מאמר סקירה

שיטות להבהרת מנגנוני מחלה בהפרעות נוירו-התפתחותיות

DOI:

10.3791/70127

⸱

6 בפברואר 2026

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפשרויות הטיפול המשנים מחלה לאנשים החיים עם הפרעות נוירו-התפתחותיות מוגבלות, ואין תרופות. כדי להתמודד עם זה, נדרשים מאמצים להגדיר מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות חדשות. בסקירה זו אנו מפרטים מספר טכניקות שמובילות את הדרך במאמצים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות נוירו-התפתחותיות (NDDs) משפיעות על 317 מיליון ילדים וצעירים ברחבי העולם. בעוד ש-NDDs הם קבוצה מגוונת של הפרעות המשפיעות על מערכות איברים מרובות, אפילפסיה, הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) ו/או מוגבלות שכלית (ID) הן תוצאות נפוצות. למרבה הצער, יש מעט טיפולים שמשנים מחלה ואין תרופות ל-NDDs. לאחרונה, עם זאת, עריכת גנים, בדיקות תאיות/מולקולריות ומודלים של תאי גזע הופיעו כטכניקות מבטיחות להבנת שורש הגורמים ל-NDD, לסווג וריאנטים גנטיים ולמידול מדויק יותר של תהליכי מחלה בבני אדם. בנוסף, מספר טכניקות, במיוחד עריכת גנים, כבר זכו להצלחה קלינית. בסקירה זו אנו מפרטים מספר שיטות חדשניות לאימות פונקציונלי של וריאנטים גנטיים, מודלים של תאי גזע של NDDs וגישות חדשות לעריכת גנים. הבנה ויישום שיטות אלו חיוניות לחשיפת מנגנוני מחלה חדשים ומטרות טיפוליות ל-NDDs, וכן לקידום גישות טכניות מהספסל אל הקליניקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות נוירו-התפתחותיות (NDDs) משפיעות על 317 מיליון ילדים ובני נוער ברחבי העולם1. הפרעות אלו יכולות לכלול שיתוק מוחין, תסמונת X שביר, תסמונת אנג'למן, וקומפלקס טרשת השחפת, בין רבות אחרות. בעוד ש-NDDs הן קבוצה מגוונת של הפרעות המשפיעות על מערכות איברים מרובות, אפילפסיה, הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD) ו/או לקות שכלית (ID) הן תוצאות נפוצות2. למעשה, מחקר אחד דיווח כי ילדים בקניה עם אפילפסיה וליקויים קוגניטיביים, ראייתיים, שמיעה או מוטוריים מתו בשיעור של פי 3 עד 4 מאלושבקבוצת 1 שאינה NDD.

שינוי פרדיגמה במחקר NDDs התרחש עם השלמת פרויקט הגנום האנושי בשנת 2003. התקדמות נוספת הושגה בהגדרת ציוני הסיכון הפוליגניים באמצעות GWAS, ובאפיון "הפרעות נוירו-התפתחותיות" על ידי DSM-5 בשנת 2013. למרות שיש התקדמות משמעותית בהבנת הגורמים הגנטיים ל-NDDs, קיימים מעט טיפולים ממוקדים ל-NDDs ספציפיים, ואין טיפולים שמשנים מחלה ל-ASD ו/או ל-ID הקשורים אליהם.

עריכת הגנים, הבדיקות האלקטרופיזיולוגיות, התאיות/מולקולריות והשיטות המתוארות בסקירה זו הן בחזית מחקר ה-NDD. למרות שלא כיסינו את כל הבדיקות, שיטות אלו מהוות גישות מתקדמות לזיהוי טיפולים המשנים מחלה. דוגמה אחת, אנזימי דאוביקוויטילציה (DUBs), היא קבוצת אנזימים שמסירים יוביקוויטין מחלבונים. מכיוון שמוטציות בתוך DUBs קשורות ל-NDDs, מיקוד בשינוי שלהן יכול להיות טיפול פוטנציאלי ל-NDDs 5,6. יתרה מזאת, מסלולים ברמת המעגל, כגון אלו הכוללים את תת-יחידת קולטני GABAA, ותעלות נוספות נחקרים כדי להגדיר מנגנוני מחלה הקשורים לאפילפסיה, ASD ו-ID7. שיטה בולטת נוספת, עריכת גנום CRISPR/Cas (איור 1), היא כלי עוצמתי המשמש לשינוי ישיר של הגנום ליצירת מודלים ניסיוניים חדשים ולטיפול לאחרונה בהפרעות גנטיות נדירות 8,9,10. ערכת הכלים של CRISPR ממשיכה להתרחב, וארבע גישות, כולל CRISPRi (הפרעה/עיכוב CRISPR), CRISPRa (הפעלת CRISPR), עריכת פריים ועריכת בסיס, הפכו לחדשנות מחקרית וקלינית משמעותית. לבסוף, מאמר זה מפרט את ההתקדמות בשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). iPSCs ונגזרות תאיות שלהם אפשרו לחוקרים למודל בצורה מדויקת יותר NDDs רבות באמצעות תאים שמקורםבמטופלים 9,11,12. חשוב לציין שפיתוח אורגנואידים מ-iPSCs אפשר את חקר תהליך ההתפתחות שמאחורי רבים מ-NDDs באופן רלוונטי הרבה יותר למחלות אנושיות מאשר מודלים של מכרסמים13,14.

סקירה קצרה זו מפרטת ומרחיבה את הטכניקות שהוצגו לעיל. בנוסף, נדונים מספר מחקרים עדכניים המנצלים טכניקות אלו כדי לקבל תובנות מעמיקות יותר על NDDs, פערים בספרות הנוכחית וכיוונים עתידיים.

סקירה ופרספקטיבה

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ופרדיגמות ניסיוניות נלוות

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו למערכת עוצמתית למידול NDDs. למעשה, תהליכים התפתחותיים רבים מתרחשים במודלים של iPSC הדומים לאלו שנצפו במהלך התפתחות המוח האנושי ואינם מתרחשים במהלך התפתחות מוח מכרסמים15. לכן, החוקרים חיברו מודלים של תאי גזע, כולל תרביות דו-ממדיות, אורגנואידים ואסמבלואידים, לשיטות ניסוי אחרות כדי להבין טוב יותר את מנגנוני המחלה ב-NDDs 11,13,14,16.

לאחרונה, השתמשו באסמבלואידים למידול תכונה מרכזית של נוירוגנזה לקויה בתסמונת דאון (DS) במהלך התפתחות העובר16. באמצעות HiPSCs של DS ו-hiPSCs יופלואידיים איזוגניים, הושרה נוירוגנזה, ואחריה התמיינות לנוירונים. לאחר 85 ימים, נעשה שימוש באימונוציטוכימיה ודימות לצפייה במחזור התא. הם הבחינו שתאי הקדמון העצביים של DS לא יצאו ממחזור התא ולא הצליחו להתמיין לנוירונים בוגרים, ומצאו גם כי פגמים במחזור התא משנים את השלב הנוירוגני, וגורמים לפגיעה בנוירגנזה ב-DS16.

בעוד שרבים ממודלי תאי הגזע התמקדו בנוירונים, סוגי תאים אחרים, כולל תאי גליאל, ממלאים תפקיד חשוב בפתולוגיית NDD17. דוח עדכני התמקד בתפקיד הגליוגנזיס והאסטרוציטים בתסמונת X השברירית (FXS). באמצעות HiPSCs, תאי אב אסטרוציטים גודלו והתביילו לאסטרוציטים ספציפיים למוח הקדמי שחסרו חלבון שביר של שליח X ריבונוקולר11. הם הבחינו שהאסטרוציטים הללו סובלים ממטבוליזם גליקוליטי ומיטוקונדריאלי לא מרוסן. עבודות קודמות של אותו צוות הראו גם כי תפקוד מיטוכונדריה תקין הכרחי לשליטה בהפעלת פוטנציאל פעולה בנוירונים שמקורם במטופלים עם FXS11,18. בעוד שנדרשת עבודה נוספת להבנת המנגנון שבו מטבוליזם האסטרוציטים וירי הנוירונים משתנים ב-FXS, מחקרים אלו מראים שאסטרוציטים יכולים גם להניע את הפתולוגיה של המחלה וגם להיות מטרה טיפולית.

עריכת גנום

פרנסיסקו מוג'יקה הניח את היסודות לעריכת הגנום עם גילוי CRISPR (Clustered Regular Regular, Interspaced Short Palindromic Repeats), מערכת חיסון אדפטיבית לפרוקריוטים, בתחילת שנותה-90. בהתבסס על כך, ג'ניפר דאודנה ואמנואל שרפנטייה היו חלוצות בשיטה בשם CRISPR/Cas9, המנצלת CRISPR מחובר לאנדונוקלאז Cas9 כדי לבודד ולשנות באופן סלקטיבי גנים20. זמן קצר לאחר פרסום מחקרי עריכת הגנים הראשוניים של CRISPR/Cas9, החלו החוקרים למניפולציה של מערכת CRISPR/Cas כדי לחשוף מידע גנומי חדש או לערוך גנים בצורה ייחודית. שיטה חדשנית היא CRISPRi – דרך להשתיק גן מעניין21,22. על ידי שימוש בנוקלאז Cas9 לא פעיל קטליטית בשילוב עם cr- ו-tracr-RNA, הגישה של RNA פולימראז לפרומוטר נחסמת, מה שמונע את ביטוי הגנים של גן מסוים או קבוצת גנים22,23. מסכי CRISPRi שימשו לזיהוי מספר גנים סיכונים ל-NDDs וכן לזיהוי השינויים התפקודיים הקשורים לאובדן תפקוד בגנים אלה. לדוגמה, סקר CRISPRi שנערך לאחרונה באוסמבלואידים שמקורם ב-iPSC בדק 425 גני NDD להשפעתם על התפתחות הנוירונים הפנימיים וחשף כי אובדן מספר גנים מועמדים השפיע על מבנה הרשתית התאתו-שלד והאנדופלסמה24. בנוסף, סקר CRISPRi גילה כי אובדן ADNP, גן סיכון ל-ASD, גרם לשינויים בגיזום מיקרוגליאלי של סינפסות25. לכן, סקרי CRISPRi חשפו מספר מנגנוני מחלה מתכנסים ושונים ב-NDD.

משלים את CRISPRi, CRISPRa הוא כלי המשמש להגדלת ביטוי הגנים. טכניקה זו מחברת Cas9 לא פעיל קטליטית למפעילי שעתוק ומכוונת על ידי RNA מנחה. CRISPRa נוצל גם להבנת האופן שבו הפעלה של גנים לסיכון ל-ASD ו-NDD יכולה לשנות פנוטיפים של מחלה. למרות שיש מעט מחקרים המשתמשים ב-CRISPRa להצלת פנוטיפים של NDD, ייתכן של-CRISPRa יש פוטנציאל טיפולי גדול. לדוגמה, מחקר עדכני הראה כי הפעלת ITGB3 (שהפלואינספיקציה שלו קשורה ל-ASD) הצילה את תפקוד הרשת ואת הפנוטיפים של ASD במכרסמים. למעשה, וריאנטים רבים של הגנים של NDD גורמים למחלות עקב ספירה של פלואין, מה שמעלה את האפשרות ש-CRISPRa יכול לשמש להגברת הביטוי של האלל הלא מושפע באופן משנה מחלה.

עריכת בסיס ועריכת פריים הן שיטות מדויקות בתוך ארגז הכלים של CRISPR לעריכת נוקלאוטידים ספציפיים בגנום. שניהם חותכים גדיל DNA יחיד במקום שבירת גדילים כפולה (DSB) כמו CRISPR/Cas910,26. בעוד שהעריכה הבסיסית מדויקת יותר מעריכה סטנדרטית ב-CRISPR/Cas9, היא פחות גמישה ולכן פחות רלוונטית מבחינה תרגומית מאשר עריכה ראשונית. היעילות של עריכת הבסיס טמונה ביכולתה לתקן מוטציות נקודתיות על ידי החלפת ציטוזין בתימין או אדנין בגואנין ולהפך. בגלל זה, עריכת הבסיס מוגבלת בסוגי המוטציות שהיא יכולה לבצע. לכן, למרות שהן שימושיות, ניתן לבצע רק מוטציות מעבר, לא הוספות או מחיקות10. עם זאת, עריכה ראשונית היא צורת עריכת גנום גמישה מאוד עם יישומים רבים אפשריים. עריכה ראשונית משתמשת ב-RNA מדריך עריכה ראשוני (pegRNA) וניקאז Cas9 המקושר לטרנסקריפטאז הפוך, שיכול להקל על החדרות, מחיקות או שינויים בנוקלאוטידים בודדים10. למרבה הצער, מכיוון שהוא מורכב יותר טכנית ויכול לבצע שינויים גנטיים גדולים יותר, עריכה ראשונית יכולה להיות פחות יעילה מעריכה בסיסית. לכן, שניהם יכולים לשמש ככלים משלימים ושימושיים בעריכה גנומית להפרעות נוירו-התפתחותיות. עריכה ראשונית כבר נוצלה לטיפול בחולה עם הפרעה גנטית נדירה27 והוכיחה פוטנציאל בהצלת פנוטיפים של מחלות במודל מכרסמים של חצי משתק מתחלף בילדות28.

בדיקות תאיות ומולקולריות

NDDs נגרמים על ידי וריאנטים גנטיים שמשפיעים על תפקוד התאים בדרכים שונות 29,30,31. אתגר מרכזי העומד בפני אלו החוקרים NDDs הוא כיצד לקבוע האם וריאנט מסוים של מטופל גורם לשינוי תפקודי מזיק בתא. לכן, יש צורך רב בבדיקות שיכולות לקבוע במהירות ובדיוק האם וריאנט גנטי מסוים גורם למחלה או שפיר. מבחן חדש ומבטיח הוא מבחן מחשוף יוביקוויטין32. אנזימי דה-ביקוויטילציה (DUB) הם קבוצת אנזימים שמסירים את האוביקוויטין מחלבונים, ומונעים פירוק. DUBs הם גם טיפולים פוטנציאליים וגם גורמים ל-NDDs. עד כה, זוהו מוטציות ב-12 DUBs כקשורות סיבתית ל-NDDs, כולל תסמונת האו-פונטיין, תסמונת פסאודו-TORCH, תסמונת מומים מיקרוצפליים-נימים, ואחרות5. כדי לקבוע האם וריאנטים מסוימים של מטופלים גורמים למחלה, בדיקות חיתוך יוביקוויטין במבחנה הפכו לסטנדרט הזהב למדידת פעילות אנזימטית של DUB לאימות פונקציונלי של מוטציות. שיטה זו יכולה לשמש להערכת השפעת וריאנטים גנטיים על DUBs. מחקר עדכני התמקד ב-DUB שעבר מוטציה בנכות אינטלקטואלית 105, DUB Ubiquitin Specific Protease 27 (USP27X). החוקרים הדגימו בהצלחה שיטה לביטוי וטיהור של USP27X רקומביננטי ובדיקת חיתוך שרשרת יוביקוויטין במבחנה. גישה זו מאפשרת לקבוע פעילות אנזימטית המווסתת את מחזור החלבון בנוירונים, ולכן עשויה להיות חשובה בהבנת המנגנונים העומדים בבסיס גיזום סינפטי משתנה, תקופות קריטיות נוירו-התפתחותיות ותפקוד חלבון32. מעניין לציין שיש מחסור במאמרים שפורסמו על DUBs ותפקידם במחלות, ולכן היקף היישום המלא של מבחן זה נותר בלתי נבדק ופתוח לחקירה נוספת.

מכיוון שרבים מה-NDDs מסווגים גם כהפרעות נדירות, זיהוי גנטי קליני של וריאנטים מזהה לעיתים קרובות שינויים גנטיים כ'וריאנטים בעלי משמעות לא ידועה' (VUS) בשל מחסור במחקרים קליניים או תפקודיים קודמים שפורסמו על אותם וריאנטים 7,33,34. לכן, בדיקות לקביעת מהירות האם VUS פתוגני הן קריטיות לזיהוי הגורמים הגנטיים ל-NDDs. דוגמה לכך היא וריאנטים בקולטני GABAA. וריאנטים גנטיים בקולטן GABAA הם גורם מוביל לאפילפסיה גנטית וקשורים לסוגים רבים של פרכוסים ולאנצפלופתיות אפילפטיות התפתחותיות 7,35. מחקר עדכני בחן את תת-יחידות קולטני GABAA וניסה לזהות האם הווריאנטים גרמו לשינויים תפקודיים בתוך התא באמצעות גישה רב-מודלית. ב-Silico נעשה שימוש בבדיקות לזיהוי VUS ולחיזוי שינויים פתוגניים בתת-יחידות γ2 GABAA. לאחר מכן הוגדרו ההשלכות המולקולריות של הווריאנטים וכללו סמנים מבניים, פיזיקוכימיים וביופיזיים. כל אחד מהתחומים הללו הוגדר באמצעות ניתוח ספרות, במידול סיליקו ואלקטרופיזיולוגיה של פאץ-קלאמפ. לאחר בחירת אזור ייחוס, נעשה שימוש במידול נוירונלי פירמידלי לבדיקת השפעות עיכוב מתווך קולטני GABAA. הם הבחינו ששתי מוטציות תת-יחידות ß3 (ß3N110D ו-ß3T288N) ושתי מוטציות תת-יחידות γ2 פגעו בעיכוב GABAergic7. פרוטוקול זה מראה כי גישה רב-מודלית שימושית לעיתים קרובות בקביעת הפתוגניות של VUS. למרות שאינה בעלת תפוקה גבוהה, גישה זו עשויה להיות שימושית גם עבור VUS אחרים הקשורים ל-NDD שאין להם מבחן ספציפי לאימות תפקודי של וריאנטים (למשל, DUBs) – במיוחד אם הם קשורים לשינויים אלקטרופיזיולוגיים.

למרות שאינה גישה חדשנית, האלקטרופיזיולוגיה של פאץ-קלאמפ נשארת הסטנדרט הזהב להבנת התכונות החשמליות של נוירונים, וכיצד שינויים גנטיים משפיעים גם על התכונות הבסיסיות של הנוירונים. רלוונטיות ל-NDDs הן תעלות36. למרות שיש סוגים רבים של ערוצים, וריאנטים ב-SCN1A נחקרו היטב והם הגורם העיקרי לתסמונת דרבט – אנצפלופתיה אפילפטית התפתחותית הרסניתבמיוחד 36. אימות פונקציונלי של וריאנטים של SCN1A הושג באמצעות גישה קומבינטורית של טלאי אוטומטי וסימולציות סילקו. באמצעות גישה זו, החוקרים הצליחו לפתור מספר VUS וליצור קורלציות גנוטיפיות-פנוטיפיות בהתבסס על שינויים תפקודיים בנוירונים37. במחקר נפרד בגישה דומה, מודלים של iPSC שימשו עם אלקטרופיזיולוגיה אוטומטית של patch-clamp ובמודלים סיליקו לסיווג וריאנטים גנטיים בתעלות סידן מסוגT-Type 38. בהתמקדות ב-CACNA1G, גן המקודד Cav3.1 בסוגים שונים של נוירונים, CACNA1G עבר מוטציה ליצירת 18 וריאנטים של Cav3.1 שהועברו לנוירונים באופן חולף. לאחר מכן בוצעו הקלטות אוטומטיות של patch-clamp, ואחריהן גישות ידניות של patch-clamp וגישות חישוביות. הם הבחינו כי פאץ'-קלאמפ אוטומטי וטאצ'ק-קלאמפ ידני הניבו תוצאות דומות, וכי גישות חישוביות הצליחו לזהות את השינויים התפקודיים הנגרמים על ידי וריאנטים גנטיים ספציפיים38. בעוד שמודלים חישוביים מספקים דרך יחסית מהירה לחזות את ההשלכות הפונקציונליות של וריאנטים גנטיים, גישות אלקטרופיזיולוגיות עדיין גוזלות זמן ודורשות מיומנויות מיוחדות מאוד שמגבילים את התועלת בגישות אלו כאשר מנסים לאמת מספר רב של וריאנטים.

מערכי רב-אלקטרודות (MEAs) משמשים למדידת פעילות חשמלית סביב קבוצות קטנות או ברשתות תאים גדולות. שיטה זו שונה מאלקטרופיזיולוגיה של פאץ'-קלאמפ בכך שהיא מתמקדת במודלים רב-תאיים, בעוד ש-patch-clamp מרוכזת בערוץ או תא יחיד39,40. בגלל זה, MEAs יכולים לתת תובנות כיצד אזורים שונים במוח מתקשרים זה עם זה ויכולים לשמש לחקר מחלות בקנה מידה רשתי. מחקרים רבים השתמשו ב-MEAs כדי לחקור מודלים ניסיוניים של אפילפסיה ו-ASD14,39. מאפיין מרכזי של MEAs הוא שהם מסוגלים לקבוע את הדרכים שבהן סוגים שונים של תאי עצב מתקשרים (למשל, נוירונים גלוטמטרגיים, נוירונים פנימיים GABAergic, אבות ותאי גליה)14. זה הופך את MEAs לגישה מצוינת לחקר הרכבות מוח. מחקר אחד, שבוצע על ידי פאן ואחרים, השתמש בשיטה זו לחקר התפתחות רשתות נוירונים. המחברים השתמשו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מפיברובלסטים של עורלה14, שסומנו תחילה ויראלית ואז גודלו ליצירת אסמבלואידים. לאחר מכן, ההרכבות הודבקו על לוחות MEA ונרשמו14. חשוב לציין, מאחר שהאסמבלואידים יכלו להיות מייצבים, תיעוד וחשיפה לניסויים פרמקולוגיים למשך כ-50 יום, פרדיגמה זו יכולה לשמש לניתוח תרופות טיפוליות לטיפול באפילפסיה הקשורה ל-NDDs. למעשה, גישה זו יכולה לשמש לבחינת כל NDD שבו ידועים או חשודים בשינויים בתכונות הרשת של נוירונים14.

מסקנות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NDDs יכולות להיות הפרעות הרסניות ויש להן מעט טיפולים ממוקדים ואין להם תרופות. למעשה, רוב הטיפולים מיועדים לניהול תסמיני מחלה (למשל, תרופות נגד פרכוסים לאפילפסיה). עם זאת, התקדמות טכנולוגית אחרונה הובילה לטכניקות עריכת גנים חדשניות, בדיקות ומערכות מודל שמאפשרות למדענים לחקור את שורשי הבעיות של NDDs  (איור 1). סקירה זו פירטה כמה מהגישות המובילות במאמצים למצוא טיפולים חדשניים ל-NDDs ולפתולוגיות קשורות. טכניקות עריכת גנים יאפשרו לחוקרים למקד מוטציות ישירות כדי להבין טוב יותר את מנגנוני המחלה ואולי לטפל במטופלים באמצעות טיפול גנטי מדויק. בדיקות חדשות מאפשרות סיווג מהיר של וריאנטים גנטיים פונקציונליים, ומודלים של תאי גזע יאפשרו למדענים להבין את המנגנונים ההתפתחותיים המוקדמים שמניעים NDDs וכן לבדוק טיפולים חדשניים. הטכניקות המפורטות בסקירה זו מהוות את הבסיס שעליו ניתן לבצע מחקרים עתידיים במטרה להעמיק את מנגנוני NDD, וכן להוביל לגישות קליניות חדשניות לטיפול בהם. ככל שהתחום ממשיך להתפתח, מחקרים עתידיים צריכים לשלב טכניקות כמו בדיקות טרום-לידתיות, טיפולים עובריים, הדמיה עתיר תוכן ופרמקוגנומיקה עם אלו המפורטות בסקירה זו.

figure-results-1
איור 1: סיכום של החוזקות והחולשות המרכזיות של גישות טכניות. השיטות המפורטות במאמר והוצגו באוספי השיטות הנלוות מסוכמות. חוזקה וחולשה עיקרית מפורטות לכל טכניקה. הפניה מרכזית לכל טכניקה מסופקת תחת עמודת השיטה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון סופק על ידי NIH NINDS RO1NS131223 ל-PHI. איור 1 הוכן באמצעות BioRender.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global report on children with developmental disabilities. , https://www.unicef.org/media/145016/file/Global-report-on-children-with-developmental-disabilities-2023.pdf (2023).">Global report on children with developmental disabilities. , https://www.unicef.org/media/145016/file/Global-report-on-children-with-developmental-disabilities-2023.pdf (2023).
  2. Neurodevelopmental disorders: 2024 update. Free Neuropathol. 20, (2024).">Martínez De Lagrán, M., Bascón-Cardozo, K., Dierssen, M. Neurodevelopmental disorders: 2024 update. Free Neuropathol. 20, (2024).
  3. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931-945 (2004).">International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431, 931-945 (2004).
  4. Diagnostic and statistical manual of mental disorders. , 5th ed, American Psychiatric Association. (2013).">Diagnostic and statistical manual of mental disorders. , 5th ed, American Psychiatric Association. (2013).
  5. The DUB club: Deubiquitinating enzymes and neurodevelopmental disorders. Biol Psychiatry. 92, 614-625 (2022).">Jolly, L. A., Kumar, R., Penzes, P., Piper, M., Gecz, J. The DUB club: Deubiquitinating enzymes and neurodevelopmental disorders. Biol Psychiatry. 92, 614-625 (2022).
  6. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 338-352 (2019).">Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 338-352 (2019).
  7. Identification and classification of position-specific GABAA receptor subunit missense variants for their role in hippocampal pyramidal neurons. J Vis Exp. , e67833(2025).">Arslan, A., Öz, P. Identification and classification of position-specific GABAA receptor subunit missense variants for their role in hippocampal pyramidal neurons. J Vis Exp. , e67833(2025).
  8. CRISPR-dependent base editing as a therapeutic strategy for rare monogenic disorders. Front Genome Ed. , 7(2025).">Cabré-Romans, J. J., Cuella-Martin, R. CRISPR-dependent base editing as a therapeutic strategy for rare monogenic disorders. Front Genome Ed. , 7(2025).
  9. CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges. Hum Mol Genet. 23, R40-R46 (2014).">Zhang, F., Wen, Y., Guo, X. CRISPR/Cas9 for genome editing: Progress, implications and challenges. Hum Mol Genet. 23, R40-R46 (2014).
  10. Current trends in gene therapy to treat inherited disorders of the brain. Mol Ther. 33, 1988-2014 (2025).">Matuszek, Z., Brown, B. L., Yrigollen, C. M., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Current trends in gene therapy to treat inherited disorders of the brain. Mol Ther. 33, 1988-2014 (2025).
  11. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cell-derived astrocytes lacking fragile X messenger ribonucleoprotein. J Vis Exp. (220), e68081(2025).">Reddy, B. K., Annaiyappa, N., Bhattacharya, A., Chattarji, S., Pal, R. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cell-derived astrocytes lacking fragile X messenger ribonucleoprotein. J Vis Exp. (220), e68081(2025).
  12. Modeling neurodevelopmental and neuropsychiatric diseases with astrocytes derived from human-induced pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 22 (4), 1692(2021).">Ren, B., Dunaevsky, A. Modeling neurodevelopmental and neuropsychiatric diseases with astrocytes derived from human-induced pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 22 (4), 1692(2021).
  13. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).">Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  14. A multi-electrode array platform for modeling epilepsy using human pluripotent stem cell-derived brain assembloids. J Vis Exp. (211), e67396(2024).">Pan, T., et al. A multi-electrode array platform for modeling epilepsy using human pluripotent stem cell-derived brain assembloids. J Vis Exp. (211), e67396(2024).
  15. Exploring human brain development and disease using assembloids. Neuron. 113 (8), 1133-1150 (2025).">Wu, S. R., Nowakowski, T. J. Exploring human brain development and disease using assembloids. Neuron. 113 (8), 1133-1150 (2025).
  16. In vitro modeling of Down syndrome neurogenesis using human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (217), e67382(2025).">Sharma, V., Chhawari, H., Joshi, P., Nehra, S., Singhal, N. In vitro modeling of Down syndrome neurogenesis using human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (217), e67382(2025).
  17. The application of human pluripotent stem cells to model the neuronal and glial components of neurodevelopmental disorders. Mol Psychiatry. 25, 368-378 (2020).">Lee, K. M., et al. The application of human pluripotent stem cells to model the neuronal and glial components of neurodevelopmental disorders. Mol Psychiatry. 25, 368-378 (2020).
  18. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42, 112344(2023).">Sharma, S. D., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42, 112344(2023).
  19. CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Barrangou, R., van der Oost, J. , 1-31 (2013).">Mojica, F. J. M., Garrett, R. A. Discovery and seminal developments in the CRISPR field. CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Barrangou, R., van der Oost, J. , 1-31 (2013).
  20. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).">Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  21. CRISPRi functional genomics in bacteria and its application to medical and industrial research. Microbiol Mol Biol Rev. 88 (2), e00170-e00222 (2024).">Enright, A. L., Heelan, W. J., Ward, R. D., Peters, J. M. CRISPRi functional genomics in bacteria and its application to medical and industrial research. Microbiol Mol Biol Rev. 88 (2), e00170-e00222 (2024).
  22. Engineering novel CRISPRi repressors for highly efficient mammalian gene regulation. Genome Biol. 26, 164(2025).">Kristof, A., et al. Engineering novel CRISPRi repressors for highly efficient mammalian gene regulation. Genome Biol. 26, 164(2025).
  23. CRISPR-mediated activation of autism gene Itgb3 restores cortical network excitability via mGluR5 signaling. Mol Ther Nucleic Acids. 29, 462-480 (2022).">Jaudon, F., Thalhammer, A., Zentilin, L., Cingolani, L. A. CRISPR-mediated activation of autism gene Itgb3 restores cortical network excitability via mGluR5 signaling. Mol Ther Nucleic Acids. 29, 462-480 (2022).
  24. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).">Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622, 359-366 (2023).
  25. CRISPRi-based screen of autism spectrum disorder risk genes in microglia uncovers roles of ADNP in microglia endocytosis and synaptic pruning. Mol Psychiatry. 30, 4176-4193 (2025).">Teter, O. M., et al. CRISPRi-based screen of autism spectrum disorder risk genes in microglia uncovers roles of ADNP in microglia endocytosis and synaptic pruning. Mol Psychiatry. 30, 4176-4193 (2025).
  26. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 42, 1867-1875 (2024).">Liang, R., et al. Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells. Nat Biotechnol. 42, 1867-1875 (2024).
  27. Patient-specific in vivo gene editing to treat a rare genetic disease. N Engl J Med. 392 (22), 2235-2243 (2025).">Musunuru, K., et al. Patient-specific in vivo gene editing to treat a rare genetic disease. N Engl J Med. 392 (22), 2235-2243 (2025).
  28. Bilateral optic nerve abnormalities associated with a 4-10 chromosomal translocation. Ophthalmic Paed Gen. 5 (3), 151-154 (1985).">Benezra, D., et al. Bilateral optic nerve abnormalities associated with a 4-10 chromosomal translocation. Ophthalmic Paed Gen. 5 (3), 151-154 (1985).
  29. A comprehensive review on neurodevelopmental disorders. 12, 5(2025).">Prasad, D., Shukla, P. A comprehensive review on neurodevelopmental disorders. 12, 5(2025).
  30. Focal cortical dysplasia: updates. Indian J Pathol Microbiol. 65, S189-S197 (2022).">Pinheiro, J., Honavar, M. F. Focal cortical dysplasia: updates. Indian J Pathol Microbiol. 65, S189-S197 (2022).
  31. Role of DNA methyl-CpG-binding protein MeCP2 in Rett syndrome pathobiology and mechanism of disease. Biomolecules. 11 (1), 75(2021).">Pejhan, S., Rastegar, M. Role of DNA methyl-CpG-binding protein MeCP2 in Rett syndrome pathobiology and mechanism of disease. Biomolecules. 11 (1), 75(2021).
  32. Measuring enzymatic activity of neurodevelopmental disorder-associated deubiquitylating enzymes via an in vitro ubiquitin chain cleavage assay. J Vis Exp. (211), e67367(2024).">Koch, I., et al. Measuring enzymatic activity of neurodevelopmental disorder-associated deubiquitylating enzymes via an in vitro ubiquitin chain cleavage assay. J Vis Exp. (211), e67367(2024).
  33. Rates and classification of variants of uncertain significance in hereditary disease genetic testing. JAMA Netw Open. 6, e2339571(2023).">Chen, E., et al. Rates and classification of variants of uncertain significance in hereditary disease genetic testing. JAMA Netw Open. 6, e2339571(2023).
  34. Reclassifying variations of unknown significance in diseases affecting Saudi Arabia's population reveal new associations. Front Genet. 14, 1250317(2023).">Al Eissa,, et al. Reclassifying variations of unknown significance in diseases affecting Saudi Arabia's population reveal new associations. Front Genet. 14, 1250317(2023).
  35. Spectrum of GABAA receptor variants in epilepsy. Curr Opin Neurol. 32 (2), 183-190 (2019).">Maljevic, S., et al. Spectrum of GABAA receptor variants in epilepsy. Curr Opin Neurol. 32 (2), 183-190 (2019).
  36. Gene variant effects across sodium channelopathies predict function and guide precision therapy. Brain. 145 (12), 4275-4286 (2022).">Brunklaus, A., et al. Gene variant effects across sodium channelopathies predict function and guide precision therapy. Brain. 145 (12), 4275-4286 (2022).
  37. Genotype-function-phenotype correlations for SCN1A variants identified by clinical genetic testing. Ann Clin Transl Neurol. 12 (3), 499-511 (2025).">Knox, A. T., et al. Genotype-function-phenotype correlations for SCN1A variants identified by clinical genetic testing. Ann Clin Transl Neurol. 12 (3), 499-511 (2025).
  38. Electrophysiological classification of CACNA1G gene variants associated with neurodevelopmental and neurological disorders. Front Pharmacol. 16, 1613072(2025).">Davakan, A., et al. Electrophysiological classification of CACNA1G gene variants associated with neurodevelopmental and neurological disorders. Front Pharmacol. 16, 1613072(2025).
  39. Multielectrode arrays for functional phenotyping of neurons from induced pluripotent stem cell models of neurodevelopmental disorders. Biology. 11, 316(2022).">McCready, F. P., et al. Multielectrode arrays for functional phenotyping of neurons from induced pluripotent stem cell models of neurodevelopmental disorders. Biology. 11, 316(2022).
  40. Patch clamping. , 95-114 (2002).">The practice of patch clamping. Patch clamping. , 95-114 (2002).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים