מאמר שיטה

פרוטוקול ללימוד ויסות הונוקיול של איתות בטא 1/SMAD בשינוי גורם גדילה במודלים של פוטו-אייג'ינג עור המושר על ידי אולטרה סגול A

DOI:

10.3791/70099

⸱

8 במאי 2026

 ,  ,  , 
1Plastic Surgery Center, the 988th Hospital of Joint Logistic Support Force of Chinese People's Liberation Army

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בודק האם הונוקיול משפר את ההזדקנות הפוטוגרפית הנגרמת על ידי UVA בפיברובלסטים דרמליים אנושיים ובעור העכבר על ידי הפעלת מסלול TGF-β1/Smad והפחתת ביטוי MMP.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הונוקיול (HNK), רכיב מרכזי שמקורו במגנוליה אופיצינליס, בעל פוטנציאל לטפל במחלות עור. נכון לעכשיו, ההשפעה ומנגנון הפעולה של HNK על נזק אורי שנגרם על ידי UVA (UVA) בעור אינם ברורים. מודל נזקי הזדקנות של תאי HDF ועור עכבר ללא שיער נבנה באמצעות השראה של UVA. השפעת HNK על הקיימות של תאי HDF תקינים ותאי HDF שנגרמו על ידי UVA נבדקה באמצעות מבחן קיום התאים. רמות SOD, GSH, CAT ו-MDA בתאי HDF נמדדו באמצעות ערכות שונות, ורמות ROS נמדדו באמצעות DCFH-DA ודיהידרואתידיום. צביעת SA-β-גלקטוזידאז ו-TUNEL זיהו הזדקנות ואפופטוזיס בתאי HDF, וציטומטריית זרימה העריכה את התקדמות מחזור התא. נזק היסטופתולוגי לעור הוערך באמצעות צביעה פתולוגית. בנוסף, נעשה שימוש באימונופלואורסצנציה וווסטרן בלוט להערכת רמות החלבונים הקשורים למסלול Ki67, קולגן, מטריקס מטלופרוטינאאז (MMP) ו-TGF-β1/Smad. טיפול ב-HNK (2.5-10 מיקרומון) לא השפיע לרעה על חיוניות תאי HDF תקינה, אך הפחית את הנזק לתאי HDF שנגרמו על ידי UVA, והפחית לחץ חמצוני ואפופטוזיס. הזדקנות של תאי HDF גרמה ל-UVA, גרמה לעצירה בפאזה S, להוריד את ויסות Ki67, להפחית את תכולת הקולגן והגביר את ביטוי MMP, בעוד ש-HNK הפחית ביעילות את החריגות שנגרמו על ידי UVA. בנוסף, UVA גרמה לקמטים עמוקים יותר, ירידה בתכולת המים ובקולגן, והגברת עובי האפיתל בעור העכבר, בעוד שהזרקה תת-עורית של HNK הפחיתה נזק פתולוגי לרקמת העור והגבירה את תכולת המים והקולגן. יתרה מזאת, HNK הפעיל את מסלול TGF-β1/Smad, ומעכב TGF-β1 SB431542 פגע באפקט ההגנה של HNK מפני נזקי הזדקנות פוטוגרפית בתאי HDF. לסיכום, ל-HNK יש פוטנציאל להיות תרופה לשיפור נזקי הזדקנות פוטוגרפית על ידי הפחתת ביטוי MMP באמצעות הפעלת מסלול TGF-β1/Smad, ובכך מעכב הזדקנות פוטוגרפית הנגרמת על ידי UVA בתאי HDF ועור עכברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך הזדקנות העור הוא מורכב ומחולק לשתי צורות עיקריות: הזדקנות טבעית והזדקנות באור1. מחקרים מראים שכ-80% עד 90% מההזדקנות של העור נגרמת על ידי גורמים חיצוניים בסביבה (למשל, קרני אולטרה סגול, זיהום אוויר), כאשר הזדקנות ארוכת טווח הנגרמת מקרינת אולטרה סגול גורמת להשפעות החמורות ביותר 2,3. קרינה אולטרה-סגולה מחולקת ל-UVC, UVB ו-UVA. מכיוון ש-UVC אינו יכול לחדור את שכבת האוזון, המחקר הנוכחי על פוט-אייג'ינג מתמקד ב-UVA (320-400 ננומטר) ו-UVB (280-320 ננומטר)4,5,6. בהשוואה ל-UVB, ל-UVA יש פחות אנרגיה, אבל הוא חודר יותר, עובר דרך האפידרמיס ומגיע עמוק לתוך הדרמיס, שזה גורם חשוב להזדקנות העור7. מחקרים קודמים הראו כי הנזק שנגרם על ידי הקרנת UVB של 57 mJ/cm2 ו-20 J/cm2 UVA לתאי HaCat הוא דומהל-8. הזדקנות פוטו-של העור גורמת לשינויים בתפקוד ובמבנה העור, המתבטאים במיוחד בשקיעת רקמת פני העור, העמקת הקמטים, אובדן קולגן והופעת צבע עור אפור הנראה לעין בלתי; במקרים חמורים, מגוון נגעים וגידולים שפירים, טרום-סרטניים יכולים להופיע 9,10. יחד עם העלייה במחקר על הזדקנות ואנטי-הזדקנות, הסיכונים הבריאותיים של פוטו-אייג'ינג הפכו לאחד הנושאים הבריאותיים החשובים ביותר בעולם. לכן, חשוב לחקור את התהליכים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס נזק פוטו-אייג'ינג הנגרמת על ידי UVA, במטרה לפתח אפשרויות טיפוליות חדשות לטיפול בו.

הונוקיול (HNK) מופק ממגדליה אופיצינליס, עשב מרפא סיני מסורתי, הוא תרכובת ביואקטיבית משמעותית עם נוסחה כימית C18H18O211. HNK מציג פעילויות פרמקולוגיות שונות, וקבוצת ההידרוקסיל הפנולית שלו רגישה מאוד לחמצון ויש לה השפעות חזקות של נוגדי חמצון ואיסוף רדיקלים חופשיים12. בנוסף, ל-HNKיש השפעות פרמקולוגיות אנטיבקטריאליות, אנטי-דלקתיות, אנטי-ויראליות, אנטי-גידוליות, נוגדות דיכאון, נוירופרוטקטיביות ואנטי-מוקדמות. HNK דרך הפה נקבע כבטוח במידה רבה במחקרים ומחקרים קליניים, ולא זוהו תופעות לוואי משמעותיות 17,18,19. מחקרים עדכניים מצאו כי HNK מונע סרטן עור20 המושרה על ידי UVB, ומעכב תגובה דלקתית עורית הנגרמת על ידי UVB והיפרמתילציה של DNA21, מה שמרמז על שימוש פוטנציאלי בטיפול במצבים עוריים. בהשוואה לסוכנים נגד הזדקנות פוטו-בשימוש נפוצים, כולל ויטמין C ורסברטרול, ל-HNK תכונות מובחנות ומעולות יותר: המבנה הליפופילי שלו מעניק חדירות טרנסדרמלית טובה יותר מאשר ויטמין C22 הידרופילי; והוא מציג יציבות פוטו-גבוהה יותר וזמינות ביולוגית ב-vivo לעומת רסברטרול23. ממצאים פרה-קליניים אלו תומכים ברעיון של-HNK יש פוטנציאל תרגומי מבטיח כמועמד בטוח ויעיל למוצרי טיפוח ולהתערבויות קליניות נגד נזק אור לעור הנגרמת מהאולטרה סגול. עם זאת, השפעת טיפול HNK על נזקי הזדקנות אורית של עור שנגרמה על ידי UVA טרם דווחה.

גורם גדילה טרנספורמטיבי-β1 (TGF-β1) הוא ציטוקין רב-תכליתי החיוני לצמיחה והתפתחות תאים, תיקון והתחדשות רקמות, וכן לצמיחה והתפתחות של תאים, רקמות ואיברים. הוכח כי TGF-β1 ממסמן לתא בעיקר דרך חברי משפחת חלבוני Smad, מה שמוביל לוויסות ספציפי של שעתוק גנים במורד הזרם. כאשר הפעלת איתות TGF-β1, היא גורמת לזרחון של Smad2 ו-Smad326,27. מחקרים אחרונים הראו קשר חזק בין מסלול TGF-β1/Smad לבין פיברוזיס העור לבין פוט-אייגינג 28,29. דווח כי המטרה היונקת של רפמיצין מפעילה את מסלול TGF-β1/Smad ברקמות עור העכברים, מה שמקדם את סינתזת הסרמידים, החשובים לשמירת לחות העור ולשמירה על מחסום העור30. ראוי לציין כי דווח כי HNK ווסת את מסלול TGF-β1/Smad בתאי כוכב כבדיים, מה ששיפר את פיברוזיסהכבד 31. לכן, הוכחו מודלים תאיים ועכבריים של פגיעות פוטו-ייג'ינג שנגרמו על ידי UVA, עם טיפול HNK של 2.5–10 מיקרומום בתאי HDF והתערבות של 5 mg/kg או 10 mg/kg HNK בעכברים חסרי שיער, כדי לחקור את השפעות HNK על נזק פוטו-ייג'ינג ואת תפקידו הפוטנציאלי בוויסות מסלול TGF-β1/Smad. מחקר זה נועד לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לנזקי אור בעור שנגרמו על ידי UVA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויי תרבית התאים בוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית ובוצעו בתנאי מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2). ניסויים בבעלי חיים בוצעו לאחר אישור ועדת האתיקה של בית החולים ה-988 של כוח התמיכה הלוגיסטית המשותף של צבא השחרור העממי הסיני (מספר אישור: 2023-089).

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. בסיום הניסוי, העכברים הושתו באמצעות מנת יתר של נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג, הזרקה תוך-צפקית). נעשו כל המאמצים למזער סבל בעלי חיים במהלך הדיור, הטיפול והליכי הדגימה. הריאגנטים, הכימיקלים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים ועיבוד

  1. תרבית פיברובלסטים דרמליים אנושיים (HDF) במדיום תרבית פיברובלסטים. שמרו על תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה רוויה עם 5%CO2.
  2. החלף את מדיום התרבית כל 3 ימים, והעבר HDF ביחס של 1:3 כשהוא מתכופף.
  3. הקרנת HDF עם מנורות UVA (ספקטרום פליטה: 320-400 ננומטר) במינון של 5 J/cm2.
  4. מלא מחדש במדיום טרי מיד לאחר 30 דקות של הקרנת UVA. חזור על הקרנת UVA פעם ביום במשך 8 ימים רצופים32.
  5. לטפל ב-HDF עם 2.5, 5, 10, 20 או 40 מיקרומום HNK למשך 24 שעות או 48 שעות בניסויי הסקר33. לטפל ב-HDF ב-2.5, 5 או 10 מיקרומום HNK למשך 24 שעות ואחריו הקרנת UVA (5 J/cm2) בניסויים הבאים.
  6. חשפו HDF ל-10 מיקרומום HNK למשך 4 שעות, לאחר מכן דגרו עם SB431542 מעכב TGF-β1 של 10 מיקרומום למשך 24 שעות, ולבסוף הקרינו ב-UVA (5 J/cm²) בקבוצת HNK+SB431542.

2. הערכת כחיות תאים

  1. החסן HDF ללוחות תרבית תאים של 96 בארות בצפיפות של 1×10תאים לבאר.
  2. לאחר טיפולים שונים, הוסף 10 מיקרוליטר של 10% מגיבת מלח טטרזוליום מסיס במים לכל באר לנפח סופי של 100 מיקרולטר לבאר, ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 1.5 שעות בחושך.
  3. מדוד את ערכי OD450 של התאים באמצעות קורא מיקרופלט.

3. קביעת רמות סופר-חמצן דיסמוטאז (SOD), מלונדיאלדהיד (MDA), קטלז (CAT) וגלותאיון (GSH)

  1. שטוף HDF עם 1 מ"ל PBS מקורר מראש (0.01 מ', pH 7.4), הוסף 200 מיקרוליטר תמיסה להכנת דגימת SOD (מערכת בדיקת SOD) כדי לעבור תאים על קרח למשך 15 דקות.
  2. צנטריפוגה את הליזאט ב-8000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ואספו את הסופרנטנט כדגימת הבדיקה.
  3. השתמש בערכת בדיקת חלבון BCA (חומצה ביצינכונינית) כדי לקבוע את ריכוז החלבון של הסופרנטנט, והתאם את הדגימה ל-50 מיקרוגרם חלבון כולל בנפח של 50 מיקרוליטר.
  4. מערבבים את דגימת החלבון של 50 מיקרוגרם עם בופר הבדיקה SOD לנפח תגובה סופי של 200 מיקרוליטר, ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך, ואז מדדו את ערך OD450.
  5. קח את אותו סופרנטנט ליזאט תא ששימש לבדיקת SOD, מדוד רמות CAT, GSH ו-MDA באמצעות ערכות הבדיקה המתאימות.

4. מדידת רמות ROS תאיות

  1. לטפל בתאי HDF בתנאים שונים, שטוף פעמיים עם 500 מיקרוליטר PBS, וערבב היטב עם 500 מיקרוליטר של גלאי פלואורסצנטי של 10 מיקרומול, ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות הרחק מהאור.
  2. צנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התאים, ואז לשטוף פעמיים עם 500 מיקרו-ליטר PBS.
  3. החזירו את התאים לתחום תרבית תאים בנפח 500 מיקרוליטר, ואז ניתחו את הצבועים באמצעות ציטומטריית זרימה.
  4. לתעד את עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה, ואז לחשב את רמות ROS בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה הגבוהה יותר ש-ROS מתאימה לפלואורסצנציה ירוקה חזקה יותר).

5. צביעת β-גלקטוזידאז (SA-β-galactosidase) הקשורה להזדקנות

  1. זרעו HDF ללוחות תרבית תאים של 6 בארות בצפיפות של 1×106 תאים לבאר ותרבו להיצמדות. אחרי טיפולים שונים, שטוף HDF פעם אחת עם 2 מ"ל PBS.
  2. הוסף 1 מ"ל קיבוע β-גלקטוזידאז לכל באר, ודגר את התאים בטמפרטורת החדר עם מקבע למשך 15 דקות.
  3. שטוף את התאים 3 פעמים עם 2 מ"ל PBS, הוסף 1 מ"ל תמיסת צביעה לכל באר, ואז דגר בטמפרטורה של 37°C במהלך הלילה בחושך.
  4. התבונן וצלם את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור (תאים מזדקנים נראים כחולים).

6. מבחן מחזור תאים

  1. זרע HDF ללוחות בעלי 6 בארות ב-1×106 תאים לבאר; לאחר טיפולים שונים, שטוף תאים פעמיים עם 2 מ"ל PBS.
  2. צנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לאיסוף תאים, הוסף 1 מ"ל של 70% אתנול (קיבע תאים), וערבב בעדינות באמצעות פיפטינג. הניחו את התאים הקבועים במקרר של 4°C למשך 12 שעות.
  3. הכינו 500 מיקרוליטר לכל דגימה של תמיסת צביעת תאים על ידי ערבוב יודיד פרופידיום (PI, ריכוז סופי 50 מיקרוגרם/מ"ל) ו-RNaseA (ריכוז סופי 200 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBS. חשפו תאים ל-500 מיקרוליטר של תמיסת צביעה, דגרו בחושך בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  4. הערכו את עוצמת הפלואורסצנציה באמצעות ציטומטריית זרימה. בצע ניתוח מחזור תא באמצעות ציטומטר זרימה.

7. צביעת טונל

  1. חשפו תאי HDF מקבוצות טיפול שונות ל-1 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. הוסיפו 1 מ״ל PBS המכיל 0.3% טריטון X-100 לתאים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  3. שטפו את התאים פעמיים עם PBS, ואז הוסיפו 500 מיקרוליטר תמיסת TUNEL לבדיקה, כדי לכסות את התאים באופן שווה. דגרו בטמפרטורה של 37°C בחושך למשך 1.5 שעה.
  4. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת DAPI לכיסוי התאים, ודוגרו הרחק מהאור למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  5. אטום את התאים עם מדיום הרכבה לשימור אותות פלואורסצנטיים, ואז צפה וצלם אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה (תאים חיוביים ב-TUNEL מראים פלואורסצנציה ירוקה).

8. צביעת אימונופלואורסצנציה

  1. זרעי תאי HDF מקבוצות טיפול שונות לפלטות של 12 בארות. כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-50%-60%, חשפו את התאים ל-1 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות.
  2. הוסף 1 מ"ל של אלבומין סרום בקר (BSA) 5% בטיפה כדי לחסום את פני התא, ודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  3. הוסף 500 מיקרוליטר נוגדנים ראשוניים Ki67 (1:300), קולגן I (1:100), מטריצת מטלופרוטינאאז (MMP)-1 (1:50), או MMP-3 (1:100) בירידה, ודגר בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה.
  4. ביום הבא, דגרו את התאים ב-500 מיקרוליטר של נוגדן משני מסומן על ידי פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) (1:100) בטמפרטורה של 37°C הרחק מהאור למשך שעה אחת.
  5. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעה DAPI לכיסוי התאים, דגרו הרחק מהאור למשך 10 דקות, צפו במיקרוסקופ פלואורסצנצי, ונתחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (תאי קולגן I ו-MMP-1 חיוביים מראים פלואורסצנציה אדומה, תאי Ki67 ו-MMP-3 חיוביים מראים פלואורסצנציה ירוקה).

9. אליסה

  1. הוסף 100 מיקרוליטר של סופרנטנט תרבית תאי HDF לבארות של לוחות קיט ELISA של MMP-1 או MMP-3, ודגר ב-37°C למשך שעתיים.
  2. שטפו את הבארות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS, ואז מוסיפים 100 מיקרוליטר של הנוגדן המתאים לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך שעה.
  3. שטוף את הבארות 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של בופר שטיפה (המסופק בערכה), נער את התמיסה העודפת, ודוגר את הדגימות עם 100 מיקרוליטר של סטרפטווידין-HRP למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C בחושך.
  4. לאחר השטיפה עם PBS, הוסיפו 100 מיקרוליטר של מצעים A ו-B לפי הוראות הערכה ודגרו בטמפרטורה של 37°C בחושך למשך 10 דקות.
  5. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סיום, ערבב היטב, העריך את ערךOD 450 באמצעות קורא מיקרופלט, וחשב את הריכוז.

10. בניית מודל עכבר בנזק להזדקנות צילום

  1. נקבות SKH1 חסרות שיער בדרגת SPF (15-20 גרם, 4-5 שבועות) בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס עם לחות של 55%-60% ומאפשרות גישה אוטונומית למזון ולמים. חיטוי מתקנים באופן קבוע, כולל מיכלי מזון, בקבוקי מים ופתחי שתייה.
  2. הקצו עכברים באקראי לקבוצת הביקורת (n=6) ולקבוצת המודל (n=18). הקרנת עכברים מקבוצת הדגם עם UVA במהירות של 0.35 J/cm2 במשך 8 שבועות34; עכברים מקבוצת ביקורת ביתית באותה סביבה ללא קרינה UVA.
  3. חלק את עכברי קבוצת המודל שווה בשווה ל-3 תת-קבוצות (n=6 כל אחת).
  4. הזרקות תת-עוריות של HNK במינון 5 מ"ג/ק"ג או 10 מ"ג/ק"ג בנפח של 100 מיקרוליטר פעמיים בשבוע לשתי תת-קבוצות במהלך הקרנת UVA (נרשמו כקבוצת HNK של 5 מ"ג/ק"ג ו-10 מ"ג/ק"ג HNK, בהתאמה). מתן זריקות תת-עוריות של 100 מיקרוליטר תמלח פעמיים בשבוע לתת-הקבוצה השלישית במהלך הקרנת UVA (רשום כקבוצת UVA).
  5. הערכו את היווצרות קמטים בעור ותכולת המים לאחר מידול מוצלח35.
  6. המית עכברים עם נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג) בתוך הפריטונה, ואז אספו רקמות עור גביות לניסויים נוספים.

11. מדידת תכולת קולגן העור I

  1. אסוף 50 מ"ג רקמות עור גב של העכבר, טחן אותן היטב בחנקן נוזלי, ובצע ליזיז באמצעות 500 מיקרוליטר של בופר RIPA מקורר מראש למשך 30 דקות על קרח.
  2. צנטריפוגה את הליזאט בטמפרטורה של 8000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אספו את הסופרנאנט, ומדדו את תכולת הקולגן באמצעות ערכת בדיקת פפטיד פרו-קולגן I C לפי הוראות היצרן.

12. צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE)

  1. קיבעו רקמות עור עכבר ב-10 מ"ל פרפורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות, ייבשו באתנול גרדיאנט (50%, 75%, 95%, 100%, כל אחד למשך 5 דקות), הטמיעו בפרפין, וחתכו לפרוסות של 4 מיקרון.
  2. אפו את הפרוסות בטמפרטורה של 65°C במשך 8 שעות, דה-פרפיניזציה בקסילן פעמיים למשך 10 דקות כל אחת, ורידרציה באתנול גרדיאנט בטמפרטורת החדר.
  3. צבעו את הפרוסות בתמיסת המטוקסילין במשך 8 דקות, שטפו במי ברז זורמים למשך דקה, התבדלו בתמיסת התבוננות למשך 30 שניות, וצבועו באאוזין דקה בטמפרטורת החדר.
  4. ייבשו את הפרוסות המוכתמות באתנול גרדיאנטי, נקוו בקסילן, אטמו עם מדיום מתקין, וצפו במיקרוסקופ (גרעין התא נראה כחול-סגול, בעוד שהציטופלזמה, סיבי הקולגן והאריתרוציטים נראים ורודים במידה משתנה).

13. צביעת מסון

  1. צביעת חלקי פרפין ברקמות עור עכבר באמצעות ערכת צביעה Masson trichrome36. דה-פרפין מחלקי פרפין מקסילן פעמיים במשך 10 דקות כל אחד, הוסף תמיסת צביעת המטוקסילין של ברזל ויגרט, וצביע 10 דקות.
  2. התמיינוי עם תמיסת התמיינות חומצית-אתנולית למשך 30 שניות, שטוף במי ברז זורמים במשך 5 דקות, ואז צבע עם תמיסת צביעה Ponceau-fuchsin טיפה ל-10 דקות בטמפרטורת החדר. בצע הכחול הפוך עם התמיסה הכחולה של Masson ואז שטוף במים מזוקקים למשך דקה.
  3. הכינו תמיסת עבודה חלשה עם חומצה ביחס של מים מזוקקים: תמיסה חומצית חלשה (בערכה) = 2:1; הוסף 1 מ״ל תמיסה חלשה של חומצה שעובדת טיפה ושוטף במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
  4. שפוך נוזל עודף, הוסיף 1 מ"ל תמיסת חומצה פופומוליבדית טיפה, וטיפל במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 1 מ"ל מהתמיסה החומצית החלשה שעובדת טיפה, ואז שטוף במשך 30 שניות.
  5. לשפוך נוזלים עודפים, להוסיף 1 מ״ל תמיסת צביעה כחולה אנילין טיפה ולצבוע דקה אחת. הוסף 1 מ"ל חומצה חלשה עם תמיסה שעובדת טיפה ושטוף במשך 30 שניות.
  6. תייבש במהירות ב-95% אתנול למשך 2 שניות. תייבש באתנול מוחלט פעמיים, 10 שניות בכל פעם.
  7. לאחר הייבוש, נקה את החלקים בקסילן, והתקן עם מסטיק נייטרלי. התבוננו בהתפלגות סיבי הקולגן בכל קבוצה תחת מיקרוסקופ (סיבי קולגן נראים כחולים, בעוד סיבי שריר, ציטופלזמה ואריתרוציטים אדומים בוהקים, וגרעיני התאים נראים כחולים-שחורים באופן מובהק).

14. מדידת רמות ROS ברקמת העור

  1. קח קטעים קפואים של רקמת עור עכבר (שהוכנה בתוך שעה מהכריכה), מרח 1 מ"ל תמיסת ניקוי טיפתית על כל משטח החתך, ותן להם לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  2. נער את תמיסת הכביסה, ואז מוסיפים 1 מ"ל של גלאי חמצן תגובתי של 10 מיקרומולר בנפילה כדי לכסות את החלקים באופן שווה; דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס הרחק מהאור למשך 30 דקות.
  3. שטוף את החלקים פעמיים עם PBS, הוסף סיפוקי כיסוי, וצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה (אזורים חיוביים ל-ROS מציגים פלואורסצנציה אדומה; ככל שרמת ROS נמוכה יותר, האות הפלואורסצנציה האדום חלש יותר).

15. בדיקות מדדים ביוכימיים

  1. אספו סרום עכברים והכינו תגובות גילוי בהתאם להוראות ערכות הבדיקה המתאימות.
  2. למדוד את פעילות האספרטט טרנסאמינאז (AST) ואלנין טרנסאמינאז (ALT) בסרום עכברים באמצעות הערכות המתאימות.
  3. קבעו את רמות החנקן של אוריאה בדם (BUN) וקריאטינין (CRE) בסרום העכברים באמצעות הערכות המתאימות.

16. כתם מערבי

  1. אסוף 50 מ"ג רקמה או 1×10תאים , ליסס את הדגימות על הקרח למשך 30 דקות באמצעות 200 מיקרוליטר RIPA לאיסוף חלבונים.
  2. צנטריפוגה ב-8000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואיסוף הסופרנטנט. העריכו את תכולת החלבון בתאים וברקמות באמצעות ערכת בדיקת ריכוזי החלבון BCA.
  3. לבצע אלקטרופורזה של חלבוני דגימה על ג'ל SDS-PAGE של 12%, והעברת חלבונים מופרדים לממברנות PVDF בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. חסום ממברנות PVDF עם 5% BSA למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר. שטוף את הממברנות עם TBST (מכיל 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, ו-0.1% Tween-20) שלוש פעמים, ואז דגר לילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:1000), קולגן I (1:1000), ציקלין A2 (1:500), קינאז תלוי ציקלין 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000), או p-Smad3 (1:1000).
  5. ביום השני, שטפו את הממברנות עם TBST 3 פעמים, ואז דגרו עם 1 מ"ל IgG אנטי-ארנבי עזים (1:10000) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. מרחו 500 מיקרוליטר של תגובת הכימילומינסציה המוגברת (ECL) באופן שווה על הממברנות, ואז סרקו אותן באמצעות מערכת הדמיה ג'לית.
  6. בצע ניתוח ערכים אפור באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. הביטו את רמת הביטוי היחסית כיחס בין ערכו האפור לזה של GAPDH.

17. ניתוח סטטיסטי

  1. לבדיקות מבוססות תאים במבחנה , כל הניסויים חוזרים באופן עצמאי שלוש פעמים (n=3, שכפולים ביולוגיים).
  2. לניסויים בבעלי חיים בחיים חיים, נכללים 6 עכברים לכל קבוצה (n=6), מה שעומד בעקרונות 3R לרווחת בעלי חיים במעבדה ואתיקה.
  3. כל התוצאות מבוטאות כסטיית תקן ממוצעת ±. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. נורמליות הנתונים נבדקה באמצעות מבחן שפירו-וילק.
  4. לנתונים המפוזרים בדרך כלל, השתמשו ב-ANOVA חד-כיווני להשוואה בין קבוצות, ואחריהם מבחן פוסט-הוק של טוקי להשוואות זוגיות בין קבוצות. עבור נתונים שאינם מבוזרים נורמלית, יש ליישם את מבחן קרוסקאל-ווליס הלא-פרמטרי. P< 0.05 מציין הבדל משמעותי.
  5. יצירת גרפים באמצעות תוכנת גרפים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNK מקל על נזקי לחץ חמצוני בתאי HDF הנגרמים על ידי UVA
השפעות הריכוזים השונים של טיפול ב-HNK במשך 24 או 48 שעות על השריות של תאי HDF נבדקו באמצעות בדיקת עמידות התאים כדי לסרוק את הריכוז ומשך הטיפול המתאימים. התוצאות הראו כי 2.5, 5 ו-10 מיקרומום של HNK לא השפיעו באופן משמעותי על החיוניות של תאי HDF תקינים לאחר 24 או 48 שעות טיפול, מה שהוכיח כי HNK אינו רעיל לתאים תקינים במינונים אלו. ראוי לציין כי HNK בריכוזים של 2.5, 5 ו-10 מיקרומום הקל על פגיעה בחיוניות תאי HDF שנגרמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אור אולטרה סגול הוא גורם סביבתי אחד הפוגע בתאים ובאורגניזמים. מחקרים קודמים דיווחו כי UVA, עם עוצמת החדירה הגבוהה שלו, הוא סוג האור האולטרה סגול העיקרי שמגיע לפני כדור הארץ38. פיברובלסטים הם תאים תפקודיים חשובים בדרמיס, והזדקנותם יכולה ישירות או בעקיפין לגרום להזדקנות העור. נזק פוטו-הזדקנות שנגרם על ידי UVA במודל תאי HDF ומודל העכבר ללא שיער נמצא בשימוש נרחב במחקר של הזדקנות פוטו-לתוך עור40,41

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מאשרים שאין להם ניגודי עניינים פיננסיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בדיקת פעילות ALTביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןP2711Mערכת זיהוי פעילות טרנסאמינאז של אלנין
ערכת בדיקה של Amplex Red CREביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0291Sערכת זיהוי קריאטינין
מדיום הרכבה נגד פיידביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןP0126מדיום הרכבה לשימור אותות פלואורסצנציה
ערכת בדיקת פעילות ASTביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןP2715Sערכת זיהוי פעילות טרנסאמינאז של אספרטט
ערכת בדיקת חלבון BCAביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןP0012ערכת קביעת ריכוז חלבון
BSAסיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בV900933מגיב חוסם לקישור לא ספציפי
ערכת בדיקה של BUNביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0574Sערכת זיהוי חנקן אוריאה בדם
ערכת בדיקת CATביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0051ערכת זיהוי פעילות קטלז
מגיב CCK-8סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב96992תמיסת בדיקת קיום תאים, שהיא מלח טטרזוליום מסיס במים
נוגדן CDK2Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בPA5-79024נוגדן ראשי לזיהוי CDK2
סוכן כימילומינסצנטי ECLMedChemExpress, מונמות' ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-K1005מגיב זיהוי כימילומינציה משופר
נוגדן קולגן IInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בPA1-26204נוגדן ראשוני לזיהוי קולגן I
נוגדן ציקלין A2Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בPA5-34682נוגדן ראשי לגילוי ציקלין A2
פתרון צביעת DAPIסיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בD9542צבע צבע גרעיני
גלאי פלואורסצנטי DCFH-DAMedChemExpress, מונמות' ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-D0940גלאי פלואורסצנטי למיני חמצן תגובתי
פתרון גזירהביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןC0161sשלב ההתבגרות של המטוקסילין מגיב
גשושית דיהידרואתידיוםביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0063גשושית מיני חמצן תגובתי
מדיום תרבית פיברובלסטיםSunncell Biotechnology Co., Ltd., ווהאן, הוביי, סיןSNPM-H342מדיום תרבית מלא לצמיחת פיברובלסטים
IgG אנטי-ארנב שמסומן על ידי FITCInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בF-2765נוגדן משני מסומן על ידי פלואורסאין איזותיוציאנאט (FITC)
ציטומטריית זרימהBD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה, ארה"בBD FACSCaliburTMציטומטר זרימה
תוכנת FlowJoBD ביוסיינס, סן חוזה, קליפורניה, ארה"בv10.8תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה
מיקרוסקופ פלואורסצנציהלייקה, היידלברג, גרמניהDM IL LEDמיקרוסקופ להדמיה פלואורסצנצית
נוגדן GAPDHInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בPA1-987נוגדן בקרה פנימית לנרמול חלבונים
מערכת הדמיית ג'לInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בiBright CL1500מערכת הדמיה לזיהוי חלבונים
עזים נגד ארנבים IgGInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב31460נוגדן משני לזיהוי חיסוני
תוכנת Graphpad Prism 9.0GraphPad Software, סן דייגו, קליפורניה, ארה"בפריזמה 9.0תוכנת גרפים
ערכת בדיקת GSHביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0053ערכת זיהוי תכולת גלוטתיון
ערכת צביעת HEביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןC0105Sערכת צביעה היסטולוגית לניתוח מורפולוגיית רקמות
HNKMedChemExpress, מונמות' ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-N0003הונוקיול, תרכובת ביואקטיבית
פיברובלסטים דרמליים אנושייםSunncell Biotechnology Co., Ltd., ווהאן, הוביי, סיןSNP-H342תאי פיברובלסטים ראשוניים בעור האנושי
תוכנת IBM SPSS Statistics 26.0חברת IBM, ארמונק, ניו יורק, ארה"בIBM SPSS סטטיסטיקה 26.0תוכנת ניתוח סטטיסטי
תוכנת ImageJויין רסבנד, המכון הלאומי לבריאות הנפש, ארה"בגרסה 1.54Hתוכנת ניתוח תמונות
נוגדן Ki67Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בMA5-14520נוגדן ראשוני לזיהוי סמני התרבות תאים
מיקרוסקופ אורלייקה, היידלברג, גרמניהDM3000מיקרוסקופ אופטי להדמיית שדות בהירים
ערכת צביעת מסון טריכרוםסולארביו, בייג'ינג, סיןG1340ערכת צביעת קולגן ורקמות חיבור
ערכת בדיקת MDAביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0131Sערכת זיהוי רמת מלונדיאלדהיד (סמן פרוקסידציה של שומן)
קורא מיקרופלטתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב1410101מכשיר מדידת ספיגה לבדיקות מבוססות תאים
נוגדן MMP-1Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בPA5-27210נוגדן ראשי לגילוי מטריקס מטאלופרוטאונאז-1
ערכת MMP-1 ELISAביוטכנולוגיה מקושרת לאנזימים, שנגחאי, סיןml038199גילוי כמותי של MMP-1 בדגימות ביולוגיות
נוגדן MMP-3אבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בab52915נוגדן ראשי לזיהוי מטריקס מטאלופרוטאינאז-3
ערכת MMP-3 ELISAביוטכנולוגיה מקושרת לאנזימים, שנגחאי, סיןml105322זיהוי כמותי של MMP-3 בדגימות ביולוגיות
מסטיק נייטרליביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןC0173מדיום הרכבה
נוגדן P16Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בPA5-20379נוגדן ראשי לזיהוי חלבון P16
נוגדן P21Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בMA5-14949נוגדן ראשוני לזיהוי חלבון P21
נוגדן P53אבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בAB131442נוגדן ראשי לזיהוי חלבון p53
פאראפורמלדהידסולארביו, בייג'ינג, סיןP1110תגובת קיבוע תאים ורקמות
PIביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןST512יודיד פרופידיום לצביעה ב-DNA בניתוח מחזורי תא
ערכת בדיקת פפטיד Pro-Colagen I Cטאקארה, טוקיו, יפןMK101ערכת זיהוי סינתזת קולגן
נוגדן p-Smad2Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב44-244Gנוגדן ראשוני לזיהוי Smad2 מזורזן
נוגדן p-Smad3Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב44-246Gנוגדן ראשוני לזיהוי Smad3 מזורחן
ממברנות PVDFInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב88520ממברנת העברת חלבון לבליטה מערבית
מאגר ניתוק RIPAביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןP0013Bבופר חילוץ חלבונים לליזטים של תאים ורקמות
RNaseAביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןST579ריבונוקלאז להסרת RNA במהלך צביעת DNA
ערכת צביעת SA-β-galactosidaseביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןC0602ערכת זיהוי הזדקנות תאית
SB431542MedChemExpress, מונמות' ג'נקשן, ניו ג'רזי, ארה"בHY-10431TGF-&בטא; מעכב מסלולי איתות אחד
ג'לים של SDS-PAGEInvitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"בWG1403BX10ג'לים פוליאקרילאמידיים לאלקטרופורזה של חלבונים
עכברים חסרי שיער SKH1ויטלריבר, בייג'ינג, סיןמודל בעלי חיים למחקרי הזדקנות צילום של עור
נוגדן Smad2Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב51-1300נוגדן ראשוני לגילוי Smad2
נוגדן Smad3Invitrogen, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב51-1500נוגדן ראשי לזיהוי Smad3
ערכת בדיקת SODביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןS0101Sערכת זיהוי פעילות סופר-חמצן דיסמוטאז
TGF-&בטא; נוגדן אחדאבקאם, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"בAB215715נוגדן ראשי ל-TGF-ו-beta; 1 גילוי
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בX-100חומר ניקוי לא-יוני לחדירות ממברנת התא
פתרון מבחן TUNELביוטכנולוגיה ביוטיים, שנגחאי, סיןC1086מגיב זיהוי אפופטוזיס לפיצול DNA
קסילןסיגמא-אלדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב247642ממס אורגני לפירוק רקמות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gu, Y., Han, J., Jiang, C., Zhang, Y. Biomarkers, oxidative stress and autophagy in skin aging. Ageing Res Rev. 59, 101036 (2020).
  2. Chaudhary, M., Khan, A., Gupta, M. Skin ageing: pathophysiology and current market treatment approaches. Curr Aging Sci. 13 (1), 22-30 (2020).
  3. Lephart, E. D. Equol’s anti-aging effects protect against environmental assaults by increasing skin antioxidant defense and ECM proteins while decreasing oxidative stress and inflammation. Cosmetics. 5 (1), 16 (2018).
  4. Gromkowska-Kępka, K. J., Puścion-Jakubik, A., Markiewicz-Żukowska, R., Socha, K. The impact of ultraviolet radiation on skin photoaging—review of in vitro. studies. J Cosmet Dermatol. 20 (11), 3427-3431 (2021).
  5. Tsai, T. Y., et al. Djulis supplementation against oxidative stress and ultraviolet radiation-induced cell damage: the influence of antioxidant status and aging of skin in healthy subjects. J Cosmet Dermatol. 21 (7), 2945-2953 (2022).
  6. McCormick, E., et al. Topical nanoencapsulated cannabidiol cream as an innovative strategy combating UV-A-induced nuclear and mitochondrial DNA injury: a pilot randomized clinical study. J Am Acad Dermatol. 91 (5), 855-862 (2024).
  7. Ansary, T. M., Hossain, M. R., Kamiya, K., Komine, M., Ohtsuki, M. Inflammatory molecules associated with ultraviolet radiation-mediated skin aging. Int J Mol Sci. 22 (8), 3974 (2021).
  8. Deng, H., et al. Pterostilbene's protective effects against photodamage caused by UVA/UVB irradiation. Pharmazie. 73 (11), 651-658 (2018).
  9. Ho, C. Y., Dreesen, O. Faces of cellular senescence in skin aging. Mech Ageing Dev. 198, 111525 (2021).
  10. Bocheva, G., et al. Protective role of melatonin and its metabolites in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (3), 1238 (2022).
  11. Rauf, A., et al. Honokiol: a review of its pharmacological potential and therapeutic insights. Phytomedicine. 90, 153647 (2021).
  12. Cardullo, N., Monti, F., Muccilli, V., Amorati, R., Baschieri, A. Reaction with ROO• and HOO• radicals of honokiol-related neolignan antioxidants. Molecules. 28 (2), (2023).
  13. Prasher, P., et al. Honokiol and its analogues as anticancer compounds: current mechanistic insights and structure-activity relationship. Chem Biol Interact. 386, 110747 (2023).
  14. Xin, L., et al. Honokiol alleviates radiation-induced premature ovarian failure via enhancing Nrf2. Am J Reprod Immunol. 90 (4), e13769 (2023).
  15. Faysal, M., et al. Neuropharmacological potential of honokiol and its derivatives from Chinese herb Magnolia species: understandings from therapeutic viewpoint. Chin Med. 18 (1), 154 (2023).
  16. Fan, X. X., et al. Honokiol improves depression-like behaviors in rats by HIF-1α-VEGF signaling pathway activation. Front Pharmacol. 13, 968124 (2022).
  17. Du, E., et al. Dietary honokiol supplementation improves antioxidant capacity, enhances intestinal health, and modulates cecal microbial composition and function of broiler chickens. Poult Sci. 103 (7), 103798 (2024).
  18. Sarrica, A., Kirika, N., Romeo, M., Salmona, M., Diomede, L. Safety and toxicology of magnolol and honokiol. Planta Med. 84 (16), 1151-1164 (2018).
  19. Zhuang, Q., et al. A validated ultra-HPLC-MS/MS method for determination of honokiol in human plasma and its application to a clinical pharmacokinetic study. Bioanalysis. 11 (11), 1085-1098 (2019).
  20. Guillermo, R. F., et al. Time- and dose-response effects of honokiol on UVB-induced skin cancer development. Drug Discov Ther. 6 (3), 140-146 (2012).
  21. Prasad, R., Singh, T., Katiyar, S. K. Honokiol inhibits ultraviolet radiation-induced immunosuppression through inhibition of ultraviolet-induced inflammation and DNA hypermethylation in mouse skin. Sci Rep. 7 (1), 1657 (2017).
  22. Dikalov, S., Losik, T., Arbiser, J. L. Honokiol is a potent scavenger of superoxide and peroxyl radicals. Biochem Pharmacol. 76 (5), 589-596 (2008).
  23. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Yang, L., Wang, D. W., Zhu, W. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. Br J Pharmacol. 174 (11), 1395-1425 (2017).
  24. Kim, K. K., Sheppard, D., Chapman, H. A. TGF-β1 signaling and tissue fibrosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 10 (4), (2018).
  25. Lodyga, M., Hinz, B. TGF-β1—a truly transforming growth factor in fibrosis and immunity. Semin Cell Dev Biol. 101, 123-139 (2020).
  26. Liu, H., et al. TGF-β/Smads signaling pathway, Hippo-YAP/TAZ signaling pathway, and VEGF: their mechanisms and roles in vascular remodeling-related diseases. Immun Inflamm Dis. 11 (11), e1060 (2023).
  27. Huang, Y., et al. HIF-1α switches the functionality of TGF-β signaling via changing the partners of Smads to drive glucose metabolic reprogramming in non-small cell lung cancer. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 398 (2021).
  28. Xie, X., et al. Iguratimod inhibits skin fibrosis by regulating TGF-β1/Smad signalling pathway in systemic sclerosis. Eur J Clin Invest. 52 (8), e13791 (2022).
  29. Guo, K., et al. Compound collagen peptide powder improves skin photoaging by reducing oxidative stress and activating TGF-β1/Smad pathway. Photochem Photobiol. 100 (6), 1874-1893 (2024).
  30. Yamane, T., et al. mTOR inhibition by rapamycin increases ceramide synthesis by promoting transforming growth factor-β1/Smad signaling in the skin. FEBS Open Bio. 6 (4), 317-325 (2016).
  31. Kataoka, S., et al. Honokiol acts as a potent anti-fibrotic agent in the liver through inhibition of TGF-β1/SMAD signaling and autophagy in hepatic stellate cells. Int J Mol Sci. 22 (24), 13678 (2021).
  32. Jang, H. Y., et al. Fisetin inhibits UVA-induced expression of MMP-1 and MMP-3 through the NOX/ROS/MAPK pathway in human dermal fibroblasts and human epidermal keratinocytes. Int J Mol Sci. 24 (24), 16212 (2023).
  33. Zheng, X., et al. Honokiol attenuates mitochondrial fission and cell apoptosis by activating Sirt3 in intracerebral hemorrhage. Chin Med J (Engl). 136 (6), 719-731 (2023).
  34. Xia, Y., Zhang, H., Wu, X., Xu, Y., Tan, Q. Resveratrol activates autophagy and protects from UVA-induced photoaging in human skin fibroblasts and the skin of male mice by regulating the AMPK pathway. Biogerontology. 25 (4), 649-664 (2024).
  35. Kim, J., Lee, N., Chun, Y. S., Lee, S. H., Ku, S. K. Krill oil's protective benefits against ultraviolet B-induced skin photoaging in hairless mice and in vitro. experiments. Mar Drugs. 21 (9), (2023).
  36. Zhang, C., et al. Combination of lyophilized adipose-derived stem cell concentrated conditioned medium and polysaccharide hydrogel in the inhibition of hypertrophic scarring. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 23 (2021).
  37. Sun, G., et al. Panax ginseng Meyer cv. Silvatica phenolic acids protect DNA from oxidative damage by activating Nrf2 to protect HFF-1 cells from UVA-induced photoaging. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115883 (2023).
  38. Fadadu, R. P., Wei, M. L. Ultraviolet A radiation exposure and melanoma: a review. Melanoma Res. 32 (6), 405-410 (2022).
  39. Wlaschek, M., Maity, P., Makrantonaki, E., Scharffetter-Kochanek, K. Connective tissue and fibroblast senescence in skin aging. J Invest Dermatol. 141 (4 Suppl), 985-992 (2021).
  40. Duan, Y., et al. Handelin reduces ultraviolet A-induced photoaging by inhibiting reactive oxygen species generation and enhancing autophagy. Tohoku J Exp Med. 259 (3), 189-198 (2023).
  41. Liu, S., et al. Oral supplementation of sea cucumber and its hydrolysate mitigates ultraviolet A-induced photoaging in hairless mice. J Sci Food Agric. 102 (5), 1987-1994 (2022).
  42. Liu, S., et al. Gly-Pro protects normal human dermal fibroblasts from UVA-induced damages via MAPK-NF-κB signaling pathway. J Photochem Photobiol B. 237, 112601 (2022).
  43. Lu, Z., et al. Hesperetin attenuates UVA-induced photodamage in human dermal fibroblast cells. J Cosmet Dermatol. 21 (11), 6261-6269 (2022).
  44. Michel, P., et al. Anti-inflammatory, antioxidant and photoprotective activity of standardised Gaultheria procumbens L. leaf, stem, and fruit extracts in UVA-irradiated human dermal fibroblasts. J Ethnopharmacol. 319 (Pt 2), 117219 (2024).
  45. Fu, H., et al. Tremella fuciformis polysaccharides inhibit UVA-induced photodamage of human dermal fibroblast cells by activating and up-regulating Nrf2/Keap1 pathways. J Cosmet Dermatol. 20 (12), 4052-4059 (2021).
  46. Park, C., et al. Honokiol ameliorates oxidative stress-induced DNA damage and apoptosis of C2C12 myoblasts by regulating ROS generation and the mitochondrial pathway. Anim Cells Syst. 24 (1), 60-68 (2020).
  47. Chen, Q., et al. Metformin attenuates UVA-induced skin photoaging by suppressing mitophagy and the PI3K/AKT/mTOR pathway. Int J Mol Sci. 23 (13), 6969 (2022).
  48. Wang, M., Guo, Y., Wan, M., Chen, Z., Zhong, J. L. TAZ reduces UVA-mediated photoaging through regulation of cell proliferation in skin fibroblasts. Photochem Photobiol. 99 (1), 153-159 (2023).
  49. Han, S., et al. Inhibitory effect of seawater pearl hydrolysate on UVA-induced photoaging of human skin fibroblasts. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1558288 (2022).
  50. Alam, A., et al. Computational development of new inhibitors for apoptosis stimulating protein of p53 (iASPP) using pharmacophore modeling, docking, and MD simulation approaches. J Cancer Biomol Ther. 1 (2), 1-9 (2024).
  51. Bai, G. L., et al. Rapamycin protects skin fibroblasts from UVA-induced photoaging by inhibition of p53 and phosphorylated HSP27. Front Cell Dev Biol. 9, 633331 (2021).
  52. Zhang, J., Yu, H., Man, M. Q., Hu, L. Aging in the dermis: fibroblast senescence and its significance. Aging Cell. 23 (2), e14054 (2024).
  53. Liu, H., Dong, J., Du, R., Gao, Y., Zhao, P. Collagen study advances for photoaging skin. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 40 (1), e12931 (2024).
  54. Fisher, G. J., et al. Skin aging from the perspective of dermal fibroblasts: the interplay between adaptation to the extracellular matrix microenvironment and cell autonomous processes. J Cell Commun Signal. 17 (3), 523-529 (2023).
  55. Li, F., et al. Discovery of matrix metalloproteinase inhibitors as anti-skin photoaging agents. Eur J Med Chem. 267, 116152 (2024).
  56. Song, M. J., et al. Downregulation of carnitine acetyltransferase by promoter hypermethylation regulates ultraviolet-induced matrix metalloproteinase-1 expression in human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 116 (2), 70-77 (2024).
  57. Choi, S. I., et al. Eisenia bicyclis extract repairs UVB-induced skin photoaging in vitro and in vivo.: photoprotective effects. Mar Drugs. 19 (12), (2021).
  58. Kim, M. K., et al. Dual role of enhancer of zeste homolog 2 in the regulation of ultraviolet radiation-induced matrix metalloproteinase-1 and type I procollagen expression in human dermal fibroblasts. Matrix Biol. 119, 112-124 (2023).
  59. Xue, N., Liu, Y., Jin, J., Ji, M., Chen, X. Chlorogenic acid prevents UVA-induced skin photoaging through regulating collagen metabolism and apoptosis in human dermal fibroblasts. Int J Mol Sci. 23 (13), (2022).
  60. Meng, L., et al. NPRC deletion attenuates cardiac fibrosis in diabetic mice by activating PKA/PKG and inhibiting TGF-β1/Smad pathways. Sci Adv. 9 (31), eadd4222 (2023).
  61. Li, W., et al. Echinacoside exerts anti-tumor activity via the miR-503-3p/TGF-β1/Smad axis in liver cancer. Cancer Cell Int. 21 (1), 304 (2021).
  62. Xiang, D., et al. Physalin D attenuates hepatic stellate cell activation and liver fibrosis by blocking TGF-β/Smad and YAP signaling. Phytomedicine. 78, 153294 (2020).
  63. Jiang, H., Zhou, X., Chen, L. Asiaticoside delays senescence and attenuates ROS generation in UV-exposed cells through regulation of the TGF-β1/Smad pathway. Exp Ther Med. 24 (5), 667 (2022).
  64. Tong, T., Park, J., Moon, Y., Kang, W., Park, T. α-Ionone protects against UVB-induced photoaging in human dermal fibroblasts. Molecules. 24 (9), 1688 (2019).
  65. Liu, X. Y., Hwang, E., Park, B., Xiao, Y. K., Yi, T. H. Photoprotective and anti-inflammatory properties of vina-ginsenoside R7 ameliorate ultraviolet B-induced photodamage in normal human dermal fibroblasts. Appl Biochem Biotechnol. 189 (3), 729-744 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TGF BetaSmadHDFWestern Blot

מאמרים קשורים