל פעילות מתוקנת.
  3. החליק את האות באמצעות פילטר Savitzky-Golay עם חלון של 725 מילישניות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להקליט בו-זמנית עד 12 אזורי מוח של SBN, בנינו מערך רב-סיבים מותאם אישית בהתאם לפרוטוקול הנ״ל. לאחר ההחלמה מהניתוח, העכברים נרשמו במהלך אינטראקציה חברתית (איור 5). בכל הניסויים, עכברים זכרים שנבדקו ב-CD1 הורשו לקיים אינטראקציה עם עכברי Balb/c זכרים בכלוב הבית שלהם. השתמשנו בעכברי Vgat-Cre לביטוי jRCaMP1b40 בנוירונים GABAergic באופן תלוי Cre ב-11 אזורי SBN במוח, GCaMP6f39 בתאים שאינם GABAergic באופן ללא Cre,45 באזורים באותם אזורים במוח, ו-GRAB-DA1m33 ב-Nucleus accumbens42 (טבלה 1). אישור היסטולוגי של מיקוד סיבים ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו42,43. כאן ניסינו לבדוק את ביצועי שיטות שונות לתיקון ארטיפקטים בתנועה. באופן ספציפי, השווינו את היעילות של שימוש: (1) מסנן חציוני בלבד; (2) רגרסיית לאסו עם רגולריזציה L1 באמצעות אותות איזוסבסטיים של אותו סיב בלבד (גישת מנבא יחיד) 11 ו-(3) רגרסיית לאסו באמצעות אותות איזוסבסטיים מכל הסיבים כמנבאים (גישה מרובת מנבאים) 41,42 (איור 4A). חשוב לציין כי שיטות מבוססות לאסו מתקנות את האות הגולמי באמצעות אות פלואורסצנטי בלתי תלוי בפעילות שנוצר בתגובה לנורית LED בתדר איזוסבסטי (415 ננומטר), בעוד שהחלקת מסנן חציונית אינה מתחשבת באות הבלתי תלוי בפעילות.

הערכנו תיקון תנועה באמצעות שני מדדים שונים: רעש בתדר גבוה מוחלט ורעידות. רעש בתדר גבוה הוגדר כסטיית התקן של הנגזרת הראשונה של האות, המשקפת את עוצמת התנודות המהירות באות. ג'יטר הוגדר כמקדם השונות של נגזרת האות, המשקף את עוצמת השונות של האות בין פריימים לפריים ביחס לממוצע הנגזרת של האות. מצאנו ששתי הגישות המבוססות על לאסו (מנבא יחיד ומנבא מרובי) עקפו משמעותית את מסנן החציון בהפחתת רעש בתדר גבוה וגם ג'יטר, כאשר תיקון רב-מנבא עלה במעט על תיקון מנבא יחיד (איור 4C–D; רעש בתדר גבוה, n=414 עבור 23 אותות ב-18 מפגשי הקלטה: בדיקת Kruskal-Wallis, H = 501.9420, p < 0.001; מבחני Mann-Whitney U לאחר הוק עם תיקון בונפרוני: רגרסיה מוחלקת לעומת רגרסיה באתר יחיד ***p < 0.001, רגרסיה חלקה מול רב-אתרית***p < 0.001, אתר יחיד מול ריבוי אתרים **p = 0.0073; ג'יטר: מבחן קרוסקאל-ווליס, H = 495.6685, עמוד < 0.001; בדיקות Mann-Whitney U לאחר הוק עם תיקון בונפרוני: רגרסיה מוחלקת לעומת רגרסיה באתר יחיד ***p < 0.001, רגרסיה מוחלקת מול רב-אתרים***p < 0.001, אתר יחיד מול ריבוי אתרים ***p = 0.0006). באופן ספציפי, הגישה של רב-מנבא (תוך שימוש בכל האיזוסבסטיים הסיבים) הראתה יתרונות לאותות ערוץ אדום (RCaMP): 5 מתוך 12 אותות אדומים הציגו רעש שאריתי נמוך משמעותית לעומת תיקון מנבא יחיד (n = 18 הקלטות לאזור). עבור ג'יטר, BNST (t-test, t = 5.42, ***p < 0.001), POA (t-test, t = 2.68, *p = 0.011), AH (t-test, t = 2.66, *p = 0.012), ו-PAG (מבחן Mann-Whitney U, U = 279, ***p < 0.001) הראו עליונות רב-חזאית. לרעש בתדר גבוה, BNST (מבחן Mann-Whitney U, U = 285, ***p < 0.001), POA (מבחן Mann-Whitney U, U = 292, ***p < 0.001), AH (t-test, t = 7.10, ***p < 0.001), PAG (t-test, t = 13.72, ***p < 0.001), ו-LHb (t-test, t = 5.47, ***p < 0.001) הראו עליונות רב-מחזיקים. אותות הערוץ הירוק (GCaMP) לא הראו הבדלים משמעותיים בין שתי גישות הלאסו בכל 12 האזורים עבור מדדי רעש של ג'יטר או תדר גבוה (כולם p>0.05, לרשימת הבדיקות הסטטיסטיות המלאה ראו טבלה 3). דבר זה מצביע על כך שבפוטומטריה דו-צבעית, שילוב מידע איזוסבסטי חוצה ערוצים משפר את תיקון התנועה לאותות אדומים, ככל הנראה משום שאיזוסבסטיקה בערוץ ירוק מספקת מידע תנועה נקי יותר. נתונים אלו מראים שתיקון ארטיפקטים בתנועה באמצעות שיטות רגרסיה מבוססות איזוסבסטיקה עולה משמעותית על גישות סינון פשוטות, כאשר רגרסיה רב-ערוצית מספקת יתרונות ייחודיים להקלטות דו-צבעוניות.

figure-results-1
איור 1. הקלטה מרשת ההתנהגות החברתית באמצעות פוטומטריית סיבים דו-צבעונית רב-אתרית. (א) ייצוג סכמטי של אופן בניית מערך רב-סיבים. (ב) ייצוג סכמטי של תהליך הניתוח. (ג) ייצוג סכמטי של ניסויים בהדמיית סידן דו-צבעונית. (D) דוגמה לשימוש באות איזוסבסטי לחישוב אות מתוקן תנועה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2. תמונות של הליכים מרכזיים לייצור וניתוח. (א) חבל פאץ' מיוצר מוכן לשימוש להקלטה. (B) מערך רב-סיבים הממוקם בתוך מחזיק סטריאוטקטי מותאם אישית עם מקדח בגודל 0.25 מ"מ x 5.5 מ"מ ממוקם מעל חור סיב. (ג) מערך רב-סיבים עם ניקוי כל חורי הסיבים ואגוזי משושה מודבקים פנימה. (ד) חיתוך סיב באמצעות כתב סיב. (ה) מערך רב-סיבים עם כל הסיבים מודבקים ומודבקים על דיסק ליטוש מותאם אישית. (ו) תצוגה מוגדלת של איך ליישר ולהבריג את מחבר הפצ'קורד למערך הרב-סיבים. (G) מערך רב-סיבי מובנה מלא עם פינים מודבקים במקומם. (H) עכבר מחובר למסגרת סטריאוטקטית עם חתך בקרקפת שנחשף את הגולגולת. (I) מערך רב-סיבים מיוצר המחובר למניפולטור הסטריאוטקטי כדי לתמרן את מערך הסיבים במהלך הניתוח. (J) מבט מוגדל של מערך הרב-סיבים שמוורד למוח. (K) מערך רב-סיבים מורד במלואו ומחובר לגולגולת עם מלט דנטלי. (L) מערך רב-סיבים על בעל חיים שמחובר היטב לכבל התיקון לפני ההקלטה. (M) תצוגה מורחבת של בעל חיים בכלוב עם כבל טלאים מחובר לפני ו/או במהלך ההקלטה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3. הפרדה ספקטרלית. דוגמאות עקבות המדגימות חיתוך ספקטרלי מינימלי בין מדדי סידן. אותות GCaMP6f (כחולים) מראים הפעלה חזקה במהלך עירור של 470 ננומטר אך תגובה זניחה לגירוי של 560 ננומטר. אותות jRCaMP1b (אדום) מציגים דפוס הפוך עם הפעלה חזקה מ-560 ננומטר אך תגובה מינימלית להארה של 470 ננומטר. (א) אותות GCaMP6f ו-jRCaMP1b מוקלטים בו-זמנית עם תאורה של 470 ננומטר בלבד. (B) זהה ל-(a), אך עם תאורה של 560 ננומטר בלבד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4. השוואה בין שיטות שונות לעיבוד אותות רב-סיבים. (א) סכמטי המציג תיקון מבוסס רגרסיה רב-אתרית של אות פוטומטריה. גישה זו כוללת שלבי עיבוד עוקבים שבהם כל האותות האיזוסבסטיים הזמינים ב-415 ננומטר ממופים ליניארית לכל אות תלוי סידן. רכיבי התנועה החזויים מחסרים מהאות הזה כדי להפיק את הקריאה הסופית של הפעילות. אותות ΔF/F עם ציון z משני אותות עם נוכחות חזקה של ארטיפקטים תנועה. (B) מלמעלה למטה: אות איזוסבסטי מאותו סיב/ערוץ הדמיה המציג ארטיפקטים של תנועה, אות RCaMP מוחלק בלבד (משמאל) או GCaMP (ימין) (מסונן חציון, ירוק), אותו סיב/אות מתוקן רגרסיה בערוץ הדמיה (ציאן), אות מתוקן רגרסיה מרובה סיבים (כחול). (C) שמאל: ציון רעש בתדר גבוה ממוצע לכל אות מוקלט (n = 21 מפגשים). רעש בתדר גבוה מחושב כסטיית התקן של הנגזרת הראשונה של כל אות. ציוני רעש מוצגים עבור 1) אות מתוקן בסיס אך לא מתוקן (אפור), 2) אות מתוקן בסיסית וסינון חציוני (ורוד), 3) אות מתוקן ברגרסיה בסיסית וסיב יחיד עם החלקת סביצקי-גולאי (ציאן), ו-4) אות מתוקן רגרסיה בסיסית ורב-סיבים עם החלקת סביצקי-גולאי (כחול). מרכז: אחוז ממוצע של רעש שהוסר באמצעות רגרסיה של החלקה בלבד, סיב יחיד או רב-סיבי, מצטבר על כל 23 האותות. אחוז הרעש שהוסר מחושב כחלק מהרעש בתדר גבוה הנובע מתיקון ביחס לרמת הרעש הכוללת באות הגולמי המתוקן על בסיס הבסיס. הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM (מבחן Kruskal-Wallis, H = 501.9420, p < 0.001; מבחני Mann-Whitney U לאחר הוק עם תיקון בונפרוני: רגרסיה מוחלקת מול אתר יחיד ***p < 0.001, רגרסיה מוחלקת מול רב-אתרי***p < 0.001, אתר יחיד לעומת ריבוי אתרים **p = 0.0073). מימין: אחוז האותות שבהם רעש בתדר גבוה שונה סטטיסטית לאחר תיקון מבוסס רגרסיה סיבי יחיד לעומת ריבוי סיבים, המופרדים לפי סוג האות. עבור כל אחד מ-23 האותות, רמות הרעש לאחר תיקון באתר יחיד הושוו לרמות רעש לאחר תיקון רב-אתרים, באמצעות בדיקות t עצמאיות (אם מחולקות בדרך כלל) או בדיקות Mann-Whitney U (חלופה לא-פרמטרית). מקטעים כחולים מציינים אותות שבהם תיקון ריבוי אתרים גרם לרעש נמוך משמעותית מתיקון באתר יחיד (p < 0.05). מקטעים אפורים מצביעים על אותות ללא הבדל משמעותי בין שיטות התיקון. מקטעי ציאן מצביעים על אותות שבהם תיקון באתר יחיד גרם לרעש נמוך משמעותית. E: Vgat- GCaMP6f. DA: תפוס-דה. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) זהה ל-(C) אך מציגה שונות מפריים לפריים (ג'יטר), מחושבת כנגזרת של מקדם השונות של כל אות (מבחן Kruskal-Wallis, H = 495.6685, p < 0.001; בדיקות Mann-Whitney U לאחר הוק עם תיקון בונפרוני: רגרסיה מוחלקת מול אתר יחיד ***p < 0.001, רגרסיה מוחלקת מול רב-אתרים***p < 0.001, אתר יחיד מול רב-אתרים ***p = 0.0006). לרשימה מלאה של בדיקות סטטיסטיות ותוצאות ראו טבלה 3. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5. תצוגה מרובת אתרים של פוטומטריית סיבים דו-צבעית. אותות מייצגים ממספר סוגי מדדים שהוקלטו בו-זמנית במהלך התנהגות חברתית (בדיקת תושב-פולש, תקופת כניסת הפולש). עקבות מראים GCaMP6f (נוירונים Cre-שליליים) לא מנורמלים ולא מנותקים בבסיס אך לא מתוקנים בתנועה, jRCaMP1b (נוירונים GABAergic Vgat-Cre+), ו-GRAB-DA1m (חיישן דופמין בגרעין אקומבנס) באתרי רשתות התנהגות חברתית באותו בעל חיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טבלה 1. קואורדינטות וירוס ואורכי סיבים לכל אזור מוחי של רשת התנהגות חברתית ממוקדת. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 2. השוואה בין שיטות תיקון חפצי תנועה לפוטומטריית סיבים רב-אתרים. עקרונות בסיסיים, מקרי שימוש אופטימליים, יתרונות ומגבלות של שיטות תיקון ארטיפקטים לתנועה הבאות: רגרסיה ליניארית פשוטה, רגרסיית לאסו עם רגולריזציה L1 (בגישת רב-מנבאים), מודלים גנרטיביים בייסיאניים, קנה מידה מבוסס תדר, וריבועים מינימליים משוקללים באופן איטרציוני. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

טבלה 3. פרטים ותוצאות המבחנים הסטטיסטיים ששימשו באיור 4. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

קובץ משלים 1. קובץ הדפסה תלת-ממדי עבור מחבר Patchcord.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ תיק משלים 2. 3D תיק הדפסה עבור מחבר Patchcord ללא חורים.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3. 3D קובץ הדפסה עבור אביזר קידוח סטריאוטקטי.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 4. תכנית פוליש מותאמת אישית.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ 5. 3D דפוס משלים למערך פוטומטריה רב-אתרים המיועד ל-12 אתרי SBN.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 6. 3D קובץ הדפסה עבור מערך פוטומטריה מרובה אתרים ללא חורים שמכוונים לאתרים המכוונים אליו.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

תיק משלים 7. קובץ קונפיגורציה של DAQ עבור תוכנת DAQ.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 8. קובץ קידוד ויזואלי למערכת פוטומטריה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 9. קוד פייתון המשמש בפרוטוקול שלב 4 ולהשוואות מתוקנות ארטיפקטים בתנועה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוטומטריית סיבים היא טכניקה שימושית וחסכונית לתיעוד פעילות סידן באוכלוסייה מאזורים עמוקים במוח או סוגי תאים ספציפיים בבעל חיים הנע בחופשיות3. הקלטה ממספר אזורים במוח בו זמנית מאפשרת למשתמש להשוות את הדינמיקות בין אזורים או הקרנות במהלך התנהגות טבעית או הכנות ראש-קבועות 5,7,12. כאן, אנו מפרטים שיטות להקליט בשני צבעים מעד 12 אזורי מוח ברחבי "רשת ההתנהגות החברתית" התת-קורטיקלית של המוח, באמצעות מערך סיבים מותאם אישית ומערכת מצלמה מסחרית. להלן נדון בצעדים קריטיים ביישום שיטה זו, שינויים אפשריים ואסטרטגיות פתרון תקלות, וחשיבותה וכן במגבלות ביחס לגישות הקיימות.

הפרוטוקול כולל שלושה שלבים עיקריים. ראשית, ייצור מערך רב-סיבים ו-patchcord דורש קידוח חלקים מותאמים אישית בהדפסה תלת-ממדית בקואורדינטות סטריאוטקטיות, ולאחר מכן הכנסת סיבים, ליטוש ובקרת איכות כדי להבטיח ≥75% יעילות העברת אור. יישור קידוח מדויק (סבילות ±0.03 מ"מ) וליטוש יסודי הם קריטיים. כשלים נפוצים כוללים יעילות העברת אור נמוכה (<75%) וחסימת חורי סיבים. יעילות נמוכה נובעת בדרך כלל מפגיעות סיבים במהלך חיתוך או ליטוש לא נכון. הפתרונות כוללים אימות שכל קצה סיב אינו פגום תחת מיקרוסקופיית Brightfield לפני ההחדרה (שלב 1.1.6.2), ליטוש מחדש באמצעות התקדמות הגריט המלאה (6 מיקרון → 0.01 מיקרון, שלב 1.1.6.1), והבטחת חד להב החוצץ. כדי לשפר את קצב התפוקה, מעבדות יכולות ליישם שינויים בזרימת עבודה כגון חיתוך סיבים מותאמים אישית באמצעות שלבי תרגום מדויקים או מערכות חיתוך מבוססות לייזר (שלב 1.2.4). יצרני הדפסת תלת-ממד מסחריים עם מערכות מדויקות מאוד יכולים להפחית את הצורך בקידוח ידני (שלבים 1.1.3–1.1.4, שלב 1.2.3), אם כי דיוק המידות עשוי להשתנות בין האצוות.

שנית, השתלה כירורגית כוללת יישור גולגולת (סבילות ±0.03 מ"מ), הזרקות ויראליות ב-11–12 אתרים, והשתלת מערך רב-סיבי ואחריה קיבוע מלט. דיוק הכוונה נפגע כאשר רמת הגולגולת חורגת מהסבילות. ניתן להקל על כך על ידי מדידת גובה הצליל במספר נקודות קדמיות-אחוריות במרחק 8.25 מ"מ זו מזו ומדידת גלגול במיקומים צדדיים של ±2.0–2.5 מ"מ, תוך הבטחת ייצוב מלא של מוטות האוזניים. בועות אוויר במיקרופיפטות הזרקת וירוסים מונעות העברה מדויקת ומחייבות להתחיל מחדש את הכנת המיקרופיפטות (שלב 2.9). במהלך השתלת מערך רב-סיבים, יש להימנע ממגע מלט עם קצות הסיבים על ידי בניית פירמידות מלט ממשטח הגולגולת כלפי מעלה (שלבים 2.10.3–2.10.5) ומתן זמן ייבוש מספק (≥15 דקות).

שלישית, הקלטה ועיבוד נתונים כוללים סנכרון מצלמה באמצעות מערכת DAQ, כיול הספק LED (0.1 mW פלט/סיב, 1.2 mW פלט/12 סיבים), ועיבוד מוקדם של אותות עם בקרות איזוסבסטיות. צינור תיקון התנועה שהוצג כאן משתמש ברגרסיית Lasso, שמתאימה מאוד לתצורות חיזוי רב-ערוציות, משום שהיא מכווצת אוטומטית את החיזויים הלא אינפורמטיביים לעבר האפס, תוך שמירה רק על אלו שתורמים משמעותית לתיקון ארטיפקטים. תכונה זו הופכת אותה ליתרון מיוחד בפוטומטריה דו-צבעית: על ידי הכללת אותות איזוסבסטיים משני הערוצים האדומים והירוקים כמנביאים, Lasso מנצל באופן סלקטיבי את הערוצים הנושאים מידע תנועה אמיתי, ומניב הפחתת רעש טובה בהרבה באותות ערוץ אדום (RCaMP) בהשוואה לתיקון סיב זהה בלבד (איור 4C–D). מכיוון שלסו מזהה אוטומטית את החיזויים המידעיים ביותר, מומלץ מאוד להשתמש בכל הערוצים האיזוסבסטיים הזמינים כקלט. עם זאת, רגרסיית לאסו היא אחת מכמה שיטות תיקון תקפות; חלופות כוללות מודל בייסיאני גנרטיבי46, קנה מידה מבוסס תדירות47, וריבועים מינימליים משוקללים מחדש (IRLS)48, שכולם ככל הנראה מניבים הפחתת ארטיפקטים דומה, עם הנחיות יישום שמופיעות בטבלה 2. איכות אות ירודה מתמשכת למרות עיבוד מקדים אופטימלי ככל הנראה מעידה על בעיות חומרה או ניתוח, ויש לבחון מחדש את השלבים 1–2

מעבר לשיקולים פרוצדורליים אלו, פוטומטריה דו-צבעונית מציבה אתגרים טכניים נוספים הקשורים להפרדה ספקטרלית. שיקול קריטי בפוטומטריה דו-צבעונית הוא ניהול חפיפה ספקטרלית בין מדדי סידן ירוק ואדום. בעוד שהסרה מוחלטת של חיתוך ספקטרלי היא אתגר בשל ספקטרום פליטה חופף של GCaMP ו-RCaMP, הגישה שלנו למולטיפלקסינג בזמן עם עירור LED משולב (470 ננומטר ל-GCaMP, 560 ננומטר ל-RCaMP, 415 ננומטר איזוסבסטי) ומסנני פליטת פס אופטימליים מפחיתים משמעותית את הבעיה הזו. בפועל, אנו מבחינים במינימום של דיבור צולב: גירוי של 470 ננומטר מעורר פעילות זניחה בערוץ האדום, ולהפך עבור גירוי של 560 ננומטר בערוץ הירוק (איור 3). חוקרים המודאגים מחפיפה ספקטרלית שאריתית יכולים לייעל את המערכות שלהם על ידי בחירת מסנני פליטה עם מעבר פס צר עם הפרדה ספקטרלית מקסימלית בהתבסס על שילובי האינדיקטורים הספציפיים שלהם.

בהשוואה לגישות אחרות להקלטות עצביות בקנה מידה גדול, פוטומטריית סיבים דו-צבעונית מרובת אתרים מציעה יתרונות משמעותיים רבים. ראשית, בעוד שפוטומטריית סיב יחיד 1,2,3, הקלטות חוץ-תאיות עכשוויות 4,6, או גישות דימות משטח קורטיקלי 8,9 מוגבלות לאזור מוחי אחד או במרחב מוגבל (למשל, במשטח הקורטיקלי), עיצוב ההדפסה התלת-ממדי המותאם אישית שאנו משתפים כאן מאפשר מיקוד של עד 12 אזורי מוח בכל מקום במוח באמצעות סיבים אופטיים של 200 מיקרון. לשם השוואה, פרולים 5,7 הזמינים מסחרית תומכים רק בסיבים אופטיים של 100 מיקרון ומוגבלים גם לקבוצת אזורים מוגבלים במוח שנמצאים ישירות בטנדרל למערך הליניארי של הפרול. לגבי מיקוד והקלטה מאזורים ספציפיים במוח, הפשרה העיקרית היא בין קוטר הסיבים לשדה הראייה של מערכת הפוטומטריה. מערכי ריבוי הסיבים המודפסים בתלת-ממד המצוידים בסיבים של 200 מיקרון מתעדים משטחים גדולים יותר בכל אתר בהשוואה לטבעות רב-סיבים מסחריות. בפרוטוקול הנוכחי, שדה הראייה של המצלמה במערכת הפוטומטריה מגביל את ההקלטה ל-12 סיבים אופטיים ב-200 מיקרון. מגבלה זו ניתנת להתגבר על ידי הקטנת קוטר הסיבים ל-100 מיקרון עבור עד 60 סיבים או על ידי בניית מערכת פוטומטריה מותאמת אישית עם מטרת מצלמה גדולה יותר.

לבסוף, פלטפורמת פוטומטריית סיבים דו-צבעונית זו שימשה למעקב אורך אחר דינמיקת פעילות עצבית של שתי אוכלוסיות עצביות מובחנות גנטית ב-11-12 אזורי מוח. באמצעות אסטרטגיית ההוצאה של Cre-in/Cre המבטאת RCaMP תלויה ב-Cre ו-ECaMP ללא Cre באוכלוסיות SBN בעכבר Vgat-cre, הוכח כי גם ניסיון אגרסיבי וגם תצפית מקדמים דפוסים משותפים של דינמיקת פעילות SBN רחבה במהלך אינטראקציות חברתיות הגנתיותעתידיות 42. באמצעות אותה אסטרטגיה ויראלית בעכבר Esr1-cre לרישום נוירונים אלפא של קולטני אסטרוגן שמביעים ולא מבטאים נוירונים, דפוסי התנהגות חברתיים ספציפיים לטריטוריה נקשרו לשינוי מהיר ורגיש להורמונים של קוד פעולה חברתית רחב-SBN, מה שהגביר פעילות קשורה להתנהגות באזור הבית43. הבדלים ספציפיים לטריטוריה בהתנהגות ובקידוד הרשת דורשים טסטוסטרון מחזורי בעכברים זכרים. בעוד שמחקרים אלו השתמשו בגישה ויראלית ובקו Cre יחיד, מחקרים עתידיים יכולים להרחיב שיטות אלו באמצעות גישות ויראליות מצטלבות, אינדיקטורים של סידן מבוטאים גנטית, או מדווחים פלואורסצנטיים של איתות נוירומודולטור וניורופפטיד.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון היה מ-NIH K99MH135212 (ל-E.M.G.), NIH F32MH126562 (ל-E.M.G.), DP2MH126375 (ל-A.L.F.), NIH R01MH126035 (ל-A.L.F.), NYSCF (ל-A.L.F.), קרן סימונס (SCGB) (ל-A.L.F.), קרן קלינגנשטיין (ל-A.L.F.), ומלגת אלפרד פ. סלואן (ל-A.L.F.), קרן מקנייט (A.L.F). מכון אלן (A.L.F). A.L.F. הוא חוקר רוברטסון מטעם קרן תאי הגזע של ניו יורק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מקדח #76עיר מקדח#76
מקדח #78עיר מקדח#78
מקדח #92עיר מקדח#92
0.01 & mu; דפי ליטוש גריטThorLabsLFCF2
מקדחים בגודל 0.25 מ"מ x 5.5 מ"מעיר מקדחמוצר מותאם אישיתמקדח 0.25 x 5.5 מ"מ, יצר קשר עם החברה לבנייה
1 & mu; דפי ליטוש גריטThorLabsLF1D
12 פאצ'ורד הסתעפות סיביתהעדשה הדוריתCustomBBP(12)_200/220/3000-0.37
_5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu; סיב אופטי MThorLabsFT200UMT
3 & mu; דפי ליטוש גריטThorLabsLF3D
30 & mu; דפי ליטוש גריטThorLabsLF30D
6 & mu; דפי ליטוש גריטThorLabsLF6D
תפר נספגאתיקוןJ421H
תיעוד אדפטיבי של ריבועים מינימליים מעונשים בעונש אדפטיביגוגללא זמיןhttps://code.google.com/archive/p/airpls/
פיני דיבל מפלדת סגסוגתמקמאסטר-קאר98381a983
מצלמות התנהגותטלדיין FLIRבלאקפליי S
בונסאיקרן התוכנה בונסאיגרסה 2.9.0
מיקרוסקופ ברייטפילדלייקהES2
מהדקי בולדוגFineScienceTools18038-45
DAQמחשוב מדידהDAQ מסדרת MC USB-200
תוכנת DAQמחשוב מדידהDAQami
תרגילKopf Instrumentsמקדח סטריאוטקסי דגם 1911
חותך סיביםThorLabsXL411/CLVB
מערכת פוטומטריית סיביםנוירופוטומטריקהFP3002
מדריך למערכת פוטומטריית סיביםנוירופוטומטריקהלא זמיןמדריך לאחסון דף אינטרנט: https://neurophotometrics.com/documentation
כתב סיביםThorLabsS90C
מפשט סיביםThorLabsT10S13
מלקחיים עדיניםFineScienceTools11252-00
מספריים עדיניםFineScienceTools14084-08
ברגי הנעה G5אתר ההפקה הפתוח של EphysOEPS-7105
מברג G5אתר ההפקה הפתוח של EphysOEPS-7121
GCaMP6fמעבדת הנדסה נוירולוגית ויראלית PNIEF1a-Cre מחוץ ל-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DAאדג'יןhSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
כרית חימוםציוד רפואי אדרויטHTP-1500
מערכת חימוםקנט סיינטיפיקRT-0515
איזופלוראןקובטרוס29405
jRCaMP1bאדג'יןpAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
אגוזי משושה מברונזה M0.6MetricScrews.us21614
מגיבים וכלים של מלט מטאבונדפארקלS380
הדפסות תלת-ממד שרף דמויי MicroFine ABSProtoLabsמוצר מותאם אישיתראו קבצי קוד משלימים 1-3, 5, 6
מזרק ננוליטרחברת דרומונד המדעיתננו-ג'קט IIמזרק ננוליטר
לוחות שעווה של פארפיןאמקורParaFilm M סרט מעבדה רב-תכליתי
פיפטרתרמופישר סיינטיפיק4641310N
ליטוש פאקסדנת מכונות במחלקת הפיזיקה של אוניברסיטת פרינסטוןמוצר מותאם אישיתראו קובץ קוד משלים 4
פאוורמטרThorLabsPM100D
משחה אופטית של פורלובהדקרהP1490-1
פייתוןקרן התוכנה של פייתוןלא זמין
צינור פלסטיק רך לטאצ'קורדמקמאסטר-קאר3774N4
ספינוויוטלדיין FLIRגרסה 1.25.0.52תוכנת הדמיה השולטת במצלמות ההתנהגות
מסגרת סטריאוטקטיתKopf Instrumentsדגם 1900
תיעוד TMACלא זמיןלא זמיןקוד TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
צינורות למסגרת סטריאוטקטיתסן-גובןE-3603
אידויקנט סיינטיפיקVetFlo Vaporizer

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494 (7436), 238-242 (2013).
  2. Adelsberger, H., Zainos, A., Alvarez, M., Romo, R., Konnerth, A. Local domains of motor cortical activity revealed by fiber-optic calcium recordings in behaving nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (1), 463-468 (2014).
  3. Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
  4. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  5. Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
  6. Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: A miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), (2021).
  7. Guo, Z., et al. Neural dynamics in the limbic system during male social behaviors. Neuron. 111 (20), 3288-3306.e4 (2023).
  8. Ma, Y., et al. Wide-field optical mapping of neural activity and brain haemodynamics: considerations and novel approaches. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1705), 20150360(2016).
  9. Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22 (10), 1677-1686 (2019).
  10. Zhou, Z. C., et al. Deep-brain optical recording of neural dynamics during behavior. Neuron. 111 (23), 3716-3738 (2023).
  11. Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. JoVE. (152), e60278(2019).
  12. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
  13. Newman, S. W. The Medial Extended Amygdala in Male Reproductive Behavior A Node in the Mammalian Social Behavior Network. Annals of the New York Academy of Sciences. 877, 242-257 (1999).
  14. Goodson, J. L. The vertebrate social behavior network: Evolutionary themes and variations. Hormones and Behavior. 48 (1), 11-22 (2005).
  15. O’Connell, L. A., Hofmann, H. A. Evolution of a Vertebrate Social Decision-Making Network. Science. 336 (6085), 1154-1157 (2012).
  16. Wu, M. V., Tollkuhn, J. Estrogen receptor alpha is required in GABAergic, but not glutamatergic, neurons to masculinize behavior. Hormones and Behavior. 95, 3-12 (2017).
  17. Moffitt, J. R., et al. spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 362 (6416), eaau5324(2018).
  18. Gegenhuber, B., Wu, M. V., Bronstein, R., Tollkuhn, J. Gene regulation by gonadal hormone receptors underlies brain sex differences. Nature. 606 (7912), 153-159 (2022).
  19. Knoedler, J. R., et al. A functional cellular framework for sex and estrous cycle-dependent gene expression and behavior. Cell. 185 (4), 654-671.e22 (2022).
  20. Musatov, S., Chen, W., Pfaff, D. W., Kaplitt, M. G., Ogawa, S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (27), 10456-10460 (2006).
  21. Lee, H., et al. Scalable control of mounting and attack by Esr1+ neurons in the ventromedial hypothalamus. Nature. 509 (7502), 627-632 (2014).
  22. Hashikawa, K., et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nature Neuroscience. 20 (11), 1580-1590 (2017).
  23. Fang, Y. -Y., Yamaguchi, T., Song, S. C., Tritsch, N. X., Lin, D. A Hypothalamic Midbrain Pathway Essential for Driving Maternal Behaviors. Neuron. 98 (1), 192-207.e10 (2018).
  24. Wei, Y. -C., et al. Medial preoptic area in mice is capable of mediating sexually dimorphic behaviors regardless of gender. Nature Communications. 9 (1), 279(2018).
  25. Yamaguchi, T., Wei, D., Song, S. C., Lim, B., Tritsch, N. X., Lin, D. Posterior amygdala regulates sexual and aggressive behaviors in male mice. Nature Neuroscience. 23 (9), 1111-1124 (2020).
  26. Yang, B., Karigo, T., Anderson, D. J. Transformations of neural representations in a social behaviour network. Nature. , (2022).
  27. Jacobowitz, D. M., O’Donohue, T. L. alpha-Melanocyte stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of rat brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (12), 6300-6304 (1978).
  28. Flanigan, M. E., et al. Orexin signaling in GABAergic lateral habenula neurons modulates aggressive behavior in male mice. Nature Neuroscience. 23 (5), 638-650 (2020).
  29. Bayless, D. W., et al. A neural circuit for male sexual behavior and reward. Cell. 186 (18), 3862-3881.e28 (2023).
  30. Dawson, M., et al. Hypocretin/orexin neurons encode social discrimination and exhibit a sex-dependent necessity for social interaction. Cell Reports. 42 (7), 112815(2023).
  31. Iyilikci, O., et al. Age-specific regulation of sociability by hypothalamic Agrp neurons. bioRxiv. , (2025).
  32. Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), eaat4422(2018).
  33. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496.e19 (2018).
  34. Sun, F., et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nature Methods. 17 (11), 1156-1166 (2020).
  35. Duffet, L., et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. Nature Methods. 19 (2), 231-241 (2022).
  36. Ino, D., Tanaka, Y., Hibino, H., Nishiyama, M. A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain. Nature Methods. 19 (10), 1286-1294 (2022).
  37. Wang, H., et al. A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors. Science. 382 (6672), eabq8173(2023).
  38. Dong, C., et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nature Neuroscience. 27 (9), 1844-1857 (2024).
  39. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  40. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, e12727(2016).
  41. Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
  42. Iravedra-Garcia, J. M., Guthman, E. M., Cuturela, L., Ocasio-Arce, E. J., Pillow, J. W., Falkner, A. L. Aggression experience and observation promote shared behavioral and neural changes. bioRxiv. , (2024).
  43. Guthman, E. M., Iravedra-Garcia, J. M., Sirrs, L., Le, A., Falkner, A. L. Context rescales a social action code in a hormone-sensitive network. bioRxiv. , (2025).
  44. Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
  45. Saunders, A., Johnson, C. A., Sabatini, B. L. Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and inactivated transgene expression in neurons. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
  46. Creamer, M. S., Chen, K. S., Leifer, A. M., Pillow, J. W. Correcting motion induced fluorescence artifacts in two-channel neural imaging. PLOS Computational Biology. 18 (9), e1010421(2022).
  47. Donka, R. M., Loh, M. K., Konanur, V. R., Roitman, M. F., Roitman, J. D. PASTa: An Open-Source Analysis and Signal Processing Toolbox for Fiber Photometry Data. Current Protocols. 5 (7), e70161(2025).
  48. Keevers, L. J., Jean-Richard-dit-Bressel, P. Obtaining artifact-corrected signals in fiber photometry via isosbestic signals, robust regression, and dF/F calculations. Neurophotonics. 12 (02), (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CMOS

מאמרים קשורים