מאמר שיטה

בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)

933 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70162

⸱

27 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Transfusion Medicine and Cell Therapy, Medical University of Vienna

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לגידול תאי T ראשוניים, כולל בידדם, הפעלה, התרחבותם וטרנספקציה חולפת באמצעות אלקטרופורציה של mRNA. בנוסף, מוצע תהליך עבודה ופאנל נוגדנים לניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפ, סמני הפעלה, כדאיות וביטוי קולטני אנטיגן כימרי (CAR).

תקציר

כדי להעריך את היעילות והעוצמה של תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR), חשוב לבודד, להפעיל, להרחיב, לאפיין ולהנדס גנטית תאי T ראשוניים בבני אדם. בהשוואה לקווי תאי T נפוצים, תאים ראשוניים יכולים לספק מערכת מודל ריאליסטית יותר, שכן הם משתנים מאוד, מסוגלים להרוג בתאי T ויכולים להתמיינות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לכל השלבים החיוניים לגידול תאי T ראשוניים, כולל בידודם ממוצרי דם, הפעלה, התרחבות מבחנה וטרנספקציה חולפת. אנו מתארים הבדלים בקינטיקת התפשטות ובהתמיינות של תאי T ראשוניים בעת הפעלה עם שני מגיבים שונים, ומספקים פאנל נוגדנים לניתוח ציטומטרי זרימה של פנוטיפ תאי T ומצב הפעלה. אנו מציעים הוראות מפורטות לאלקטרופורציה של תאי T אנושיים באמצעות mRNA המקודד ל-CAR ולהערכת קינטיקת ביטוי CAR לאורך זמן. פרוטוקול זה מספק המלצות על נקודות זמן אידיאליות לבדיקות עוצמה ויעילות במורד הזרם של תאי CAR T ולהשפעת כמויות שונות של mRNA על עוצמת האות. בהתחשב באופי הזמני של שיטה זו, היא מספקת אפשרות מהירה וקלה ליישום לבדוק ולהשוות מבנים רבים של CAR במקביל.

מבוא

תאי T אנושיים ראשוניים מהווים מודל פיזיולוגי רלוונטי ורב-שימושי לחקר ביולוגיית תאי T ולפיתוח והערכת טיפולים תאיים, כולל הנדסת CAR. בניגוד לקווי תאים מונצחים, תאי T שמקורם בתורמים בריאים משקפים מקרוב את המגוון הפונקציונלי, מצבי ההפעלה, המגוון הפנוטיפי ודינמיקת האיתות של תאי T בגוף, ומספקים ייצוג מדויק יותר של תגובות חיסוניות וביצועים טיפוליים 1,2. יתרה מזאת, קו תאי ה-T של ג'ורקט הנפוץ ביותר, שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית, דווח כי מציג חוסר יציבות גנומית לאחר תרבית ממושכת, תופעה נפוצה בקווי תאים. 3 בעוד שקווי תאי T, כולל קווי תא מדווחים4, יכולים להיות כלים חשובים לסינון מוקדם ולאפשר קריאה מהירה, השימוש בתאי T ראשוניים של מטופלים משקף במדויק יותר את היישום הסופי. עם זאת, הזמינות המוגבלת והאיכות הלא אופטימלית של תאי T שמקורם במטופלים לעיתים מגבילים את היישום שלהם, במיוחד בשלבים מוקדמים של פיתוח מוצר פרה-קליני 5,6,7. שימוש בתאים מתורמים בריאים ממזער עוד יותר את השונות שנוצרת על ידי שינויים חיסוניים הקשורים למחלה וטיפולים קודמים, ומאפשר הערכה שחזורית של תפקוד, הפעלה וביטוי גנים טרנסג'ינים בקרב תורמים מרובים.

בהינתן שקיימים תאי T ראשוניים, פרוטוקולים לבידוד, הפעלה והרחבה של תאי T ראשוניים הם תנאים קריטיים למניפולציה גנטית ולבדיקות תפקודיות שלהם. אסטרטגיות הפעלה נפוצות כוללות או חרוזים מגנטיים מצופים בנוגדנים, תגובות פולימריות המכילים אגוניסטים לתאי T, או נוסחאות נוגדנים מסיסות. בדרך כלל, מגיבים להפעלה מחקים הפעלה פיזיולוגית של קולטני תאי T (TCR) דרך קומפלקס CD3 ואיתות קו-גירוי דרך CD28, שמזכיר הפעלה חזקה יותר מאשר רק דרךCD3 8. הפעלה עם חרוזי CD3/28 מאפשרת שליטה מדויקת בעוצמת ההפעלה וביחס החרוזים לתא. לאחר שלב גירוי ראשוני, ניתן להסיר את החרוזים או להישמר בתרבות להפעלה רציפה. תאי T מתרחבים בדרך כלל במהירות במשך שלושה עד ארבעה שבועות לפני שגדילת התאים מאטה. לעומת זאת, טרנסאקט מכיל מטריצה פולימרית קולואידית, וניתן להסיר מיותרים פשוט באמצעות צנטריפוגה והחלפת הסופרנאנט. לכן, הוא מספק אלטרנטיבה שמאפשרת הפעלה הומוגנית בתרבות ודומה להפעלה של תאי T עם גירוי נמוך יותר בהשוואה לחרוזי CD3/28. עם זאת, התרבות מושרה למשך כשבועיים, ונדרש גירוי חוזר לתקופות התרחבות ארוכות יותר. לאחר הפעלה ראשונית של תאי T באמצעות תגובת הפעלה, תאי T מתרבים ומורחבים במבחנה למשך שבוע עד ארבעה שבועות לפני שניתן להשתמש בהם לניסויים. ראוי לציין שסוג המגיב להפעלה, בחירת הציטוקינים 9,10,11, ותקופת ההתרחבות משפיעים על מספר תאי ה-T המוחלטים, הפנוטיפ ומצב ההפעלה המוחלט. בדרך כלל, יש לבדוק תחילה תנאים אופטימליים כמו ריכוז תגובה, צפיפות תרבית, תוספת ציטוקינים וזמן התרחבות כדי להשיג רבייה עמידה מבלי לגרום למוות תאי המושרה על ידי הפעלה או להתשה של תאי T. כאן אנו מציגים השוואה זו לצד זו של שני פרוטוקולי הפעלה שונים והשפעתם על ההתמיינות ופרופיל ההפעלה של תאי T ראשוניים בבני אדם, כדי לתמוך בהחלטות לגבי בחירת מגיב ההפעלה ותזמון הניסויים.

בנוסף, אנו מציעים לשלב פאנל ציטומטרי זרימה שימושי לניתוח הרכב פנוטיפי ומצב הפעלה של תאי T, התומך בתכנון ניסוי. לצורך שינוי גנטי של תאי T ראשוניים, טרנספקציה חולפת באמצעות אלקטרופורציה של חומצה ריבונוקלאית שליח (mRNA) מהווה אלטרנטיבה בטוחה, יעילה וגמישה להעברה ויראלית12. בעוד שווקטורים לנטיויראליים מאפשרים ביטוי יציב וארוך טווח של טרנסגנים, הם דורשים אמצעי בטיחות ביולוגית מורכבים, כוללים אינטגרציה בגנום של המאכסן, ויכולים להוביל לביטוי משתנה בהתאם לאתר האינטגרציה. בנוסף, ייצור סופרנטנטים של לנטי-ויראליים, ואחריו העברת תאי T ובחירת תאים מועברים, גוזלת זמן. לעומת זאת, אלקטרופורציה של mRNA מאפשרת ביטוי מהיר וחולף של גנים יעדיים ללא אינטגרציה גנומית או רכיבים ויראליים, ובכך מפחית את העומס הרגולטורי ומאפשר בדיקות מהירות ואיטרטיביות של מבנים. זה מועיל במיוחד בשלבי הפיתוח המוקדמים, בהם מספר מועמדים ל-CAR עוברים סינון ומוערך. בפרסומים אחרונים, טרנספקציה באמצעות mRNA נחקרת כפלטפורמה טיפולית 13,14,15. אנו מציעים כי טרנספקציה חולפת עם mRNA16 היא גישה שקלה ליישום, במיוחד במעבדות שאין להן אפשרות לבצע עבודות לנטיוויראליות בסביבה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). השוואה זו לצד של משטרי הפעלה שונים של טרנסדוקציה לנטיוויראלית קודמת זמינה במקום אחר17.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, ההפעלה, הטיפוח, ההתרחבות והטרנספקציה החולפת של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות חרוזי אנטי-CD3/28 או TransAct להפעלה ואלקטרופורציה של mRNA לביטוי CAR חולף. תהליך העבודה המתוארת מאפשר יצירת תאי CAR T פונקציונליים שניתן לשחזור המתאימים ליישומים במורד הזרם כגון בדיקות ציטוטוקסיות, אפיון פנוטיפי או מודלים במבחנה של טיפולי תאי T מאמצים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות האתיות של האוניברסיטה הרפואית של וינה. ההצעות האתיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של וינה (1087/2025 ו-1198/2025).

1. בידוד תאי T ראשוניים ממוצרי דם

הערה: החומר ההתחלתי יכול להיות דם מלא, תוצרי אפרזיס או תאי הפחתת לויקוציטים. שמרו את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד והתחילו את הבידוד מוקדם ככל האפשר, אך לכל המאוחר בתוך 24 שעות לאחר איסוף הדגימות. קיימות אסטרטגיות בידוד שונות לבידוד תאי T, כולל ברירה שלילית וחיובית. סעיפים 1.1 ו-1.2 מציגים שני פרוטוקולים שונים כדי לספק אפשרויות לבידוד תאי T. טיפול במוצרי דם צריך להתבצע בארון בטיחות ביולוגית, תוך שמירה על טמפרטורת החדר (RT) במהלך העיבוד.

  1. בידוד תאי T באמצעות בחירה שלילית באמצעות צנטריפוגציה של גרדיאנט צפיפות
    1. לפי הוראות הערכה, הוסף את הכמות הנדרשת של קוקטייל הנוגדן לכל מ"ל דגימה. תדגר לזמן הנתון ב-RT. לערכת העשרת תאי T האנושית המוצעת: השתמשו ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים לכל מ"ל דגימה ודגרו במשך 20 דקות ב-RT (למשל, עבור 5 מ"ל דגימה, מוסיפים 250 מיקרו-ליטר של קוקטייל נוגדנים).
      הערה: עבור ערכה ספציפית זו, יש צורך בכמות מינימלית של תאי דם אדומים (RBCs) לצורך בידוד מוצלח של תאי T (היחס המינימלי המומלץ הוא 100 תאי דם אדומים לכל תא גרעין). זה קורה בדרך כלל כאשר תאי הפחתת דם מלא או לויקוציטים משמשים כחומר התחלתי. לשימוש במכפלת אפרזיס, אסטרטגיית בידוד זו עשויה שלא להצליח כיוון שיחס ה-RBC בדרך כלל נמוך מדי. לכן, מומלץ לבצע בידוד קודם של תאי דם מונוגרעיניים היקפיים (PBMCs) ואחריו שלב בידוד תאי T כפי שמתואר בסעיף 1.2.
    2. הכינו מדיום צפיפות (Ficoll, Pancoll או דומה) בצינור מתאים. לנפחי דגימה מתחת ל-3 מ"ל, השתמשו ב-3 מ"ל של מדיום צפיפות (בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל). לנפחי דגימה של 4 מ"ל ומעלה, השתמשו ב-15 מ"ל של מדיום צפיפות (בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל).
    3. בסיום זמן הדגירה, מדללים את הדגימה בנפח שווה של סרק בופר פוספט (PBS) המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) ומערבבים באמצעות פיפטינג. זה מתאים לדילול של 1:2 (למשל, דילול של 3 מ"ל דגימה עם 3 מ"ל PBS עם 2% FBS). שכב בזהירות את הדגימה המדוללת מעל מדיום הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית ועזר פיפטינג, כאשר מהירות הפיפט מוגדרת למינימום.
    4. החזק את הצינור בזווית של 45° כדי להגדיל את שטח הפנים של מדיום הצפיפות ולתמוך בשכבות.
    5. צנטריפוגה את הדגימה ב-1,200 x גרם, RT, למשך 20 דקות. כבה את הבלם של הצנטריפוגה או הגדיל אותו למינימום. לאחר הצנטריפוגה, שכבה לבנה צריכה להיות נראית בין הממשק בין תווך הצפיפות לפלזמה. הטבעת הלבנה המעוננת הזו מכילה את תאי ה-T הרצויים.
    6. קצרו את תאי ה-T על ידי איסוף זהיר של השכבה באמצעות פיפטה סטרילית או פיפטה סרולוגית בנפח 2 מ"ל והעברתם לצינור טרי. הפריעו לשכבות כמה שפחות כדי להימנע מהעברת חומר הצפיפות או הפלזמה.
    7. המשך עם סעיף 1.3.
  2. בידוד תאי T באמצעות בחירה חיובית באמצעות ערכת זרימת כבידה
    1. בצע שלב בידוד גרדיאנט צפיפות לחילוץ PBMCs מהדגימה: הכין מדיום צפיפות לפי סעיף 1.1.2. מדלל את הדגימה בנפח שווה של PBS עם 2% FBS. זה מתאים לדילול של 1:2 (למשל, דילול 3 מ"ל של דגימה עם 3 מ"ל PBS + 2% FBS).
    2. שכב בזהירות את הדגימה המדוללת מעל מדיום הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית ועזר פיפטינג, כאשר מהירות הפיפט מוגדרת למינימום. החזק את הצינור בזווית של 45° כדי להגדיל את שטח הפנים של מדיום הצפיפות ולתמוך בשכבות.
    3. צנטריפוגה ב-400 x g, RT, למשך 30 דקות כשהברייק כבוי או מוגדר למינימום. לאחר הצנטריפוגה, שכבה לבנה אמורה להיות נראית בממשק בין מדיום הצפיפות לפלזמה. הטבעת הלבנה המעוננת הזו מכילה את ה-PBMCs, שכן צפיפותם נמוכה מזו של תאי דם אדומים.
    4. קציר PBMCs על ידי איסוף זהיר של השכבה הלבנה והמעוננת והעברתם לצינור טרי. השתמשו בפיפטה סטרילית בהעברה או בפיפטה סרולוגית של 2 מ"ל לשלב זה והפריעו לשכבות כמה שפחות.
    5. שטוף את התאים שנאספו: הוסף 20 מ"ל PBS עם 2% FBS. ספרו את התאים וחשבו את מספר התאים הכולל. צנטריפוגה ב-300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות, עם הבלם. מהיום, תשמור את התאים על קרח ותעבוד עם מגיבים מקוררים.
    6. פיפט מהסופרנטנט. החישובים הבאים משמשים עד 1 על 10 תאים7 וניתן להגדיל אותם בהתאם. החזירו את כדור התא ל-80 מיקרוליטר של PBS עם 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA) ו-2 מ"מ אתילנדיאמינטטטראצטית (EDTA).
    7. מערבבים 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD4 עם 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזי CD8. הוסיפו את תערובת החרוזים ל-PBMCs שהוחזרו. ערבבו היטב ודגרו 15 דקות בטמפרטורה של 4°C.
    8. בינתיים, מקם את עמודת זרימת הכבידה בשדה המגנטי של מכשיר הפרדה מתאים. הכינו את העמודה על ידי שטיפה ב-3 מ"ל PBS עם BSA ו-EDTA.
    9. לאחר שלב הדגירה, שוטפים תאים על ידי הוספת 2 מ"ל PBS עם BSA ו-EDTA. צנטריפוגה ב-300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. השליכו סופרנטנט ותלו מחדש עד 10⁸ תאים ב-500 מיקרו-ליטר של PBS עם BSA ו-EDTA.
    10. הניחו את תליית התא על העמוד. התאים המסומנים נשמרים בעמודה על ידי מכשיר ההפרדה המגנטית. הזרימה מכילה תאים לא מסומנים (PBMCs כפולים שליליים CD4 ו-CD8) וניתן לאסוף אותם במידת הצורך. שטוף את העמודה 3 פעמים על ידי שטיפה עם 3 x 3 מ"ל PBS עם BSA ו-EDTA. הוסף בופר חדש ברגע שהעמודה מתרוקנת.
    11. כדי לשחרר תאים מסומנים, הסר את עמוד זרימת הכבידה מהפריד המגנטי והניח את היציאה שלו מעל צינור איסוף חדש. פיפט של 5 מ"ל PBS המכיל BSA ו-EDTA אל העמוד, ואז דוחף את הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה כדי להוציא את התאים. המשך עם סעיף 1.3.
      הערה: ערכות נוגדנים מגנטיים זמינות כערכות פאן תאי T וכן לתת-קבוצות ספציפיות של תאי T, ויכולות להיות ערכות בחירה חיוביות או שליליות. בכל מקרה, תאים מסומנים נשמרים על ידי מכשיר ההפרדה המגנטית. לברירה חיובית, תאי T (או תת-הקבוצות שלהם) מתויגים בחרוזי מגנטיות דרך הנוגדן המקובע שלהם. לברירה שלילית, כל התאים שאינם שייכים לאוכלוסיית תאי ה-T המוגדרת מסומנים בחרוזים מגנטיים. תאי T נמצאים לכן בזרימה הדרך.
  3. הקפאת תאי T מבודדים
    1. שטוף תאי T עם 20 מ"ל PBS עם 2% FBS. צנטריפוגה ב-300 x g, RT, למשך 10 דקות. ההפסקה יכולה להידלק שוב. זרוק את הסופרנטנט.
    2. תשעה תאים ב-5-10 מ"ל של PBS עם 2% FBS. כדי להשתמש בתאים ישירות לגידול, יש להמשיך עם סעיף 2.4. כדי להקפיא תאים, המשיכו עם הסעיף הבא.
      הערה: הקפאת תאים אינה נדרשת אם תאי T המבודדים משמשים מיד להפעלה וגידול.
    3. ספרו את התאים והצנטריפוגה שהוחזרו ב-300 x g, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. בינתיים, חשב את מספר התאים שיש להקפא. אליקווט תא T אחד צריך להכיל 5-20 x10 6 תאים. הכינו את מספר הבקבוקים הקריו-מסומנים הנדרש וכן את מדיום ההקפאה (ראו טבלה 1).
    4. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנטנט והפיפטה מהנוזל שנותר. תעבוד מהר מעכשיו.
    5. החזירו את כדור התא ב-1 מ"ל של מדיום הקפאה מקורר מראש עבור כל אליקווט (למשל, אם מוכנים חמישה אליקווטים, החזירו את הכדור ל-5 מ"ל של מדיום הקפאה). Aliquot 1 מ"ל תאי השעיה לכל בקבוקון קריו. הקפיאו את הבקבוקים הקריו-מבחנות מיד בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: מומלץ להקפיא בקצב מבוקר. כדי להשיג זאת, השתמשו במיכלי הקפאה מתאימים. העבר את התאים לחנקן נוזלי לאחר הקפאה בטמפרטורה של מינוס 80°C (למשל, ביום הבא או בתוך שבועיים).
רכיבריכוז סופי
דימתיל סולפוקסיד10% (v/v)
סרום בקר עוברי45% (v/v)
RPMI 1640 עם פנול אדום45% (v/v)

טבלה 1: הרכב מדיום ההקפאה. מדיום ההקפאה משמש לשמירה על שלמות וחיוניות התאים במהלך ההקפאה והאחסון.

2. הפשרה, הפעלה והתרחבות של תאי T ראשוניים

  1. בצע את כל השלבים בתנאי עבודה סטריליים באמצעות ארון בטיחות ביולוגי.
  2. מדיום טרום חימום של מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI) 1640 ללא תוספים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והעברת 20 מ"ל לצינור צנטריפוגה. הפשרה של תאי T קפואים על ידי חשיפת הצינור במהירות למים חמים. הפסיקו להפשיר כאשר כדור קרח קטן עדיין נראה בתוך הבקבוקון הקריו.
  3. מיד הוסיפו 1 מ"ל RPMI מחומם מראש למתלה התא והעבירו בזהירות לצינור הצנטריפוגה. שטוף את הבקבוקון הקריו-ב-1 מ"ל RPMI. הימנע משלבים נוספים של תלייה מחדש, שעלולים לחשוך את התאים למתח גזירה.
  4. תאי צנטריפוגה ב-300 x גרם, RT, למשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט. החזירו את כדור התא למדיום מלא של תא T. מדיום תאי T מלא מורכב מ-RPMI 1640 עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 ng/mL אינטרלוקין 7 (IL-7), ו-10 ng/mL אינטרלוקין 15 (IL-15) (ראו טבלה 2).
  5. ספרי את התאים שהושעו. תאי זרע במדיום מלא של תאי T בצפיפות של 1 x 106 תאים/מ"ל בלוח באר מתאים. הוסף את כמות התגובה הנדרשת של הפעלה, כפי שמצוין במדריך המתאים. לדוגמה, כדי להפעיל תאים של 1 x 106 , תאי זרע ב-1 מ"ל של מדיום תאי T מלא בלוח עם 24 בארות. הוסיפו או 25 מיקרוליטר של חרוזי CD3/28 או 10 מיקרוליטר של תגובת TransAct.
    הערה: אם התאים אינם צפופים מספיק (כלומר, ספירת התאים נמוכה מ-1 x 106 תאים למ"ל), צנטריפוגה שוב עם אותם תנאים כמו קודם. החזירו את הכדור בכמות מתאימה של מדיום מלא של תאי T כדי להגיע לצפיפות של 1 על 106 תאים למ"ל.
  6. דגרו תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם סביבה של 5%CO2 למשך עד שלושה שבועות. ספרו תאים כל 2-3 ימים וכווננו את הצפיפות ל-0.3-0.5 x10 6 תאים למ"ל על ידי הוספת מדיום תאי T מלא וטרי. צפיפות התאים לא צריכה לעלות על 1.5 x 106 תאים/מ"ל, שכן תאי T ראשוניים עשויים לא לחזור לשלב הצמיחה האקספוננציאלית אם הם מתורבתים בצפיפויות גבוהות.
    הערה: במיוחד בימים הראשונים לאחר ההפעלה, אשכולות תאים מקרוסקופיים עשויים להיות גלויים (ראו איור 2D). זה צפוי, שכן התאים מתאספים סביב מגיב ההפעלה בעת אתחול הרבלייה. בדרך כלל, התאים יהיו מוכנים לשימוש כשבוע לאחר ההפעלה. עם זאת, התזמון תלוי במבנה הניסוי ובמספר התאים הנדרש. מומלץ להשתמש בתאי T שנמצאים תמיד באותו טווח לאחר ההפעלה עבור שכפולים ביולוגיים (כלומר, 9-12 ימים לאחר ההפעלה).
רכיבריכוז סופי
סרום בקר עוברי10% (v/v)
אינטרלוקין 15 (IL-15)10 ng/mL
אינטרלוקין 7 (IL-7)5 ng/mL
פניצילין/סטרפטומיצין 10,000 U/mL1% (v/v)
RPMI 1640 עם פנול אדוםNA

טבלה 2: הרכב מדיום תאי T מלא. מדיום המשמש לגידול תאי T אנושיים ראשוניים לאחר ההפעלה.

3. צביעה לפנוטיפ וסמנים להפעלה

  1. לספור תאי T. השתמש ב-0.1 x 106 תאים בכל תגובת צביעה. חשב את נפח המתלה הנדרש והעבר אותו לצינור פוליסטירן עגול לתחתית מתאים.
    הערה: ניתן להפחית את מספר התאים המוצבעים למינימום של 50,000 תאים במידת הצורך. צביעת יותר תאים מהכמות הנדרשת אפשרית, כל עוד הנוגדנים נמצאים בעודף מולר, כפי שתואר קודם18,19.
  2. שטוף תאים פעם אחת על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר צביעה, הכולל PBS עם 0.5% FBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. מהיום, תשמור תאים על הקרח ותעבוד עם תגובות מקוררות.
  3. בינתיים, הכן תערובת נוגדנים ראשית אחת לכל הצינורות כפי שמתואר בטבלה 3. מדלל את הנוגדנים לריכוז הסופי בבופר הצביעה. הצביעה מתבצעת בנפח של 50 מיקרוליטר לכל צינור. תערוב טוב, למשל, על ידי מערבולת (וורטקסינג).
    הערה: פרוטוקול זה עשוי להיות משולב עם ניסויים נוספים בצביעה, כגון צביעת ביטוי CAR כפי שמתואר בסעיף 6. ניתן להוסיף צבע לצביעה חי/מת כדי לסייע בגייטינג לתאים חיים. במקרה זה, יש לבחור את ספקטרום הפליטה בהתאם כדי למנוע חפיפה עם שאר הפלואורופורים שבשימוש.
  4. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנטנט והפיפטה מהנוזל שנותר. החזירו כל כדור ל-50 מיקרולטר של תערובת הנוגדנים הראשית.
  5. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך לפחות 30 דקות. שלב הדגירה הזה יכול להימשך עד מספר שעות.
  6. שטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר צביעה ישירות לתגובת הצביעה. צנטריפוגה ב-300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות וזרקו את הסופרנטנט. חזור על החלק הזה עם אותם תנאים. לאחר שלב הכביסה השני, השליכו את הסופרנטנט, והשאירו מעט בופר שאריתי בצינורות כדי למנוע מהתאים להתייבש.
  7. השאר את התאים המוכתמים על קרח עד למדידה. תלה את הכדור ב-100 מיקרוליטר של בופר צביעה ממש לפני המדידה.
    הערה: פרוטוקול זה מותאם לצביעה המתבצעת בצינורות תחתית עגולים של 5 מ"ל. צביעה בלוחות 96 בארות אפשרית גם באמצעות פרוטוקול מעט מותאם. מכיוון שללוחות יש נפח עבודה נמוך יותר, מומלץ לבצע שני שלבי שטיפה של 200 מיקרוליטר לפני צביעה. אם מוזרעים יותר מ-50 מיקרו-ליטר תליון תאים בכל באר, תאי כדור וזרקו את הסופרנטנט לפני המשך שלבי הכביסה. צביעה מתבצעת גם ב-50 מיקרוליטר לבאר. לאחר הצביעה, יש לבצע שלושה שלבים במקום שניים עם בופר צביעה של 200 מיקרוליטר. הצנטריפוגציה מתבצעת באותן הגדרות שתוארו לעיל.
צבע לייזרלייזר λ (nm)מסנן פליטהטווח מסנן (ננומטר)צבע פלואורסצנטיאנטיגןדילול סופיסוג סמן
ויולט405450/45427.5–472.5VioBlueCD451:100לויקוציט פאן
ויולט405525/40505–545VioGreenCD691:50הפעלה
ויולט405610/20600–620Vio Bright V600CD45RA1:100פנוטיפ
כחול488525/40500–545FITCCD81:100פנוטיפ
כחול488690/50665–715PerCP–Vio 700CD1541:50הפעלה
צהוב/ירוק561585/42564–606חינוך גופניCD1341:50הפעלה
צהוב/ירוק561675/30660–690PE–Vio 670CD31:100תא פאן טי
צהוב/ירוק561780/60750–810PE–Vio 770CD251:50הפעלה
אדום638660/20650–670נגמ"שCD1371:50הפעלה
אדום638712/25699.5–724.5ויו ברייט R720CD62L1:100פנוטיפ
אדום638780/60750–810APC–Vio 770CD41:100פנוטיפ

טבלה 3: סקירה של פאנל הנוגדנים והפלואורופורים המוצעים לניתוח ביטוי ראשוני של פנוטיפ וסמני הפעלה בתאי T ראשוניים. נדרש ציטומטר זרימה עם לפחות 4 לייזרים ומערכת המסנן המתאימה לביצוע ניסוי זה. אם הגדרת המכשיר שונה, יש לכוונן את הפלואורופורים בהתאם.

4. שעתוק חוץ-גופי של DNA המקודד ב-CAR ליצירת mRNA

  1. עצב תבנית DNA מתאימה לשעתוק במבחנה (IVT) ל-mRNA. כלול פרומוטר T7 עבור פולימראז RNA של T7, רצף קוזאק, קודון התחלה, רצף פפטיד אות, רצף CAR הרצוי, וקודון עצירה (איור 1).
    הערה: רצף קוזאק הוא מוטיב זיהוי קריטי להתחלת תרגום חלבונים על ידי תמיכה בהרכבה נכונה של קודון התחלה על ידי הריבוזום. פפטיד האות נדרש לעיבוד נכון של ה-CAR בגולג'י ולשילובו בממברנת הפלזמה. כדי לזהות ביטוי CAR, מומלץ לכלול תג בחלק החוץ-תאי של ה-CAR (למשל, תג DYKDDDDK או תג MAP). חלק מה-CAR עשויים גם להתגלות באמצעות אנטיגן קוגנאטי מסיס שלהם המשולב עם פלואורופור, או נוגדנים נגד מבנים נפוצים אחרים, כמו דומיין הקישור scFv (למשל, נוגדן מקשר אנטי-G4S או נוגדן מקשר אנטי-וויטלו).
  2. הגברת DNA באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות פריימרים משני צידי מבנה CAR, כולל פרומוטר T7. עבור ה-IVT נדרש 1 מיקרוגרם של CAR-DNA. אמת את האורך הנכון של מוצר ה-PCR על ידי ביצוע אלקטרופורזה אנליטית בג'ל אגרוז. לטהר את מוצר ה-PCR על ידי טיהור עמודה באמצעות ערכת ניקוי PCR ו-DNA לפני המעבר ל-IVT. ניתן לאחסן DNA בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: יכול להיות מועיל לכלול 5-10 נוקלאוטידים אקראיים באזורי הפריימר לפני ואחרי התמלול כדי להשיג קישור טוב יותר של הפולימראז. מכיוון שנדרשת כמות גדולה של DNA ל-IVT, ניתן להגדיל את נפח תגובת ה-PCR בהתאם.
  3. השתמשו בערכת IVT הכוללת שלב זנב פולי (A) ליצירת mRNA פוליאדנילated. בצע IVT בארון בטיחות ביולוגית ונקה היטב משטחים עם חומר חיטוי. עקוב אחרי הוראות הערכה כדי לבצע את ה-IVT.
    הערה: הארכת שלב השעתוק למספר שעות עלולה להגדיל את תפוקת ה-mRNA. משך שלב הפוליאדנילציה צריך להישאר קבוע בין הדגימות, שכן הוא משפיע ישירות על אורך זנב הפוליאדינציה. דבר זה יכול, בתורו, להשפיע על יציבות ויעילות הביטוי של mRNA ב-vivo20.
  4. טיהור mRNA באמצעות ערכת ניקוי RNA מבוססת עמודה וקבעו את ריכוז ה-mRNA המטוהר באמצעות מכשיר מתאים.
    הערה: ישנן מספר דרכים להעריך את איכות ה-mRNA המועתק, כולל אלקטרופורזה אנליטית בג'ל לפני ואחרי שלב הזנב של הפוליאוריתון (A) ושיטות מבוססות יחס ספיגה לקביעת ריכוז ה-mRNA. היחס המומלץ ל-A260/230 הוא 2.0-2.2; ערכים מתחת ל-1.8 מצביעים על זיהום ופוטנציאל לביצועים ירודים במבחני ביטוי. חשיבות השינויים והטיהור ב-mRNA לפני האלקטרופורציה מתוארת במקום אחר 21,22,23.
  5. Aliquot 3-5 מיקרוגרם של mRNA מטוהר (הכמות הסופית של mRNA שתשמש בניסויים לאלקטרופורציה אחת) ואחסון אליקוואטים ב-80°C- הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.

איור 1
איור 1: ייצוג סכמטי של רכיבי תבנית ה-DNA הנדרשים ליצירת mRNA להעברת תאי T. ה-DNA התבנית ל-IVT צריך להכיל פרומוטר T7, רצף קוזאק, קודון התחלה ואחריו פפטיד אות לאפשר הפרשת החלבון למרחב החוץ-תאי, רצף CAR הרצוי, וקודון עצירה. קיצורים; mRNA = חומצה ריבונוקלאית שליחה; DNA = חומצה דאוקסיריבנוקלאית; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; IVT = תמלול מבחץ . אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. טרנספקציה חולפת של תאי T ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של mRNA

  1. יום אחד לפני הטרנספקציה, דיללו תאי T לצפיפות של 0.3 x 106 תאים/מ"ל במדיום מלא של תאי T (ראו טבלה 2). התאים צריכים להיות בשלב הצמיחה האקספוננציאלית ביום הטרנספקציה (כלומר, בצפיפות מתחת ל-1 x 106 תאים/מ"ל) לצורך ביטוי יעיל של CAR.
  2. ביום הטרנספקציה, חממו מראש את כל המדיה הנדרשת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  3. ספר את תאי ה-T וחשב את הנפח הנדרש. השתמש ב-1-5 x10 6 תאים לכל CAR-mRNA.
    הערה: מומלץ תמיד לכלול טרנספקציה "מדומה" (כלומר, תאי T שעוברים את הליך הטרנספקציה, אך ללא הוספת mRNA). תאים אלו יכולים לשמש גם כאמצעי בקרה שליליים לצביעה ולניסויים. שמור על מספר התא קבוע בתוך ניסוי.
  4. העבר את נפח ההשעיה הנדרש של תאי T לצינור צנטריפוגה חרוטית. צנטריפוגה ב-300 x g, RT, למשך 5 דקות. זרוק את הסופרנטנט. כל שלבי הצנטריפוגה בקטעים הבאים חוזרים על עצמם בתנאים אלו.
    הערה: אם הנפח הנדרש עולה על קיבולת של צינור צנטריפוגה חרוטי יחיד, ניתן לפצל אותו לחלקים שווים על פני שני צינורות או יותר. במקרה זה, תלה מחדש את כל הפלטים בנפח כולל של 20 מ"ל RPMI בינוני ואגד אותם במהלך שלב השטיפה הראשון (סעיף 5.6).
  5. הכינו מדיום מלא של תאי T בלוח באר מתאים לשחזור תאי ה-T לאחר האלקטרופורציה.
    הערה: השתמשו בשיקולים אלו לחישוב: יש לזרוע את התאים בצפיפות של כ-0.5-1.0 x 106 תאים/מ"ל לאחר אלקטרופורציה. כ-1/3 עד 1/2 מהתאים מתים במהלך או אחרי האלקטרופורציה. לדוגמה, אם משתמשים ב-2 x 106 תאים בכל אלקטרופורציה, צפוי להישאר מינימום של 1 x10 6 תאים. כדי להגיע לצפיפות התאים הנדרשת, השתמשו ב-2.0 מ"ל של תווך תאי T מלא (בלוח של 12 בארות). חממו מראש את הלוח המכיל את מדיום תא ה-T בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לביצוע אלקטרופורציה.
  6. בצע את שלב הכביסה הראשון עם 20 מ"ל RPMI עם פנול אדום וללא תוספים. פיפטה RPMI מעל התאים, צנטריפוגה ב-300 x g, RT למשך 5 דקות, והשלכת סופרנטנט.
  7. בצע את שלב השטיפה השני עם 20 מ"ל RPMI ללא פנול אדום וללא תוספים כפי שתואר לעיל.
    הערה: אם משתמשים בתאי T ממספר תורמים לאלקטרופורציה, ניתן להכין את התאים במקביל עד סעיף 5.8. השתמש רק באצווה אחת של תא T לביצוע שלב הכביסה האחרון (סעיף 5.8). השאירו את התאים האחרים מטושטשים בלי להשליך את הסופרנטנט והמשיכו בשלב השטיפה האחרון לאחר סיום סבב האלקטרופורציה הראשון.
  8. בצע את שלב השטיפה השלישי עם 20 מ"ל מדיום סרום מופחת כפי שתואר לעיל.
  9. בשלב הצנטריפוגציה האחרון, אספו את כל האליקוטים הנדרשים של mRNA מהמקפיא ושמרו אותם על קרח. תייגו את הקובטות האלקטרופורציה ואת הפלטה עם המדיה המחוממת מראש.
  10. הגדר את התנאים על מכשיר האלקטרופורציה. כאן משתמשים במערכת כוללת של Gene Pulser Xcell. הגדרות הפרוטוקול לתאי T ראשוניים צריכות להיות:
    פרוטוקול גל מרובע: מתח: 500 וולט, מספר פולסים: 1, אורך פולס: 5 מילישניות, מרווח פולס: 0, קוטר קובטה: 4 מ"מ
    הערה: פרוטוקול זה מותאם לתאי T ראשוניים. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש התאמה של ההגדרות, במיוחד אורך הדופק.
  11. השליך את הסופרנטנט היטב על ידי פיפסת נוזל שנותר מבלי להפריע לכדור. החזירו את כדור התא ל-100 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל אלקטרופורציה (למשל, אם בוצעו חמש אלקטרופורציות, החזירו את הכדור בנפח כולל של 500 מיקרו-ליטר).
  12. השתמשו ב-100 מיקרוליטר של מתלה תאי T ו-3-5 מיקרוגרם של mRNA לכל אלקטרופורציה. הכינו רק אלקטרופורציה אחת בכל פעם. הוסף את תליית תא ה-T לצינור המכיל mRNA, מערבב בעדינות. הימנע מפיפטינג למעלה ולמטה. תעבוד במהירות מעכשיו.
    הערה: נפח ה-mRNA הנוסף לא צריך לעלות על 10 מיקרוליטר. כמות ה-mRNA ניתנת להתאמה במידת הצורך. כשמשווים CARs או ניסויים, תמיד השתמשו באותו מספר תאים ו-mRNA לכל אלקטרופורציה. זה חשוב, שכן כמות ה-mRNA קשורה ישירות לרמות הביטוי של CAR (ראו איור 5).
  13. העבר את תערובת תאי mRNA/T לקובט אלקטרופורציה. ודא שהמתלים מכסים את תחתית הקובטה. אל תבצע פיפטות למעלה ולמטה.
  14. העבר במהירות את הקובטה המכילה את תערובת תאי mRNA/T למכשיר האלקטרופורציה ובצע אלקטרופורציה עם ההגדרות כפי שהוכנו בסעיף 5.11.
  15. לאחר האלקטרופורציה, לשחזר בזהירות את תאי ה-T בתווך מלא של תאי T מחוממים מראש על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מדיום מלוח הבאר לקובט, ואז להעביר את התאים חזרה לפלטה. שטוף קווטה עם 100 מיקרוליטר של חומר בינוני.
    הערה: תאים רגישים למתח גזירה לאחר אלקטרופורציה. הימנע משלבים חוזרים של השעיה מחדש.
  16. חזור על סעיפים 5.12 עד 5.15 לכל מבני ה-mRNA.
  17. דגרו תאי T שעברו טרנספקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2. אם מוכנים אצווה נוספת של תאי T, המשיכו עם סעיף 5.8 עם האצווה הזו עכשיו.
  18. בצע את הניסוי המתאים בתוך 24 שעות.
    הערה: ביטוי CAR יהיה ניתן לזיהוי כבר 3-6 שעות לאחר האלקטרופורציה. רמות הביטוי השיא והקינטיקה עשויות להיות תלויות במבנה ה-mRNA ויש לבדוק אותן בניסויים ראשוניים. פרוטוקולים מפורטים המתארים בדיקות עוצמה אפשריות במורד הזרם, כגון ניתוח ציטוטוקסיות של תאי CAR T או רמות הפרשת ציטוקינים במקביל עם תאי יעד גידול, זמינים במקומות אחרים 23,24,25,26,27.

6. ניתוח ביטוי CAR לאחר אלקטרופורציה

  1. 6-24 שעות אחרי האלקטרופורציה, השעתי מחדש וספרי תאי T. השתמש ב-50,000-100,000 תאים בכל תגובת צביעה. העבר את נפח המתלים התא הנדרש לצינור פוליסטירן עגול בתחתית מתאים. החלקים הבאים יכולים להתבצע מחוץ לארון בטיחות ביולוגית.
  2. שטיפו תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר צבע, הכולל PBS עם 0.5% FBS. צנטריפוגה ב-300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. מהיום, תשמור תאים על הקרח ותעבוד עם תגובות מקוררות.
  3. הכינו תערובת מאסטר עם כל הנוגדנים שמופיעים בפאנל הצביעה. כלול נוגדן שמאפשר זיהוי CAR (למשל, באמצעות תג פפטיד משולב כמו DYKDDDDK-tag). מדלל את הנוגדנים לפי ההמלצה בנפח צביעה סופי של 50 מיקרוליטר (למשל, כדי לקבל דילול של 1:50, מוסיפים 1 מיקרוליטר נוגדן ל-49 מיקרוליטר של בופר לכל צינור).
    הערה: צביעה לביטוי CAR יכולה להתבצע אך ורק באמצעות נוגדן גילוי CAR או בשילוב עם צביעה פנוטיפית וסמן הפעלה. הנוגדן, כמו גם הפלואורופור המצורף, ניתנים לכוונון. בעת החלפת נוגדנים ו/או פלואורופורים, יש לקחת בחשבון את ספקטרום הגירוי והפליטה המתאימים. APC תואם לצבע המוצע 7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD) לצביעת חיוניות במקביל.
  4. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנטנט היטב על ידי פיפסת נוזל שנותר מבלי להפריע לכדור התא. החזירו כל כדור ל-50 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים המוכנה.
  5. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך לפחות 30 דקות. שלב הדגירה הזה יכול להימשך עד מספר שעות.
  6. שטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של בופר צביעה ישירות לצינור. צנטריפוגה ב-300 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות והשליך את הסופרנטנט היטב על ידי פיפטור נוזל שנותר. החזירו את כדורי התאים ל-100 מיקרוליטר של בופר צביעה לכל צינור.
  7. לפני תחילת המדידה, הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת 7-AAD לצינורות וערבב היטב. דגר 10 דקות ב-RT בחושך. המשיכו למדידה מיד.
    הערה: אין לדגור תאים עם 7-AAD למשך יותר מ-15 דקות, כי זה עלול להשפיע על התוצאות. כדי להשיג זמני דגירה הומוגניים, שקול להוסיף 7-AAD ברצף או בקבוצה. פרוטוקול זה מותאם לצביעה המתבצעת בצינורות תחתית עגולים בנפח 5 מ"ל. ניתן גם לבצע צביעה בלוחות 96 בארים באמצעות פרוטוקול מעט שונה. מכיוון שלפלטות יש נפח עבודה נמוך יותר (מקסימום של 250 מיקרוליטר), מומלץ לבצע שני שלבי שטיפה עם 200 מיקרוליטר בופר לפני הצביעה. אם זרעו יותר מ-50 מיקרוליטר תאים בכל באר, יש לפרוק את התאים ולזרוק את הסופרנטנט לפני המשך לשלבי השטיפה. צביעה מתבצעת גם ב-50 מיקרוליטר לבאר. לאחר הדגירה, יש לבצע שתי שטיפות עם בופר צביעה של 200 מיקרוליטר. הצנטריפוגציה מתבצעת באותן הגדרות שתוארו לעיל.

תוצאות

הפעלה והתרחבות של תאי T ראשוניים בבני אדם
תאי T ראשוניים הופסמו והופעלו ביום 0 עם חרוזי CD3/28 או TransAct, הורחבו במשך 23 ימים ונספרו כל 2-3 ימים (איור 2A). בימי הספירה, צפיפויות התאים הותאמו ל-0.3-0.5 x 106 תאים למ"ל. בימים 0/2/5/9/14/20, תאי T שימשו לניתוח זרימה ציטומטרית להערכת הפנוטיפ והביטוי של סמני הפעלה. בשבוע הראשון לאחר ההפעלה, תאי T התרבו והתרחבו במהירות עם שני מגיבי ההפעלה (איור 2B), עם התרחבות קיפול מעט נמוכה יותר בימים הבאים עבור תאי T שהופעלו על ידי TransAct (איור 2C). ראוי לציין כי הפעלת תאי T הייתה נראית גם בניתוח מיקרוסקופי, כאשר אשכולות תאי T נוצרו סביב מגבי ההפעלה (איור 2D).

איור 2
איור 2: הפעלה והתרחבות של תאי T ראשוניים באמצעות שני מגיבים שונים להפעלה. (א) ייצוג סכמטי של ציר הזמן הניסוי. התאים הופעלו או עם חרוזי CD3/28 או TransAct ביום 0 ונתרבו במשך 23 ימים. נקודות כחולות מציגות ימים שבהם נספרו התאים, נקודות אדומות מציגות ימים שבהם התאים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה, ונקודות סגולות מציגות ימים שבהם בוצעו שני הניתוחים. (B) ו-(C) התרחבות תאי T ראשוניים במהלך (B) השבוע הראשון או (C) בתוך 16 ימים מהתרבית. הערכים מציגים את סטיית התקן הממוצעת ± של 4 (חרוזי CD3/28) או 3 (TransAct) תורמי תאי T בריאים שונים. (D) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של תאי T מופעלים עם התקבצות תאי גלוי בימים 1 ו-2 לאחר ההפעלה. התמונות צולמו במיקרוסקופ הפוך. הסרגל מתאים ל-200 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

צביעת פנוטיפ וסמני הפעלה של תאי T
לניתוח ציטומטרי זרימה, יושמה אסטרטגיית השער הבאה (איור 3): הוחל שער ראשון (גובה FSC לעומת גובה SSC) להסרת שאריות תאים וחרוזים, ואחריו שער לתאים בודדים (רוחב FSC לעומת שטח SSC). אחוז תאי CD3+ צריך להיות בטווח של 98-100%. תת-שער נוסף הניב אחוז של תאי T מסוג CD4+ (עוזר) ותאי T של CD8+ (ציטוטוקסיק), אשר הוגדרו עוד יותר לתת-קבוצות פנוטיפיות שונות של תאי T באמצעות הסמנים CD45RA ו-CD62L. תאי T של CD3+ נותחו בנוסף לביטוי סמנים של הפעלה (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).

איור 3
איור 3: אסטרטגיית גייטינג לניתוח ציטומטרי זרימה. מוצגים גרפים מייצגים של תורם תאי T אחד שהופעל עם חרוזי CD3/28 ביום החמישי (n = 4). קיצורים; TEMRA = תאי זיכרון אפקטור T המבטאים מחדש CD45RA; TSCM = תאי T זיכרון דמויי תאי גזע; TEM = תאי T של זיכרון אפקטור; TCM = תאי T מרכזיים בזיכרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לאחר הפעלה עם חרוזי CD3/28, אחוז תאי ה-T של CD4+ לעומת תאי CD8+ T ירד עם הזמן, כאשר 74.3% (± 7.4%) מתאי CD4+ T ביום החמישי, שירד ל-14.6% (± 3.4%) ביום ה-20 לאחר ההפעלה. תאי T של CD8+ עלו מ-20.7% (± 6.4%) ביום החמישי ל-82.4% (± 3.1%) ביום ה-20 (איור 4A). מגמות דומות זוהו לאחר ההפעלה עם TransAct, עם אחוזים מעט נמוכים יותר של תאי CD8+ T ביום ה-20 (72.5% ± 0.7%). לכן, ההתרחבות האיטית מעט של תאי T שנצפתה לאחר הפעלה עם TransAct התאימה לאחוז נמוך יותר של CD8+ ולאחוז גבוה יותר של תאי CD4+ במהלך תקופת ההתרחבות. ההבדלים בהרכב הפנוטיפי של תאי T היו דומים בשני המגבים האקטיבציונליים (איור 4B). עם זאת, תדירות תאי הזיכרון של אפקטור T שהביעו מחדש CD45RA (TEMRA) הייתה גבוהה יותר באופן כללי עבור תאי CD8+ מאשר בתאי CD4+ . בהתאם לכך, תאי T מסוג CD4+ הראו אחוזים גבוהים יותר של תאי זיכרון מרכזיים (TCM) ותאי זיכרון T דמויי תאי גזע (TSCM) (איור 4B).

CD134 היה סמן ההפעלה היחיד שכבר עבר ויסות לאחר הפשרת תאי T, כאשר 37.6% (± 4.1%) תאי T של CD134+ הופעלו עם חרוזי CD3/28 ו-36.1% (±4.4%) תאי T של CD134+ לתאי T מופעלים על ידי TransAct (איור 4C). בשתי אסטרטגיות ההפעלה, CD25, CD69 ו-CD134 היו מוגברים מאוד ביום השני. עבור חרוזי CD3/28, ביטוי CD69 ו-CD134 הגיע לשיא ביום ה-2, בעוד ש-CD25 הגיע לשיא ביום החמישי. תוצאות דומות נצפו עבור תאי T המופעלים על ידי TransAct. CD134 ו-CD154 עברו ויסות גבוה רק ביום ה-14 עבור חרוזי CD3/28 ותאי TransAct. בסך הכל, המגמות שנצפו היו דומות מאוד בין שני המגבים להפעלה. עם זאת, ביטוי CD69 ביום ה-14 היה מעט גבוה יותר בתאי T מופעלים על ידי CD3/28 לעומת מקביליהם ב-TransAct (97.1% ± 0.9% לעומת 86.5% ± 5.1%). זה תואם לקצב ההתרחבות הגבוה הממושך שנראה בתאי CD3/28 המופעלים על ידי חרוזים. לסיכום, פאנל סימני ההפעלה המוצע כולל סמנים שמועתקים הן בנקודות זמן מוקדמות והן מאוחרות לאחר ההפעלה, עם רגישות משתנה בין סמני ההפעלה השונים, אך באופן כללי, מגמות דומות לשני המגבים ההפעלה.

איור 4
איור 4: ניתוח פנוטיפ של תאי T וביטוי סמן הפעלה עם תגובות הפעלה שונות במהלך תקופת טיפוח של 20 יום. (א) אחוזים של תאי T של CD4+/CD8+ במהלך גידול לאחר ההפעלה עם חרוזי CD3/28 (משמאל) או TransAct (מימין). (B) התמיינות תאי T לאחר הפעלה עם חרוזי CD3/28 (שני פאנלים שמאליים) או TransAct (שני פאנלים ימניים), כל אחד לתאי CD4+ או CD8+. הפנוטיפ הוערך באמצעות הסמנים CD45RA ו-CD62L. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA- CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (ג) ביטוי סימני הפעלה לאחר הפעלה עם חרוזי CD3/28 או TransAct ובמהלך תקופת ההתרחבות. תדירויות [%] של תאי ה-T של CD3+ בקבוצת המשפחה מוצגת (סטיית תקן ממוצעת ±של 4 [חרוזי CD3/28] או 3 תורמי תאי T בריאים שונים [TransAct]). קיצורים; TEMRA = תאי זיכרון אפקטור T המבטאים מחדש CD45RA; TSCM = תאי T זיכרון דמויי תאי גזע; TEM = תאי T של זיכרון אפקטור; TCM = תאי T מרכזיים בזיכרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

טרנספקציה זמנית של תאי T ראשוניים וניתוח ביטוי CAR
תאי T ראשוניים הועברו ל-mRNA באמצעות אלקטרופורציה ביום השביעי לאחר ההפעלה עם חרוזי CD3/28 או TransAct. כתבנית, נעשה שימוש בקידוד mRNA לדור השני של CAR המיועד לכונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן 4 (CSPG4) עם קו-גירוי CD28 ותחום איתות CD3ζ. תג DYKDDDDK (תג דגל) נכלל כדי לאפשר זיהוי זרימה-ציטומטרי. הערכות תאי T והביטוי של CAR הוערכו 3, 6, 24 ו-48 שעות לאחר האלקטרופורציה. הצביעה בוצעה כפי שמתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול.

למרות שהכדאיות של תאי T מסוג חרוז CD3/28 ותאי T מופעלים על ידי TransAct הייתה נמוכה 3 שעות לאחר האלקטרופורציה, בסך הכל, החיוניות של תאי CAR T שעברו טרנספקציה נעה בין 51-85% ולא הייתה שונה משמעותית בין שתי אסטרטגיות ההפעלה (איור 5A). ה-CAR היה ניתן לזיהוי כבר בשלב מוקדם זה לאחר האלקטרופורציה. למרות שאחוז תאי CAR+ ירד בהדרגה עם הזמן, התדירות הגבוהה ביותר של תאי CAR+ הייתה ניתנת לזיהוי תוך 24 שעות לאחר האלקטרופורציה (איור 5B, לוח שמאל). ראוי לציין כי עוצמת האות הייתה יציבה בתוך 6 השעות הראשונות לאחר האלקטרופורציה וירדה בהדרגה לאחר מכן (איור 5B, לוח ימין). ביטוי CAR כמעט נעדר לאחר 48 שעות, מה שהדגים את האופי החולף של מניפולציה של תאים ואת חשיבות בחירת חלון זמן מוקדם לבדיקות במורד הזרם. גרפים נקודתיים מייצגים לביטוי CAR של תורם אחד מוצגים באיור 5C. עבור שני המגיבים להפעלה, יחס CD4/CD8 לא היה שונה בין תאים CAR לתאים שעברו טרנספקציה MOCK (איור 5D). בהתאם לתוצאות הקודמות, תאי T שהופעלו עם חרוזי CD3/28 הראו שכיחות מעט גבוהה יותר של תאי T ב-CD8+ מאשר תאים שהופעלו באמצעות TransAct. לניתוח הפנוטיפי, מוצג תורם מייצג אחד בשל וריאציות גדולות התלויות-תורם (איור 5E). בעוד שגם תגובת ההפעלה וגם מצב CD4/CD8 משפיעים על הפנוטיפ של תאי T, ביטוי CAR אינו גורם לשינוי בפנוטיפ בהשוואה לתאים שעברו טרנספקט MOCK.

כדי להעריך את השפעת ריכוז ה-mRNA על רמות הביטוי, תאי T ראשוניים עברו העברה עם mRNA מקודד לגרסה מוטנטית של GFP (muGFP) באמצעות 0.1, 0.3, 1, 3 או 6 מיקרוגרם של mRNA. אות ה-GFP נמדד באמצעות ציטומטריית זרימה 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. כצפוי, כבר כמויות נמוכות של mRNA כמו 0.1 מיקרוגרם הובילו לאות GFP שניתן לזיהוי, עם עלייה הדרגתית בעוצמת האות עם עלייה בכמויות ה-mRNA. בניסויים שלנו, 1 מיקרוגרם mRNA כבר היה רווי, וכמויות גדולות יותר (3 ו-6 מיקרוגרם mRNA) לא הובילו לאות GFP מוגבר (איור 5F). דבר זה מדגיש את האפשרות להשתמש בכמויות משתנות של mRNA כדי לאזן את רמות הביטוי, מה שיכול להיות מועיל לבדיקת השפעה של רמות ביטוי אנטיגן שונות של CAR או אפילו מטרה28.

איור 5
איור 5: קינטיקת ביטוי של CARs וניתוח פנוטיפ של תאי CAR T שעברו טרנספקט. (א) חיוניות של תאי CAR T לאחר אלקטרופורציה עם mRNA מקודד CAR. 2 מיקרוליטר 7-AAD ב-100 מיקרוליטר של בופר צביעה שימשו להערכת היתכנות לאחר 10 דקות דגירות. n = 2-3 תורמים בודדים (B) צביעה לביטוי CAR בנוגדן אנטי-DYKDDDDK (מצורף עם APC, דילול סופי של 1:50). לאחר שגייטינג על תאים ברי קיימא, נותחו או אחוז התאים החיוביים ל-CAR ביחס לבקרות שעברו MOCK-transfect (פאנל שמאל) או את עוצמת הפלואורסצנציה הגיאומטרית החציונית (GeoMean, הפאנל הימני) של כל האוכלוסייה. מוצגים ממוצעים של n = 3 תורמים בודדים ± S.D. (C) גרפים מייצגים של תורם אחד מ-(B) המדגימים את הקינטיקה של ביטוי CAR לאורך זמן. (ד) ניתוח תאי T מסוג CD4+/CD8+ והשוואה בין תאי T שעברו טרנספקציה MOCK לתאי T שעברו טרנספקציה ב-CAR, ושתי אסטרטגיות הפעלה שונות 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. מוצגים ממוצעים של n = 3 תורמים בודדים ± S.D. (E) ניתוח פנוטיפי של תאי T שעברו MOCK-transfect ו-CAR, שהוצג ב-(B) 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. מוצג תורם מייצג אחד של n = 3. (ו) ניתוח ביטוי muGFP 24 שעות לאחר אלקטרופורציה עם כמויות שונות של mRNA. גייטינג לתאים חיים בוצע לפני ש-GeoMean עבור GFP נמדד. מוצגים ממוצעים של n = 3 תורמים ± קיצורי S.D. CAR = קולטן אנטיגן כימרי; mRNA = חומצה ריבונוקלאית שליחה; 7-AAD = 7-אמינואקטינומיצין; RT = טמפרטורת החדר; muGFP = חלבון זוהר ירוק מוטנטי; S.D. = סטיית תקן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

בידוד וטיפוח תאי T ראשוניים בבני אדם מהווים את הבסיס למחקרים במבחנה ולמחקרים ב-in vivo. מוכח היטב כי לאחר הפעלה והתרחבות במבחנה, תאי T מתמיינים לפנוטיפ דמוי אפקטור, וכי בחירת תוספי ציטוקינים משפיעה מאוד על גורלות ההתמיינותהללו. תאי CAR T שגודלו עם IL-7 ו-IL-15 הראו שיפור בהתמדה ופעילות אנטי-גידולית טובה יותר במודלים של עכברים לעומת תאי T שהורחבו עםIL-2 29. לכן, הבחירה בין תגובות הפעלה ותוספי ציטוקינים חשובה כדי להעניק לתאי T את הפנוטיפ הרצוי. השווינו שני תגובות הפעלה (חרוזי CD3/28 ו-TransAct), המשפיעים באופן שונה על קינטיקת התפשטות תאי T, התפוקה ויחס CD4/CD8, לאורך תקופת התרחבות של שלושה שבועות. באופן כללי, תאי T שהתרחבו לאחר הפעלת חרוזי CD3/28 הראו אחוז גבוה יותר של CD8+ ותדירויות נמוכות יותר של תאי CD4+ לעומת לאחר הפעלת TransAct. כאשר תאי T מסוג CD8⁺ מתמיינים באופן מועדף לעבר פנוטיפ TEMRA דמוי אפקטור, בחירת המגיב היא משתנה מרכזי שצריך להתאים למטרות הניסוי. בנוסף לסמנים פנוטיפיים על פני השטח, העלאת סמני ההפעלה מספקת מידע על מצב תא ה-T ועל פונקציות האפקטור. גם CD25 וגם CD69 הם סמני הפעלה רגישים ובדרך כלל מוגברים בנקודות זמן מוקדמות לאחר ההפעלה. הם משמשים לעיתים קרובות להערכת הפעלה של תאי T, אך גם סוגי תאים אחרים, כגון תאי רוצח טבעיים (NK) 30,31,32. לעומת זאת, סמני ההפעלה CD137 ו-CD154 הראו ביטוי נמוך יותר בתאי T מורחבים, מה שמדגיש את הפוטנציאל שלהם להעריך עלייה ספציפית בתאי CAR T בעת קו-קולטורציה עם תאי היעד. ראוי לציין כי כאשר מיישמים את לוח סמני ההפעלה להערכת פעילות תאי CAR T בעת חקלאות משותפת עם תאי המטרה (כלומר, תאי גידול), נדרשת בחירה זהירה של סמני הפעלה כדי למנוע ביטוי רקע גבוה של הסמנים הללו על תאי T גם בהיעדר תאי מטרה.

כאשר עובדים עם תאי T ראשוניים, יש לדעת שפרופילי ההתרחבות וההתמיינות שלהם תלויים מאוד בתורם. עם זאת, אחסון הדגימה הראשונית בטמפרטורה של 4°C לפני בידוד תאי T וזמן טיפול קצר בסך הכל משפרים את התפוקה ואת איכות התאים המבודדים. חיוניות התאים מושפעת ממשך שלבי ההקפאה וההפשרה, שכן המדיום ההקפאה מכיל חומרי קריופרוטקטן כמו דימתיל סולפוקסיד (DMSO). בעוד ש-DMSO חיוני לשימור מבני התאים בעת הקפאה, הוא רעיל לתאים בטמפרטורת החדר. לכן, נדרשים טיפול מהיר ודילול מהיר של DMSO לאחר הפשרה. בעת אלקטרופורציה של תאי T, התאים רגישים במיוחד לאחר הפולס החשמלי, שמטרתו להפוך את דופן התא לחדירה ל-mRNA. טיפול זהיר בתאים על ידי הימנעות מלחץ גזירה נוסף ועבודה עם תמיסות מחוממות מראש עשוי להגדיל משמעותית את התאוששות התאים ואת החיוניות. יכול להיות מועיל להוסיף mRNA בקרה חיובי, כמו CAR בעל ביטוי ידוע או חלבון דיווח כמו GFP, בעת בדיקת מבנה CAR חדש. מומלץ גם לכלול לפחות תאים שעברו טרנספקציה MOCK (כלומר, תאים שעברו אלקטרופורציה ללא mRNA) כבקרה שלילית. לבדיקות פונקציונליות, קידוד mRNA ל-CAR המכוון נגד מטרה שונה עשוי לשמש להערכת הפעלה ספציפית ל-CAR.

מכיוון שקינטיקת ביטוי עשויה להיות תלויה ברצף ה-mRNA, הערכת הקינטיקה בנפרד היא כלי חשוב לבחירת נקודת הזמן האידיאלית להוליך בדיקות במורד הזרם. שיטת הטרנספקציה הזו מיועדת בעיקר כדרך מהירה וקלה לסנן מספר מבני CAR במקביל. עקב פרק הזמן הקצר שבו ה-CAR מתבטא על פני שטח תא T, לא ניתן לבצע בדיקות ארוכות טווח. עם זאת, מניסויי טרנספקטציה ראשוניים ניתן לקבוע את העיצוב הטוב ביותר של CAR כדי להתקדם לטרנסדוקציה ויראלית, אם ירצו.

לבסוף, נוגדנים או הפלואורופורים המצומדים שלהם עשויים להיות מוחלפים כדי להתאים למערכת הניסויית. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את ספקטרום הגירוי והפליטה של הפלואורופורים כדי לפרש את התוצאות באופן אמין. יתרה מזאת, צביעה בודדת עם נוגדן אחד בכל פעם יכולה להתבצע בניסויים ראשוניים כדי להבטיח פיצוי נכון של פאנל רב-צבעוני. למרות שלא דרשנו פיצוי ספקטרלי לפאנל הנוגדנים המוצע, ייתכן שיהיה צורך להקים מטריצת פיצוי כאשר הפאנל משתנה.

פרוטוקול IVT ואלקטרופורציה שהוצג מציע חלופה פשוטה וגמישה לטרנסדוקציה ויראלית להכנסת מבני CAR לתאי T ראשוניים בבני אדם. מכיוון שהיא מתבססת לחלוטין על אספקה מבוססת RNA, ניתן לבצע אותה במעבדות ללא גישה לתשתית BSL-2, מה שמפחית משמעותית את המחסום למחקר תאי T ב-CAR. למרות שהטרנסדוקציה הוויראלית יעילה מאוד ומשמשת בעיקר בתחום CAR, היא מלווה בדאגות בטיחות הקשורות לאינטגרציה גנומית, סיבה פוטנציאלית לממאירות משניות, וכן לייצור עתיר עבודה ועלות33,34. יתרה מזאת, האופי החולף של ביטוי CAR הופך גישה זו למתאימה במיוחד לסינון מהיר ומקבילי של מספר עיצובים של CAR35, ומאפשר לחוקרים להשוות ביצועי מבנים בצורה בעלת תפוקה גבוהה. החיסרון של שיטה זו הוא הזמן המוגבל של ביטוי CAR, שמגיע לשיא בדרך כלל סביב 6-12 שעות לאחר האלקטרופורציה 22,24,35,36. בטרנספקציה חולפת, תרביות ארוכות טווח, כמו בדיקות גירוי חוזרות, אינן ניתנות לביצוע עקב ירידה ברגולציה של CAR. עם זאת, אנו מציעים לזהות את המבנה המבטיח ביותר של CAR עם אלקטרופורציה של mRNA לפני ששוקלים מעבר למערכות ביטוי יציבות עם מספר מוגבל של מועמדים.

אלקטרופורציה של mRNA לתאים ראשוניים היא טכנולוגיה רב-שימושית לביטוי חלבונים כגון אנטיגנים בסוגי תאים שונים, כולל PBMCs, תאי T, תאי B, תאי NK ותאי דנדריט37. ראוי לציין כי אפשרות נוספת להעברת CAR חולפת היא ננו-חלקיקי ליפידים (LNPs)36,38, המאפשרים העברת mRNA או DNA המקודדים ב-CAR לתאי T ללא וקטורים ויראליים ומאפשרים ביטוי CAR ללא אינטגרציה. לעומת זאת, מערכת הטרנספוזון SleepingBeauty 39,40,41 משיגה אינטגרציה יציבה ללא דרישות רכיבי ויראליים. הבחירה המתאימה ביותר לטרנספקציה או טרנסדוקציה של תאי T תלויה ביישום המיועד ובשיקולים של סקלביליות וייצור. תאי CAR T מבוססי mRNA שימשו בהצלחה במחקרים פרה-קליניים וקליניים נגד מגוון גורמים שונים, כולל ממאירות המטולוגית ומוצקה ומחלות אוטואימוניות 42,43,44. CAR מבוטאים באופן זמני מציעים יתרונות לעומת CAR מבוטאים באופן יציב, שכן ביטוי שטחי מוגבל יכול למנוע או להפחית תופעות לוואי25.

לסיכום, תהליך עבודה זה מספק פרוטוקול פשוט ושלב אחר שלב לבידוד, הפעלה, טיפוח, ניתוח והעברה של תאי T ראשוניים ליצירת תאי T ראשוניים. הוא פשוט ליישום, אינו דורש מתקני מעבדה מסוג BSL-2, וניתן לשלבו בקלות במעבדות המצוידות בביולוגיה מולקולרית ומתקני תרבית תאים סטנדרטיים.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (פרויקט FWF ESP 465-B). אנו מכירים במתקני הליבה של האוניברסיטה הרפואית, יחידת זרימת הציטומטריה. אנו מודים לכל התורמים הבריאים המתנדבים על השתתפותם ותרומת דגימה, ולצוות האחיות על תמיכתם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High PerformanceVWR525-1164
12-well plates, flat bottom, TC-treated VWR734-2324
24-well plates, flat bottom, TC-treatedVWR734-2325
6-well plates, flat bottom, TC-treated VWR734-2323
7-AAD staining solutionMiltenyi Biotec130-111-568
Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinityMiltenyi Biotec130-119-584
BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry SystemBD BiosciencesFACSCanto II
Bovine Serum AlbuminMerckA4503-10Gלבידוד זרימה בכבידה
CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-126-048חומר צביעה: PE
CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-764חומר צביעה: APC
CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-114-142חומר צביעה: PerCP-VIO 700
CD25 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-114-541חומר צביעה: PE-Vio 770
CD3 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-132-352חומר צביעה: PE-Vio 670
CD4 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-113-223חומר צביעה: APC-Vio 770
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-101לבידוד זרימה בכבידה
CD45 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-775חומר צביעה: VioBlue
CD45RA Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-132-270חומר צביעה: Vio Bright V600
CD62L Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-127-499חומר צביעה: Vio Bright R720
CD69 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-112-800חומר צביעה: VioGreen
CD8 Antibody, anti-human, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-677חומר צביעה: FITC
CD8 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-201לבידוד זרימה בכבידה
Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottomGreiner Bio-one650 185
Centrifuge 5810 REppendorf5811000015
CO2 incubator ICO150MemmertICO150
CoolNat Ice MachineZiegra Eismaschinen GmbHZBE 30-10
Corning CoolCell Freezer ContainerCorningCLS432000
Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRANDBrand719520
CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw capSarstedt72,380
CytoFLEX LX Flow CytometerBeckmann CoulterC11185
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447S
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture gradeAppliChemA3672
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-144
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Gibco11131D
Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow capVWR732-1137
Eppendorf Research plus pipette, 0.1–2.5 µLEppendorf3123000012
Eppendorf Research plus pipette, 100–1000 µLEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus pipette, 2–20 µLEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus pipette, 20–200 µLEppendorf3123000055
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)MerckE6758-100Gלבידוד זרימה בכבידה
Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical BottomCorning352196
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubeCorning352008
Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical BottomCorning325098
Fetal Bovine Serum, Value FBSGibcoA52567-01
Ficoll PM 400Sigma-AldrichF4375-10Gלבידוד מדרגי צפיפות
Fisherbrand Sterile Graduated Transfer PipetsFisher Scientific13469108
Gene Pulser Xcell Total SystemBioRad1652660עם מודול PC ומודול CE
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)New England BiolabsE2060S
Human IL-15, research gradeMiltenyi Biotec130-093-955
Human IL-7, research gradeMiltenyi Biotec130-095-367
Integra Biosciences Corp PIPETBOY acu 2 pipet aidFisher ScientificNC0085685
LE AgaroseBiozym840004
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401לבידוד זרימה ב

מקורות

  1. Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells. PLoS One. 4 (5), e5430(2009).
  2. Smeets, R. L., et al. Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling. BMC Immunol. 13 (12), (2012).
  3. Wilson, A., et al. Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function. Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).
  4. Dobersberger, M., et al. An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells. Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).
  5. Van Bruggen, J. A. C., et al. Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy. Blood. 134 (1), 44-58 (2019).
  6. Hoffmann, J. M., et al. Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients. Front Immunol. 8 (1956), (2017).
  7. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  8. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. J Transl Med. 8 (104), (2010).
  9. Xu, X. J., et al. Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo. Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).
  10. Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15. Blood. 108 (2), 600-608 (2006).
  11. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  12. Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy. Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).
  13. Becker, S. A., et al. Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers. Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).
  14. Wiesinger, M., et al. Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance. Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).
  15. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).
  16. Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).
  17. Underwood, S., et al. T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function. Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).
  18. Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins. Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).
  19. Seigner, J., et al. Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity. Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).
  20. Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big. Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).
  21. Foster, J. B., et al. Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response. Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).
  22. Kitte, R., et al. Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation. Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).
  23. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  24. Hu, L., et al. A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy. J Vis Exp. (216), e67548(2025).
  25. Foster, J. B., et al. Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models. Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).
  26. Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level. J Vis Exp. (217), e67657(2025).
  27. Subham, S., et al. Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging. J Vis Exp. (200), e65560(2023).
  28. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  29. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  30. Clausen, J., et al. Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells. Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).
  31. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  32. Rotta, G., et al. Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection. STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).
  33. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  34. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  35. Krug, C., et al. Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone. Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).
  36. Kitte, R., et al. Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).
  37. Sauerer, T., et al. Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins. Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).
  38. Bimbo, J. F., et al. T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles. J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).
  39. Hudecek, M., et al. Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  40. Prommersberger, S., et al. Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview. Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).
  41. Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy. Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).
  42. Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  43. Granit, V., et al. Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study. Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).
  44. Dagher, O. K., et al. Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד תאי Tהפעלת תאי Tהרחבת תאי Tפרוטוקול אלקטרופורציהציטומטריית זרימהטרנספקציית mRNAפנוטיפ של תאי T
בידוד, טיפוח והעברה חולפת של תאי T ראשוניים אנושיים ליצירת תאי T של קולטני אנטיגן כימריים (CAR)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.