מאמר שיטה

הקמת מודל דיכוי חיסון המושר על ידי ספסיס בעכבר על ידי החדרה תוך-אפית של חיידקים

119 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70150

⸱

12 ביוני 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Burns and Combined Injury, Army Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Daping Hospital, Army Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל דיכוי חיסון לספסיס בעכבר באמצעות הזרעה תוך-אפית של Klebsiella pneumoniae ואימתנו את המודל באמצעות אינדיקטורים שונים.

תקציר

אלח דם הוא כשל איבר מסכן חיים הנגרם מתגובה לא הולמת של המארח לזיהום. דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לאלספסיס. מודלים בעלי חיים הם כלים חשובים לחקר הפתוגנזה של ספסיס ולהערכת אסטרטגיות טיפול חדשות. מודלים קודמים של אלח דם בבעלי חיים לא כללו מסלולי זיהום טבעיים, מה שהקשה לשקף במדויק את תהליך ההדבקה הקליני.

מחקר זה הציג מודל דיכוי חיסון לספסיס בעכברים, שהוקם על ידי החדרה תוך-אפית של Klebsiella pneumoniae (KP) לסימולציה של מסלול זיהום נשימתי טבעי. לאחר מודלים עם ריכוזים שונים של KP, הוערכה הדלקת במודל ב-12 שעות לרמות ציטוקינים אינטרלוקין-6 (IL-6), ונזק לאיברים הוערך לאחר 24 שעות עבור רמות אלנין אמינוטרנספראז (ALT), אספרטט אמינוטרנספראז (AST), קריאטין קינאז (CK) וחנקן אוריאה בדם (BUN). שיעור ההישרדות של המודל נותח לאחר 7 ימים. אחוז הלימפוציטים ותאי הדם הלבנים, שיעור הביטוי של קומפלקס היסטוקומפליטיות עיקרי מחלקה II (MHC-II) במונוציטים, ועוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת (MFI) של IL-10 ו-TGF-β1 בתאי T CD4+ נצפו כדי להעריך את הדיכוי החיסוני בעכברים. לאחר 7 ימי מודל, בוצע זיהום משני באמצעות הזרקה תוך-אף של Pseudomonas aeruginosa (PA). העומס החיידקי בנוזל השטיפה הברונכואלוואולרי (BALF) 24 שעות לאחר זיהום משני ושיעור התמותה בתוך 14 ימים הוערכו כדי להעריך את הדיכוי החיסוני של המודל.

החדרה לאף של Klebsiella pneumoniae בריכוז גבוה יכולה לגרום לדיכוי חיסוני ביעילות. מטרתו היא לדמות ספסיס הנגרמת על ידי מסלול זיהום נשימתי טבעי ולספק מודל סטנדרטי למחקר ספסיס בבעלי חיים.

מבוא

אלח דם הוא כשל איבר מסכן חיים הנובע מתגובה לא מתאימה של המארח לזיהום 1,2,3. זהו אחד הגורמים המובילים לתמותה ביחידות טיפול נמרץ (ICU). בעולם יש 48.9 מיליון מקרי אלח דם בשנה, עם 11 מיליון מקרי מוות נלווים4. למרות ההתקדמות האחרונה בטיפול אנטי-זיהומי וטכנולוגיות תמיכה באיברים, הפתוגנזה של ספסיס נותרה מובנת לחלוטין, ואפשרויות טיפול ספציפיות חסרות. כתוצאה מכך, ספסיס הפך למוקד מרכזי ואתגר במחקר רפואי קליני.

מודלים בעלי חיים ממלאים תפקיד בלתי ניתן להחלפה במחקר רפואי בסיסי ותרגומי, ומשמשים ככלים חיוניים לחקר פתוגנזה של אלח דם ולהערכת אסטרטגיות טיפוליות חדשות. על ידי סימולציה של תהליכים פתופיזיולוגיים של ספסיס אנושי, מודלים אלו לא רק מאפשרים חקירה של מנגנונים מרכזיים כגון הפרעות חיסוניות ותפקוד לקוי באיברים, אלא גם מספקים פלטפורמה ניסיונית לסקר סמים ולפיתוח אסטרטגיות התערבות. מבין מודלים שונים של בעלי חיים, עכברים הם הנפוצים ביותר במחקר ספסיס בזכות הרקע הגנטי המוגדר היטב שלהם, מחקר נרחב על מערכת החיסון שלהם וקלות המניפולציה.

נכון להיום, קיימים מספר מודלים של בעלי חיים לספסיס המבוססים על פרדיגמות שונות, כולל מודלים של אנדוטוקסין, מודלים של עירוי חיידקים, מודלים של קשירת סקל ונקירה (CLP),ומודלים 5 של פריטוניטיס סטנט במעי הגס (CASP). עם זאת, מודלים אלו חסרים מסלולי זיהום טבעיים, מה שמקשה על שיקוף אמיתי את תהליך ההדבקה הקליני. מחקרים דיווחו כי דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לאלסח דםבארצות הברית. לכן, הקמת מודל ספסיס לעכברים המדמה מסלולי זיהום טבעיים, מציג תכונות מדכאות חיסון וקל לתפעול עם שחזוריות גבוהה היא בעלת חשיבות רבה למחקר מעמיק על מנגנוני החיסון של אלח דם ולהערכת אסטרטגיות התערבות פוטנציאליות.

Klebsiella pneumoniae (KP) אחראית ל-3% עד 8% מכלל הזיהומים החיידקיים שנרכשו בבתי חולים 7,8,9. חיידק זה יכול להיכנס לגוף דרך פורטלים שונים, כולל מערכת הנשימה, מערכת העיכול והשתן, וכן העור, וזיהומים הנגרמים על ידי KP הם בעלי פרוגנוזה גרועה, במיוחד אצל מטופלים עם מערכת חיסון מוחלשת 7,10. בהינתן שדלקת ריאות היא הגורם המוביל לאלחם דם ו-KP הוא פתוגן נשימתי נפוץ הקשור לתוצאות גרועות, KP הוא מועמד אידיאלי להקמת מודל אלח דם קליני רלוונטי.

למרות שמגוון מודלים של בעלי חיים של זיהום KP, כולל השיטה התוך-נזלית, כברהוקמו קודם לכן 11, רק מחקרים בודדים התמקדו באופטימיזציה של המודל כדי לגרום לדיכוי חיסון הקשור לספסיס או להגדיר את ריכוז ה-KP האופטימלי להקמת המודל. פער זה מגביל את השימושיות של מודלים קיימים של KP לחקר תפקוד לקוי של מערכת החיסון הנגרמת על ידי ספסיס.

כדי לענות על צורך זה, הקמנו מודל דיכוי חיסוני מושרה על ידי ספסיס בעכברים באמצעות הזרעה תוך-אפית של KP. בהשוואה למודלים קיימים, מודל זה מדמה את המסלולים הטבעיים של זיהומים נשימתיים. המודל אומת נוסף כדי לספק שיטה למחקר מאוחר יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים במאמר זה אושרו על ידי ועדת המעבדה, רווחת בעלי החיים ואתיקה של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה (SCXK(PLA)20120031).

1. בעלי חיים ניסיוניים

  1. השתמש בעכברי C57BL/6, זכר, בגיל 8–10 שבועות, במשקל 23–28 גרם (רישיון בעלי חיים מס': SCXK (Xiang) 2019-0004). הכניסו את העכברים לסביבה מסוימת ללא פתוגנים (SPF) עם גישה חופשית למזון ולמים. שמרו על תנאי המגורים כדלקמן: טמפרטורת החדר (24 ± 2ºC), לחות של 50%–55%, ומחזור אור-חושך של 12 שעות ל-12 שעות.

2. הכנה חיידקית

  1. השתמש בזן מתאים. כאן, השתמשו בזן 43816 של Klebsiella pneumoniae American Type Culture Collection (ATCC).
  2. הכינו מדיום תרבית מתאים (מרק לוריה-ברטאני [LB]).
  3. הכינו חיידקים להזרעה.
    1. קטף מושבה אחת ומחסן אותה ב-5 מ"ל מרק LB, ואז דגר לילה (12 שעות) בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-220 סל"ד.
    2. העבר את תרבית החיידקים ללילה למרק LB טרי ולתרבית למשך 3–4 שעות עד שמגיעים לשלב גדילה בצפיפות גבוהה (צפיפות אופטית ב-600 ננומטר [OD600] ≈ 0.8).
    3. לאחר דילול התמיסה החיידקית, קח 100 מיקרול ומוסף אותו לתחתית כלי התרבית המכיל חומר תרבית מוצק. הניחו אותו באינקובטור של 37°C למשך 12 שעות, ספרו את מספר המושבות, וקבלו את ריכוז KP ב-2 × 109 CFU/mL, כלומר OD600 ≈ 0.8.
    4. כוון את ריכוז החיידקים באמצעות תמיסת NaCl של 0.9%. הכינו שלושה תללים חיידקיים בריכוזים של 1 × 108 CFU/מ"ל, 1 × 106 CFU/מ"ל, ו-1 × 104 CFU/מ"ל לשימוש הבא.

3. זיהום באינזריה תוך-נזלית (איור 1)

  1. הרדמו את העכבר באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית של 2% נתרן פנטוברביטל במינון של 2 מיקרוליטר/גרם (איור 1A,B).
  2. כאשר העכבר מציג תודעה מופחתת אך שומר על רפלקס הבליעה, יש לשאוב 50 מיקרוליטר של ההשעיה החיידקית (או 0.9% NaCl כבקרה) באמצעות מיקרופיפטה.
  3. החזק בעדינות את צוואר העכבר כשהאגודל מונח על חזית הצוואר, ואחז בעדינות בגוף העכבר עם שאר האצבעות. הטה את ראש העכבר לאחור (איור 1C).
  4. החדרו בהדרגה את ההשעיה החיידית לנחיריו של העכבר באמצעות פיפטה (כ-5–10 מיקרוליטר לטיפה). הטמיעו טיפה אחת לנחיר אחד בכל פעם (איור 1D).
  5. לאחר שראיתי שהעכבר שאף את המתלה, הרם אותו במהירות כלפי מעלה ואז מוריד אותו באיטיות כדי לעודד את שאיפת המתלה אל תוך הסימפונות (איור 1E,F).
  6. חזור על השלבים הנ״ל, תוך התחלפות בין ההשקעה לנחיר השני עד שהעכבר שואף לחלוטין את תליית החיידקים של 50 מיקרוליטר.
  7. אם העכבר משתעל, נאנח או אינו יכול לשאוף את התמיסה החיידקית במהלך הניתוח, אפשר לעכבר לנוח ולהתבונן. לאחר שהמצב מתייצב, המשך בשלב השאיפה כדי לוודא שהעכבר שואף את כל תמיסת החיידקים (או 0.9% NaCl).
  8. קבע את העכבר במצב שכיבה על לוח עכבר מוטה ב-60°. אם טמפרטורת החדר נמוכה, השתמש בתנור כדי לעזור לעכבר להתאושש. עקבו אחרי העכבר עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה, ואז החזירו אותו לכלוב עם תנאי טמפרטורה מיטביים, מים ומזון מספקים.

4. הערכת מודלים

הערה: ארבע קבוצות של מודלים של עכברים הוקמו באמצעות שיטת ההחדרה התוך-נזלית שהוזכרה קודם, כלומר קבוצת הביקורת (קבוצה א', שהושתלה ב-PBS), קבוצת הריכוז 1 ×-104 ק"פ (קבוצה ב'), קבוצת הריכוז 1 ×-106 קילומטר (קבוצה ג'), וקבוצת הריכוז 1 ×-108 קילומטר (קבוצה ד'). המודל הוערך באמצעות השיטות הבאות:

  1. העריכו את המדדים הדלקתיים של 12 שעות.
    1. ב-12 שעות לאחר הזרקת KP בתוך האף, יש לאסוף דם (≥ 300 מיקרוליטר) באמצעות ניקור לב (n = 5 לכל קבוצה). הפרדו את הסרום בצנטריפוגה (1000 × גרם, 10 דקות) והשתמשו בו לזיהוי אינטרלוקין-6 ציטוקין (IL-6).
  2. הערכת נזק לאיברים למשך 24 שעות
    1. ב-24 שעות לאחר הזרקת KP בתוך האף, יש להשתמש בסרום לזיהוי אינדיקטורים ביוכימיים (n = 5 לכל קבוצה). בין המדדים הללו, יש להשתמש באלנין אמינוטרנספראז (ALT) ובאספרטט אמינוטרנספראז (AST) להערכת נזק לכבד, בקריאטין קינאז (CK) לנזק שרירי, וחנקן אוריאה בדם (BUN) לנזק לכליות.
  3. הערכת תסמינים
    1. עקבו אחרי משקל הגוף של העכבר מדי יום, ועקוב אחרי מצב השיער, רמת הפעילות ופרמטרים נוספים.
  4. ציטוקינים ותאי מערכת החיסון למשך 7 ימים
    1. לאחר 7 ימים לאחר המידול (n = 10 [A/B], n = 15 [C], n = 40 [D]), יש לאסוף דם היקפי באמצעות ניקור לב לניתוח ציטומטריית זרימה להערכת אחוזי הלימפוציטים, את שיעור הביטוי של קומפלקס היסטוקומפביליות עיקרי מסוג II (MHC-II) במונוציטים, עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת MFI) של IL-10 ו-TGF-β1 בתאי T CD4+ .
    2. עיבוד רקמות
      1. מערבבים דגימות דם (100 מיקרוליטר) עם בופר פירוק תאי דם אדומים (300 מיקרוליטר) ביחס נפח של 1:3. לאחר 15 דקות של ניתוק אריתרוציטים בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את התערובת ב-400 × גרם למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנאנט.
      2. החזירו את הכדור ל-200 מיקרוליטר של בופר פירוק תאי דם אדומים (יחס נפח = 1:2) ודוגרו במשך 10 דקות לפירוק משני.
      3. לאחר צנטריפוגציה נוספת ב-400 × גרם למשך 5 דקות, הסר את הסופרנאנט ותליה מחדש את הכדור ב-100 מיקרו ליטר של בופר צבע תאי.
      4. הוסף 1 מיקרוליטר מכל נוגדן ציטומטריית זרימה לדגימות. בקצרה, הוסיפו את CD45 לצביעת לימפוציצים; נוגדנים CD45, CD116, Ly6G, Ly6C ו-MHC-II לזיהוי MHC-II; נוגדנים CD45, CD3, CD4, CD8 ו-CD25 למדידת IL-10 ו-TGF-β1. יחס הדילול לכל נוגדן שצויין לעיל הוא 1:100.
      5. דגרו את כל הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. לאחר מכן, מוסיפים 1 מ"ל של בופר צבע תאי, ואז צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות; השליכו את הסופרנטנט.
      6. לצורך זיהוי לימפוציטים ו-MHC-II, יש להשעות מחדש ב-400 מיקרוליטר של בופר כתמי תא לפני ניתוח ציטומטריית זרימה.
      7. לאחר מכן, לבצע נהלים לזיהוי IL-10 ו-TGF-β1 לפי שלבים 4.4.2.8–4.4.2.12:
      8. הוסיפו 1 מ"ל של בופר קיבוע ודוגרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 60 דקות.
      9. לאחר הוספת 1 מ״ל של בופר פרם, צנטריפוגה את התערובת ב-400 × גרם למשך 5 דקות, וזרקו את הסופרנטנט.
      10. השעתי מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של בופר פרם, ואחר כך מוסיפים 1 מיקרוליטר כל אחד מנוגדני Foxp3, IL-10 ו-TGF-β1. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
      11. לאחר מכן, הוסיפו 1 מ"ל של בופר פרם, וצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות לפני הסרת הסופרנטנט.
      12. לבסוף, החזירו את התאים לתוך 400 מיקרוליטר של בופר צבע תאים וזוהו באמצעות ציטומטריית זרימה.
    3. אסטרטגיית סגירת השער
      1. כדי לזהות לימפוציטים, יש להוציא פסולת וכפילים בגרף FSC-A/FSC-H. זהה את סך הלויקוציטים כאירועי CD45⁺. השער את הלימפוציטים בהתבסס על FSC/SSC נמוך באוכלוסיית CD45⁺.
      2. לזיהוי MHC-II, תחילה לויקוציטים בשער על FSC-A/SSC-A כדי להוציא פסולת, ולאחר מכן בוחרים תאי CD45⁺. זהה תאי מיאלואידים כ-CD11b⁺, כאשר נויטרופילים מודרים על ידי שליליות Ly6G. הגדר מונוציטים קלאסיים כתאי Ly6G⁻ Ly6Chi, והעריך את ביטוי MHC-II באוכלוסייה זו.
      3. כדי לזהות IL-10 ו-TGF-β1, יש להוציא פסולת וכפילים על ידי FSC-A/SSC-A ו-FSC-A/FSC-H. זהה את סך תאי ה-T כאירועי CD45⁺CD3⁺. בתוך אוכלוסיית CD4⁺CD8⁻, מזהים את ה-Tregs כתאי CD25⁺FOXP3⁺. כמת תאי TGF-β⁺ בתת-הקבוצה של Treg, והערכת ביטוי IL-10 בכל תאי ה-CD4⁺ T. הגדר את כל השערים החיוביים באמצעות בקרות FMO.
  5. ספירת חיידקים בנוזל שטיפה ברונכואלוואולרי (BALF) לאחר 24 שעות לאחר זיהום משני
    1. ביום השביעי לאחר הקמת המודל (n = 5 [A/B], n = 10 [C], n = 40 [D]), יש לחשוף את העכבר להזרקה תוך-אף של 50 מיקרו-ליטר של Pseudomonas aeruginosa (PA) (בריכוז של 6.8 ×10 10 CFU/mL) באמצעות שיטת ההחדרה התוך-אפית שהוזכרה קודם.
    2. ב-24 שעות לאחר ההדבקה המשנית ב-PA, יש לאסוף 1.5 מ"ל של נוזל שטיפה ברונכואלואולרית (BALF). מדלל סדרתי את ה-BALF, צריח אותו על מדיום נוזלי LB, ודוגר אותו באינקובטור בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37°C במשך 24 שעות לפני ספירת המושבה.
    3. עקבו אחר השלבים הבאים לאיסוף BALF.
      1. הרדמו עמוק (2.5 מיקרוליטר/גרם 2% נתרן פנטוברביטל) או הורדמו את העכבר (7.5 מיקרוליטר/גרם 2% נתרן פנטוברביטל) באופן הומני והניחו אותו בשכיבה עם הצוואר מתוח מדי.
      2. בצע חתך צוואר הרחם באמצע כדי לחשוף את קנה הנשימה. הכנס קטטר קהה של 24G לקנה הנשימה עד קצת מעבר לקרינה ומאובטח אותו עם תפר.
      3. הזרקו לאט ומשכו בעדינות PBS סטרילי וקר (0.5 מ"ל לאליקווט) באמצעות מזרק של 1 מ"ל. חזרו על מחזור השטיפה הזה 3–5 פעמים. בצע את התהליך הזה 3 פעמים, מה שמוביל לנפח שטיפה כולל של 1.5 מ"ל.
  6. ניתוח הישרדות
    1. השתמש בקבוצה נפרדת של עכברים לניתוח הישרדות (n = 10 [A/B/C], n = 40 [D]).
    2. רשמו את מצב ההישרדות של העכברים בתוך 7 ימים לאחר ההדבקה.
    3. לאחר הדבקה משנית ב-PA, יש לעקוב אחרי שיעור התמותה של העכברים מהיום השביעי ועד היום ה-14.
    4. לאחר התצפית, הרדמו עמוק את העכברים עם איזופלורן (5%) והורדים אותם בהזרקה תוך-פריטוניאלית של מנת יתר של פנטוברביטל נתרן (150 מ"ג/ק"ג), כאשר מותם מאושר על ידי פריקה צווארית.
  7. ניתוח סטטיסטי
    1. לבצע בדיקות נורמליות ובדיקות הומוגניות של שונות על הנתונים הכמותיים.
    2. להשוואות בין קבוצות, יש להשתמש בניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) אם הנתונים מתפלגים באופן תקין ומציגים שונות הומוגנית; אחרת, השתמש במבחנים לא פרמטריים.
    3. בצע ניתוח הישרדות באמצעות שיטת קפלן-מאייר. השתמשו במודלים של השפעות מעורבות כדי לבדוק הבדלים בשינויים במשקל הגוף בין קבוצות בנקודות זמן שונות. נבחן ערך p ≤ 0.05 כמובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ב-12 שעות לאחר הזרקה תוך-אפית, רמת IL-6 בסרום בקבוצת 1 ×-108 KP עלתה באופן משמעותי (p < 0.0001, n = 5) (איור 2A). ב-24 שעות לאחר ההזרעה התוך-נזלית, רמות הסרום של ALT (p < 0.01, n = 5) (איור 2B), AST (p < 0.01, n = 5) (איור 2C), CK (p < 0.01, n = 5) (איור 2D), ו-BUN (p < 0.001, n = 5) (איור 2E) בקבוצת 1 × 108KP היו גבוה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אלח דם הוא תסמונת קלינית מורכבת, ומצב הדיכוי החיסוני האופייני בשלב המאוחר הוא גורם מרכזי המוביל למוות המטופל12,13. לכן, מודלים פרה-קליניים המדמים במדויק את הפתופיזיולוגיה של דיכוי חיסון המושרה על ידי ספסיס הם חיוניים לחקירה מעמיקה של המנגנונים שלה ולפיתוח טיפולים חדשים. במחקר זה, הצלחנו לבסס ולאמת מודל אלח דם של עכבר שנגרם על ידי הזרקה תוך-אפית של KP, עם תכונה מרכזית של שכפול יציב של מצב מדכא חיסון שרלוונטי מאוד לפרקטיקה הקלינית....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82222038 ו-81970259), הכישרונות הצעירים המצטיינים בביוטכנולוגיה להגנה הלאומית (2023-JCJQ-ZQ-001 ו-01-SWKJYCJJ06), וקרן המדע של צ'ונגצ'ינג לחוקרים צעירים מצטיינים (CSTB2022NSCQ-JQX0017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Biochemical incubatorYSEISHH-150Lדגירה בקטריאלית
C57BL/6J miceVital River Laboratories8-10 weeks, male
CD116bBioLegend101257נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
CD25BD bioscience740447נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
CD3BioLegend100203נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
CD4BioLegend100544נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
CD45BioLegend103116נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
CD8BioLegend100752נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
Cell stain buffer BioLegend420201
Constant temperature shakerHonourHNY-100Bגידול חיידקים
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEXניתוח ציטומטריית זרימה
High-speed centrifugeBeckman CoulterAIIEGRA
IDEXX catalyst oneIDEXXCatalyst Oneניתוח ביוכימי
IL-10BioLegend505026נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
Insulin syringe WEGO1mLאיסוף דם
Klebsiella pneumoniae ATCC 43816biobw.orgbio-81659
LB Broth (powder)SolarbioL1010תרביות נוזלית LB
LB Broth (powder)SolarbioL1015צלחת אגר LB
LY6CBioLegend128010נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
Ly6GBioLegend127606נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
MHC-IIBioLegend107622נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
MicropipetteEppendorfP100
Red blood cell lysis bufferSolarbioR1010
SpectrophotometerEppendorfEppendorf6131מדידת צפיפות אופטית
Statistical softwareGraphPad SoftwareGraphpad Prism10.0
Sterile and enzyme-free pipette tipsBiosharp200μL
TF diluent bufferBD Pharmingen51-90008101
TF fix/perm bufferBD Pharmingen51-90008100
TF perm/wash bufferBD Pharmingen51-90008102
TGF-β1BioLegend141406נוגדנים זרימה (נוגד עכבר)
Varioskan LUX multimodemicroplate readerThermo ScientificVarioskan LUX 

מקורות

  1. Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: for the third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
  3. Seymour, C. W., et al. Assessment of clinical criteria for sepsis: for the third international consensus definitions for sepsis and septic shock (sepsis-3). JAMA. 315 (8), 762-774 (2016).
  4. Meyer, N. J., Prescott, H. C. Sepsis and septic shock. N Engl J Med. 391 (22), 2133-2146 (2024).
  5. Kingsley, S. M., Bhat, B. V. Differential paradigms in animal models of sepsis. Curr Infect Dis Rep. 18 (9), 26(2016).
  6. Hansen, V., Oren, E., Dennis, L. K., Brown, H. E. Infectious disease mortality trends in the United States, 1980-2014. JAMA. 316 (20), 2149-2151 (2016).
  7. Ashurst, J. V., Dawson, A. Klebsiella pneumonia. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  8. Jondle, C. N., Gupta, K., Mishra, B. B., Sharma, J. Klebsiella pneumoniae infection of murine neutrophils impairs their efferocytic clearance by modulating cell death machinery. PLoS Pathog. 14 (10), e1007338(2018).
  9. Aghamohammad, S., et al. First report of extended-spectrum betalactamase-producing Klebsiella pneumoniae among fecal carriage in Iran: high diversity of clonal relatedness and virulence factor profiles. Microb Drug Resist. 26 (3), 261-269 (2020).
  10. Bengoechea, J. A., Sa Pessoa, J. Klebsiella pneumoniae infection biology: living to counteract host defenses. FEMS Microbiol Rev. 43 (2), 123-144 (2019).
  11. Assoni, L., et al. Animal models of Klebsiella pneumoniae mucosal infections. Front Microbiol. 15, 1367422(2024).
  12. Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nat Rev Immunol. 13 (12), 862-874 (2013).
  13. Van Der Poll, T., Van De Veerdonk, F. L., Scicluna, B. P., Netea, M. G. The immunopathology of sepsis and potential therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 17 (7), 407-420 (2017).
  14. Diboue Betote, P. H., et al. Sex-dependent vulnerability for Wistar rats model following intranasal instillation with Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 causing lobar pneumonia. Pneumonia. 16 (1), 5(2024).
  15. Leus, I. V., Zgurskaya, H. I. No two are alike: on the role of Klebsiella pneumoniae permeability barriers in antibiotic susceptibility and persistence. Antimicrob Agents Chemother. 69 (8), e0008525(2025).
  16. Siempos, I. I., et al. Cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice. J Vis Exp. (84), e51066(2014).
  17. Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
  18. Prescott, H. C., Angus, D. C. Enhancing recovery from sepsis: a review. JAMA. 319 (1), 62-75 (2018).
  19. Barichello, T., Generoso, J. S., Singer, M., Dal-Pizzol, F. Biomarkers for sepsis: more than just fever and leukocytosis-a narrative review. Crit Care. 26 (1), 14(2022).
  20. Vulliamy, P. E., Perkins, Z. B., Brohi, K., Manson, J. Persistent lymphopenia is an independent predictor of mortality in critically ill emergency general surgical patients. Eur J Trauma Emerg Surg. 42 (6), 755-760 (2016).
  21. Pei, F., et al. Expert consensus on the monitoring and treatment of sepsis-induced immunosuppression. Mil Med Res. 9 (1), 74(2022).
  22. Lang, J. D., Matute-Bello, G. Lymphocytes, apoptosis and sepsis: making the jump from mice to humans. Crit Care. 13 (1), 109(2009).
  23. Wu, H., et al. Predictive value of the neutrophil-to-lymphocyte ratio in the prognosis and risk of death for adult sepsis patients: a meta-analysis. Front Immunol. 15, 1336456(2024).
  24. Siegler, B. H., et al. Postoperative abdominal sepsis induces selective and persistent changes in CTCF binding within the MHC-II region of human monocytes. PLoS One. 16 (5), e0250818(2021).
  25. Pachot, A., et al. Messenger RNA expression of major histocompatibility complex class II genes in whole blood from septic shock patients. Crit Care Med. 33 (1), 31-38 (2005).
  26. Padovani, C. M., Yin, K. Immunosuppression in sepsis: biomarkers and specialized pro-resolving mediators. Biomedicines. 12 (1), 175(2024).
  27. Misra, A. K., Levy, M. M., Ward, N. S. Biomarkers of immunosuppression. Crit Care Clin. 36 (1), 167-176 (2020).
  28. Monneret, G., et al. The anti-inflammatory response dominates after septic shock: association of low monocyte HLA-DR expression and high interleukin-10 concentration. Immunol Lett. 95 (2), 193-198 (2004).
  29. Bergmann, C. B., et al. Potential targets to mitigate trauma- or sepsis-induced immune suppression. Front Immunol. 12, 622601(2021).
  30. Van Vught, L. A., et al. Incidence, risk factors, and attributable mortality of secondary infections in the intensive care unit after admission for sepsis. JAMA. 315 (14), 1469-1479 (2016).
  31. Jones-Nelson, O., et al. The neutrophilic response to Pseudomonas damages the airway barrier, promoting infection by Klebsiella pneumoniae. Am J Respir Cell Mol Biol. 59 (6), 745-756 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Klebsiella pneumoniaeMHC II
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים