פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ חומצה-ממס דו-פאזית לבידוד חומצות שומן קצרות שרשרת מדגימות צואה עכבריות בעלות קלט נמוך ללא גזירה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפקת חומצות שומן קצרות שרשרת מצואת עכברים באמצעות שיטת חומצה-ממס דו-פאזית
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) מדגימות צואה של עכבר בעלות קלט נמוך באמצעות אסטרטגיית חילוץ דו-פאזית של חומצה-ממס. השיטה מיועדת לקלטים בודדים של כ-20–50 מ"ג ומשתמשת בחומצה כלורית מדוללת ובאצטט אתיל כדי לאפשר הפרדת פאזה ללא גזירה. הפרוטוקול כולל הומוגניזציה של צואה, החמצה, חלוקת ממס אורגני וצנטריפוגה בטמפרטורות נמוכות, וניתן לבצע אותו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי הזמין בדרך כלל במעבדות מחקר. לאחר החילוץ, SCFAs מתאימים לניתוח במורד הזרם באמצעות פלטפורמות מבוססות כרומטוגרפיית גז שגרתית. ביצוע מוצלח של הפרוטוקול מתבטא בזיהוי שיאי SCFA ברורים בזמנים אופייניים מעל רעש רקע, כפי שמודגם עבור SCFAs עיקריים בצואה כולל אצטט, פרופיונאט ובוטיראט מדגימות עכברים בודדות. פרוטוקול זה מתמודד עם אתגר פרוצדורלי נפוץ במחקרים על בעלי חיים קטנים על ידי מתן זרימת עבודה סטנדרטית להפקת SCFA בצואה מחומר דגימה מוגבלת, תוך שמירה על תאימות לתהליכי עבודה אנליטיים שגרתיים.
מבוא
פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר הפקת חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs) מדגימות צואה של עכבר בעלות קלט נמוך, בפורמט התואם לניתוח מבוסס כרומטוגרפיית גז שגרתית (GC). SCFAs הן חומצות שומן אורגניות נדיפות עם פחות משישה אטומי פחמן, בעיקר חומצה אצטית, חומצה פרופיונית וחומצה בוטירית, המיוצרים על ידי מיקרוביום המעי באמצעות תסיסה של סיבים תזונתיים בלתי עכלים1. כימת מטבוליטים אלו מעכברים בודדים נדרשת לעיתים קרובות במחקרים על בעלי חיים קטנים שבהם חומר הצואה מוגבל, והדגימות מקושרות לפנוטיפים התנהגותיים, מטבוליים או פיזיולוגיים 2,3,4,5,6. לכן, יש צורך בתהליך חילוץ מעשי עם קלט נמוך כדי לתמוך בעיצובים ניסיוניים התלויים במדידות SCFA לכל בעל חיים.
הגישות הקיימות לניתוח SCFA בצואה מציגות מספר מגבלות מתודולוגיות. כימות SCFAs בדגימות צואה נותר מאתגר אנליטית בשל התנודתיות, השפע הנמוך והמורכבות של מטריצות ביולוגיות7. תהליכי עבודה סטנדרטיים דורשים לעיתים שלבי גזירה, נפחי דגימות גדולים וציוד מיוחד כגון טיפול נוזלי אוטומטי, פלטפורמות הומוגניזציה מיוחדות, או עמודות חילוץ בפאזה מוצקה 8,9,10,11. דרישות אלו עלולות להגביל נגישות ויכולת הרחבה, במיוחד במחקרי עכברים שבהם תפוקת הצואה לכל בעל חיים מינימלית ודגימה אורכית או גנוטיפית נפוצה 12,13,14. כתוצאה מכך, נותר פער מתודולוגי בפרוטוקולים המאפשרים חילוץ SCFA מכניסות צואה קטנות ללא גזירה תוך שמירה על התאמה לתהליכי עבודה סטנדרטיים של כרומטוגרפיית גז.
הפרוטוקול המתואר כאן מתמודד עם פער זה באמצעות אסטרטגיית חילוץ חומצה-ממס דו-פאזית באמצעות חומצה כלורית מדוללת ואתיל-אצטט. תהליך העבודה כולל הומוגניזציה של צואה, חמצה, חלוקת ממס אורגני וצנטריפוגציה בטמפרטורות נמוכות, ומיועד לפעול עם מסות קטנות של צואה. בניגוד לתהליכי עבודה מבוססי גזירה שדורשים שלבי שינוי כימיים נוספים או פלטפורמות הכנת דגימות מיוחדות, פרוטוקול זה מאפשר חילוץ ישיר של SCFAs בפורמט התואם לניתוח שגרתי מבוסס GC באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי2.
שיטה זו מיועדת למחקרים הדורשים חילוץ SCFA מכמויות מוגבלות של חומר צואה של עכברים, במיוחד כאשר נדרשות מדידות ברמה בודדת או כאשר זמינות הדגימה מגבילה את תכנון הניסוי. הוא מתאים לניתוח מבוסס GC של SCFAs נפוצים (C2–C6) בדגימות צואה, אך אינו מיועד ליישומים הדורשים גילוי תלוי נגזרות, כימות אולטרה-עקב מעבר לרגישות GC, או הערכת ריכוזי SCFA מערכתיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הוועדה הקבועה לבעלי חיים בבית הספר Mass General Brigham (MGB), בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב, אישרה את פרוטוקול בעלי החיים הקודם, שנועד למזער את מספר בעלי החיים בשימוש. פרוטוקול זה עומד בהנחיות ותקנות המכון הלאומי לבריאות. כתב יד זה נוצר לפי הנחיות ARRIVE. דיאגרמת הפרוטוקול מוצגת באיור 1, והחומרים הנדרשים מפורטים בטבלת החומרים.
איור 1: דיאגרמת הפרוטוקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור.
1. איסוף והכנת דגימות צואה
- אסוף דגימות צואה טריות (~30 מ"ג) בצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים בנפח 1.5 מ"ל. רשמו את מסת הכניסה המדויקת של הצואה לכל דגימה כדי לאפשר נרמול מדויק של ריכוזי SCFA.
הערה: ודא שהאיסוף כולל בקבוקונים, כפפות ופינצטה נקיים לכל דגימה. כל כלי הזכוכית והכלים חייבים להיות מאוטוקליבים לפני השימוש. פרוטוקול זה אומת למסות כניסה של כ-20–50 מ"ג לדגימה, כאשר ~30 מ"ג משמש כקלט מייצג. נפחי החילוץ נשמרים קבועים בטווח זה. - מקם ותתייג את מספר בקבוקי הצנטריפוגות הנדרש בהתאם לדגימות.
- הכינו חומצה כלורית מדוללת (0.5 מ'; pH 1–2) על ידי הוספת HCl מרוכז באיטיות (12 מ', דרגת ACS) למים אולטרה-טהורים.
אזהרה: HCl הוא קורוזיבי; הוא עלול לגרום לכוויות חמורות בעור, בעיניים ובדרכי הנשימה. מסוכן לשאיפה. - הפשרו דגימות בטמפרטורת החדר למשך 30–45 דקות, או עד להפשרה מלאה.
2. הומוגניזציה וחמצה של הדגימה
- הוסף 255 מיקרוליטר מתמיסת 0.5 M HCl לכל בקבוק צנטריפוגה.
- קח בקבוקון חדש ומלא אותו ב-70% אתנול לשימוש לניקוי פינצטה. נקה את המלקחיים על ידי טבילה באתנול ואז ייבוש על מגבת נייר נקייה.
אזהרה: אתנול דליק ועלול לגרות את העור והעיניים; שאיפת אדים עלולה לגרום לסחרחורת. - הכינו אמבט אתנול לעלי על ידי הכנסת העלים למיכל ומילוי המיכל ב-70% אתנול עד שכל העלים טובלים לחלוטין.
- שלף את הדגימה הנכונה מתיבת הדגימה. הסר את המכסה מהבקבוקון והסר דגימה אחת (~30 מ"ג) של צואה.
- הניחו את דגימות הצואה בבקבוקי הצנטריפוגה המתאימים.
- לאחר שכל הדגימות מונחות לבקבוקי הצנטריפוגה הנכונים, הסר עלי מאמבט האתנול. ייבשו את העלי עם מגבת נייר נקייה.
הערה: השתמש בעלי חדש לכל דגימה. - השתמשו בעלי העלים כדי לרסק ולהמיס כראוי את דגימות הצואה, ראו איור 2. לטחון את דגימת הצואה עד שמתקבל השעיה הומוגנית ויזואלית, ללא שברים מוצקים נראים לעין.
איור 2: טחינת דגימות צואה באמצעות עלי. צואה שנאספה טרייה נטחנת כדי להשיג עקביות אחידה לניתוח SCFA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.
- הנח את העלי המשומשים בקופסה ריקה לכביסה מאוחר יותר.
- מערבל את הדגימות באמצעות מערבל מערבולת מסוג פולס במהירות מקסימלית למשך 10 שניות, עם צינורות סגורים היטב.
הערה: ודאו שבקבוקי הצנטריפוגה מכוסים היטב כדי למנוע שפיכת התערובת.
3. חילוץ SCFA והפרדת פאזה
- צנטריפוגה את הדגימות בעוצמה של 16,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כדי להבטיח איזון תקין של הצנטריפוגה.
- לאחר הפעלת הצנטריפוגה, יש לסמן את בקבוקי הצנטריפוגה החדשים התואמים לדגימות. הסר את הדגימות מהצנטריפוגה לאחר סיום הצנטריפוגה.
- כוון את הפיפטה בנפח 200 מיקרוליטר ל-120 מיקרוליטר. אסוף בזהירות 120 מיקרוליטר מהסופרנטנט המימי לאחר הצנטריפוגה, תוך הימנעות מהפרעה לכדור. העבר את הסופרנטנט לבקבוקי הצנטריפוגה החדשים והשליכו את הכדור.
- הוסיפו כמות שווה (120 מיקרוליטר) של אצטט אתיל לתוך הבקבוקונים החדשים עם הנוזל הסופרנטנטי. חזור על זה לכל הדגימות.
אזהרה: אתיל אצטט דליק ועלול לגרות את העור, העיניים ומערכת הנשימה. הימנעו משאיפת אדים ומגע ממושך. - תביא את הדגימות שוב לצנטריפוגה. ודא שהצנטריפוגה מאוזנת כראוי ומכסה הרוטור מאובטח. סובב ב-2,374 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- לאחר הצנטריפוגה, יש לאסוף בזהירות 120 מיקרוליטר מהפאזה האורגנית העליונה מבלי להפריע לפאזה המימית התחתונה. העבר את הסופרנטנט המכיל SCFA שהופק לבקבוקי צנטריפוגה חדשים מסומנים.
הערה: הנפח שנאסף עשוי להיות קטן מ-120 מיקרוליטר. אם קיימת אמולסיה בממשק, יש להאריך את הצנטריפוגה או לקרר את הדגימות על הקרח עד להשגת הפרדה ברורה. דגימות ריקות פרוצדורליות המעובדות במקביל ללא חומר צואה עשויות להיכלל כשלב בקרת איכות אופציונלי להערכת רמות הרקע של SCFAs שהוכנסו על ידי תגובות או טיפול. - בדקו את הבקבוקים הקודמים כדי לוודא שהשכבה התחתונה לא נמשכה בטעות.
הערה: שלבים הכוללים הוספת חומצה וטיפול בממס אורגני צריכים להתבצע במהירות, עם שמירה על הצינורות סגורים ככל האפשר, כדי למזער אובדן אידוי או התנדפות.
4. טיפול ואחסון של חילוץ
- אתר ותייג נכון תיבת חילוץ, ואז הנח את הדגימות שחולקו בתוכה.
הערה: ניתן להשהות דגימות בבטחה לאחר איסוף פאזה אורגנית על ידי אחסון התמציות בטמפרטורה של −20°C עד 24 שעות בצינורות סגורים בכיסוי הדוק, ואז להעביר אותן ל-−80°C לאחסון ארוך טווח. - הכניסו את הקופסה למקפיא בטמפרטורה של -80°C כדי להמתין לניתוח SCFA.
הערה: מכיוון שגם אתיל אצטט וגם SCFA הם נדיפים מאוד, יש לנתח דגימות שהופקו במהירות לאחר אחסון בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. אחסון ממושך לטווח ארוך עלול לפגוע בשלמות הדגימה.
5. ניתוח כרומטוגרפיית גז
- ניתחו את ה-SCFAs שהופקו על ידי GC באמצעות עמוד נימי מזויך-סיליקה עם פאזה נייחת של חומצות שומן חופשיות בקצבי זרימה של 30, 300 ו-20 מ"ל לדקה עבור מימן, אוויר וחנקן, בהתאמה. הזריק 1 מיקרו-ליטר אליקוט מהתמצית האורגנית לניתוח.
- ליישומים כמותיים, יש לשלב תקנים פנימיים ונהלי כיול (למשל, חומצה 2-אתילבוטירית) כפי שתואר קודם2.
הערה: הגדרות מפורטות ספציפיות לכלי ניתנות בשיטות14 המוזכרות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול הנ״ל הניב אליקווטים של SCFA שהופקו בעומק של 120 מיקרוליטר, התואמים למספר דגימות הצואה מהן הן נגזרו. ביצוע מוצלח של פרוטוקול החילוץ מתבטא בנוכחות שיאים ברורים של SCFA בזמנים אופייניים של שמירה עם עוצמת אות מעל רעש רקע. כאשר מתבצע כפי שתיאר, הפרוטוקול מספק פרופילי SCFA בצואה המתאימים להשוואה כמותית במורד הזרם בין מדגמים. כמתנו שמונה SCFAs: חומצה אצטית, חומצה פרופיונית, חומצה בוטירית, חומצה איזובוטירית, חומצה ולריקית, חומצה איזווולרית, חומצה הקסאנואית, וחומצה 2-אתילבוטירית (תקן פנ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים שמבטיחים חילוץ יעיל וניתן לשחזור של SCFAs מדגימות צואה בעכברים בנפח קטן. הפרוטוקול עושה שימוש במערכת הפקת חומצה-ממס דו-פאזית באמצעות נפחים מוגדרים של חומצה כלורית מדוללת ואצטט אתיל, המותאם לתכונות הפיזיקוכימיות של SCFAs כחומצות אורגניות חלשות במשקל מולקולרי נמוך. החמצה מעבירה את SCFAs לצורתם הפרוטונאית, מפחיתה אינטראקציות יוניות עם מטריצת הצואה ומקלה על חלוקתם במהלך הפרדת הפאזה הבאה. משולבים צנטריפוגציה בטמפרטורות נמוכות ווורטקס סטנדרטי לקידום הפרדת פא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
תודות
אנו מודים בתודה על התמיכה המימנית למחקר זה שניתנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות R21AG065606 R21AG08176 לייינג ג'אנג, וכן על התמיכה מקרן משפחת בורטן ומתנת משפחת טאנג לייינג ג'אנג.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, stock solution); diluted to 0.5 M for use |
| 1000 μL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, 70% solution |
| 200 μL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Tweezers | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
מקורות
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
