הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ריצוף מטגנומי מהדור הבא של נוזל מוח-שדרה לזיהוי פתוגנים במערכת העצבים המרכזית

292 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

17 באפריל 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מחקר זה מתאר תהליך עבודה אופטימלי לריצוף מטאגנומי מהדור הבא (mNGS) של נוזל מוח-שדרה. על ידי התמודדות עם אתגרים ייחודיים לדגימות בעלות ביומסה נמוכה, השיטה מאפשרת גילוי פתוגנים חזק במגוון משאבים, ומספקת בסיס גמיש ליישומי מחקר מחלות נוירו-זיהומיות.

תקציר

ריצוף מטאגנומי מהדור הבא (mNGS) הפך לכלי עוצמתי לזיהוי פתוגנים בלתי מוטה ולפרופיל שעתוק של מארחים בהקשרים קליניים ומחקריים. בעוד ששימושו באבחון זיהומים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוכר יותר ויותר, דגימות נוזל מוח-שדרה (CSF) מציבות אתגרים ייחודיים בשל שפע נמוך של חומצות גרעין ורגישות להתדרדרות. מחקר זה מציג פרוטוקול מחקר אופטימלי לפלטפורמות ריצוף Illumina, המותאם ל-CSF mNGS, הכולל טיפול בדגימות, חילוץ חומצות גרעין, הכנת ספרייה, ריצוף וניתוח ביואינפורמטי. מוצעות גם גישות בקרת איכות המותאמות לסביבות עם משאבים גבוהים וגם נמוכים, כולל חלופות לאלקטרופורזה קפילרית. מחקר זה מדגים את עמידות הפרוטוקול דרך שתי קבוצות מייצגות: זרימת עבודה מבוססת NovaSeq בעומק גבוה וזרימת עבודה מודעת לעלות מבוססת NextSeq. בקבוצות אלו, פתוגנים זוהו ביותר מ-50% מהמקרים, מה שמדגיש את פוטנציאל האבחון של השיטה גם עם התאמות מוגבלות משאבים. פרוטוקול זה מאפשר mNGS שניתן לשחזור של CSF, ומספק בסיס ליישומים מגוונים במחקר ואבחון מחלות נוירוזידבקיות.

מבוא

ריצוף מטגנומי מהדור הבא (mNGS) הוא טכניקה מולקולרית בשימוש הולך וגובר, המאפשרת זיהוי של מגוון רחב של חומצות גרעין בתוך סביבה נתונה או דגימת מארח1. על ידי הגברה וריצוף של רוב החומר הגנטי בדגימה, mNGS אינו דורש השערה מוקדמת לגבי המיקרואורגניזמים הספציפיים שעשויים להימצא. mNGS הוכיח שימושיות ככלי אבחון במגוון סביבות קליניות, כגון בזיהוי פתוגנים נדירים או הופעות לא שגרתיות של מחלות זיהומיות 1,2,3. יתרה מזאת, פרופיל השעתוק של המאכסן נלכד גם הוא על ידי נתוני ריצוף ה-RNA שנוצרים על ידי מבחן mNGS, מה שמאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את תגובת החיסון של המארח למצבי מחלה שונים4. היישום של mNGS במגוון רחב של הקשרים קליניים ומחקריים, יחד עם הירידה הדרמטית בעלות ריצוף גנרי בעשורים האחרונים, הובילו לצמיחה אדירה בשימושבטכנולוגיה זו.

במיוחד, mNGS הראה פוטנציאל בגילוי זיהומים במערכת העצבים המרכזית (CNS), שעדיין קשה לאבחון 2,6,7. לפני הופעת בדיקות ה-mNGS הקליניות, פרויקט דלקת המוח של קליפורניה בחן את הסיבות לדלקת מוח ברחבי המדינה ומצא כי למעלה ממחצית מהמקרים נותרו ללא אבחנה, למרות שימוש במגוון רחב של בדיקות מולקולריות והערכה קלינית מפורטת8. כעת, למעלה מעשרים שנה לאחר מכן, בדיקת mNGS של נוזל מוח-שדרה (CSF) מאומתת קלינית זיהתה נוכחות של אורגניזמים פתוגניים ב-CSF של כמעט 15% מהחולים עם חשד לזיהומים במערכת העצבים המרכזיתבמשך תקופה של שבע שנים. יתרה מזאת, בקרב מטופלים עם אבחנות זיהומיות מאומתות, אחד מכל חמישה אובחן רק באמצעות בדיקת mNGS קלינית זו של CSF, מה שמדגיש את התועלת של גישת הבדיקההזו 7. בנוסף, מחקרים הראו גם את הפוטנציאל לחיזוי הסבירות לזיהומים שונים במערכת העצבים המרכזית בהתבסס על טרנסקריפטום המארח שנוצר על ידי מבחן mNGS 9,10,11.

עם זאת, הנגישות של טכניקה מבטיחה זו מוגבלת בשל אתגרים ייחודיים לטיפול ועיבוד דגימות CSF. בפרט, כמות ה-DNA וה-RNA של CSF לעיתים נמוכה מהכמות המינימלית שנקבעה על ידי ערכות הכנת ספרייה12,13. איכות חומצות הגרעין יכולה להיות גם לא אופטימלית, בהתחשב בכך שדגימות CSF שנאספות למטרות קליניות מאוחסנות לעיתים בטמפרטורות שבהן DNA ו-RNAים יכולים להישאר פעילים14. מאמר זה מתאר פרוטוקול mNGS מבוסס מחקר CSF עבור פלטפורמות ריצוף Illumina, שעבר אופטימיזציה כדי למקסם את הסיכוי ליצירת נתונים שימושיים לזיהוי פתוגנים (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה פותח ונבדק באמצעות דגימות שנאספו כחלק ממחקרים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UCSF.

figure-protocol-1
איור 1: עיבוד ריצוף דגימות מהדור הבא (mNGS) של נוזל מוח-שדרתי (CSF) ותהליך אנליטי לזיהוי פתוגנים. דיאגרמה זו מדגימה את השלבים העיקריים במעבדה רטובה של CSF mNGS ובמסלולי הביואינפורמטיקה של CSF. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

1. שיקולי טיפול בדגימות CSF

הערה: תוצאות mNGS הן מיטביות אם מתבצעת הכנת ספריית CSF בזמן האיסוף, או אם דגימות CSF נשמרות באמצעות הקפאה מיידית בחנקן נוזלי, ולאחר מכן אחסון ארוך טווח בטמפרטורה של -80°C15. חלופה נוספת היא שימוש בתמיסות משמרות כמו מגן DNA/RNA בזמן איסוף הדגימה יכול לאפשר אחסון בטמפרטורת החדר לתקופות ארוכות יותר 16,17. זה עשוי להיות מועדף במצבים שבהם יש חששות לגבי אמינות שרשרת הקירור. בנוסף, הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה מיותרים יכולה גם לסייע בשמירה על שלמות חומצות הגרעין, וייתכן שמומלץ לבצע פר-אליקווט דגימות בזמן האיסוף אם צפויים תהליכי עבודה אנליטיים מרובים עבור דגימות CSF18,19.

2. הפקת חומצה גרעין נוזלית נוזלית

זהירות: יש לבצע את הפעילות בארון ברמת בטיחות ביולוגית מתאים עם כפפות ומעיל מעבדה כדי להפחית את הסיכון להעברת אורגניזמים זיהומיים. חומרים מזיקים אם נבלעים אותם, נשאפים או באים במגע עם העור. להשליך חומרים משומשים כפסולת כימית מסוכנת בהתאם לתקנות המקומיות.

  1. ערכת Quick-DNA/RNA בדרך כלל עובדת היטב עבור דגימות עם שכיח נמוך של חומצות גרעין.
  2. הפשרו את דגימות ה-CSF על קרח, ואז העבירו 100 מיקרוליטר–1 מ״ל מכל דגימה לצינור ובצנטריפוגה של 1.5 מ״ל בטמפרטורה של 16,000 x גרם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. הפיפט בזהירות את הסופרנאנט, והשאירו מאחור את הכדור (שלרוב אינו נראה לעין בלתי) ו-100 מיקרו-ליטר של סופרנאנט.
  4. הוסף 100 מיקרולטר של מגן DNA/RNA ל-100 מיקרו-ליטר הנותרים של סופרנטנט וכדור, וערבב פיפטה היטב.
  5. לאחר מכן, מוסיפים 600 מיקרוליטר של בופר ניתוק DNA/RNA ותערובת פיפטות עד שהתמיסה הופכת הומוגנית.
  6. עקבו אחר שאר פרוטוקול חילוץ ה-DNA/RNA כפי שתואר על ידי היצרן בנספחים משלימים A, עם השינויים החשובים הבאים הספציפיים ל-CSF:
    1. בצע את כל שלבי הצנטריפוגציה למשך דקה אחת במהירות מקסימלית (~21,000 x g) למעט שלב השטיפה הסופי של DNA/RNA, שצריך להימשך 3 דקות במהירות מקסימלית.
    2. מזרקים את הדגימה על ידי הוספת 22 מיקרוליטר (במקום 25 מיקרוליטר) של מים נטולי נוקלאז ישירות למטריצת העמודה, ואז דגרו את הדגימה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הנפח הגבוה יותר בדרך כלל גורם לכמות כוללת גדולה יותר של חומצה גרעין שנפלטת מהעמודה.
    3. לאחר ההסרה, מפעילים פיפטה על ה-flow-through חזרה למטריצת העמודה ובצנטריפוגה למשך דקה במהירות מקסימלית. העבר את הדגימה לצינור אחסון חדש בנפח 1.5 מ"ל, והמשך מיד להכנת הספרייה או אחסן בטמפרטורה של -80°C.

3. הכנת ספריית RNA ל-CSF

זהירות: בצע בארון בטיחות ביולוגית מתאים, עם כפפות ומעיל מעבדה. חומרים מזיקים אם נבלעים אותם, נשאפים או באים במגע עם העור. להשליך חומרים משומשים כפסולת כימית מסוכנת בהתאם לתקנות המקומיות.

הערה: שיקולים חשובים לפני ההתחלה: דלדול rRNA מועדף על פני העשרת פוליאדנילציה לבידוד mRNA, בהתחשב בכך שדלדול ה-rRNA אינו דורש שלבים נוספים של ניקוי חרוזים (שיכולים להפחית את תפוקת ה-mRNA השמיש), וחלק מתמלולי וירוסי RNA נוירואינו-פולשניים חסרים פוליאדנילציה. ERCC (קונסורציום בקרות RNA חיצוניות) ניתן להוסיף RNA Spike-In כאמצעי בקרת איכות, אם כי זה לא הכרחי בהכרח. אם ה-RNA אוחסן בטמפרטורה של מינוס 80°C לאחר החילוץ, יש להפשיר על הקרח לפני ההתחלה.

  1. פרגמנטציה ופריימינג של RNA: פיפטה מערבבת את הדברים הבאים בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR): דגימת RNA של 3.5 מיקרוליטר, 0.5 מיקרוליטר 1:2500 ERCC ספייק-אין מדולל, 4 מיקרוליטר בופר תגובת גדיל ראשון (5x), 1 מיקרוליטר פריימרים אקראיים, ו-1 מיקרוליטר rRNA מדולל 1:100 (טבלת חומרים). בתרמחזור, כוונו את המכסה המחומם ל-105 מעלות צלזיוס ודגרו את הדגימות בטמפרטורה של 75 מעלות ל-2 דקות, 70 מעלות צלזיוס ל-2 דקות, 65 מעלות צלזיוס ל-2 דקות, 60 מעלות צלזיוס ל-2 דקות, 55 מעלות צלזיוס ל-2 דקות, 37 מעלות ל-5 דקות, ו-25 מעלות צלזיוס ל-5 דקות.
  2. סינתזת cDNA של גדיל ראשון: פיפטה מערבבת את ה-RNA המקוטע והפריימייז (10 מיקרוליטר) עם 8 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז ותערובת אנזימי סינתזת גדיל ראשון של 2 מיקרוליטר. בתרמוסייקלר מכוונים את המכסה המחומם ל-105 מעלות צלזיוס ודגרו את הדגימות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 42 מעלות צלזיוס ל-15 דקות, ו-70 מעלות צלזיוס ל-15 דקות.
  3. סינתזת cDNA בגדיל שני: פיפט מערבבת את ה-DNA הסינתטי של הגדילים הראשונים (20 מיקרוליטר) עם בופר תגובה סינתזת גדיל שני של 8 מיקרוליטר, תערובת אנזימים לסינתזה של גדיל שני של 4 מיקרולטר, ו-48 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. בתרמוסייקלר יש לדגור את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס, כאשר המכסה המחומם כבוי.
  4. בצע טיהור חרוזים מגנטיים (נספחים משלימים B) באמצעות יחס של 1.8x של חרוזי SPRI מגנטיים (144 מיקרוליטר). שחרור למים נטולי נוקלאז של 53 מיקרולטר והעבר 50 מיקרוליטר מהסופרנטנט הסופי (המכיל cDNA כפול גדילים מטוהרת) לצינור PCR נקי ללא נוקלאז. בשלב זה, ניתן להקפיא את הדגימות בבטחה בטמפרטורה של -20°C במהלך הלילה במידת הצורך.
  5. הכנת סוף ספריית cDNA: אם הדגימה נשמרה בטמפרטורה של מינוס 20°C במהלך הלילה, יש להפשיר על קרח לפני ההפעלה מחדש. פיפטה מערבבים את ה-ds-cDNA המטוהר (50 מיקרוליטר) עם 7 מיקרוליטר של בופר תגובה בקצה ו-3 מיקרוליטר של תערובת אנזימים להכנת קצה.
  6. בתרמחזור, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ו-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כאשר המכסה המחומם כבוי.
  7. קשירת מתאם (ביצוע שלב זה על הקרח): צור דילול של מתאם ביחס של 1:100 במים ללא נוקלאז. פיפט את תערובת התגובה להכנת קצה (60 מיקרוליטר) לצינור המכיל תערובת ראשית של 30 מיקרו-ליטר ליגציה, משפר ליגציה 1 מיקרוליטר, ומתאם מדולל של 2.5 מיקרוליטר 1:100. ודא שהמתאם מתווסף בנפרד (למשל, לא מעורבב מראש עם תערובת הליגציה הראשית או משפר הליגציה) כדי למנוע היווצרות דימר במתאם.
  8. בתרמחזור, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, כאשר המכסה המחומם כבוי.
  9. המשך מיד לטיהור חרוזים מגנטיים (נספח משלים 2) באמצעות יחס 0.9x של חרוזי SPRI מגנטיים (87 מיקרוליטר).
  10. השפך למים ללא נוקלאז בנפח 17 מיקרוליטר, והעבר 15 מיקרוליטר מהסופרנטנט הסופי לצינור PCR נקי ללא נוקלאז
  11. ברקידוד PCR: פיפט את ה-cDNA המטוהר, הקשור למתאם (15 מיקרוליטר) לצינור עם אנזים USER של 3 מיקרוליטר, 25 מיקרוליטר Q5 Master Mix, ו-10 מיקרוליטר פריימרים ייחודיים עם ברקוד. בתרמחזור, כוונו את המכסה המחומם ל-105 מעלות צלזיוס, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואז מבצעים 19 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-65 מעלות צלזיוס למשך 75 שניות. סיימו את ה-PCR על ידי דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. לבצע טיהור סופי של חרוזים מגנטיים באמצעות יחס של 0.8x של חרוזים מגנטיים (43 מיקרוליטר). שחרור למים נטולי נוקלאז של 23 מיקרוליטר, ולאחר שלב הפרדת החרוזים הסופי, העבר 20 מיקרוליטר לצינור PCR נקי ללא נוקלאז. בשלב זה, ניתן להקפיא את הדגימות בבטחה בטמפרטורה של -20°C במהלך הלילה במידת הצורך.

4. הכנת ספריית DNA ל-CSF

אזהרה: יש לבצע בארון ברמת בטיחות ביולוגית מתאים עם כפפות ומעיל מעבדה. חומרים מזיקים אם נבלעים אותם, נשאפים או באים במגע עם העור. להשליך חומרים משומשים כפסולת כימית מסוכנת בהתאם לתקנות המקומיות.

  1. אם ה-DNA שהופק נשמר בטמפרטורה של מינוס 20°C במהלך הלילה, יש להפשיר על קרח לפני ההפעלה מחדש.
  2. פיצול DNA והכנת קצה: ערבבו היטב את בופר תגובת הגדיל הראשון על ידי מערבוב וערבוב פיפטה לתמיסה כדי להחזיר את המשקעים. תערובת פיפטה 3.5 מיקרוליטר של DNA שהופק, 22.5 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז, 7 מיקרוליטר בופר תגובה לגדיל ראשון, ותערובת אנזימים של 2 מיקרוליטר עם גדיל ראשון.
  3. בתרמוסייקל, כוונו את המכסה המחומם ל-105 מעלות צלזיוס ודגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז בטמפרטורה של 65 מעלות למשך 30 דקות.
  4. תהליך ה-PCR של קישור המתאם וברקודינג זהה לספריות ה-DNA וה-RNA. חזרו על סעיפים 7–10 של "הכנת ספריית ה-RNA של CSF" עם ה-DNA המקוטע וההוכן בקצה כדי להשלים את הכנת ספריית ה-DNA.

5. בקרת איכות ואיגוד ספריות

  1. כימות את ריכוז ספריות הדגימות באמצעות ערכת כימות ה-DNA והפלואורומטר המתאים. בקרות מים אמורות להיות בעלות ריכוזים נמוכים משמעותית (או לא ניתנים למדידה) בהשוואה לשאר הדגימות.
  2. הערכו את גודל ספריית הדגימות על ידי הרצת הדגימות על מכונת אלקטרופורזה קפילרית אוטומטית.
  3. לחילופין, אם אין מכונת אלקטרופורזה קפילרית אוטומטית, יש להגביר עוד 1-2 מיקרוליטר מהדגימה על ידי ביצוע תגובת PCR עם פריימרים אוניברסליים של Illumina, ואז לבצע אלקטרופורזה של 10 מיקרוליטר של המוצר הסופי על ג'ל אגרוז 2%. להשליך חומרים משומשים כפסולת כימית מסוכנת בהתאם לתקנות המקומיות.
    הערה: אורך הספרייה האופטימלי הוא כ-400–500 זוגות בסיסים, ולכן יש להתאים את דגימות הפיצול העתידיות אם גודל הספרייה גדול או קצר מהרצוי. בנוסף, חשוב להעריך את נוכחותם של דימרים מתאמים, שאורכם כ-150 זוגות בסיסים ומתרחשים כאשר שתי מולקולות מתאימות מתחברות בטעות ללא רצף החדרה. גם אם הם קיימים בכמויות נמוכות, דימרים מתאמים נוטים להתקבץ ולרצף ביעילות על תא הזרימה, מה שמפחית את שיעור הקריאות השימושיות במהלך ריצת ריצוף. לכן, אם קיימים דימרים מתאמים, יש לבצע טיהור נוסף של חרוזים מגנטיים עם יחס של 0.8x של חרוזי SPRI מגנטיים. (ראוי לציין שאם >10% מהדגימה היא דימר מתאם, ייתכן שיידרש 2-3 סבבים של טיהור חרוזים מגנטיים כדי להסיר את רוב דימרים של המתאם).
  4. כדי להבטיח עומק ריצוף דומה בין דגימות באותו ריצוף, יש צורך לאגד כמויות אקווילריות של כל דגימה. אם גודל הספריות דומה לכל הדגימות, פשוט אסוף מסות שוות ערך של כל ספריית RNA וחזר על הפעולה בנפרד עבור כל ספריית DNA.

6. שיקולי רצף

  1. הדגימות המאגדות מוכנות כעת לריצוף במכשירי ריצוף Illumina. אם מבצע רצף פנימי (ולא דרך מתקן ליבת ריצוף מיוחד), יש לפרק ולדולל בקפידה את הספריות המאוחדות בהתאם להוראות התקן הרצף לפני טעינת המאגר על מחסנית הריגונציה (הריכוז הטיפוסי הוא 4 ננומטר ברוב פלטפורמות הריצוף של Illumina).
  2. חשב את עומק הריצוף המשוער על ידי חלוקת תפוקת הנתונים הצפויה עבור תא זרימת Illumina במספר הדגימות המולטי-פלקסיות בריצה.
    הערה: קביעת עומק הריצוף הרצוי תלויה במספר גורמים, כולל עלות, מכשיר הריצוף בו נעשה שימוש ומטרות הניסוי. שני דוגמאות לעומקי ריצוף שונים מוצגים להלן בסעיף תוצאות מייצגות.

7. ניתוח נתונים לזיהוי פתוגנים

  1. השתמש בפלטפורמת הקוד הפתוח מבוססת האינטרנט Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) לביצוע ניתוח מטהגנומי לזיהוי פתוגנים. CZID כולל גם אפשרויות להעלאת דגימות דרך ממשק שורת הפקודה ולהעברה ישירה מחשבון Illumina BaseSpace ל-CZID. סקירה מפורטת של ניתוח נתוני mNGS של CZID זמינה באתר https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. התחבר ל-CZID, לחץ על "העלה", בחר "מטגנומיקה" לסוג הניתוח, ובחר את קבצי הקלט מהרצף הרצף. הזן את המידע הנדרש לכל דגימה, כולל שם המדגם, סוג הדגימה (CSF) ונוקלאוטיד (RNA או DNA).
    הערה: הקבצים המועלים עוברים עיבוד אוטומטי דרך צינור CZID, הכולל מספר כלים חישוביים כגון STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq ו-GSNAP, בין היתר, כדי להסיר קריאות באיכות נמוכה ורצפי קריאה אנושיים. הצינור מיישר ומרכיב את הרצפים המסוננים באמצעות מסדי הנתונים של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) של נוקלאוטידים (NT) וחלבונים (NR) באמצעות תוכנות Minimap2 ו-DIAMOND, בהתאמה. הפלט הסופי של CZID כולל ספירות טקסונים NT/NR וספירות קונטיג (מקטעים רציפים וחופפים שנוצרים במהלך ההרכבה) עבור כל דגימה.
  3. לאחר העיבוד, לחץ על תיקיית הפרויקט המכילה את הדוגמאות ועבור ללוח הבקרה הסיכומים.
  4. גלול למטה כדי לבדוק את מספר הקריאות לכל דגימה (והשווה למספר הקריאות הצפוי בהתבסס על תא זרימת Illumina ומספר הדגימות המולטיפלקס בהריצה), אחוז הקריאות שעברו סינון בקרת איכות, ויחס הדחיסה הכפול כדי להעריך האם יש הגברת יתר מוטה ב-PCR.
  5. נוכחות זיהום על ידי שברי חומצות גרעין סביבתיות - בין אם נרכשו במהלך תהליך איסוף דגימות CSF, או במהלך חילוץ/הכנת ספרייה - היא תופעה נפוצה20. כדי לקבוע האם קריאות חיידקיות, פטריות וטפיליות הן חיוביות אמיתיות, ניתן לשקול שיטות פוטנציאליות המשתמשות בספירות הקריאה המנורמליות (קריאות למיליון, או rPM):
    1. צור מודל רקע (למשל, באמצעות דגימות מים שנלקחו, הוכנו ורצפו) ישירות בתוך CZID כדי לסנן טקסונים עם rPMs שהם דומים או פחות בשפע ביחס למודל הרקע (ולכן סביר שייצגו זיהום). בתוך תיקיית הפרויקט, בדוק כל דגימות בקרת מים ואז לחץ על "מודל רקע" כדי ליצור. בעת ניתוח כל דגימה, בחר את מודל הרקע ולחץ על "מסנני סף" כדי להחיל "ציון NTZ" > 1 (או יותר) כדי לסנן מזהמים פוטנציאליים.
    2. השתמש בספי rpm מוגדרים מראש, כמומדגם rpM > 10* (בקרות rpm ממוצעות), או log10 (דגימת rPM) לפחות 1 log גדול יותר מ-log 10 (ממוצעrpm כל קבוצה). ראשית, הורידו את ה-rpm הספציפי לטקסון לכל דגימה על ידי בדיקת כל דגימה בדף הפרויקט, לחיצה על הורדה ובחירה ב"תוצאות טקסונים משולבות." קובץ .csv המתקבל ניתן לניתוח באמצעות תוכנות סטטיסטיות כמו R או Stata לפי הצורך.
      הערה: בהתחשב בשפע הנמוך היחסי של פתוגנים ויראליים, כל וירוס עם פוטנציאל נוירופולשני ידוע ולפחות קריאה אחת המתיישרת לגנום הוויראלי צריך להיחשב כתוצאה חיובית (ורצוי, לאישור באמצעות mNGS חוזר או בדיקות קליניות ספציפיות לפתוגן). בנוסף, צינור האנליטיקה דורש שכל קריאה בקובץ fastq תהיה מיושרת חישובית לגנום הייחוס הסביר ביותר במסד הנתונים של NCBI. כתוצאה מכך, חלק מהקריאות עשויות להיות יחסית לא ספציפיות לפתוגן מסוים, וייתכן שתיאורטית היו מיושרות למגוון רחב של אורגניזמים במקום לטקסון הספציפי שהוקצה ב-CZID. בהינתן סיכון זה, יש לבצע אישור ידני של קריאות חיוביות על ידי אישור היישור באמצעות כלי NCBI BLAST מבוסס האינטרנט (הקריאות הספציפיות לטקסון יכולות להישלח ישירות מ-CZID ל-NCBI BLAST על ידי לחיצה על סמל הפיצוץ ליד הטקסון הרלוונטי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בקרת איכות ספרייה
לאחר חילוץ DNA/RNA, הריכוז הנמדד של ה-DNA המופק הוא בדרך כלל 1–10 ng/μL. עם זאת, ריכוז ה-RNA המופק הוא לעיתים קרובות בסדר גודל של pg/μL, ולכן לעיתים קרובות אינו ניתן לזיהוי על ידי ספקטרופוטומטרים. לאחר הכנת הספרייה, ספריות ה-cDNA וה-DNA המטוהרות והמוגברות בדרך כלל בריכוז של 0.5–10 ng/μL ו-10–30 ng/μL, בהתאמה. נתוני האלקטרופורזה והאלקטרופרוגרמה בקפילרי באיור 2A מראים ספריית דגימות cDNA שהיא מפותחת יתר ומכילה דימרים מתאימי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם שיקולים חשובים שעשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול זה, בהתאם לעומק הרצף הרצוי, לפלטפורמת הריצוף שבה נעשה שימוש וזמינות הציוד לבקרת איכות. עם זאת, שתי הקבוצות המייצגות המוצגות כאן מראות כי ניתן לזהות פתוגן איתן במגוון רחב של תנאים ניסיוניים. באופן ספציפי, קבוצה ב' הראתה כי למרות מספר צעדים לחיסכון בעלויות – ריצוף בעומק רדוד, הוצאת בקרות ERCC, מזעור הפרוטוקול, ושימוש באלקטרופורזה ג'ל מסורתית לבקרת איכות (במקום ביואנלייזר או TapeStation) – עדיין זוהו מגוון רחב של פתוגנים נוירו-פולשניים בדג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

M.R.W. מקבל מימון מענקי מחקר לא קשורים מרוש/ג'ננטק, נוברטיס וקייברנה תריפיוטיקס, והוא מייסד וחבר דירקטוריון ב-Delve Bio Inc. הוא סיפק שירותי ייעוץ לפייזר, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines ו-Indapta Therapeutics.

תודות

מחקר זה נתמך במימון ממרכז פוגרטי הבינלאומי של המכון הלאומי לבריאות במסגרת פרס מספר D43TW009343. ברצוננו להודות לרבים מהחוקרים במעבדת וילסון, UCSF ו-CZI שתרמו לפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקולי mNGS ליישומי מחקר מגוונים בשנים האחרונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רצועת צינור PCR בנפח 0.2 מ"לאפנדורף30124359
צינורות לובינד DNA בנפח 1.5 מ"לאפנדורף30108051
צינורות מנעול בטוח בנפח 1.5 מ"לאפנדורף30120191
תערובת ספייק-אין של ERCC RNAתרמו פישר4456740
תגובות D1000 ברגישות גבוההאג'ילנט5067-5585
מיקס מאסטר להגברת ספריית Invitrogen Collibriתרמו פישרA38539050
מאסטרסייקלר x50תרמו פישר6311000010
אוליגוס מולטיפלקס NEBNext עבור Illuminaניו אינגלנד ביולאבס7335S/L
ערכת הכנה לספריית DNA של NEBNext Ultra IIניו אינגלנד ביולאבסE7645
ערכת הכנה לספריית ה-RNA של NEBNext Ultra II עבור Illuminaניו אינגלנד ביולאבסE7770
NextSeq 500/550 ערכת תפוקה גבוהה v2.5 (150 מחזורים)אילומינה20024907
NextSeq 550אילומינהלא זמין
ערכת QIAseq FastSelect -rRNA HMRקיאגן334386
ערכת בדיקה רגישות גבוהה של קיוביט 1X dsDNAקיוביטQ33230
פלואורומטר קיוביט 4תרמו פישרלא זמין
ערכת Quick-DNA/RNA Microprep Plus  זימוD7005
טייפסטיישן 4150אג'ילנטG2992AA

מקורות

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  2. Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
  3. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: the next culture-independent game changer. Front. Microbiol. 8, (2017).
  4. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  5. DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data (2026).
  6. Wilson, M. R., et al. Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing. JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).
  7. Benoit, P., et al. Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections. Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).
  8. Glaser, C. A., et al. In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000. Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).
  9. Ramachandran, P. S., et al. Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 13, 1675(2022).
  10. Xing, Z., et al. Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis. J Transl Med. 22, 583(2024).
  11. Omura, C., et al. 298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections. Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).
  12. Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).
  13. Olausson, J., et al. Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics. Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).
  14. Becskei, A., Rahaman, S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).
  15. Wang, C., Liu, H. Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR. Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).
  16. Cb, T., et al. DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples. Frontiers in microbiology. 13, (2022).
  17. Kazantseva, J., et al. Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies. BMC microbiology. 21 (1), (2021).
  18. Xiaoli, J., et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).
  19. Kellman, B. P., et al. Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing. BMC genomics. 22 (1), (2021).
  20. Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments. Microbiome. 7 (1), 62(2019).
  21. Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation. PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).
  22. Sakiyama, Y., et al. Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis. Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).
  23. Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing. Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).
  24. Sun, J., et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules. Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).
  25. Tan, J. K., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery. Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).
  26. Prasanna, A. kshatha Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).
  27. Marra, P. S., et al. Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).
  28. Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination. Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).
  29. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  30. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ריצוף מטגנומי מהדור הבא של נוזל מוח-שדרה לזיהוי פתוגנים במערכת העצבים המרכזית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.