מאמר שיטה

הערכה קולורימטרית של פעילות דיאודינאז 1 במיקרוזומי כבד אנושי באמצעות תגובת סנדל-קולטהוף

675 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70104

⸱

10 באפריל 2026

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה קולורימטרית להערכת השפעה אמינה של כימיקלים על פעילות דיאודינאז 1 (DIO1) במיקרוסומי כבד אנושי באמצעות תגובת סנדל-קולטוף. הוא כולל קריטריוני קבלה מוגדרים מראש ומדדי ביצועים סטטיסטיים ותומך במאמצים מתמשכים להכללת הנחיות מבחן ב-OECD.

תקציר

שיטה זו מאפשרת זיהוי חומרים לבדיקה המעכבים את פעילות DIO1 ועלולים להפריע להומאוסטזיס של הורמון בלוטת התריס. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה קולורימטרית לא-רדיואקטיבית להערכת השפעות חומרי הבדיקה על הפעילות האנזימטית של דיאודינאז 1 (DIO1) במיקרוזומי כבד אנושי. הבדיקה מבוססת על תגובת סנדל-קולטהוף (SK), שמכמת את היודיד המשתחרר במהלך הדיאודינציה של טריודותירונין הפוך (rT3) לדיודותירונין (T2). הצריום הצהוב (IV) מצטמצם לצריום חסר צבע (III) בנוכחות יודיד, מה שמאפשר זיהוי פוטומטרי ב-415 ננומטר. בהגדרה הסטנדרטית הזו, ריכוז הסריום (IV) מוגדר ל-40 mM לשיפור יציבות ועמידות האות בתנאים המתוארים. כדי להבטיח אמינות ויכולת שחזור של הבדיקה, נכללת מערכת בקרה מקיפה: 6-פרופיל-2-תיאורציל (פריט ייחוס), אורותיוגלוקוז (בקרה חיובית), 1-תיו-β-D-גלוקוז מלח נתרן (בקרה שלילית), ו-1% דימתיל סולפוקסיד (בקרת ממס). הפרוטוקול כולל מבחן מדידת טווח לקביעת ריכוזי בדיקה מתאימים, סטנדרטיזציה של פעילות שחרור יודידים ספציפית לאצווה של מיקרוזום ובדיקות הפרעות כימיות מובנות בהיעדר מיקרוזומים, עם הערכה אופציונלית ללא דיתיותרייטול (DTT) לזיהוי ארטיפקטים התלויים ב-DTT. מבחן DIO1-SK מתאים לסינון בקצב בינוני עד גבוה ולמחקרים מכניים של טוקסיקולוגיה. החוזקות, ההרחבה והיישום שלו למיקרוזומים אנושיים הופכים אותו לכלי חשוב לחקר הפרעות אנדוקריניות. פרוטוקול זה תומך במאמצי אימות רגולטורי.

מבוא

משבשי אנדוקרינים (EDs) הם כימיקלים שמפריעים לוויסות ההורמונלי ולכן גורמים לתופעות לוואי בבני אדם 1,2. דיאודינזים (DIO) הם אנזימים הקשורים לממברנה, כאשר סלנוציסטאין הוא שארית מרכזית באתרים הפעילים שלהם. משפחת האנזימים הזו מורכבת משלושה איזופורמים מובחנים (DIO1, DIO2 ו-DIO3), אשר יחד מווסתים את ריכוזי הורמון בלוטת התריס (TH) במחזור הפעולה ומפקחים על זמינותם הספציפית לרקמה בתוך תאים3. תירוקסין (T4), המשמש כפרוהורמון, וטריאודותירונין (T3), הצורה הפעילה, ממלאים תפקידים חיוניים בוויסות הוצאת אנרגיה, גדילה, תהליכים התפתחותיים וויסות חום בגוף4. איזופורמי ה-DIO שונים במאפייני ספציפיות אתר הדיאודינציה, תכונות קינטיות והעדפות המצע3. DIO1 הוא איזופורם הדיאודינאז העיקרי בכבד בוגר ומפגין זיקה חזקה לסובסטרט לטריאודותירונין הפוך (rT3) ויודותירונינים סולפטיים, בעוד ש-DIO2 משתמש בעיקר ב-T4 ו-rT3, ו-DIO3 פועל בעיקר על T4 ו-T3. שימוש במיקרוזומים של כבד אנושי וב-rT3 כסובסטרט מאפשר זיהוי סלקטיבי של פעילות DIO1, ומפחית הפרעות מאיזופורמים אחרים. בעוד שההשלכות המדויקות של עיכוב DIO1 המושרה על ידי חומרים עדיין לא ברורות במלואן, עדויות ממוטציות גנטיות אנושיות המשפיעות על DIO1 מראות בבירור ש-DIO1 יכול לשבש את מערכת הורמון בלוטת התריס5. כתוצאה מכך, יש צורך קריטי בשיטות חזקות וניתנות לשחזור כדי לחקור עיכוב DIO1.

מטרת השיטה המוצגת היא לכמת את פעילות DIO1 במבחנה באמצעות גישה קולורימטרית לא-רדיואקטיבית המבוססת על תגובת סנדל-קולתוף (SK). DIO1 מזרז את ההמרה של rT3 הפוך ל-T2, תהליך שמוביל לשחרור יוני יודיד. תגובת SK מאפשרת זיהוי רגיש של היודיד המשתחרר, ומאפשרת לקבוע את פעילות שחרור היודיד (IRA) כמדד ישיר לפעילות DIO1. בדיקה זו מאפשרת זיהוי השפעות מעכבות של חומרים ניסיוניים על DIO1, ותומכת בטוקסיקולוגיה מכנית, סקר או קבלת החלטות רגולטורית. הוא רלוונטי במיוחד לחקירת עיכוב DIO1 כאירוע מולקולרי שמתחיל מסלולי תוצאות שליליות המוביל להפרעות בבלוטת התריס, כפי שמפורט במאמצי אימות בינלאומיים כגון אלו שתואמו על ידי EURL ECVAM 6,7. השיטה פותחה במקור בשנת 2012 8,9 ואופטימיזציה נוספתשל 6,7 בתגובה לצורך הגובר בבדיקות פנימיות עמידות, שכפוליות וניתנות להרחבה, שניתן לשלב בסוללות בדיקה לסקר אנדוקריני, במיוחד בהקשר של מטבוליזם הורמון בלוטת התריס. לאחרונה פורסם יישום של מערכות אנלוגיות מבוססות SK לסינון בינוניות 10 ועד תפוקהגבוהה 11, מה שמדגים את היישום הרחב של הגישה מבוססת SK.

למרות שמבחן DIO1-SK מודד בעקיפין פעילות DIO1 על ידי כימות IRA ולא מוצרי TH, הוא מציע מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות. בניגוד לשיטות המסתמכות על סובסטרטים מתויגיםברדיו 12 או על כימות מבוסס ספקטרומטריית מסה של הורמוני בלוטת התריס13 המדולדלים או הנוצרים, תגובת SK מספקת קריאה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית על ידי מדידת שחרור יודידים ב-415 ננומטר14. בעוד ששיטות LC-MS/MS עם חילוץ בפאזה מוצקה (SPE-LC-MS/MS) מציעות ספציפיות ורגישות גבוהות לכמת rT3 ו-T2, הן דורשות מכשור יקר ופחות מתאימות לסינון בקצב תפוקה גבוה. לעומת זאת, ניתן ליישם את מבחן DIO1-SK במסגרת מעבדה סטנדרטית והוא אומת מראש לשימוש עם מיקרוזומי כבד אנושי, מה שמראה שחזוריות וחיזוי גבוהים 6,7. במחקר השוואתי, תוצאות תגובת SK, ובמיוחד שחרור יודיד, הושוו ישירות לכימות מטבוליטים של הורמון בלוטת התריס (rT3 ו-T2) באמצעות SPE-LC-MS/MS 15. הממצאים חשפו התאמה חזקה בין שתי הגישות במגוון חומרי בדיקה ועוצמות עיכוב. לכל החומרים שנבדקו, שינויים בפעילות שחרור היודיד (IRA) שנמדדו על ידי תגובת SK השתקפו במידה רבה בשינויים ברמות rT3 ו-T2 שנקבעו על ידי ספקטרומטריית מסה. דבר זה תמך עוד יותר בתוקף קריאת SK כתחליף לפעילות DIO1. ניתוחים השוואתיים אלו מאשרים כי מבחן SK מספק אלטרנטיבה איתנה ואמינה לטכניקות אנליטיות מורכבות יותר, וכי ניתן למדוד את שחרור היודיד בביטחון כדי להעריך את עיכוב DIO1 במבחנה.

עם זאת, לשיטת SK יש מגבלות מסוימות שיש לקחת בחשבון: היא רגישה להתערבות מחומרים שמכילים יודיד חופשי כזיהום, משחררים יודיד באופן לא אנזימטי, או מגיבים עם רכיבי בדיקה כמו דיתיותרייטול (DTT). DTT נכלל כקו-פקטור מפחית לשמירה על יכולת קטליטית של דיאודינאז על ידי תמיכה בהתחדשות של סלנוציסטאין באתר הפעיל במצבו המופחת במהלך תקופת המחזור. מכיוון ש-DTT הוא רדוקטנט חזק, חומרים מסוימים (או זיהומים) עשויים לעבור תגובות רדוקס שיכולות להשפיע על הקריאה הקולורימטרית ובמקרים מסוימים להוביל לתוצאות בדיקה התלויות ב-DTT שאינן קשורות לשחרור יודידים אנזימטיים. הפרעות כאלה עלולות להוביל לתוצאות שליליות שגויות בעיכוב DIO1, שכן ייתכן שהיודיד הנמדד אינו נובע מההמרה האנזימטית של rT3. לכן, בעוד שבדיקת SK מתאימה לסינון שגרתי ולרוב חומרי הבדיקה, ניתן להשתמש ב-LC-MS/MS לאישור כאשר יש חשד להפרעה לבדיקה או לחומרים בעלי תכונות כימיות מורכבות.

מבחן DIO1-SK נמצא כעת בהכנה להכללה כהנחיית מבחן של ה-OECD בפרויקט PEPPER בינלאומי (פלטפורמה ציבורית-פרטית לאימות שיטות אפיון מפריעות אנדוקריניות), המדגיש את חשיבותו הגוברת ליישומים רגולטוריים ולתיאום בינלאומי של אסטרטגיות בדיקות משבש אנדוקריני. הבדיקה עשויה להיות משולבת בסוללות מבחנה מקיפות, התומכות הן בהערכת בטיחות כימית והן בחקירות מכניות של הפרעות אנדוקריניות16. כאשר משולבים עם בדיקות המטפלות באירועים מרכזיים נוספים לאורך מסלול התוצאה השלילית של בלוטת התריס, היא תורמת להבנה מלאה יותר של מנגנוני הפרעה בהורמון בלוטת התריס.

בנוסף, יכולת ההרחבה והשחזור הגבוה של הפרוטוקול הופכים אותו למתאים מאוד לסינון בקצב בינוני עד גבוה. זה חיוני להערכת כמויות גדולות של חומרים במהלך פיתוח תרופות ובמסגרות אקדמיות, כפי שהודגם לאחרונה11. חוקרים המתעניינים בעיכוב DIO1, בין אם לצורך סקר, טוקסיקולוגיה מכנית או קבלת החלטות רגולטורית, ייהנו מבדיקה חזקה, נגישה ורב-שימושית. האימות של שיטה זו יהפוך אותה לכלי סטנדרטי למחקר על הפרעות במערכת הורמוני בלוטת התריס ולהערכת בטיחות כימית.

פרוטוקול

הערה: לפני ביצוע הבדיקה הראשית, סדרת שלבים מקדימים חיונית כדי להבטיח את הדיוק, השחזוריות והתקפות של מבחן DIO1-SK. פעילויות הבדיקה כוללות יציקת החלפת יונים, לוחות סינון מלאים בשרף, שהם קריטיים להפרדה יעילה ולמזעור הפרעות רקע בתגובת ה-SK. תגובת סנדל-קולטהוף מתוקנת באופן קבוע באמצעות עקומות סטנדרטיות של יודידים למעקב אחר שינויים שיטתיים ושמירה על איכות הבדיקה. הפעילות של מיקרוזומי כבד אנושי נמדדת כדי לקבוע את יכולת שחרור היודיד הספציפית לאצווה הספציפית, ובכך להבטיח ביצועים אנזימטיים עקביים בין הניסויים. יחד, שלבים אלו מספקים בסיס איתן לעבודת הבדיקה המרכזית והערכת הנתונים הבאה, ותומכים ביצירת תוצאות ניתנות לשחזור ולפרשנות.

1. עבודת קדם-בדיקה

  1. הכנת מאגרים ומגבים
    1. הכינו מראש את כל המאגרים ופתרונות המלאי כפי שמתואר בטבלה 1. אחסן אליקווט כפי שמצוין כדי להבטיח יציבות ושחזור.
    2. ביום הבדיקה, הכינו את תערובת המצע טרייה לכל צלחת עם 96 בארות. ללוח עם 96 בארות אחד, יש לשלב 5.75 מ"ל בופר HEPES/EDTA (50 מ"מ HEPES, 2.16 מ"מ EDTA, pH 7.0), 0.5 מ"ל של 1 מ"מ DTT מופשל, ו-10 מיקרוליטר של 6 מ"מ rT3 (מומס ב-DMSO). ערבבו בעדינות והשאירו את המצע על קרח עד השימוש.
  2. הכנת ההפניה
    1. הכינו תמיסת מלאי של 10-1 מטר של יחידת בקרת ייחוס 6-PTU בממס מתאים (למשל, DMSO) טרי ביום ביצוע הבדיקה.
    2. הכינו דילול 1:10 של המלאי הזה ב-diH2O (RI-C8) כדי להגיע לריכוז DMSO של 10% ולהכין סדרת דילול ממאגר זה ב-10% DMSO ב-diH2O כפי שמתואר בטבלה 2.
  3. הכנת הבקרה החיובית
    1. הכינו תמיסת מלאי של 10-2 מ' של אורותיוגלוקוז בשליטה חיובית בממס מתאים (למשל, DMSO) ואחסנו אותה עד 6 חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. ביום הבדיקה, יש לדלל את המלאי ל-10-3 מיליון ב-diH2O כדי להגיע לריכוז DMSO של 10% DMSO.
  4. הכנת השליטה השלילית
    1. הכינו תמיסת מלאי של 10-2 מטר של מלח נתרן 1-Thio-β-D-גלוקוז עם שליטה שלילית ביום ביצוע הבדיקה.
    2. ביום הבדיקה, יש לדלל את המלאי ל-10-3 מיליון ב-diH2O כדי להגיע לריכוז DMSO של 10% DMSO.
      הערה: תמיד יש להשתמש באמצעי זהירות מתאימים, במיוחד בעת טיפול בכימיקלים מסוכנים כמו נתרן ארסניט וחומצה גופרתית. כל התגובות צריכות להיות מוכנות עם מים דה-יוניים ומאוחסנות בהתאם להמלצות היצרן. תערובת המצע, לאחר ההכנה, והאליקווט המופשר של DTT מיועדים לשימוש חד-פעמי ביום הבדיקה ואין להקפיא מחדש.
  5. יציקת שרף חילוף יונים
    1. השתמשו במיכל מלבני שקוף מתאים להכנה.
    2. הוסיפו כ-250 גרם (או הכמות הרצויה) של שרף חילוף יונים למיכל גדול ושטפו. לשטוף על ידי הוספת 10% חומצה אצטית; תן למתלה השרף לנוח 10 דקות.
    3. לאחר שנתתי למתלה להתייצב ל-10 דקות, הטה מעט ושאוף את הסופרנאנט. לשטוף לפחות 5 פעמים בסך הכל או עד שצבע לא דולף לממס.
    4. לאחר שלב הכביסה האחרון, הוסיפו 10% חומצה אצטית כך שתהווה בערך 50% מהנפח הכולל.
    5. הטה את המיכל כך שהשרף יזוז לצד אחד וייצב את המיכל במצב המוטה. חכה ~10 דקות עד שהשלבים יתפזרו.
    6. הניחו לוח סינון עם 96 בארות מעל פלטת באר בעומק 96 ומוסיפים 100 מיקרוליטר חומצה אצטית 10% לכל באר של לוח המסנן עם 96 הבארות.
    7. חתכו את הקצוות המשמשים ליציקת שרף בגובה ~1 ס"מ להרחבת הפתח בקצה ויצקו 300 מיקרו-ליטר של שרף חילוף יונים לכל באר בלוח המסנן עם 96 בארות.
      הערה: הקצוות בעבודתנו מגיעים לנפח מרבי של 1,200 מיקרוליטר וניתן לחבר אותם לפיפטות רב-ערוציות.
    8. מפעילים את החומצה האצטית על ידי צנטריפוגה ללוח באר בעומק 96 עם 100–200 × גרם בצנטריפוגה עם רוטור מתנדנד לצלחות מיקרוטיטר למשך דקה אחת. בדוק אם השרף מפוזר באופן שווה על הלוח.
    9. אטום את הפלטה עם יריעת פלסטיק אטומה ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מקסימום של 6 חודשים.
      הערה: ידוע כי רכיבי שרף חילוף יונים משפיעים על תגובת SK אם לא נשטפים כראוי. הסופרנטנט שהוסר יכול לשמש ישירות בתגובת SK (שימוש ב-50 מיקרוליטר של דגימת סופרנטנט, הוספת 50 מיקרוליטר סריום, ולבסוף 50 מיקרוליטר תמיסת ארסן) וניתן להשוות אותו לדגימת חומצה אצטית של 10% (בקרה ריקה) כדי להבטיח שטיפה מלאה של הרכיבים.
  6. תקנון תגובת סנדל-קולתוף
    1. הכינו דילול יודידים ממקור יודיד מתאים (למשל, תמיסת יודיד סטנדרטית) עם ריכוזים מומלצים של 1,500, 1,000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 ו-1 ננומטר יודידים באמצעות תקן יודיד מתאים ב-diH2O.
    2. הוסף 50 מיקרוליטר diHטהור 2O כבקרה ו-50 מיקרוליטר מדולול היודיד המוכן לפלטת 96 בארות בשלושה עותקים כפי שמתואר בפריסה באיור 1.
    3. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סריום של 40 מ"מ מולן לכל הבארות והתחל את התגובה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת ארסניט של 25 מ"מ מולר לכל הבארות.
    4. בהקדם האפשרי לאחר הוספת תמיסת הארסניט, יש למדוד את הספיגה באמצעות קורא לוחות ב-415 ננומטר (±2 ננומטר) על ידי רישום הצפיפות האופטית (OD) כל דקה במשך 21 דקות, וכן רישום הצפיפות האופטית הראשונית.
    5. הערך את התוצאות כפי שמתואר בסעיף 4.
      הערה: בדרך כלל, רקע שלΔOD 21 דקות > 0.3 בבקרת diH2O טהורה ידרוש תשומת לב ובדיקה נוספת של הגורמים הבסיסיים (למשל, זיהום ב-A או Ce-buch, איכות מים נמוכה).
  7. הערכת פעילות מיקרוסום
    1. הכינו את הריכוז הגבוה ביותר (RI-C8) של פריט הייחוס (6-PTU) כפי שמתואר בשלב 1.2.
    2. הכינו את ששת דילול המיקרוסום כפי שמתואר בטבלה 3 ואת תערובת הסובסטרט כפי שמתואר בטבלה 1.
    3. הוסף 10 מיקרוליטר מדילול ממס של 10% (v/v) ב-diH2O (למשל, 10% DMSOב-diH 2O) ו-10 מיקרוליטר של 10-2 M 6-PTU (RI-C8) לפלטת 96 בארות בשלושה עותקים כפי שמתואר בפריסת הלוחות באיור 2.
    4. הוסף 40 מיקרוליטר של דילול מיקרוסום ב-diH2O (מה שמוביל ל-20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.68 ו-0 מיקרוגרם חלבון מיקרוזומלי לכל באר) ללוח עם 96 בארות כפי שמוצג בפריסת הלוחות.
      הערה: הספקים בדרך כלל מספקים את ריכוז החלבון המיקרוזומלי במלאי. אם לא, ייתכן שישתמשו בשיטות כימות חלבון סטנדרטיות, אם כי לא השתמשנו בהן במחקר זה.
    5. הוסף 50 מיקרוליטר תערובת מצע טרייה לכל באר ואטום את הצלחת עם יריעת פלסטיק בלתי חדירה.
    6. הניחו את לוח 96 הבארות על שייקר באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ב-850 סל"ד) ודגרו במשך 2 שעות.
    7. לאחר זמן הדגירה, שים את הצלחת על קרח כדי לעצור את התגובה.
    8. בצע את חילוף היונים בדומה לשלב 2.2.
    9. העבר כמויות מתאימות של דגימה מהבאר העמוקה שהתקבלה בשלב החלפת היונים ללוח חדש עם 96 בארות למדידת דילול לא מדולל (50 מיקרוליטר דגימה), 1:2 (25 מיקרוליטר דגימה + 25 מיקרוליטר של 10% חומצה אצטית), ו-1:4 (12.5 מיקרוליטר דגימה + 37.5 מיקרוליטר של 10% חומצה אצטית), תוך שמירה על סידור הלוחות ללא שינוי.
    10. הערך את התוצאות כפי שמתואר בסעיף 4 וקבע את גורם הדילול לדגימות בחומצה אצטית 10% וכן את ריכוז החלבון המיקרוזומלי שעדיין מוביל לערכי ΔOD21min -BG הגבוהים ביותר בתגובת Sandell-Kolthoff מבלי להגיע לרמת הרוויה.
      הערה: בדרך כלל, שחרור יודידיםשל ΔOD 21 דקות > 0.5 ניתן להשגה בקלות בדילול חומצה אצטית 1:4 או 1:2 של 20 מיקרוגרם חלבון מיקרוזומלי לכל דגימת באר, ובדרך כלל נע סביב ΔOD21 דקות של 1. ריכוזי חלבון מיקרוזומלי גבוהים אינם מומלצים לשימוש, שכן הם מגדילים את הקשר הרקעי והלא ספציפי במהלך הבדיקה. מומלץ לחזור על מדידת סדרת דילול 6-PTU באמצעות ריכוז מיקרוזום וגורם דילול שנקבעו כדי לאשר את התוצאה.
  8. הערכת מסיסות של פריטי בדיקה
    1. המיס את פריט הבדיקה ב-100 מ"מ או 200 מ"ג/מ"ל בממס מתאים (למשל DMSO) בטמפרטורת החדר. ערבב או מערבב ובודק את ההתמוססות חזותית (מיקרוסקופ).
    2. אם הוא לא מומס, סוניקט עד 5 דקות ובדוק שוב. אם עדיין לא מומס, חמם ב-37 מעלות צלזיוס עד 60 דקות ובדוק שוב.
    3. אם אינו מסיס, יש לדלל עוד או להכין ציור חדש בריכוז נמוך יותר ולחזור על ההליך. אם DMSO לא מתאים, נסה מים או אתנול כממסים חלופיים.
    4. לאחר המיסה, הכינו דילול של 1:10 ב-diH2O (10% ממס) וחזרו על ההערכה (ערבוב, סוניקציה, חימום לפי הצורך).
    5. כדי לדמות את תנאי הבדיקה, יש להכין דילול פריט בדיקה של 1% במאגר הבדיקה ולחזור על בדיקת המסיסות.
  9. הכנת פריטי בדיקה ומציאת טווח
    1. הכינו את תמיסת המלאי של פריט הבדיקה בריכוז המסיס הגבוה ביותר בממס מתאים (רצוי DMSO), כפי שנקבע במהלך הערכת המסיסות בשלב 1.8.
    2. למבחן מציאת טווח, יש להכין שמונה דילול פריטי בדיקה באמצעות שלבי דילול עוקבים של 1:10 (v/v) באמצעות תמיסת המלאי ו-10% DMSO ב-diH2O.
    3. בצע את בדיקת מדידת הטווח כדי להעריך את פרופיל העיכוב של פריט הבדיקה על ידי ביצוע השלבים המתוארים בסעיף 2. אם פריט הבדיקה מראה עיכוב של ≥25% בכל ריכוז, יש להתאים את טווח הריכוזים לריצות הבדיקה הסופיות כך שיכלול לפחות שלושה ריכוזים בטווח העיכוב הליניארי ושני ריכוזים מתחת ל-10% IRA, אם רלוונטי.
    4. אם פריט הבדיקה מראה עיכוב של <25% בכל הריכוזים שנבדקו, יש להשתמש שוב באותה סדרת דילול לריצות הבדיקה הסופיות. במקרה זה, מבחן מציאת הטווח עשוי להיחשב כאחד משלושת ריצות הבדיקה העצמאיות הנדרשות.
      הערה: בצע לפחות שניים, רצוי שלושה, ניסויים עצמאיים לכל פריט בדיקה כדי להבטיח שחזוריות ואמינות התוצאות. אם בוחרים דילול אחר כדי לכסות טוב יותר את טווח הפעילות, מותרת סטייה מיחס הדילול של 1:10. סף ה-25% באסטרטגיית בדיקה זו (ראו שלבים 1.9.3 ו-1.9.4) מבדיל השפעות פריטי בדיקה מביקורת שליליים, תוך התחשבות בשונות הפעילות הבסיסית תוך מתן מרווח בטיחות נוסף. סף זה מבטיח סיווג אמין של פרופילי מעכבים.

figure-protocol-1
איור 1: פריסת לוחות עבור עקומת תקן יודית. איור זה מציג את פריסת לוחות 96 בארות המשמשת ליצירת עקומת תקן היודיד. בארות מכילות דילול סדרתי של יודיד הנעים בין 1 ננומטר ל-1,500 ננומטר, וכן בקרות diH2O-בלבד.  אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-2
איור 2: פריסת הלוחות לטיטרציה של חלבונים מיקרוזומיים ובדיקת פריטי ייחוס. איור זה מציג את פריסת לוח 96 בארות לטיטרציה מיקרוזומלית של חלבונים ובדיקת מעכבי ייחוס (6-PTU). שורות מכילות כמויות הולכות וגדלות של חלבון מיקרוזומלי בכל באר, עם ובלי 6-PTU.  אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

2. ביצוע בדיקת DIO1–SK

  1. דגירה מיקרוזומית עם פריט בדיקה
    1. הכינו את פריט ההתייחסות כפי שמתואר בשלב 1.2, וכן את הבקרה החיובית והשלילית, כפי שמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4. הכינו את פריטי הבדיקה בריכוזים מתאימים בהתאם לפרוטוקול המתואר בשלבים 1.8 ו-1.9.
    2. הכינו את תערובת הסובסטרט כפי שמתואר בטבלה 1 והכינו תסף מיקרוזום בריכוז החלבון המוגדר מראש לפי שלב 1.7 על ידי דילול תמיסת מיקרוזום מופשרת בקפידהב-diH 2O. שמרו את תמיסת המיקרוסום על הקרח עד שצריך לדגירה.
    3. בהתאם לפריסות הלוחות המוצגות באיור 3 ובאיור 4 (אם מוערכים יותר משני פריטי בדיקה בו-זמנית) הוסף 10 מיקרוליטר של ריכוזי פריטי ייחוס, בקרה חיובית ושלילית, בקרת ממס (10% (v/v) בממסב-diH 2O), וריכוזי פריטי בדיקה לבארות.
    4. הוסיפו 40 מיקרוליטר מתלים מיקרוסום לכל הבארות. הוסיפו 50 מיקרו ליטר מתערובת המצע הטרייה לדגימות.
    5. אטום את הפלטה עם יריעת פלסטיק בלתי חדירה והנח אותו על שייקר באינקובטור (37°C ב-850 סל"ד) למשך 2 שעות; הנח את הפלטה אחרי הדגירה על הקרח כדי לעצור את התגובה.
    6. הנח את הפלטה על הקרח לאחר הדגירה כדי לעצור את התגובה.
      הערה: ניתן לאחסן את הפלטה על קרח עד למדידה כדי לשמור על שלמות הדגימה. לוח הבדיקה הראשון מכיל שמונה ריכוזים של פריט הייחוס, בעוד שכל לוח נוסף באותו יום מכיל רק את הריכוז הגבוה ביותר של פריט הייחוס, מה שמשאיר יותר מקום לפריטי בדיקה נוספים במידת הצורך.
  2. הפרדה באמצעות לוחות מסנן 96 בארות מלאים בשרף חילוף יונים
    1. הניחו לוח מסנן מוכן מלא בשרף חילוף יונים, כפי שהוכן בשלב 1.5, מעל פלטת באר בעומק 96 והוסיפו 150 מיקרוליטר של חומצה אצטית 10% לכל באר של לוח פילטר 96 בארות ממולא שרף חילוף יונים כדי להרטיב את השרף בעמודות.
    2. הוציא את החומצה האצטית על ידי צנטריפוגה לתוך לוח הבאר בעומק 96 עם 100–200 × גרם בצנטריפוגה עם רוטור מתנדנד החוצה לפלטות מיקרוטיטר למשך דקה.
    3. החלף את לוח הבאר המשמשת בעומק 96 בלוח באר חדש בעומק 96.
    4. הוסף 133 מיקרוליטר של חומצה אצטית 10% לכל באר של לוח 96 בארות מודגר מהשלב 2.1.6 ונער את הצלחת בקצרה לערבוב התמיסות.
    5. העבר 175 מיקרוליטר מהדגימות שהוכנו בשלב הקודם ללוח מסנן 96 בארות ממולא שרף חילוף יונים, תוך שמירה על פריסת הלוחות הראשונית.
    6. העבר את הדגימות דרך השרף אל לוח הבאר בעומק 96 על ידי צנטריפוגה (100–200 × גרם) בצנטריפוגה עם רוטור מתנדנד לצלחות מיקרוטיטר למשך דקה. הסר את לוח המסנן הממולא בשרף עם 96 בארות.
      הערה: לוח הבאר בעומק 96 עם דגימות ניתן לאטום עם יריעת פלסטיק בלתי חדירה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך לפחות 3 חודשים. זה מאפשר מדידות נוספות במקרה של טעויות ידניות/טכניות או שינויים במקדם הדילול בתגובה או מדידה של סנדל-קולטהוף בימים הבאים.
  3. תגובת סנדל-קולתוף
    1. בהתאם לפקטור הדילול שנקבע של הדגימות בחומצה אצטית 10% עבור אצווה מיקרוזום (ראו שלב 1.7), יש להוסיף 50 מיקרוליטר מהדגימה הלא מדוללת או מדוללת כראוי לפלטת 96 בארות חדשה.
    2. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת סריום של 40 מ"מ (שהוכנה כפי שמתואר בטבלה 1) לכל הבארות והתחל את התגובה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של תמיסת ארסניט של 25 מ"מ (שהוכנה כפי שמתואר בטבלה 1) לכל הבארות.
    3. בהקדם האפשרי לאחר הוספת תמיסת הארסניט, יש למדוד את הספיגה באמצעות קורא לוחות ב-415 ננומטר (±2 ננומטר) על ידי רישום צפיפות האופטיקה (OD) כל דקה במשך 21 דקות, וכן רישום ה-OD הראשוני.

figure-protocol-3
איור 3: פריסת הלוחות לבדיקה מקבילה של שני פריטי בדיקה. פריסת לוח 96 בארות לבדיקת שני פריטי בדיקה בשלושה עותקים בריכוזים שונים, יחד עם שכפולים של בקרות שליליות, חיוביות וממס ופריט ייחוס. שימש כלוח הבדיקה הראשון של היום. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-4
איור 4: פריסת לוח לבדיקה מקבילה של שלושה פריטי בדיקה. פריסת לוחות של 96 בארות לבדיקת שלושה פריטי בדיקה בשלושה שכפולים בריכוזים שונים, עם שכפולים של בקרות שליליות, חיוביות וממסים. פריט ההתייחסות נכלל רק בריכוזו הגבוה ביותר, שכן הוא נבדק במלואו על הלוח הראשון (ראו איור 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. בדיקת הפרעות (± מיקרוזומים ו-DTT ±)

  1. הכינו את הריכוז הגבוה ביותר (RI C8) של פריט הייחוס (6 PTU) כפי שמתואר בשלב 1.2 והכינו את תמיסת המלאי של פריט הבדיקה ודילול (כולל הריכוז הגבוה ביותר של פריט הבדיקה).
  2. הכינו את מתלי המיקרוזום בריכוז המוגדר לכל באר (ראו שלב 1.7) על ידי דילול מיקרוזומים מופשרים ומופרדים ב-diH2O. שמרו את המיקרוזום על קרח עד לשימוש.
  3. הכינו שתי תערובות תת-מצע: תערובת מצע סטנדרטית עם DTT כפי שמתואר בטבלה 1, ותערובת מצע זהה ללא DTT (ללא DTT בלבד).
  4. יש להזרים לבארות המיועדות לוח באר 96 לפי איור 5: 10 מיקרוליטר של RI C8, 10 מיקרוליטר של 10% (v/v) DMSO ב-diH2O (בקרת ממס), ו-10 מיקרוליטר מכל דילול פריט בדיקה.
  5. יש להוסיף 40 מיקרוליטר של מיקרוזום מתלים לבארות המסומנות "עם מיקרוזומים" ו-40 מיקרוליטר diH2O לבארות המסומנות "ללא מיקרוזומים", לפי איור 5.
  6. על קרח, יש להוסיף 50 מיקרוליטר תערובת מצע עם DTT לבארות המסומנות "עם DTT" ו-50 מיקרוליטר של תערובת המצע ללא DTT לבארות המסומנות "ללא DTT" (איור 5).
  7. אטום את הפלטה עם יריעת פלסטיק בלתי חדירה ודגר על שייקר באינקובטור (37°C, 850 סל"ד) למשך 2 שעות.
  8. לאחר הדגירה, מניחים את הצלחת על קרח כדי לעצור את התגובה.
  9. בצע הפרדת חילוף יונים וכימות יודידים באמצעות תגובת SK כפי שמתואר בשלבים 2.2 ו-2.3, והעריך את התוצאות כפי שמתואר בסעיף 4.
    הערה: מערכת לוח אחת זו (איור 5) בודקת את ריכוז פריט הבדיקה הגבוה ביותר במקביל לבין ללא מיקרוזומים ועם לעומת ללא DTT כדי להבחין בין פעילות DIO1 אנזימטית לבין ארטיפקטים של הבדיקה. עלייה ב-IRA ≥20% בבארות ללא מיקרוזומים" מצביעה על הפרעת SK (שחרור/קריאה של היודיד ללא תלות ב-DIO1), והחומר מסווג כ"לא ישים במבחן DIO1 SK" ואינו מופיע בניתוח. הבדלים בין תנאי DTT לבין ללא DTT מסייעים לזהות שחרור יודידים התלוי ב-DTT כמנגנון הפרעות נוסף.

figure-protocol-5
איור 5: פריסת הלוחות לבדיקת הפרעות. איור זה מציג את פריסת לוחות 96 בארות לבדיקות התאבכות, שבה פריטי בדיקה, פריטי ייחוס ובקרת ממס נבדקים הן עם מיקרוזומים והן בלי מיקרוזומים בנוכחות DTT וכן ללא מיקרוזומים וללא נוכחות DTT. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. הערכת נתונים

  1. הערכת פעילות DIO1
    1. קבעו את ערכיΔOD של 21 דקות על ידי חיסור ערכי 21 הדקות של כל הדגימות מהערכים הראשוניים שנמדדו (0 דקות):
      figure-protocol-6
    2. קבעו את ערכי ΔOD-BG על ידי חיסור ממוצע ערכיΔOD 21 דקות של 10 הבקרות המעוכבות של 10 M 6-PTU (RI) מערכי ΔOD21 דקות של כל הדגימות:
      figure-protocol-7
    3. נרמול ערכי פריט הבדיקה לערכי בקרת הממס המתאימים באמצעות חלוקה של ערכי פריט(ים) הבדיקה (TI) ΔOD21min-BG לפי ממוצע ערכי ΔOD21min -BGSC של בקרת הממס (SC) המתאימה, ויצירת ערכי פעילות שחרור יודיד (IRA) באחוזים.
      figure-protocol-8
    4. צייר את ערכי ה-IRA של הריכוזים השונים של פריטי הבדיקה בחבילת תוכנה לסטטיסטיקה, כאשר ערכי ה-IRA על ציר ה-y (ליניארי) וריכוזי פריטי הבדיקה על ציר ה-x (לוגריתמי).
    5. השתמשו באלגוריתם התאמת עקומה כדי להמחיש קשר ריכוז-תגובה (למשל, "[מעכב] לעומת תגובה -- שיפוע משתנה (ארבעה פרמטרים)" בתוכנה סטטיסטית מועדפת. "Top" מייצג את התגובה המקסימלית, "Bottom" מייצג את התגובה הנמוכה ביותר, ו-"HillSlope" מתאר את תלילות העקומה:
      figure-protocol-9
    6. קבע את ה-IC50 של פריט ההתייחסות ואם רלוונטי, של פריט הבדיקה.
    7. חשב את מקדם השונות (CV) של אומדן log IC50 של פריט ההתייחסות ב-%:
      figure-protocol-10
    8. חשב את ה-IRA של הבקרה השלילית המנורמלת לבקרת הממס ב-%:
      figure-protocol-11
    9. חשב את ה-IRA של הבקרה החיובית המנורמלת לבקרת הממס ב-%:
      figure-protocol-12
    10. חשב את גורם z':
      figure-protocol-13
    11. כדי לבדוק את תקפות הניסוי, השווה את הערכים המחושבים לקריטריוני הקבלה בטבלה 4.
      הערה: יש לעמוד בכל הקריטריונים כדי לקבל ריצת בדיקה תקפה.
    12. סווג את פריטי הבדיקה כמעכבים מלאים, מעכבים חלקיים או לא-מעכבים בהתבסס על העיכוב המקסימלי שלהם וערכי IC50 , כפי שמסוכם בטבלה 5.

תוצאות

איור 6 מספק סקירה של תהליך הבדיקה של DIO1-SK ואת שלבי התקינה המרכזיים הנדרשים להקמת השיטה בהצלחה במעבדה. תהליך העבודה (איור 6A) מסכם את השלבים הסדרתיים של הבדיקה, כולל שימוש במיקרוזומים של כבד אנושי, דגירה עם פריטי בדיקה ובקרות, הפקת יודידים באמצעות הפרדת יונים, וכימות יודידים קולורימטריים באמצעות תגובת סנדל–קולתוף (SK). איור 6B מדגיש את אסטרטגיית התקינה שמבססת על ביצועים חזקים ותוצאות תקפות, כולל (i) תקנון תגובת SK, (ii) בדיקות פעילות מיקרוזום ספציפיות לאצווה, (iii) הערכת מסיסות ובדיקות הפרעות, (iv) בדיקת מדידת טווח, ו-(v) התאמת ריכוזי פריטי בדיקה בהתבסס על הרצת הבדיקה הראשונה התקפה.

מרכיב מרכזי באסטרטגיה זו הוא בדיקת פעילות מיקרוזומלית ספציפית לאצווה, שכן אצוותי מיקרוזום כבד אנושיים יכולים להיות שונים משמעותית בפעילות הדיאודינציה של rT3, מה שמחייב לקבוע ריכוז אנזימים מתאים לכל אצווה חדשה לפני בדיקות החומרים השגרתיות.

אסטרטגיית הבדיקה המדורגת הזו קריטית ליישום: רק לאחר אימות ביצועי הבדיקה הבסיסיים (בקרות, התנהגות תגובת SK ופעילות מיקרוזום) ותנאי הבדיקה סטנדרטיים, ניתן לצפות מבדיקות החומרים להניב פרופילי עיכוב תקפים וניתנים לפרשנות.

figure-results-1
איור 6: שלבי תהליך הבדיקה והסטנדרטיזציה של DIO1 SK. (א) תהליך העבודה ממחיש את השימוש במיקרוזומי כבד אנושיים, הקמת לוח 96 בארות, דגירה עם פריטי בדיקה ובקרות, חילוץ יודידים וכימות קולורימטרי באמצעות תגובת SK. כל שלב מתואר ברצף כדי להדגיש את השלבים המרכזיים של הבדיקה. (ב) שלבי התקינה כוללים תקנון תגובת סנדל-קולטוף, בדיקת פעילות מיקרוזומים ספציפית לאצווה, הערכת מסיסות ובדיקות הפרעות, בדיקת מדידת טווח, והתאמת ריכוזי פריטי הבדיקה בהתבסס על הרצת הבדיקה הראשונה התקפה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בהתבסס על זרימת העבודה ומסגרת התקינה המוצגת באיור 6, איור 7 ממחיש כיצד מעבדות קובעות ריכוז חלבון מיקרוזומלי מתאים (ודילול לאחר חילופי יונים) כדי להשיג טווח דינמי מספק תוך שמירה על תגובת עיכוב סיגמואידי עבור מעכב הייחוס. באיור 7A, ΔOD21min-BG עולה עם עלייה בחלבון מיקרוזומי ותלוי בדילול לאחר חילופי היונים (לא מדולל, 1:2, 1:4). הדילול שמניב את ה-ΔOD21min-BG הגבוה ביותר תוך שמירה על תגובה סיגמואידלית נבחר לניסויים הבאים (דוגמה: דילול 1:2). באיור 7B, עקומות עיכוב 6-PTU מושוות בין כמויות חלבון מיקרוזומלי כדי לזהות את ריכוז החלבון הנמוך ביותר שעדיין מניב עקומת סיגמואיד (דוגמה: 5 מיקרוגרם חלבון לבאר), ובכך מאזנת בין רגישות לרקע.

חשוב לציין, שלב האופטימיזציה הזה חייב להתבצע על ידי כל מעבדה בעת יישום השיטה, שכן ריכוז החלבון הנדרש תלוי בפעילות האצווה של המיקרוזום בשימוש, מה שמחייב תקנון ריכוז אנזימים ספציפי לאצווה בלבד.

figure-results-2
איור 7: פעילות מיקרוזומלית ועיכוב על ידי 6-PTU. (A) הגרף מראה את העלייה בפעילות כאשר אות Sandell-Kolthoff מתוקן על ידי הרקע (BG) (ΔOD21 דקות n-BG) עם כמויות הולכות וגדלות של חלבון מיקרוזומי בכל באר (log10[μg חלבון/באר]), שנבדק בדילול לא מדולל, 1:2 ו-1:4. הדילול הגבוה ביותר עם ערך ΔODהגבוה ביותר של 21 דקות BG, וכן עם צורה סיגמואידלית, ישמש לניסויים עתידיים. במקרה הזה, זה דילול 1:2. (B) עקומת ריכוז-תגובה של המעכב 6-פרופיל-2-תיוראציל (6-PTU) המראה פעילות שחרור יודידים (IRA באחוז) מוצגת מול log10[ריכוז (M)] בעומסי חלבון מיקרוזומליים שונים (5, 7.5 ו-10 מיקרוגרם חלבון לבאר). ערכי IRA מנורמלים לבקרת הממס. נקודות הנתונים של שני הגרפים מייצגות ממוצע ± SD של שלושה שכפולים טכניים (בארות) לכל מצב מבדיקת פעילות מיקרוזום מייצגת אחת. העקומות הותאמו באמצעות רגרסיה לא ליניארית באמצעות מודל לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים ("שיפוע משתנה") (מעכב לעומת תגובה). ריכוז החלבון הקטן ביותר עם עקומת סיגמואיד ישמש לניסויים עתידיים; במקרה זה, 5 מיקרוגרם לבאר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לאחר שתהליך העבודה והסטנדרטיזציה (איור 6) הושלמו ונקבע ריכוז חלבון מיקרוזומלי מתאים עבור אצווה נבחרת של מיקרוזום (איור 7), פרמטרי הבדיקה המרכזיים מוכנים לביצוע בדיקות שגרתיות של חומרים. בשלב זה, ניתן להעריך פריטי בדיקה לצד קבוצת בקרת הלוחות (פריט ייחוס, בקרת ממס ובקרות חיוביות/שליליות) בפורמט לוח סטנדרטי, מה שמאפשר נרמול חזק ופרשנות עקבית של פרופילי עיכוב.

איור 8 מראה הבחנה בין בדיקות בהתבסס על התנהגות ריכוז-תגובה בפעילות שחרור יודידים (IRA). מעכב הייחוס 6-PTU (איור 8A) מראה ירידה תלויה בריכוז ב-IRA, ומספק את פרופיל העיכוב הסיגמואידי הצפוי, כפי שמצופה לאימות ביצועי הבדיקה. חומצה טנית (איור 8B) מציגה פרופיל מעכב הדומה למעכב הייחוס (עיכוב מרבי > 90%) בתנאים המוצגים. שלושת הריכוזים הגבוהים ביותר של חומר הבדיקה הציגו ערכי IRA שליליים. ערכי IRA <0% אינם משקפים 'שחרור יודידים שלילי' ביולוגי משמעותי אלא נובעים מהליך החישוב (חיסור רקע ונרמול לבקרת הממס), שיכול להפיץ תנודות קטנות בבקרת הממס לערכים שליליים ומנורמלים. בהתאם לכך, ערכי IRA מתחת ל-0% נחשבים כשוויים ל-0% (קו בסיס) לפרשנות התוצאה. דיבוטילפתלאט (איור 8C) אינו מציג עיכוב (עיכוב מקסימלי מתחת ל-25%) בטווח הריכוז שנבדק, ומייצג פרופיל לא-מעכב. יחד, פרופילים אלו ממחישים שהבדיקה יכולה להבדיל בין התנהגות מעכבת ללא-מעכבת בתנאים סטנדרטיים. מערכת הבדיקה יכולה גם לזהות מעכבים חלקיים, שמראים רמות עיכוב מקסימליות בין 25% ל-90% (הנתונים אינם מוצגים). פרטים נוספים על אופן הסיווג הללו ניתן למצוא בטבלה 5.

figure-results-3
איור 8: התנהגות תגובה במינון של בדיקת DIO1–SK מבדילה בין מעכבים ללא-מעכבים. עקומות מינון-תגובה מראות פעילות שחרור יודידים (IRA באחוזים) בציור מול ריכוז log10 (M) עבור (A) המעכב הייחוס 6-PTU, (B) מעכב מייצג (חומצה טניק), ו-(C) לא מעכב מייצג (דיבוטיל פתלאט). ערכי IRA חושבו לאחר חיסור הרקע ונרמלו לבקרת הממס. סמלים מייצגים ממוצע ± SD (n = 3) מניסוי עצמאי אחד, שכל אחד מבוצע עם שלושה שכפולים טכניים (בארות) לכל ריכוז. העקומות הותאמו באמצעות רגרסיה לא ליניארית באמצעות מודל לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים ("שיפוע משתנה") (מעכב לעומת תגובה). ערכי IRA מתחת ל-0% נחשבים שקולים ל-0% (קו בסיס) לפרשנות התוצאה. נתונים אלו מראים כי הבדיקה מניבה פרופיל עיכוב סיגמואידי למעכב הייחוס ויכולים לאשר האם עקומת ריכוז-תגובה היא מעכבת או לא מעכבת בתנאים סטנדרטיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בהרצת בדיקה תקפה, בקרות ממס (SC) מציגות הפרדה ברורה של21 דקות בין האות למצב ההתייחסות המעוכב לחלוטין (6-PTU, RI-C8). במאגר נתונים לדוגמה (10 ריצות עצמאיות), כל לוח כלל n = 9 שכפולים טכניים עבור SC וההתייחסות המלאה (6-PTU ב-10−3 מ'). על פני הלוחות, ערכי SC ΔOD21 דקות של ממוצע צלחת נעו בין 1.383 ל-1.819 (ממוצע ± SD: 1.565 ± 0.114), בעוד שערכי ממוצע ΔODשל 21 דקות למצב 6-PTU מעוכב נעו בין 0.258 ל-0.771 (ממוצע ± SD: 0.473 ± 0.087). חישוב ΔOD במבחן זה מבוסס על ההפרש בין OD0min ל-OD 21min, ותוקף הבדיקה נתמך בדרך כלל על ידי סף z′ של >0.5.

ב-10 ריצות בדיקה עצמאיות, 6-PTU יצר עקומת ריכוז-תגובה סיגמואידלית עם ערכי IC50 בטווח 1.20E-06 M עד 5.02E-06 M (ממוצע SD ±: 2.74E-06 M ± 1.13E-06 M). קריטריוני הקבלה לערכי IC50 בטווח ההתייחסות 1.00E-06 עד 1.00E-05 מבוססים על נתונים ממחקרי אימות קודמים. עם זאת, ערכי IC50 מושפעים משמעותית מהאצווה הספציפית של מיקרוזום ועשויים להציג שונות משמעותית. עם זאת, צפוי שהשינויים הללו יישארו באותו סדר גודל.

ניתן לסכם את איכות הבדיקה באמצעות גורם z′, המשקף הן את חלון האות והן את השונות של הבקרות. במאגר הנתונים המתואר, שישה עקומות ייחוס היו קשורות לגורמי z′ שנעים בין 0.544 ל-0.774 (ממוצע ±SD: 0.658 ± 0.062), בהתאם ליעד הקבלה הנפוץ של z′ > 0.5.

בפועל, ניתן לזהות ריצות לא אופטימליות על ידי סטיות ברקע הבדיקה ו/או אי עמידה בקריטריוני קבלה מוגדרים מראש. לדוגמה, רקע גבוה בתגובת Sandell-Kolthoff מצוין כאשר ה-diH₂O הטהור מראה ΔOD > 0.3, מה שמצדיק בדיקה (למשל, זיהום תגובתי או בעיות איכות מים). עליות רקע כאלה יכולות להפחית את טווח הדינמי של הבדיקה ולהעלות שונות בקרת, ובכך לתרום לכישלון בקריטריוני קבלה, כולל מקדם z′ מתחת ל-0.5. בארות המציגות ארטיפקטים טכניים ברורים (למשל, משקעים או שינוי צבע לא תקין) לא נכללות כחריגות מההערכה. חריגים שנקבעו באמצעות בדיקת חריגות ב-boxplot גם הם אינם כלולים. אם קריטריוני הקבלה אינם מתקיימים לאחר הסרת החריגות, הרצת הבדיקה נחשבת ללא תקפה ויש לחזור עליה.

ריאגנט/בופרמידע על ההכנה
תמיסת אמוניום חומצית (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0.5 M H2SO4) (250 מ"ל)הוסיפו 6.32 גרם (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O ו-125 מ"ל diH2O לבקבוק נפחי של 250 מ"ל. הוסף 125 מ"ל 1 מטר H2SO4 כדי להגיע לנפח סופי של 250 מ"ל. אחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
DTT (אליקווטים של 1 מטר)אליקווט הוא תמיסת DTT של 1 מטר מוכן או מסופק ב-H2O כ-0.5 מ"ל לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ומאוחסנת בטמפרטורה של -20°C עד 6 חודשים.
בופר HEPES (50 מ'מ') / EDTA (2.16 מ'מ') (pH 7.0)באמצעות בקבוק נפחי של 250 מ"ל, הוסיפו 12.5 מ"ל תמיסת HEPES של 1 מ"ל, 201 מ"ג אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) ומלאו עד 250 מ"ל ב-diH2O. אחסן בטמפרטורה של 4°C עד 3 חודשים.
תמיסת rT3 ("צינורות תערובת מצע")המיס rT3 ב-DMSO לריכוז סופי של 6 מ"מ, פרש אותם במנות של 10 מיקרוליטר בצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל ואחסן אותם בטמפרטורה של -20°C עד 6 חודשים.
תמיסת נתרן ארסניט (25 מ"מ מ' NaAsO2, 0.8 מיליון NaCl, 0.5 מיליון H2SO4) (250 מ"ל)הוסף 0.81 גרם NaAsO2, 11.7 גרם NaCl ו-125 מ"ל diH2O לבקבוק נפחי בנפח 250 מ"ל. הוסף 125 מ"ל 1 מטר H2SO4 כדי להגיע לנפח סופי של 250 מ"ל. אחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.

טבלה 1: הכנת מאגרים ותגובות. טבלה זו מפרטת את שלבי ההכנה והוראות האחסון לכל המאגרים ותמיסות המלאי המשמשות במבחן DIO1 SK, כולל בופר HEPES/EDTA, DTT, תמיסת rT3, תמיסת אמוניום חומצית, ותמיסת ארסניט נתרן.

שם דילול פריט הייחוסריכוז דילול פריט ייחוס [M]10% DMSO [μL]פריט התייחסותריכוז סופי של פריט ייחוס במבחן [M]
RI-C81.00E-0245050 מיקרוליטר של תמיסת פריט ייחוס 10-1 מטר1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 מיקרוליטר של RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 מיקרוליטר RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 מיקרוליטר של RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 מיקרוליטר של RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 מיקרוליטר של RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 מיקרוליטר של RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 מיקרוליטר של RI-C21.00E-08

טבלה 2: הכנת דילול פריטי ייחוס. טבלה זו מסכמת את הכנת הדילול הסדרתי לפריט הייחוס (6-PTU), כולל ריכוזים, נפחי DMSO והריכוזים הסופיים ששימשו בבדיקה.

מיקרוזום לכל באר [מיקרוגרם]diH2O [μL]דילול מיקרוזום [μL]ריכוז האנזים הסופי במבחן [μg/mL]
2078020 מיקרוליטר של תמיסת מקור מיקרוזום 20 מ"ג/מ"ל200
10400400 מיקרוליטר של מיקרוזום של 20 מיקרוגרם לכל דילול באר100
5400400 מיקרוליטר של מיקרוזום של 10 מיקרוגרם לכל דילול באר50
2.5400400 מיקרוליטר של מיקרוזום של 5 מיקרוגרם לכל דילול באר25
1.25400400 מיקרוליטר של מיקרוזום של 2.5 מיקרוגרם לכל דילול באר12.5
0.68400400 מיקרוליטר של מיקרוזום של 1.25 מיקרוגרם לכל דילול באר6.8

טבלה 3: הכנת דילול מיקרוסומים. טבלה זו מספקת את שיטת הדילול לחלבון מיקרוזומלי לכל באר, כולל נפחי diH₂O ותמיסת מלאי מיקרוזום הנדרשים להשגת ריכוזי החלבון המיקרוזומלי הסופיים לבדיקה.

קריטריוני קבלהערך חיתוך מוצע
נומרי
IC50 של פריט ייחוס [M]1*10-05 - 1*10-06
קורות חיים של לוגריתם, IC50 , אומדן פריט ייחוס [%]< 3
שליטה שלילית ב-IRA [%]80 - 120
בקרת IRA חיובית [%]< 20
z'-פקטור> 0.5
בינארי
צורת פריט ההתייחסות (סיגמואידלי?)כן
עקומת הריכוז-תגובה הסופית של פריט הייחוס מורכבת ממינימום שישה ריכוזים משלושה שכפוליםכן
עקומת הריכוז-תגובה הסופית של פריט הבדיקה מורכבת ממינימום שישה ריכוזים משלושה שכפוליםכן

טבלה 4: קריטריוני קבלה למבחן DIO1 SK. טבלה זו מפרטת את קריטריוני הקבלה לתוקף הבדיקה כגון טווח IC₅₀, מקדם השנות, ערכי IRA לבקרות, גורם z', ודרישות לעקומות ריכוז-תגובה. חלונות הקבלה נגזרו ממחקרי אימות DIO1-SK שדווחו קודםלכן 6, כולל הערכת שחזוריות המבוססת על חמש ריצות עצמאיות שהשפיעו על חלון IC₅₀ הייחוס. במאגר נתונים לדוגמה של 10 ריצות עצמאיות, ביצועי z′ פקטורים נעו בין 0.544 ל-0.774 (ממוצע ±SD: 0.658 ± 0.062), ותומכים בסף הקבלה של z′ שמשמש כאן.

קטגוריה (לפי יעילות)תת-קטגוריה (לפי עוצמה)פעילות עיכובסף
קטגוריה 1: מעכב מלאת: מעכב מלא עוצמתימעכב לחלוטין פעילות DIO1 בריכוז השווה לפריט הייחוס 6-PTUעיכוב מקסימלי גבוה יותר מ-90% ו-IC50 בטווח העליון או מתחת לטווח IC50 של 6-PTU
ב: מעכב מלא חלשמעכב לחלוטין את פעילות DIO1 בריכוזים גבוהים יותר מפריט הייחוס 6-PTUעיכוב מקסימלי גבוה יותר מ-90% ו-IC50 מעל הטווח העליון של IC50 של 6-PTU
קטגוריה 2: מעכב חלקי-אין עיכוב מלא, אבל יותר משלילי ושליטה בממסעיכוב מקסימלי בין 25% ל-90%
קטגוריה 3: לא מעכב-לא מעכב DIO1 (כמו שליטה שלילית וממסים)עיכוב מקסימלי מתחת ל-25%

טבלה 5: סיווג פריטי בדיקה בהתבסס על עוצמת העיכוב והיעילות של DIO1. פריטי הבדיקה מסווגים לשלוש קבוצות יעילות (מלאות, חלקיות או לא-מעכבות) בהתבסס על העיכוב המרבי שלהם של פעילות DIO1. מעכבים מלאים מסווגים עוד לפי עוצמה, בהתאם ל-IC₅₀ שלהם ביחס לפריט הייחוס 6-PTU.

דיון

מבחן DIO1-SK מספק חלופה לא רדיואקטיבית, חסכונית וניתנת להרחבה לשיטות המסורתיות להערכת פעילות DIO1, כגון בדיקות מסומנות רדיו או ספקטרומטריית מסה. האימות המוקדם שלו למיקרוזומי כבד אנושי והתאמה חזקה למדידות SPE-LC-MS/MS של רמות הורמוני בלוטת התריס מאשרים את אמינותו ואת הרלוונטיות הרגולטורית שלו, כפי שמשתקף בהכללתו בתוכנית העבודה של ה-OECD לבדיקות הנחיה. הפשטות של תגובת סנדל-קולטהוף (SK) הופכת את הבדיקה לנגישה למעבדות ללא מכשור מתקדם.

בפרוטוקול הנוכחי, מספר היבטים מעשיים הוגדרו בפירוט רב יותר לעומת נהלי DIO1-SK שפורסמו קודם לכן, כדי לתמוך עוד יותר בעמידות ושחזוריות בפורמט שגרתי של 96 בארות. הבהרות אלו מתמקדות בהיגיון של מושג הבקרה (בקרות ממס, שליליות וחיוביות), בהחלטה להשתמש בלוחות שרף של חילוף יונים שהוכנו לאחרונה במקום להשתמש מחדש בלוחות יצוקים קודמים, ובתנאי תגובת SK המשפרים את עמידות הטיפול במדידות לוחות מרובי בארות, תוך שמירה על עקביות הפרשנות הביולוגית עם עבודות התקינההקודמות 6,7.

למרות חוזקותיו, יש לנקוט במספר שלבים קריטיים כדי לכמת במדויק את כמות היודיד שמשתחרר במהלך ההמרה המתווכת DIO1 של rT3 ל-T2. זה מושג באמצעות תגובת סנדל-קולתוף, שדורשת תזמון מדויק וטיפול עקבי בתגובות כדי להבטיח שחזוריות. תגובת SK היא תהליך קטליטי מהיר שבו יודיד מאיץ את הפחתת הסריום הצהוב (IV) לצריום חסר צבע (III) על ידי ארסניט; קצב שינוי הצבע פרופורציונלי ישירות לריכוז היודיד. מכיוון שהתגובה מתקדמת במהירות לאחר הוספת תמיסת הארסן, חיוני שהמדידה תתחיל ללא עיכוב. בפורמט של לוחות של 96 בארות, תוספת איטית או לא עקבית של תמיסת הארסן יכולה לגרום לשונות משמעותית בין הבארות. לכן, מומלץ בחום להשתמש בפיפטה רב-ערוצית או במתקן אוטומטי כדי להבטיח תוספת אחידה ומהירה של תגובות בכל הבארות.

כדי למקסם את ההשוואה בין בארות ובין לוחות, יש לשמור על סדר הוספת התגובות בתגובת SK בהתאם לזרימת העבודה המתוארת: סריום נמצא כמצע כרומוגני, והתגובה מתחילה על ידי הוספת ארסניט, שמגדירה את זמן ההתחלה ולכן דורשת זריקה מהירה ומסונכרנת. פקודות הוספת מגיב חלופיות לא הוערכו במערך זה; לכן, שינוי הסדר אינו מומלץ בעת שחזור הפרוטוקול. בנוסף, ריכוז הסריום יכול להשפיע על מאפייני הביצועים המעשיים של קריאת ה-SK (למשל, חלון אות ועמידות). בעוד ש-25 mM cerium הוגדר כתנאי תקן מאומת במהלך תקנון הבדיקה הקודמת, ריכוזים גבוהים יותר כמו 40 mM הוכחו כמגבירים את חלון האות ואת מקדם z′ מבלי להשפיע על ערכי IC50 או על הפרשנות הביולוגית, כפי שתואר כבר בעבודותקודמות 6. בפרוטוקול זה, 40 מ"מ צריום משמש להבטחת קומפלקס יודידים מלא ומהיר בתנאי הבדיקה ולשיפור החוסן והיציבות של האותות במדידות שגרתיות מבוססות לוחות. קריטריוני הקבלה (למשל, גורם z′, ערכי IC50 של מעכב הייחוס) מבוססים על ביצועים היסטוריים שנצפו במחקרי אימות קודמים ומיועדים לשמש כבדיקת ביצועים שגרתית במבחן.

השימוש במיקרוזומי כבד אנושי יוצר שונות ביולוגית, מה שהופך את תקנון פעילות שחרור היודיד הספציפית לאצווה של מיקרוזום לחיוני. הכנה זהירה של לוחות מסנן מלאים בשרף חילוף יונים נחוצה כדי למנוע פיזור שרף לא אחיד על פני לוח הסינון ולהבטיח הפרדה מלאה של יודיד מחומרים שעלולים להתערב. ביחס לזרימת העבודה של השרף, נבחרו לוחות סינון חדשים, הממולאים בשרף להחלפת יונים, כדי למזער את הסיכון לשונות נוספת הנובעות מרוויית שרף, העברת יודידים או חלבונים, ואובדן אפשרי של יעילות הקשירה בשימוש חוזר. שימוש חוזר בשרף וללוחות סינון הוא אפשרי טכנית, אך ייתכן שהוא טומן בחובו סיכונים שלא הוערכו באופן שיטתי במחקר זה. ייתכן שזה יגרום לסטייה בין אצווה אם קיבולת הקישור לשרף מופחתת או אם רכיבי מטריצה שנותרו בשכבת השרף לאחר ריצות קודמות. למעבדות השוקלות מיחזור, המלצה פרגמטית היא לאמת את ביצועי השרף לאחר שימוש חוזר (למשל, על ידי ניטור רקע והתנהגות עקומה סטנדרטית והבטחת קליטת יודידים עקבית) ולהפסיק שימוש חוזר אם נצפתה רקע מוגבר, טווח דינמי מופחת או הפרדה לא עקבית. מומלץ להשתמש בלוחות סינון מלאי שרף לשימוש חד-פעמי, שכן פרוטוקול זה פותח במיוחד על פי שיטה זו.

בנוסף, יש לקבוע את המסיסות של כל פריט בדיקה ברכב מתאים, שכן הריכוז המקסימלי שנבדק מוגבל על ידי המסיסות (בדרך כלל עד 1 מ"מ עם 1% DMSO). מכיוון שכל תרכובות הבדיקה מיושמות ב-DMSO כממס, בקרת הממס מגדירה את פעילות DIO1 הבסיסית בתנאים רלוונטיים לבדיקה ומשמשת כתנאי ההתייחסות המתאים ביותר לנרמול והשוואה. לעומת זאת, מלח נתרן 1-תיו-β-D-גלוקוז נכלל כבקרה שלילית משום שהוא דומה מבנית לאורוטיוגלוקוז הבקרה החיובית (ATG) אך כימי אינו פעיל ביחס לדיאודינציה של יודותירונין ואינו מפריע למערכות חמצון מיקרוסומליות או לפעילות הקטליטית DIO1. הכללתו מסייעת להבחין בין השפעות ספציפיות אמיתיות ל-DIO1 לבין השפעות לא ספציפיות הקשורות להוספת תרכובות, טיפול או אינטראקציות במטריצות הבדיקה. בקרה ללא טיפול/ללא כלי רכב לא שימשה כתנאי ייחוס עיקרי, משום שלא שיקפה את סביבת הבדיקה האמיתית שבה נמצא DMSO בכל בארות הטיפול המורכבות; לכן, בקרת הממס היא קו הבסיס הרלוונטי לפרשנות הבדיקה.

פתרון תקלות מתמקד בזיהוי הפרעות בתגובת ה-SK. חומרים המכילים יוד, כילטים או מחמצנים חזק עשויים להשפיע באופן מלאכותי על הקריאה הקולורימטרית 14,17,18. כדי להתמודד עם זה, הפרוטוקול כולל בדיקות הפרעות ללא מיקרוזומים. יתרה מזאת, השימוש בדיתיוטרייטול (DTT) כקופקטור יכול גם להוביל לשחרור יודידים לא אנזימטיים מחומרים מסוימים של הבדיקה. במקרים כאלה, שיטות אורתוגונליות כמו SPE-LC-MS/MS מומלצות לאישור עיכוב DIO1. הפרעות לא ספציפיות באמצעות השפעות דנטורציה כלליות (למשל, סורפקטנטים) יכולה לגרום לתוצאות חיוביות שגויות, ולכן אסטרטגיה כללית לזיהוי מכות תכופות, באמצעות כלי סיליקו או שיטות בדיקה משולבות, יכולה להיות בעלת ערך.

לבדיקה יש מספר מגבלות. הוא רגיש להתערבות מחומרים ניסיוניים שמגיבים עם רכיבי בדיקה או משחררים יודיד באופן עצמאי מפעילות DIO1. הבדיקה אינה מבחינה בין עיכוב ספציפי של DIO1 לבין הפרעה לא ספציפית בתפקוד האנזים או בשלמות המבנית. לשיפור הספציפיות, ניתן לנתח עיכוב של אנזימים מיקרוזומליים נוספים במקביל, והשוואת עוצמות מעכבות בין מבחני אנזימים שונים עשויה לספק ראיות נוספות.

אסטרטגיה נוספת לזיהוי ארטיפקטים אפשריים היא לכלול בדיקות שלמות או כדאיות, כפי שמבוצע לעיתים קרובות במבחנים מבוססי תאים במבחנה , כדי להגדיר את ריכוז הבדיקה המרבי. למרות שחסר בדיקת שלמות ישירה במבחן DIO1-SK, השימוש בו בתוך סוללת בדיקה במבחנה מאפשר אינטגרציה של נתוני ציטוטוקסיות מבדיקות תאיות אחרות כדי להנחות את בחירת הריכוז. אם אין מידע כזה על בדיקות צולבות זמין, הריכוז העליון במבחן DIO1-SK מוגבל על ידי מסיסות, שעשויה שלא לשקף חשיפות ב-vivo רלוונטיות. עם זאת, ניתן להשתמש בגישות טוקסיקוקינטיות להגדרה ופרשנות טובה יותר של ריכוזי בדיקות במבחנה.

מבחן DIO1-SK בעל ערך מיוחד בסקר טוקסיקולוגי ובמחקרים מכניים של הפרעות אנדוקריניות. הוא מתייחס לאירוע מרכזי בהומאוסטזיס הורמונלי בלוטת התריס וניתן לשלבו בסוללות בדיקות חוץ-גופיות. החוזקות, השחזוריות וההתאמה שלו לסביבות מעבדתיות וצרכי תפוקה שונים הופכים אותו לכלי חשוב להערכת בטיחות כימית ולאימות רגולטורי. הבדיקה מספקת מדד חוץ גופי חזק לעיכוב DIO1 בתנאים סטנדרטיים ותומכת בסיווג חומרי בדיקה ביחס למעכב ייחוס מאופיין היטב (6-PTU). עם זאת, נתוני ה-in vivo על עיכוב DIO1 נדירים, ולכן הקשר הישיר בין תוצאות עיכוב DIO1 במבחנה לבין השפעות in vivo אינו רלוונטי כיום להערכת חיזוי in vivo. בהתאם לכך, תוצאות הבדיקה צריכות להיות מפורשות כראיות מכניות להפרעה לאירוע מרכזי אחד במטבוליזם הורמון בלוטת התריס ולשלב אותן עם קווי ראיות נוספים (למשל, בדיקות MoA נוספות של בלוטת התריס ומדידות אורתוגונליות במידת הצורך). חשוב לציין כי מבחן DIO1–SK הוערך במספר מחקרים ממוקדי אימות (אופטימיזציה/סטנדרטיזציה, הערכת חיזוי וניתוח עמידות/דיוק)6,7,15, וככל שהשיטה מתקדמת ליישום OECD, המאמר הנוכחי מספק רמת פירוט פרוצדורלי שלב אחר שלב שמטרתה להקל על העברה ויישום עקבי בין מעבדות נוספות.

גילויים

המחברים K.S., N.H, D.F.-W. ו-R.L. הם עובדים של BASF SE, חברת כימיקלים, שעשויה להשתמש במבחן DIO1 לפיתוח ורישום מוצרים מסחריים בעתיד.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר אנדראס ובר על עבודתו במהלך הקמת מבחן DIO1-SK.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-תיו-&בטא;-D-גלוקוז, מלח נתרןסיגמא-אלדריץ'T6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-טריאודותירונין (rT3) ביוטכנולוגיה של סנטה קרוזSC-209692CAS 5817-39-0
6-פרופיל-2-תיוראציל (6PTU)סופלקוP3755-10GCAS 51-52-5
חומצה אצטיתתרמו פישר9526-33CAS 64-19-7
איזון אנליטיNANAמסוגל לשקול בדיוק עד 30 גרם עם קריאות של 0.1 מ"ג
תחמוצת נתרן ארסן (NaAsO2)תרמו פישר041533.APCAS 7784-46-5
לוחות בדיקה (פורמט 96 בארות)מרקZ707902-108EAלדוגמה, לוחות תרבית רקמה, לוח 96 בארות, תחתית שטוחה, פוליסטירן, 0.34 ס"מ רבוע, סטרילי, 108/cs, TPP
אורותיוגלוקוז (ATG)סיגמא-אלדריץ'A0606-5MGCAS 12192-57-3
צינורות צנטריפוגה 15 ו-50  mLמרקZ707724-800EA, Z707716-320EAלדוגמה, צינורות צנטריפוגות TPP, נפחים 15 ו-50 מ"ל, פוליפרופילן,  
צנטריפוגה עם רוטור מתנדנד החוצה לפלטות מיקרוטיטרNANAצריך להיות גבוה מספיק כדי להכיל לוח באר בעומק 96 עם לוח סינון של 96 בארות למעלה (לפחות כ-6 ס"מ גובה)
סריום (IV) אמוניום סולפט (Ce(NH4)4(SO4)4)סיגמא-אלדריץ'22269-100G-FCAS 10378-47-9
חממת CO2NANAמסוגל לשמור על טמפרטורות של 37&°G; C, 5% CO2 ו-&GE; 90% לחות
לוחות באר עמוקים (פורמט 96 בארות)סופלקו575653-Uלדוגמה, לוח איסוף באר ריבועי SPE 96 עמוק, נפח באר 2 מ"ל, פוליפרופילן
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)AppliChemA3672,0250CAS 67-68-5
דיתיותרייטול (DTT)סיגמא-אלדריץ'D9779-1GCAS 3483-12-3
אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) סיגמא-אלדריץ'APO456787707-500GCAS 6381-92-6
לוחות סינון (פורמט 96 בארות)מרקWHA77002810לדוגמה: מיקרו-פלטות, 96 בארים, פוליסטירן שקוף, 800 ומיקרו; L, קישור DNA, וואטמן
אטמי לוחות אטומים לגזתרמו פישר232698לדוגמה: סרט איטום, פוליאסטר, סטרילי, סרט איטום, פוליאסטר, סטרילי, Nunc
HEPESפאן ביוטקP05-01100CAS 7365-45-9
מיקרוסומי כבד אנושיביוויטX008070לדוגמה, מיקרוסופים של כבד כבד אנושי שנאספו על ידי תורמים INVITROCYP 150
יודיד (תקן IC)סופלקו41271-100MLלדוגמה, תקן יודיד ל-IC, 1000 מ"ג/ליטר במים, סיגמא-אלדריץ'
שרף להחלפת יונים כמו Dowex 50WX2רות'334.4CAS 12612-37-2; רשת 100-200
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5  mLמרקEP0030120086-1PAKלדוגמה: Eppendorf® צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, נפח 1.5 מ"ל, טבעי
מפיץ רב-ערוצי המסוגל לספק 50 עד 300 ו-nbsp; &; L לכל שלבNANANA
פיפטה רב-ערוצית המסוגלת לספק בין 10 ל-100  &; L לכל שלבNANANA
מד pH עם אלקטרודות ובופרי כיולNANAמסוגל לקרוא +/- יחידות pH של 0.1
פוטומטר למדידת ספיגהTecan Trading AGNAלדוגמה, קורא ספיגת זריחה, INSTSUN-3
פיפטים המסוגלים לספק 1 עד 10  &; LNANANA
פיפטים המסוגלים לספק 10 עד 100  &; LNANANA
פיפטים המסוגלים לספק בין 100 ל-1000 ו-nbsp; &; L NANANA
פיפטים לנפחים גבוהים יותרNANAפיפטות סרולוגיות, למשל 10, 25, 50 מ"ל
מנער פלטותתרמו פישרNAלדוגמה, לוח מיקרוטיטר Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER, נשלט ישירות
פיפטת משחזרNANANA
נתרן כלוריד (NaCl)סיגמא-אלדריץ'S9888-25GCAS: 7647-14-5, לדוגמה נתרן כלורי, תגובת ACS, ≥ 99.0 %
תוכנת סטטיסטיקהNANAמסוגל לבצע ניתוח רגרסיה המשקף מאפייני בדיקה ויכולת לחשב ריכוזים מעכבים, למשל GraphPad Prims 8, GraphPad
חומצה גופרתית (H2SO4) סופלקו1007311000CAS 7664-93-9
בקבוק וולומטריNANAמוסמך בנפח מוגדר

מקורות

  1. Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
  2. Yue, B., et al. Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study. J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).
  3. Köhrle, J. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).
  4. Zhang, J., Lazar, M. A. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).
  5. França, M. M., et al. Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism. Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).
  6. Weber, A. G., et al. Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).
  7. Weber, A. G., et al. A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).
  8. Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay. Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).
  9. Renko, K., et al. An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases. Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).
  10. Olker, J. H., et al. Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases. Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).
  11. Sane, R., et al. Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method. Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).
  12. Visser, T. J., Van Overmeeren, E. Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase. Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).
  13. Hindrichs, C., et al. A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma. Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).
  14. Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. A modified persulfate-arsenite method for manganese. Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).
  15. Stefanidis, K., et al. Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis. Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).
  16. Satya, S., et al. Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption. OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).
  17. Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine. Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).
  18. May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified. Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הערכה קולורימטרית של פעילות דיאודינאז 1 במיקרוזומי כבד אנושי באמצעות תגובת סנדל-קולטהוף
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.