מאמר שיטה

בידוד וזיהוי תאי סינוביאלים ראשוניים דמויי פיברובלסטים אצל מטופלים עם דלקת מפרקים שגרונית

533 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70116

⸱

24 בפברואר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השיטה לבידוד וזיהוי סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים ראשוניים בעלי טוהר גבוה מרקמת סינוביאלית של חולי דלקת מפרקים שגרונית, לצורך מידול מחלות אמין וסקר תרופות.

תקציר

דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המתאפיינת בהיפרפלזיה סינוביאלית והרס מפרקים מתקדם כמאפיין הפתולוגי העיקרי שלה. סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים (FLS) מוכרים כרכיבים תאיים מרכזיים בפתוגנזה של RA, המאופיין בהתנהגותם האגרסיבית הדמוית גידול, המתווכת הרס סחוס ועצם. הבידוד והטיהור של דלקת מפרקים שגרונית, סינוביוציטים דמויי סינובלסטים (RA-FLS) הם כלי קריטי לחקר מנגנוני מחלה ולהערכת תרופות טיפוליות פוטנציאליות. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף לבידוד, גידול ואימות פונקציונלי של RA-FLS ראשוני אנושי מדגימות רקמה סינוביאלית שנלקחו במהלך ניתוח החלפת ברך אצל מטופלי דלקת מפרקים שגרונית (RA). שיטה זו משתמשת ברקמה סינוביאלית טרייה ומשתמשת בתהליך עיכול אנזימטי רציף עם טריפסין וקולגנאז סוג II כדי למקסם את הבידוד של RA-FLS ממטריצת הרקמות. לבסוף, זיהוי התאים מושג באמצעות אימונופלואורסצנציה של וימנטין וציטומטריית זרימה, בתוספת הערכה פונקציונלית של התרבות מונעת מ-TNF-α. פרוטוקול זה מאפשר רכישת תרביות RA-FLS טוהרות עם תכונות פנוטיפיות ספציפיות ותגובתיות דלקתית, ומספק לחוקרים שיטה אמינה להשגת RA-FLS מתורבתים קצרי טווח, שמקורו במטופלים, המתאימים לסקר תרופות, מחקרים מכניים ויישומים בהנדסת רקמות.

מבוא

דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה דלקתית אוטואימונית כרונית המאופיינת בפוליארתריטיס סימטרי במפרקים היקפיים, עם שכיחות גלובלית מוערכת של 0.5%-1% ופוטנציאל לגרום לסיבוכים מערכתיים וחוץ-מפרקיים שונים 1,2,3,4,5. המאפיין הפתולוגי המרכזי של דלקת מפרקים שגרונית הוא דלקת סינוביטיס כרונית המתווכת על ידי תגובות אוטואימוניות, מה שמוביל עוד יותר להיווצרות רקמת פנוס פולשנית שמחליקה את סחוס המפרקים ואת עצם תת-כונדרלית 6,7. מבין אלה, סינוביטיס מייצגת את הסימן הפתולוגי המוקדם והמרכזי ביותר של דלקת מפרקים שרטונית (RA). סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים (FLS), החיים בתאים השוהים הדומיננטיים של הסינוביום, הם גורם מרכזי בארגון הן בדלקת סינוביאלית והן בהרס עצם 8,9. במהלך התגובה הדלקתית הסינוביאלית ב-RA, סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים (RA-FLS) בדלקת מפרקים שגרונית, מאבדים את הפנוטיפ ה"רגולטורי" הרגיל שלהם ומציגים במקום זאת פרופיל "פרו-דלקתי"10. שינוי זה מוביל לייצור עצום של ציטוקינים דלקתיים, שעשויים להפעיל מסלולי מטבוליזם אנרגיה קשורים, מה שמוביל להגברת התרבות התאים ולהעצמת מפל הדלקת הסינוביאלי 11,12,13. במקביל, RA-FLS מתקשר עם תאי חיסון אחרים (כגון מקרופאג'ים, תאי T ותאי B) כדי לשמור על מצב דלקתי כרוני מתמשך14,15. יתרה מזאת, RA-FLS מציג תכונות דמויי סרטן, כולל יכולת נדידה מוגברת, פולשניות, התרבות בלתי מבוקרת ועמידות לאפופטוזיס, ומעורב באופן פעיל בתהליכי סחוס ושחיקת עצם16.

בשנים האחרונות, FLS שימש באופן נרחב כמודלים במבחנה לחקר מחלות דלקתיות מפרקיים כגון דלקת מפרקים כמו RA, מגמה שמונעת בחלקה על ידי מגבלות התרופות הקו הראשון הנוכחיות 17,18,19. הם משמשים בתרביות דו-ממדיות, במודלים תלת-ממדיים ובמערכות איבר על שבב כדי לחקור מנגנוני מחלה, לאמת מטרות טיפוליות ולביצוע בדיקות סמים 20,21,22,23. יתרה מזאת, RAFLS משמש בסיס ליישומים מתקדמים, כולל אורגנואידים סינוביאליים שמקורם במטופל לחיזוי תגובת DMARDs; עריכה גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 לחקר תפקוד גנים בהתקדמות RA; וכמקור תאים להנדסת שתלים סינוביאלים פונקציונליים 24,25,26.

השגת RA-FLS בתרבות קצרה טווח מרקמת סינוביאלית של חולי דלקת מפרקים שגרונית מהווה את הצעד הראשון לניסויים רבים. בהשוואה לקווי תאים של FLS, RA-FLS קצר טווח שמקורו במטופלים שומרים על הטרוגניות בין מטופלים ומאפיינים ספציפיים למחלה, מה שמאפשר ייצוג אותנטי יותר של גורמים שעתוקיים הקשורים למחלה והבדלים רגולטוריים במסלול. כתוצאה מכך, תפוקת התאים, קצב הגדילה והביצועים התפקודיים עשויים להיות מושפעים מגורמים ספציפיים למטופל כגון גיל, משך המחלה, היסטוריית התרופות ופעילות המחלה, מה שמוביל למידה מסוימת של שונות בין אצוות. לכן על החוקרים להעריך את הרקע הקליני של מקור הרקמה לפני השימוש ולבצע ניסויים במעברים מוקדמים (P3-P7) לשמירה על יציבות פנוטיפית של התאים.

מחקר זה מפרט פרוטוקול יעיל להפקה וזיהוי RA-FLS מרקמת סינוביאלית בברך. השיטה עושה שימוש בעיכול אנזימטי רציף (טריפסין ואחריו קולגנאז סוג II) בשילוב עם דיסוציאציה מכנית עדינה. הראיות מצביעות על כך שאסטרטגיות אנזימטיות אופטימליות ורב-שלביות כאלה בדרך כלל עולות על טיפולים עם אנזימים בודדים או לא סדרתיים בתערובת אנזימים, מה שעלול לפגוע בחיוניות התאים ובפנוטיפ 27,28,29,30. בהשוואה לכך, הפרוטוקול המוצג מאפשר בידוד יעיל ועדין יותר של RA-FLS בעל עמידות גבוהה וטוהר גבוה, ומפחית נזק תאי ואובדן פנוטיפי כדי להבטיח התאמה לבדיקות פונקציונליות בהמשך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אסף רקמות סינוביאליות מחולי דלקת מפרקים שגרונית שעברו ניתוח החלפת מפרקים בבית החולים הידידות סין-יפן. כל המטופלים נתנו הסכמה מדעת בכתב לפני הניתוח. המידע והדגימות הביולוגיות שנאספו טופלו באמצעים מחמירים להבטחת פרטיות המטופלים ואבטחת המידע. כל דגימות רקמת סינוביאל שנותרו הושלכו בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית. השימוש ברקמת סינוביאלית במפרק הברך אצל חולי דלקת מפרקים שגרונית במחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לידידות סין-יפן (אישור מס' 2025-KY-223). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. רכישה והכנה של רקמת סינוביאלית

הערה: הניחו את הרקמה הסינוביאלית שהושגה במהלך הניתוח במיכל סטרילי מלא בתמיסת מלח 0.9% או PBS כדי למנוע זיהום במהלך ההעברה מחדר הניתוח לארון הבטיחות הביולוגית. השתמשו בטבילה באתנול ואחריה שטיפה עם תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין כצעדים קריטיים למניעת זיהום חיידקי או פטרייתי, כדי להבטיח את הצלחת הניסויים הבאים.

  1. טבלו רקמה סינוביאלית טרייה בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל PBS והעבירו אותה לארון בטיחות ביולוגית.
  2. העבר את רקמת הסינוביאלית לצלחת פטרי המכילה 75% אתנול וטבול במשך 30 שניות לחיטוי.
  3. הסר שומן ורקמת עצם מרקמת סינוביאל באמצעות מספריים וכירורגיים סטריליים ומלקחיים, ואז העבר את הרקמה שנותרה לצלחת תרבית חדשה.
  4. שטפו את הרקמה הסינוביאלית שהתקבלה 3 פעמים עם PBS המכיל 10% פניצילין/סטרפטומיצין.

2. עיכול רקמת סינוביאלית

הערה: השתמש בטריפסין כדי לשבש את הצמתים התאים ואת המטריצה החוץ-תאית ברקמה הסינוביאלית לצורך בידוד מאוחר יותר. יש להחיל קולגנאז מסוג II כדי לפרק באופן סלקטיבי את מבנה המטריצה החוץ-תאי, מה שמקל על ניתוק התאים מהמטריצה. סטריליזציה של כל המספריים, המלקחיים ומסנני התאים הנדרשים לפירוק רקמות סינוביאליות על ידי אוטוקלבינג לפני השימוש. לאחר העיכול, שברי הרקמה אמורים להיראות רפויים, עם קצוות פרומים, והמדיום עלול להפוך מעט עכור. רקמה לא מעוכלת תישאר קומפקטית ואטומה.

  1. טחנו את הרקמה שוב ושוב עם מספריים לחתיכות של 1 מ"מ × 1 מ"מ.
  2. הוסיפו 0.25% טריפסין לרקמה ועוכלו בטמפרטורה של 37°C במנער טמפרטורה קבוע (ב-100-150 סל"ד) או באינקובטור תאים למשך 30 דקות.
  3. הכינו תמיסה של 10% סרום בקר עוברי (FBS) באמצעות תמיסת מלח מפופר פוספט (PBS).
  4. העבר את הרקמה לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל או 50 מ"ל בהתאם לכמות הרקמה, ונטרל ומעכל אותה עם PBS המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS).
  5. צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), ואז משליכים את הסופרנטנט ושומרים את הכדור.
  6. תשהי מחדש את הכדור ב-PBS.
  7. צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), ואז משליכים את הסופרנטנט ושומרים את הכדור.
  8. הוסף 100 מ"ג קולגנאז מסוג II ל-50 מ"ל של מדיום DMEM להכנת תמיסת קולגנאז מסוג II של 2 מ"ג/מ"ל.
  9. סיננו את תמיסת הקולגנאז מסוג II המוכנה דרך ממברנה של 0.22 מיקרון לצורך עיקור.
  10. הוסף 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג II ומעכל במנער טמפרטורה קבועה של 37°C (ב-100-150 סל"ד) או באינקובטור תאים למשך 4 שעות.

3. בידוד ותרבות של סינוביוציטים דמויי פיברובלסטים

הערה: בצע את כל הליכי תרבית התאים על ארון בטיחות ביולוגית בתנאים סטריליים ולבש כפפות סטריליות למניעת זיהום.

  1. הכינו מדיום DMEM מלא על ידי תוספת של מדיום בסיס DMEM עם 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
  2. הניחו מסננת תאים בת 100 רשתות על צלחת פטרי סטרילית ושפכו את הרקמה הסינוביאלית המעכלכת והנוזל על המסננת.
  3. העבר את מסננת התאים עם הרקמה השארית לצלחת פטרי סטרילית אחרת.
  4. טחנו את הרקמה שנותרה על המסננת באמצעות קצה מוט בומפה סטרילי של 20 מ"ל עד שנשארו רק שאריות לבנות וסיביות, ולא ניתן להוציא תלות תא נוספות.
  5. שטוף את המסננת בנפח מתאים של מדיום DMEM מלא.
  6. אסוף את כל הסינון, הצנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), וזרוק את הסופרנטנט.
  7. החזירו את הכדור ל-PBS, בצנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליכו את הסופרנטנט.
  8. להחזיר את התאים למצב DMEM מלא.
  9. בצע ספירת תאים והעבר את התאים לבקבוק תרבית.
  10. דגרו את הבקבוקון באינקובטור תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
  11. החלף את המדיום אחרי 48 שעות.
  12. לעכל את התאים עם טריפסין ומעבר ביחס של 1:3 כשהם מגיעים לחיבור מלא.

4. זיהוי RA-FLS באמצעות צביעת וימנטין אימונופלואורסצנציה

הערה: חממו מראש את תמיסת ה-PBS המשמשת לשטיפת תאים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כל נפחי המגיב המפורטים בסעיף זה סטנדרטיים לפורמט לוחות של 48 בארות. הנפחים צריכים להיות מוגדלים באופן פרופורציונלי בהתאם לאזור הגדילה כאשר משתמשים בלוחות בפורמט שונה.

  1. עכלו תאים עם טריפסין, החזירו את התאים שנקטפו, ומדללים ל-1 ×-104 תאים לליטר באמצעות מדיום DMEM מלא.
  2. זרע RA-FLS לפלטת 48 בארות בקצב של 200 מיקרוליטר לבאר.
  3. הניחו אותו באינקובטור תרבית תאים (37 °C, 5% CO₂) ודגרו במשך 24 שעות.
  4. להשליך את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS מחומם מראש.
  5. הוסיפו 4% פרפורמלדהיד לקיבוע תאים למשך 10 דקות, זרקו את הקיבע, ושוטפים שלוש פעמים עם PBS.
  6. הכינו 150 מיקרוליטר של תמיסת טריטון X-100 של 0.1% ב-PBS לכל באר. ודאו ערבוב מלא על ידי מערבולת או היפוך עדין לפני השימוש.
  7. הוסיפו 0.1% תמיסת טריטון X-100 לבארות ודגרו במשך 10 דקות לחדירת התאים.
  8. זרוק את תמיסת Triton X-100 של 0.1%, ושטוף שלוש פעמים עם PBS.
  9. הוסיפו 150 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ללא בעלי חיים לבאר, דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  10. זרוק את פתרון החסימה. הוסף 150 מיקרול של תמיסת נוגדנים ראשונית לפעולה של וימנטין (מדוללת 1:200 בדילול נוגדנים) לכל באר.
  11. דגרו עם נוגדן ראשוני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  12. השליכו את הנוגדן הראשי ושטפו את התאים חמש פעמים עם PBS.
  13. הוסף 150 מיקרוליטר של נוגדן משני IgG אנטי-ארנב אלקסה פלואור 488-קונצוגטי (מדולל 1:50 בדילול נוגדנים אוניברסלי) לכל באר, ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה מוגנת מאור.
  14. זרוק את הנוגדן המשני ושטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
  15. הוסיפו טיפה אחת של מדיום התקנה אנטיפייד המכיל DAPI בכל באר, וייבשו 10 דקות בחושך.
  16. צפו וצילמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד ב-20× אובייקטיב ומערכות פילטרים מתאימים ל-DAPI ו-FITC/GFP.
    הערה: שטוף תאים עם PBS על ידי מילוי מלא של הבארות ב-PBS, דגירה למשך 5 דקות, ואז הסרת ה-PBS. הליך זה מהווה מחזור שטיפה אחד.

5. כימות RA-FLS והערכת טוהר באמצעות ציטומטריית זרימה

הערה: השתמשו בוימנטין ו-CD90 כסמנים חיוביים לזיהוי RA-FLS, תוך יישום CD68, CD14 ו-CD11b כאמצעי ביקורת שליליים כדי למנוע זיהום תאי חיסון. וימנטין משמש כחלבון פילמנט ביניים תוך-תאי ייחודי, הממוקם בעיקר בציטופלזמה של RA-FLS. CD90 משמש כסמן שטח קריטי המתבטא מאוד ב-RA-FLS, ומאפשר להבחין ביניהם לתאי החיסון. בעוד ש-CD68, CD14 ו-CD11b מתבטאים במיוחד במקרופאגים, מונוציטים ותאי מיאלואידים, הם משמשים כסמנים שליליים למניעת זיהום תאי חיסון. הקצו פלואורוכרומים לסמנים על פני התא בהתאם לספציפיות הקישור שלהם, ווודאו שאין חפיפה בתעלות הפלואורסצנציה. לדוגמה, בניסוי זה, CD90 ו-CD68 חולקים את אותו פלואורוכרום; לכן, אל תוסיפו אותם לאותו צינור צנטריפוגה. לפני דגירה עם נוגדן וימנטין, יש להוסיף סוכני קיבוע וחדירות כדי להפריע לממברנת התא. אם לציטומטר הזרימה יש מספיק תעלות פלואורסצנטיות, ניתן להקצות סמנים כמו CD90 ו-CD68 לערוצים שונים לניתוח סימולטני רב-צבעי לשיפור יעילות הגילוי ותוכן המידע.

  1. לעכל RA-FLS דור שלישי באמצעות טריפסין ללא EDTA.
  2. סיימו את העיכול עם מדיום DMEM מלא, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליכו את הסופרנטנט.
  3. החזירו את הכדור ל-PBS, בצעו ספירת תאים, וכווננו את ריכוז התאים ל-1 × 10⁶ תאים/מ"ל באמצעות PBS.
  4. פזר את התאים לשלושה צינורות צנטריפוגות, ומוסיפים לכל צינור 200 מיקרו ליטר של תליית תאים.
  5. הוסף נוגדן CD11b (מדולל 1:100 בדילול נוגדנים אוניברסלי) בנפח סופי של 100 מיקרוליטר לצינור 1. מערבולת לערבב.
    1. לאחר 15 דקות של דגירה, הוסף 1 מ"ל חומר קיבוע וחדירות לצינור 1, מערבב מערבב, ודגר 30 דקות מוגן מאור.
    2. הוסיפו 1 מ"ל בופר/פרמיאביליזציה לצינור 1 לסיום החדירה, מערבובת לתערובת, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליכו את הסופרנאנט.
    3. הכינו 100 מיקרוליטר וימנטין וקוקטייל נוגדנים CD68 (כל אחד מדולל 1:100 בדילול נוגדנים אוניברסלי), הוסיפו לצינור 1, מערבבים מערבובים, ודגרו אותו בהגנה מפני אור למשך 30 דקות.
    4. הוסף 1 מ"ל בופר קיבע/פרמיאביליזציה לצינור 1, מערבובת לערבוב, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), וזרוק את הסופרנטנט.
    5. הוסף 100 מיקרולטר של נוגדן משני IgG אנטי-ארנב אלקסה פלואור 488 (מדולל 1:50 במדלל נוגדנים אוניברסלי) לצינור 1. מערבוב ודגירה מוגן מאור למשך 30 דקות.
    6. הוסף 1 מ"ל בופר לצינור 1, מערבובת לערבוב, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), וזרוק את הסופרנטנט.
    7. הוסיפו 300 מיקרולטר של בופר לצינור 1, ומערבב מערבב לדגימת הטעינה.
  6. הוסף נוגדנים CD90 ו-CD14 (כל אחד מדולל ביחס 1:100 בדילול נוגדנים אוניברסלי) לצינור 2 לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. השאירו את צינור 3 ללא נוגדנים כבקרה שלילית.
    1. לאחר 15 דקות דגירה, הוסף 1 מ"ל PBS לצינורות 2 ו-3.
    2. צינורות צנטריפוגה 2 ו-3 (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), משליכים את הסופרנטנט, מוסיפים 300 מיקרו ליטר של בופר ומערבובת לערבוב לדגימת הטעינה.
  7. לבצע רכישת ציטומטריית זרימה של הדגימות המוכנות.
  8. לנתח נתוני ציטומטריית זרימה ולבצע סטטיסטיקות באמצעות תוכנה תואמת.

6. מדידת התרבות RA-FLS הנגרמת על ידי TNF-α באמצעות מבחן MTS

  1. לעכל RA-FLS דור שלישי באמצעות טריפסין ללא EDTA.
  2. סיימו את העיכול עם מדיום DMEM מלא, צנטריפוגה (4 מעלות צלזיוס, 500 × גרם, 5 דקות), והשליכו את הסופרנטנט.
  3. החזירו את הכדור למרחק DMEM מלא, בצעו ספירת תאים, ודיללו ל-1 × 10⁵ תאים לליטר.
  4. זרעו את התאים התלויים מחדש לפלטת 96 בארות בקצב של 100 מיקרוליטר לבאר.
  5. דגרו את הפלטה באינקובטור תרבית תאים עד שמתרחשת היצמדות תאים, ואז התחלקים לקבוצות בקרה ריקות וקבוצות התערבות.
  6. הוסף 10 ng/mL TNF-α לקבוצת ההתערבות ונפח שווה של PBS לקבוצת הביקורת הריקה.
  7. לאחר 24 שעות של התערבות, מוסיפים 10 מיקרוליטר מגיב MTS לכל באר וממשיכים בדגירה באינקובטור תרבית התאים.
  8. לאחר שעה של דגירה, מדוד את הספיגה (OD) ב-490 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.
  9. חשב את כדאיות התרבות התאים בהתבסס על ערך ה-OD של כל באר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול, הצלחנו לבודד RA-FLS קצר טווח שמקורו במטופלים, מתורבת. מסופק דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה הפרוצדורלית (איור 1). במיקרוסקופ אור, ה-RA-FLS הציג פנוטיפ מורפולוגי דומיננטי של תאים בצורת ציר ופוליגונליים לא סדירים. התאים הראו התפשטות ציטופלזמית נרחבת עם תהליכים מוארכים. גבולות התאים נראו מעט לא ברורים באזורים של מגע או חפיפה בין תאים. רוב התאים הציגו ציטופלזמה שקוף יחסית עם הארכה מקוטבת. הגרעינים היו בעיקר אליפטיים או מוארכים והיו ממוקמים בעיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה קובע שיטה ניתנת לשחזור לבידוד ותרבות קצרה טווח של RA-FLS מחולי דלקת שגרונית (RA), והצלחתו ניכרת בחיוניות תאית גבוהה, פנוטיפ אופייני, ביטוי סמן ספציפי ותגובה פונקציונלית לגירויים דלקתיים.

צעדים קריטיים ושיקולים טכניים
אמינות השיטה הזו תלויה במספר שלבים קריטיים. ראשית, רקמת סינוביאלית טרייה צריכה להיחשף לעיכול אנזימטי בדיוק בתוך 4-6 שעות מהרכישה. בעוד שניתן לאחסן רקמה זמנית בטמפרטורה של -80°C, אין להאריך את משך האחסון כדי להבטיח ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מדווחים שאין ניגודי עניינים בעבודה זו ומאשרים כי השימוש ב-Figdraw ליצירת איור 1 עומד בתנאי הרישוי של הפלטפורמה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספרים 82074223 ו-8207141673) והפרויקט המרכזי ברמת הממשלה המרכזית: הקמת שימוש בר-קיימא במשאבי רפואה סינית יקרי ערך (מס' 2060302).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלקסה פלואר 488-קונוגטייטד אנטי-ארנב IgGביוטכנולוגיה ג'ונגשאן ג'ינגצ'יאוZF-0511
0.25% טריפסין-EDTA (1X)גיבקו25200-072
4% פאראפורמלדהידסולרביולוגיהP1110
Alexa Flour674 אנטי-אנושי CD68ביולג'נד562111
פתרון חסימה ללא בעלי חייםטכנולוגיית איתות סלולרי15019
APC אנטי-אנושי CD90ביולג'נד559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD ביוסיינסס657925
BD LSRFortessaBD ביוסיינסס647177
BV605 אנטי-אנושי CD11bבידגנד563015
CellTiter 96 AQueous Solution One Reproductive Cell Assay (MTS)פרומגהG358A
קולגנאז IIסולרביולוגיהC8150
מדיום התקנה פלואורסצנטי המכיל DAPIביוטכנולוגיה ג'ונגשאן ג'ינגצ'יאוZLI-9556
מדיום התקנה פלואורסצנטי המכיל DAPIביוטכנולוגיה ג'ונגשאן ג'ינגצ'יאוZLI-9556
מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM), עם רמת סוכר גבוהההייקלוןSH30022.01
סרום בקר עוברי-סופרפיין (FBS)שנגחאי ג'ונגצ'יאו שינדאן ביוטכנולוגיה בע"מZQ0500
FITC אנטי-אנושי CD14ביולג'נד325604
PBS, 1× (pH 7.4) תמלח מפוספט עם בופרסרוויסביוG4202
תמיסת תערובת פניצילין-סטרפטומיצין (אנטיביוטיקה כפולה) 100 פעמים;שנגחאי ג'ונגצ'יאו שינדאן ביוטכנולוגיה בע"מCSP006
חסימת החלבון האוניברסלית של QuickBlock ובפרי דילול נוגדניםביוטייםP0270-500ml
TNF ואלפא רקומביננטיים אנושיים;פפרוטק300-01A
באף צביעת פקטור שעתוקמדעי הביולוגיה האלקטרוניים00-5523-00
טריטון X-100סולרביולוגיהT8200
תמיסת טריפסין (ללא EDTA)בייג'ינג לאבגיק טכנולוגיה בע"מ.BL526A

מקורות

  1. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  2. Uke, P., Maharaj, A., Adebajo, A. A review on the epidemiology of rheumatoid arthritis: An update and trends from current literature. Best Pract Res Clin Rheumatol. 39 (1), 9(2025).
  3. Wu, D., et al. Systemic complications of rheumatoid arthritis: Focus on pathogenesis and treatment. Front Immunol. 13, 13(2022).
  4. Chen, G., Yan, Z., Wang, Y., Tao, Q. Rheumatoid arthritis and fibromyalgia syndrome: A bibliometric and bioinformatics perspective on comorbidity research. J Multidiscip Healthc. 18, 6811-6827 (2025).
  5. Zhao, Y., Chen, G. Y., Fang, M. Research trends of rheumatoid arthritis and depression from 2019 to 2023: A bibliometric analysis. J Multidiscip Healthc. 17, 4465-4474 (2024).
  6. Komatsu, N., Takayanagi, H. Mechanisms of joint destruction in rheumatoid arthritis - immune cell-fibroblast-bone interactions. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 415-429 (2022).
  7. Zhang, Y. Y., Gao, Z. J., Chao, S. S., Lu, W. J., Zhang, P. P. Transdermal delivery of inflammatory factor-regulated drugs for rheumatoid arthritis. Drug Deliv. 29 (1), 1934-1950 (2022).
  8. Bottini, N., Firestein, G. S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 9 (1), 24-33 (2013).
  9. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 4, 23(2018).
  10. Liu, Y., et al. Regulatory fibroblast-like synoviocytes cell membrane-coated nanoparticles: A novel targeted therapy for rheumatoid arthritis. Adv Sci. 10 (4), 15(2023).
  11. Li, C. L., et al. A transformable nanoplatform precisely positions fibroblast-like synoviocytes via FAP-α for improved rheumatoid arthritis therapy. Adv Healthc Mater. 15 (2), e03277(2026).
  12. Meng, Q. L., Wei, K., Shan, Y. E3 ubiquitin ligase gene BIRC3 modulates TNF-induced cell death pathways and promotes aberrant proliferation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Front Immunol. 15, 10(2024).
  13. Chen, L., et al. AMPK signaling in osteoarthritis: From mechanisms to targeted therapeutics. Front Pharmacol. 16, 1681610(2025).
  14. Bakinowska, E., et al. The role of mesenchymal stromal cells in the treatment of rheumatoid arthritis. Cells. 13 (11), 17(2024).
  15. Filer, A. The fibroblast as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 413-419 (2013).
  16. Promila, L., et al. Mitochondrial calcium uniporter regulates human fibroblast-like synoviocytes invasion via altering mitochondrial dynamics and dictates rheumatoid arthritis pathogenesis. Free Radic Biol Med. 234, 55-71 (2025).
  17. Wang, X. C., He, J. X., Zhang, Q., He, J., Wang, Q. W. Constructing a 3D co-culture in vitro synovial tissue model for rheumatoid arthritis research. Mater Today Bio. 31, 16(2025).
  18. Shi, R. Y., et al. Monocyte membrane-coated drug nanocrystals for enhanced targeted therapy of rheumatoid arthritis. J Control Release. 384, 14(2025).
  19. Smolen, J. S., et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann Rheum Dis. 79 (6), 685-699 (2020).
  20. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  21. Philippon, E. M. L., et al. A novel 3D spheroid model of rheumatoid arthritis synovial tissue incorporating fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. Front Immunol. 14, 11(2023).
  22. Lin, X., et al. Sesamol serves as a p53 stabilizer to relieve rheumatoid arthritis progression and inhibits the growth of synovial organoids. Phytomedicine. 121, 14(2023).
  23. Lee, M. S., Kim, S., Lee, J. H., Bae, Y. S., Lee, S. K. Synovium-on-a-chip reveals fibroblast-macrophage crosstalk underpinning joint homeostasis and evaluation of gout therapies. Adv Healthc Mater. 14 (18), 16(2025).
  24. Kim, D., et al. 3D in vitro synovial hyperplasia model on polycaprolactone-micropatterned nanofibrous microwells for screening disease-modifying anti-rheumatic drugs. Mater Today Bio. 26, 10(2024).
  25. Murakami, A., et al. Human CD4(+) T cells regulate peripheral immune responses in rheumatoid arthritis via insulin-like growth factor-like family member 2. Sci Immunol. 10 (110), eadr3838(2025).
  26. Yue, S., et al. Unveiling the therapeutic potential: Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Expert Rev Mol Med. 27, e18(2025).
  27. Clister, T., et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single-cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets. Cells. 13 (3), (2024).
  28. Hu, Z., et al. Novel strategy for primary epithelial cell isolation: Combination of hyaluronidase and collagenase I. Cell Prolif. 56 (1), e13320(2023).
  29. Sueters, J., Schipperheijn, R., Huirne, J., Smit, T., Guler, Z. Reproducibility and consistency of isolation protocols for fibroblasts, smooth muscle cells, and epithelial cells from the human vagina. Cells. 14 (2), 76(2025).
  30. Jiang, D. X., et al. Primary isolation, culture, and phenotypic verification of rat knee articular chondrocytes. J Vis Exp. (225), e69509(2025).
  31. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res Ther. 20 (1), 139(2018).
  32. Zhang, F., et al. Deconstruction of rheumatoid arthritis synovium defines inflammatory subtypes. Nature. 623 (7987), 616(2023).
  33. Li, P. F., et al. Comparative proteomic analysis of polarized human THP-1 and mouse RAW264.7 macrophages. Front Immunol. 12, 13(2021).
  34. Zhu, E. B., et al. Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies. Nat Nanotechnol. 19 (12), 1914-1922 (2024).
  35. Sato, N., Bamford, R. N., Bryant, B. R., Tagaya, Y., Waldmann, T. A. Accessory cells precondition naive T cells and regulatory T cells for cytokine-mediated proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), 13(2023).
  36. Krishnaswamy, J. K., Alsén, S., Yrlid, U., Eisenbarth, S. C., Williams, A. Determination of T follicular helper cell fate by dendritic cells. Front Immunol. 9, 16(2018).
  37. Ndeupen, S., et al. Langerhans cells and cDC1s play redundant roles in mRNA-LNP-induced protective anti-influenza and anti-SARS-CoV-2 immune responses. PLoS Pathog. 18 (1), 18(2022).
  38. Walsh, M. C., et al. Osteoimmunology: Interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol. 24, 33-63 (2006).
  39. Koenderman, L., Tesselaar, K., Vrisekoop, N. Human neutrophil kinetics: A call to revisit old evidence. Trends Immunol. 43 (11), 868-876 (2022).
  40. Montero, R. B., et al. bFGF-containing electrospun gelatin scaffolds with controlled nano-architectural features for directed angiogenesis. Acta Biomater. 8 (5), 1778-1791 (2012).
  41. Yang, C. Y., Yuan, W. W., Liao, G. X., Yu, Q. Q., Wang, L. G. Construction of bFGF/heparin and Fe3O4 nanoparticles functionalized scaffolds aiming at vascular repair and magnetic resonance imaging monitoring. Int J Biol Macromol. 286, 15(2025).
  42. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of induced-pluripotent stem cells using fibroblast-like synoviocytes isolated from joints of rheumatoid arthritis patients. J Vis Exp. (116), e54072(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TNF Alpha
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים