מאמר שיטה

תהליך חישובי לשכפול לגילוי תרופות לסטנדרטיזציה של פרמקולוגיה ברשת וניתוחי עגינה מולקולרית

462 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70171

⸱

24 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of TCM Constitution and Preventive Treatment of Disease, Wangqi Academy of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 3School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 4Sunsimiao Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול סטנדרטי זה מאחד פרמקולוגיה רשת ועגינה מולקולרית עם סימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) לגילוי תרופות. הוא קובע קריטריוני סינון כמותיים ושלבים ניתנים לשחזור, המתאימים לסריקת תרופות רב-מטרותית באמצעות מאגרי נתונים ציבוריים ולשפר את אמינות התוצאות.

תקציר

פרמקולוגיה רשתית ועגינה מולקולרית מיושמות באופן נרחב בגילוי תרופות, אך זרימות עבודה מפוצלות ופעולות לא עקביות לעיתים קרובות פוגעות בשחזור התוצאות. כאן מתואר פרוטוקול סטנדרטי המשלב גישות אלו במסגרת ניתנת לשחזור לסינון תרופות וחקר מנגנונים, כאשר תהליך העבודה מאורגן לשלושה שלבים עוקבים: הכנת נתונים, ניתוח חישובי ואימות. בשלב ההכנה, ספריות תרכובות ממאגרי מידע ציבוריים מסוננות באמצעות קריטריונים של ספיגה, הפצה, מטבוליזם, הפרשה ורעילות (ADMET), כולל זמינות ביולוגית דרך הפה, דמיון תרופות וחיזוי רעילות, בעוד שמטרות טיפוליות פוטנציאליות מושגות באמצעות חיזוי מטרות ואינטגרציה של מאגרי מידע הקשורים למחלות לזיהוי מקיף של מועמדים לאינטראקציה בין תרופות למחלה. בשלב הניתוח החישובי, היעדים החופפים עוברים ניתוחי העשרה של אונטולוגיית גנים (GO) וקיוטו אנציקלופדיה לגנים וגנומים (KEGG) וניתוח טופולוגי של רשת אינטראקציה בין חלבונים לחלבון כדי לזהות מטרות ליבה; עגינה מולקולרית מוגדרת עם שתי אסטרטגיות אופציונליות סטנדרטיות עם יתרונות ברורים. האסטרטגיה הפרוגרסיבית הדו-שלבית עושה שימוש ב-AutoDock Vina לסינון ראשוני בתפוקה גבוהה של ספריית התרכובות, ואחריה עגינה מדויקת עם YASARA, שמבטל חיוביים שגויים מסינון בתפוקה גבוהה ומייצר קומפלקסים של חלבון-ליגנד התואמים באופן טבעי לסימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) של YASARA (MD) מאוחרות כדי למנוע סטיות מבניות הנגרמות מהמרה בין פורמטים בין תוכנות. האסטרטגיה החד-שלבית משלימה את תהליך העגינה המלא באמצעות YASARA בלבד, מה שמפשט את זרימת הפעולה של הפעולה, משפר את יעילות הניסוי ויישמת לחלוטין למטרות מחקר ספציפיות. בשלב הוולידציה, סימולציות MD סטנדרטיות מעריכות יציבות קומפלקס ליגנד-חלבון באמצעות מדדים מרכזיים של סטיית שורש ממוצע ריבועי (RMSD) ותנודות ריבוע ממוצע שורש (RMSF). צינור מאוחד וניתן לשחזור זה משפר את אמינות המחקרים הפרמקולוגיים הרשתיים ומחקרי העגינה ומקל על השוואות בין מחקרים בגילוי תרופות חישובי.

מבוא

פרמקולוגיה רשתית מייצגת גישה מחקרית שמפענחת את דפוסי האינטראקציה בין תרופות לאורגניזם מנקודת מבט רשת הוליסטית1. על ידי בניית וניתוח רשת האינטראקציה הכוללת את מסלול התרופה-רכיב-מטרה-מחלה-ביולוגיה, היא מזהה כמותית את המולקולות המרכזיות, המסלולים המרכזיים והמנגנונים הסינרגטיים שבאמצעותם תרופות מפעילות את השפעתן. מסגרת אנליטית זו מתיישבת עם התקן הבינלאומי לפרמקולוגיית רשת, המדגיש אינטגרציה של נתוני מולטי-אומיקס וניתוח רשת טופולוגי, ולבסוף מבהירה את ההשפעות הטיפוליות הכוללות של תרופות, חוזה תופעות לוואי פוטנציאליות או מספק הנחיות שיטתיות לפיתוח תרופות חדשות. אסטרטגיה כזו יושמה בהצלחה בתחומים מגוונים, כולל פענוח מסלולי איתות הקשורים לחלבוני מטרה של תרופות אנטי-דלקתיות שאינן סטרואידיות (NSAIDs) נגד COVID-19, וחקר מנגנון הפעולה של טיפול במחלות כמו אוסטאוסרקומה וסוכרת סוג 2 2,3,4. יתרון זה מניע את המעבר הפרדיגמטי מגילוי תרופות ממטרה אחת למספר מטרות בפרמקולוגיה המודרנית.

עגינה מולקולרית היא טכניקת סימולציה חישובית המשתמשת במידול אלגוריתמי להערכת התאימות המרחבית ועוצמת האינטראקציה בין תרכובות מולקולות קטנות למטרות ביולוגיות מקרומולקולריות, ובכך לחזות תצורות קישור אופטימליות 5,6. מוריס ואח' הציגו את AutoDock4 ו-AutoDockTools4, המאפשרים עגינה אוטומטית עם גמישות קולטנים סלקטיבית; כלים אלו מבוססים על דינמיקה מולקולרית וגאומטריה מולקולרית, ומעריכים יציבות וזיקה של קישור על ידי חישוב הבדלי אנרגיה בין מולקולות7. כלים קלאסיים כמו AutoDock משתמשים במידול חצי-גמיש של ליגנד-קולטן והפכו לסטנדרט זהב להערכת זיקת קישור בסימולציות כאלה7.

בגילוי תרופות, טכניקות סקר פרמקולוגיה רשתית משמשות לעיתים קרובות לזיהוי רכיבים מרכזיים, אשר מאומתים באמצעות עגינה מולקולרית להערכת הקשר שלהם לחלבוני היעד, ובסופו של דבר קובעים את הקשר בין התרופה למחלה8. עם זאת, יישומים נוכחיים סובלים לעיתים קרובות מתכנון ניסויי לא עקבי, פרוצדורות פעולה לא סטנדרטיות וחסרי שלבי אימות. הערכה שיטתית של מחקרים פרמקולוגיים רשתיים הקשורים לרפואה צמחית תיעדה בעיה נפוצה זו, ומציינת כי הטרוגניות בנתונים בין מסדי נתונים ואימות ניסויי לא מספק מובילים לתוצאות בלתי שחזוריות9. מגבלות אלו לא רק פוגעות בשחזוריות ובאמינות תוצאות המחקר אלא גם מעכבות את תרגום התחזיות החישוביות לאימות ניסוי. בניגוד למחקרי פרמקולוגיה רשת מבודדים שחסרים אימות ניסיוני או תהליכי עגינה מפורקים עם פרמטרים שרירותיים, פרוטוקול זה משלב את שתי הגישות עם ספים סטנדרטיים ופעולות שלב אחר שלב. מסגרת זו מבטלת בחירת פרמטרים סובייקטיבית, ומבטיחה שתהליך העבודה יוכל להיות משוכפל על ידי אופרטורים שונים עם תוצאות עקביות.

לכן, קביעת נהלים תפעוליים סטנדרטיים לזיהוי מטרות ומסלולים פוטנציאליים באמצעות סקר פרמקולוגי רשתי, בשילוב עם עגינה מולקולרית לאימות פעילות קישור בין תרופות למטרה, יכולה לספק ראיות ניסיוניות לחקר מנגנוני פעולה תרופתיים ולסינון תרופות מועמדות10. פרוטוקול זה מתאים במיוחד לסינון תרופות רב-מטרתי של רכיבי תרופות ומולקולות קטנות סינתטיות באמצעות מאגרי אומיקים, כימיקלים ומבני חלבונים זמינים לציבור; הוא אינו חל על מטרות ללא מבני גבישים מפותרים, או על סקר תרופות יתומים במטרה אחת ללא רשתות אינטראקציה ידועות הקשורות למחלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה כולל רק ניתוחים חישוביים של מאגרי מידע זמינים לציבור ואינו כולל שימוש בנבדקים אנושיים, בעלי חוליות או רקמות ביולוגיות. כל תהליכי העבודה המסכמים המתוארים בסעיף זה מוצגים באיור 1.

figure-protocol-1
איור 1: סיכום תהליך העבודה. מלבנים ירוקים מייצגים רכיבי תרופה חלופיים, מלבנים אדומים מייצגים מחלות, אליפסות צהובות מכילות את האתרים והתוכנות שבהן משתמשים, מלבנים כתומים מכילים את הקבצים או הנתונים שהושגו, וכן שלבים מרכזיים, ויהלומים סגולים מייצגים את התוצאות הסופיות הנדרשות. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

1. רכישת רכיבי ומטרות התרופות

  1. חפש במסד הנתונים של PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) באמצעות שמות כימיים כמילות מפתח כדי לקבל את מחרוזות SMILES (Simplified Molecular Input Line-Entry System) המתאימות.
  2. גש לאתר ADMETlab 3.0 (https://admetlab3.scbdd.com/), בחר באפשרות הערכת ADMET תחת לשונית השירותים, הזן את מחרוזות SMILES, ולחץ על כפתור SUBMIT (שלח ).
  3. סנן את תוצאות ADMET בהתבסס על מדדים: ספיגה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, רעילות, כימיה רפואית וכללי טוקסיקופור. שמור רק תרכובות העומדות בכל קריטריוני סף מוגדרים מראש לכל מדד (טבלה 1).
  4. ניגש לאתר ProTox 3.0 (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home), הזן את שרשראות SMILES של התרכובות המסוננות, בחר את מודול TOX PREDICTION, סמן את כל אפשרויות החיזוי הרצויות (למשל, רעילות איברים, סרטן), והריץ את התחזית.
  5. סננו תרכובות עם רעילות צפויות העולות על ספי בטיחות מוגדרים מראש בהתבסס על תוצאות ProTox 3.0 (טבלה 2).
  6. אסוף את התרכובות שעוברות את בדיקות ADMET ו-ProTox 3.0 למסד נתונים מובנה של רכיבי תרופות (למשל, בפורמט Excel או CSV) עם עמודות לשם התרכובת, SMILES ומצב הסינון.
  7. היכנסו לאתר SwissTargetPrediction (https://swisstargetprediction.ch/), בחרו את Homo sapiens מתפריט הנפתח של האורגניזם, הזינו את מחרוזות SMILES של הרכיבים במסד הנתונים של רכיבי התרופות, לחצו על כפתור Predict יעדים , ואספו את כל היעדים החזויים עם ציון הסתברות גבוה מ-0.
  8. היגש לאתר SEA (Similarity Ensemble Approach) (https://sea.bkslab.org/) והזן את אותם מחרוזות SMILES ששימשו למעלה לחיזוי יעד וסינון את התוצאות כך שישמרו רק ערכים בשדה מפתח היעד שמסתיימים ב-_Human וערך p שלהם מתחת ל-0.05.
  9. שלבו את רשימות היעדים שהושגו מ-SwissTargetPrediction ו-SEA לספריית יעדים אחת לפעולות תרופות. הסר מטרות כפולות וסטנדרטיזציה של שמות מטרות לסמלים גנים רשמיים (למשל, באמצעות הנחיות HGNC) באמצעות Uniprot (https://www.uniprot.org/).
    הערה: ספריית היעד של פעולת התרופות יכולה להישמר כקובץ CSV לשימוש מאוחר יותר.

טבלה 1: קריטריוני סף ADMETlab 3.0 לסקר בטיחות תרופות. הטבלה מסכמת את ערכי החיתוך המומלצים וטווחי הסיווג לתכונות פיזיקוכימיות מרכזיות, פרמטרי ADME, אינטראקציות מטבוליזם, נקודות קצה של רעילות, מסלולי רעילות וכללי טוקסיקופור. התחזיות מסווגות לשלוש רמות סיכון (נמוכות, בינוניות וגבוהות) בהתבסס על ערכי הסתברות (< 0.3, 0.3 - 0.7, > 0.7) או טווחים כמותיים, המאפשרים הערכה שיטתית של פרופילי בטיחות תרכובות במהלך גילוי תרופות מוקדם. אנא לחצו כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: קריטריוני סף ProTox-3.0 לחיזוי רעילות בגילוי תרופות. הטבלה מסכמת נקודות קצה מרכזיות של רעילות שחזו ProTox 3.0, עם דגש על פרמטרים קריטיים להערכת בטיחות התרופה במהלך גילוי תרופות מוקדם. כל נקודת קצה מחזירה סיווג בינארי (פעיל או לא פעיל) מלווה בציון הסתברות (0-1), כאשר פעיל מציין סיכון פוטנציאלי לרעילה. יש לתת עדיפות לרעילות איברים (רעליות כבד, רעילה לבבית), נקודות קצה רעילות (סרטן, מוטגניות, אימונוטוקסיות) ועיכוב מטבוליזם של CYP, שכן אלו הם הגורמים העיקריים לדעיכה קלינית. פגיעות פעילות מרובות בנקודות קצה מצביעות על פוטנציאל רעילות רחב ומצדיקות דה-עדיפות של תרכובת. רעילות חריפה מוערכת באמצעות קטגוריית LD50 ו-GHS החזויות, כאשר מחלקה 1-3 (< 300 מ"ג/ק"ג) נחשבת לרעילות גבוהה. ציוני הסתברות מספקים רמות ביטחון לכל תחזית. אנא לחצו כאן להורדת הטבלה הזו.

2. רכישת מטרות מחלה

הערה: בעת סינון מאגרי מידע, יש לאחד את קונבנציות מתן שמות הגנים למטרות כדי למנוע השמטות הנגרמות מאי התאמות בשמות.

  1. גש לחמישה מאגרי מידע הקשורים למחלות: OMIM (https://www.omim.org/), Disgenet (https://disgenet.com/), TTD (https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards (https://www.genecards.org/) ו-PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). יישם את קריטריוני הסינון הספציפיים למסד הנתונים הבאים: עבור GeneCards, סנן רשומות עם ציון רלוונטיות ≥ 1.0; עבור DisGeNET, בחר רשומות הקשורות למחלה היעד; עבור PharmGKB, הגבל את התוצאות לרשומות הקשורות לגנים על ידי בחירת אפשרות Gene ; עבור TTD, שמור רשומות שבהן עמודת המחלה תואמת למחלה היעד.
  2. לכל מסד נתונים, השתמש בשם הרשמי של המחלה היעד (למשל, מחלת אלצהיימר) כמילת מפתח לחיפוש כדי לאסוף את כל היעדים הנלווים.
  3. אסוף את רשימות היעדים מכל חמשת מסדי הנתונים לגיליון אלקטרוני אחד. הסר מטרות כפולות על ידי השוואת סמלי גנים בין רשימות.
  4. תקננו את כל שמות היעד שנותרו לסמלי גנים רשמיים באמצעות Uniprot כדי לפתור אי-עקביות בשמות. שמרו את הרשימה הסטנדרטית והמשוכפלת כספריית יעד מחלות (CSV או Excel בפורמט).
    הערה: ספריית יעד המחלה יכולה להישמר לצד ספריית יעד פעולת התרופה (שלב 1.9) לשימוש מאוחר יותר בשלב 3.

3. רכישת מטרות נפוצות למחלות סמים

  1. גש לכלי האינטרנט של Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). ייבא את ספריית יעד הפעולה של התרופות (שלב 1.9) ואת ספריית יעד המחלות (שלב 2.4) לשני שדות הקלט של Venny 2.1.0 כדי ליצור דיאגרמת Venn המראה את החפיפה בין שתי קבוצות היעד.
  2. הוצא את מטרות החיתוך מתוצאות דיאגרמת ון. סמן אותן כמטרות נפוצות למחלות סמים (נקודות אינטראקציה פוטנציאליות) ושמור אותן כקובץ CSV.

4. בניית רשתות אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) וניתוח מטרות ליבה

  1. גש למסד הנתונים STRING (https://cn.string-db.org/). בחר את הומו ספיינס כאורגניזם מתפריט הנרחב.
  2. ייבא את יעדי מחלת הסמים הנפוצות (שלב 3.2) לשדה קלט STRING. הגדר את פרמטר ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש לביטחון גבוה (0.700) ולחץ על חיפוש ליצירת נתוני PPI. ייצא את נתוני ה-PPI כקובץ TSV (ערכים מופרדים בלשונית).
  3. פתח תוכנת Cytoscape עם תוסף CytoNCA מותקן מראש. ייבא את קובץ ה-PPI TSV ל-Cytoscape באמצעות תפריט File > Import > Network from File .
  4. הפעילו את תוסף CytoNCA על ידי לחיצה על אפליקציות > CytoNCA > Open. בחרו חמישה מדדי ייחוס לסינון ליעד מרכזי: בין, קרבה, דרגה, וקטור עצמי ו-LAC.
    הערה: חמש מדדים טופולוגיים מרכזיים בהם משתמשים הם: 'בין' (מרכזיות בין הזמנים, מדידת תדירות הופעת מטרה בכל הנתיבים הקצרים ביותר ברשת), קרבה (מרכזיות קרבה, המשקפת את אורך המסלול הממוצע הקצר ביותר מהמטרה לכל שאר המטרות ברשת), דרגה (דרגת חיבור מקומית, כימות מספר האינטראקציות הישירות בין מטרה למטרות אחרות), וקטור עצמי (מרכזיות וקטור עצמי, משקללת הן את הקישוריות של המטרה עצמה והן את חשיבות המטרות המחוברות), ו-LAC (קישוריות ממוצעת מקומית, הערכת צפיפות החיבור בין הצמתים השכנים של מטרה).
  5. הפעל ניתוח רשת על ידי לחיצה על תפריט כלים > ניתוח רשת , ואז לחץ על אישור. ייצא את תוצאות הניתוח לטבלת CSV.
  6. חשב את ערך החציון לכל חמשת המדדים ושמור על יעדים שעומדים או עולים על החציון. חזור על שלב 4.5 מספר פעמים עד שנשארו 10 עד 20 יעדים.
  7. דרג את המטרות הנותרות לפי מדד הדרגה (מהגבוה לנמוך) ובחר מראש את עשרת המטרות המובילות כגנים מרכזיים. שמור את רשימת הגנים המרכזיים כקובץ CSV.
    1. כדי להפחית חיוביים שגויים ולהבטיח שרק מטרות מתאימות מבנית ימשיכו לעגינה, בצע הערכה נוספת של היתכנות מבנית ויכולת תרופת: בדקו את מאגר הנתונים של PDB למבני גביש ברזולוציה גבוהה זמינים (≤ 2.5 Å) או הערכו האם ניתן לבנות מודל הומולוגיה אמין; השתמשו בכלי חיזוי כיס לאישור קיומם של אתרי קישור מתאימים; והפניה עם ספרות או מסדי נתונים פונקציונליים כדי לאמת רלוונטיות מתועדת למסלול המחלה.
    2. הפחתת עדיפות למטרות שחסרות זמינות מבנית, כיסי תרופות או רלוונטיות מחלותית למחקרי עגינה. ניתוח העשרת GO ו-KEGG עדיין יכול להתבצע באמצעות רשימת היעדים המרכזית המלאה משלב זה, שכן הוא אינו דורש מידע מבני.
      הערה: ניתן לשנות את מספר הגנים בשלבים 4.6 ו-4.7 לפי הצורך. בדרך כלל, נשארים 10 עד 20 יעדים לאחר שלב 4.6, ומומלץ לשמור לפחות על 10 גנים מרכזיים בשלב 4.7 כדי להבטיח נפח נתונים מספק לניתוח העשרה אמין של GO ו-KEGG ומגמות ויזואליזציה עקביות.

5. ניתוח והדמיה של העשרת GO ו-KEGG

הערה: חלק זה מבהיר את תפקודי הגנים ברמות הרכיב התאי, התפקודי והתוך-תאי.

  1. גש לכלי האינטרנט של DAVID (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp). בחר את רשימת הגנים כסוג הקלט וייבא את הגנים המרכזיים לשדה הקלט.
  2. הגדר את המזהה ל-OFFICIAL_GENE_SYMBOL ובחר בהומו ספיינס בבחירת מינים. לאחר מכן, לחץ על שלח רשימה כדי להעלות את הגנים המרכזיים.
  3. לניתוח העשרת GO, בחרו בקטגוריות GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT ו-GOTERM_MF_DIRECT .
  4. לניתוח העשרת KEGG, בחרו בקטגוריית KEGG_PATHWAY . קבעו את סף המובהקות ל-p < 0.05 עבור ניתוחי GO ו-KEGG.
  5. לחצו על תרשים ההערות הפונקציונליים כדי ליצור תוצאות העשרה. ייצאו את תוצאות GO ו-KEGG כקבצי CSV. השתמשו בתוכנת R Studio עם ggplot2 ליצירת תרשימי עמודות או גרפים בועות עבור עשרת המונחים/המסלולים המועשרים ביותר.
    הערה: ניתן להתאים את מספר המונחים/המסלולים המוצגים בהתאם לדרישות.

6. עגינה מולקולרית באמצעות Autodock Vina

הערה: שלבים 6 ו-7 הם שניהם שלבי עגינה מולקולרית. שלב 6 משתמש בתוכנת AutoDock Vina 1.1.2, בעוד ששלב 7 משתמש ב-YASARA 10.3.16. שימוש ב-YASARA מקל על סימולציית הדינמיקה המולקולרית של YASARA הבאה. אם נדרשות תוצאות העגינה מ-AutoDock Vina, תוצאות העגינה ב-YASARA צריכות להיות תואמות לאלו של AutoDock Vina. זה מונע אי-התאמות הנגרמות מהחלפת תוכנה וגם מבטיח את אמינות תוצאות האימות של סימולציית הדינמיקה המולקולרית, בשיטה מפורטת: פתח את תוצאת "result.pdb" של שלב 6.31 באמצעות LigPlot+ (גרסה 2.3) ליצירת דיאגרמת אינטראקציה דו-ממדית, זיהוי השאריות המרכזיות האינטראקטיביות עם הליגנד, ואז בחירת שאריות המפתח בשלב העגינה 7.18 של YASARA, והגדרת גודל הקופסה לכסות את כיס הקישור, כדי למקסם את העקביות של אתרי העגינה בין Vina ל-YASARA. לאחר מכן, בעת בחירת תוצאות העגינה האופטימליות בשלב 7.19, ודא שהשאריות האינטראקטיביות של המפתח בין הליגנד לקולטן נשארות עקביות עם אלו שזוהו מתוצאות AutoDock Vina. דרישת עקביות זו מתמקדת בשימור דפוסי אינטראקציה חיוניים ולא בהתאמה אטומית מדויקת; צפויות שינויים קלים בקונפורמציות שאריות היקפיות בשל הבדלים בפרמטריזציה של שדה כוח וגמישות בשרשרת הצדדים. כל עוד האינטראקציות הקריטיות עם שאריות האתר הפעיל המרכזיות נשמרות, תוצאות העגינה יכולות להיחשב עקביות לצורכי אימות צולב. אם אין צורך בעגינת AutoDock Vina (שלב 6), ניתן לבצע את שלב 7 ישירות.

  1. השגת קובץ הנתונים המבניים (SDF) של תרכובות התרופות בשם ligand.sdf ממסד הנתונים PubChem על ידי חיפוש מחרוזות SMILES המתאימות (שלב 1.1).
  2. פתח קבצי SDF באמצעות תוכנת Chem3D. באפשרות החישוב, בחר MM2 ולחץ על מזעור אנרגיה כדי לבצע מזעור אנרגיה חופשית של מבנה התרכובת.
  3. שמור את המבנה המינימלי כקובץ ligand.mol2 על ידי קובץ בחירה > Save As. קבל את קובץ פורמט PDB (Protein Data Bank) של קולטן החלבון של הגן המרכזי ממאגר ה-PDB של RCSB (https://www.rcsb.org/; חפש לפי מזהה PDB או שם גן) בשם receptor.pdb.
    1. תעדף מבנים עם רזולוציה ≤ 2.5 Å ואתרי קישור פתורים אם קיימים. בעת בחירת מבנה, בדוק את הערך לאימות שלמות (למשל, נוכחות כל הדומיינים הצפויים, היעדר לולאות גדולות ולא פתורות), מוטציות פוטנציאליות שעשויות להשפיע על קשירת הליגנד, והאם נכללים קו-פקטורים חשובים מבחינה פונקציונלית (כגון הם, יוני מתכת) או ליגנדים מתגבשים במשותף.
    2. למטרות עם הרכבות אוליגומריות ידועות, יש לשקול האם הצורה המונומרית או הרב-מרית מתאימה לשאלת המחקר; ניתן להוריד את ההרכבה הביולוגית אם אינטראקציות דימריות או מדרגה גבוהה רלוונטיות. המבנה הנבחר יעבור הכנה נוספת בשלבים הבאים, ולכן בדיקה ראשונית מסייעת למנוע סיבוכים בהמשך.
  4. פתח את הקולטן.pdb באמצעות תוכנת PyMOL. הקלד הסר אורגני בשורת הפקודה ולחץ Enter כדי להסיר ליגנדים של מולקולות קטנות ממבנה החלבון.
    הערה: אם משתמשים בליגנד הקו-קריסטליזציה כדי להגדיר את אתר הקישר, תחילה רשמו את קואורדינטות המרכז התלת-ממדיות של הליגנד, ואז הקליד הסר אורגני בשורת הפקודה של PyMOL ולחץ Enter כדי למחוק מולקולות קטנות שהתגבשו במשותף; אחרת, הפעל ישירות את פקודת הסרת אורגני להסרת מולקולות קטנות שהתגבשו יחד (co-crystalzed).
  5. הקלדו את הסרת הממס בשורת הפקודה ולחצו Enter כדי להסיר מולקולות מים חופשיים ממבנה החלבון; השתמשו בפקודה select metal_cofactor, resn [שם שאריות קופקטור יעד] כדי לזהות יונים או קופקטורים קריטיים למתכות (למשל, HEM, Zn2⁺, Mg2⁺) ולאשר את החזקתם במבנה.
  6. ייצוא את הקולטן הנקי מ-PyMOL כ-receptor_clean.pdb על ידי לחיצה על קובץ > ייצוא מולקולה > שמירה.
  7. פתח receptor_clean.pdb ב-UCSF Chimera 1.19. הצג את הרצף על ידי לחיצה על Tools > Sequence > Sequence כדי לבדוק לולאות חסרות סמוכות לאתר הקישור (אזורים חסרים מסומנים בתיבות מתאר אדומות). אם קיימות לולאות חסרות, בנה אותן מחדש על ידי בחירת Structure > Modeller (לולאות/עיבוד) מתפריט חלון הרצף, בחירת מבנה חסר לא-טרמינלי, הגדרת מספר מתאים של מודלים (למשל 5), והמשך בחישוב. לאחר ההשלמה, בחר את המודל הסביר ביותר.
  8. אופטימיזציה של המבנה ב-Chimera. השתמש בכלי Rotamers (ספריית Dunbrack) על שאריות נבחרות כדי לאופטימיזציה של שרשראות צדדיות, הוספת Clashes ו-H-Bonds דרך תפריט העמודות להערכה ובחירת קונפורמציות עם התנגשויות מינימליות (0 - 1 מועדף) וקשרי H מועדפים. לאחר מכן הוסף מימן והקצה מטענים באמצעות Dock Prep (AMBER ff14SB). לבסוף, בצע מזעור אנרגיה עם כלי Minimize Structure, תיקון אטומי עמוד השדרה על ידי בחירתם (sel @ca,c,n,o), הפיכת הבחירה והפעלת אטומים קבועים. שמור את המבנה המעובד כ-receptor_optimized.pdb על ידי בחירת File > Save PDB.
    הערה: דלג על אופטימיזציה של שרשרת צד עבור שאריות מסודרות היטב. Dock Prep מטפל אוטומטית בפרוטונציה. יש לבצע מזעור עם עמוד השדרה הקבוע.
  9. פתח מחדש את receptor_optimized.pdb ב-PyMOL והגדיר את אתר הקישור הקנוני. אם קיים ליגנד קו-קריסטליזציה, השתמש בקואורדינטות שלו כדי למרכז את הרשת: רשם את מרכז הליגנד, ואז הסר אותו עם הסרת אורגני. אם אין ליגנד קו-גבישי זמין, הגדירו את אתר הקישור בהתבסס על שאריות מפתח ידועות מהספרות (למשל, select binding_site, resi XXX-XXX) או על ידי זיהוי חזותי של כיס הקישור המשוער באמצעות כלי חיזוי כיס לאימות ההערכה הוויזואלית. רשמו את קואורדינטות המרכז התלת-ממדיות (x/y/z) של האתר המוגדר להגדרת קופסת הרשת.
    הערה: הקואורדינטות המתועדות כאן משמשות למרכז רשת AutoDock Vina. להגדרה מבוססת שאריות, יש לחשב את המרכז הגיאומטרי של השאריות הנבחרות; עבור כיס שמזוהה חזותי או באמצעות כלי חיזוי, משתמשים במרכז החלל. בעת הגדרת אתר הקישור, יש לשקול האם אסטרטגיית העגינה המיועדת מכוונת לאתר אורתוסטרי (פעיל) או לאתר אלוסטרי. למיקוד אורתוסטרי, אתר הקישור צריך להיות מוגדר על בסיס ליגנד קו-קריסטליזציה או שאריות אתר פעיל משומרות המדווחות בספרות. למיקוד אלוסטרי, כלים לחיזוי כיס עשויים לזהות אתרים אלוסטריים פוטנציאליים, במיוחד למטרות עם תקנות אלוסטריות ידועות. בהיעדר מידע מוקדם, עגינה גלובלית ואחריה אשכולות נקודות קשירה צפויות יכולה לסייע בזיהוי אתרים אלוסטריים פוטנציאליים. גמישות זו מאפשרת לפרוטוקול להתאים לקמפיינים לגילוי תרופות אורתוסטריות ואלוסטריות.
  10. ייצא את המבנה הסופי המותאם מ-PyMOL כ-receptor.pdb על ידי לחיצה על קובץ > ייצוא מולקולה > שמירה.
  11. פתח receptor.pdb ב-AutoDock Tools 4.2.6 על ידי לחיצה על קובץ > קריאת מולקולה. הגדר שאריות גמישות. לחץ על עריכה > שאריות גמישות > בחר שאריות ובחר שאריות אתר קישור הצפויות לעבור שינויים קונפורמציונליים בעת קשירת הליגנד (בחר ≤ 10 שאריות).
    הערה: שלב זה מאפשר לשרשראות צד נבחרות לנוע במהלך העגינה, תוך התחשבות בהשפעות התאמה מושרות.
  12. שמור את הקולטן עם שאריות גמישות כקובץ PDB. לחץ על קובץ > שמור, בחר בכתוב PDB מתפריט הנפתח. בחלון רשומות PDB זמינים, סמן ATOM ו-CONECT, לחץ על ADD ואז אישור. שמור את הקובץ כ-receptor.pdb.
    הערה: קובץ PDB זה מכיל מידע על שאריות גמישות וישמש ליצירת קובץ ה-PDBQT.
  13. הכינו את המקרומולקולה לעגינה. לחצו על Grid > Macromolecule > Choose, בחרו את קובץ receptor.pdb , ולחצו על Select Molecule. שמרו את הקולטן כקובץ PDBQT על ידי לחיצה על File > Save As וקרא לו receptor.pdbqt.
    הערה: AutoDock Tools מקצה מטענים וסוגי אטומים, ושומרים את הקולטן בפורמט PDBQT המקורי של AutoDock, מוכן ליצירת קופסאות רשת וחישובי עגינה.
  14. לחץ על תפריט הליגנד , בחר קלט, ואז פתח ( Open). בחר ligand.mol2 ולחץ על אישור. לחץ על תפריט הליגנד , בחר טורשיות, ואז לחץ על זיהוי טורסיות. כלי אוטודוק יזהו אוטומטית קשרים סיבובים במבנה הליגנד (למשל, קשרים בודדים בשרשראות אלקיל, קשרי אמיד ללא קשרי פפטיד).
  15. בחלון בחירת הטורסיה, אמת את הקשרים הסיבובים שזוהו (שמור על כל הקשרים הסיבובים התקפים, לא כולל קשרים קשיחים כמו קשרי טבעת ארומטיים). לחץ על Set כדי לאשר את הגדרות הטורסיה, ואז לחץ על סגירה.
    הערה: שמירה על קשרים סיבובים תקפים מבטיחה שהליגנד יוכל לאמץ קונפורמציות שונות במהלך העגינה (ליגנד גמיש), תוך שמירה על קשיחות הקולטן — זהו הליבה של עגינה חצי-גמישה ב-AutoDock Vina.
  16. לחץ שוב על תפריט Ligand , בחר Output, ואז לחץ על Save as PDBQT. תן שם לקובץ ligand.pdbqt ותשמור אותו באותה תיקייה כמו receptor.pdbqt.
  17. לחץ על תפריט התצוגה , בחר מבנה משני. לחץ על Display Only, ואז בחר Lines ולחץ על Undisplay כדי לפשט את תצוגת החלבון.
  18. לחץ על תפריט הרשת , בחר תיבת רשת. כוון את ערכי x, y, z (קואורדינטות המרכז) והמרווח (Å) כדי למקם את התיבה מעל האתר הפעיל של החלבון.
    הערה: אם אתר הקישור אינו ידוע, השתמש בכלי חיזוי כיסים (כגון CASTp, DoGSite) כדי לזהות כיסי קישור פוטנציאליים. כיסוי כל החלבון מעלה משמעותית חיוביים שגויים ועלות חישובית ואינו מומלץ.
  19. לחץ על File > Closing saving current, ואז לחץ על Grid > Output > Save GPF כדי לשמור את הגדרות תיבת הרשת כ-Grid.gpf.
  20. פתח את Grid.gpf עם עורך טקסט והקלט את מרכז הרשת (ערכי x, y, z) ואת ה-npts (ערכי בגודל x, y, z) מהקובץ.
  21. צור קובץ טקסט חדש בשם Config.txt והקלד את התוכן הבא:
    קולטן = קולטן.pdbqt
    ליגנד = Ligand.PDBQT
    center_x = [ערך מרכז הרשת x מ-Grid.gpf]
    center_y = [ערך מרכז הרשת y מ-Grid.gpf]
    center_z = [ערך מרכז הרשת z מ-Grid.gpf]
    size_x = [npts x ערך מ-Grid.gpf]
    size_y = [npts y ערך מ-Grid.gpf]
    size_z = [npts ערך z מ-Grid.gpf]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    החלף את הטקסט בסוגריים בערכים מ-Grid.gpf (שלב 6.19).
    הערה: הפרמטר energy_range צריך להיות מוגדר כהפרש האנרגיה המרבי המותר ביחס למודל המשולב האופטימלי, עם יחידות בקלור/מול. לדוגמה, הגדרה ל-5 משמעותה ש-AutoDock Vina תסיים את החישובים כאשר הפרש האנרגיה מהמודל האופטימלי מגיע ל-5 קקלורי/מול. בנוסף, num_modes מגדיר את מספר מודלי הקישור ליצור, שבדרך כלל מוגדר ל-10.
  22. הנח את קבצי ה-vina_split.exe וה-vina.exe באותה תיקייה כמו receptor.pdbqt, ligand.pdbqt ו-Config.txt.
  23. פתח את קונסולת המערכת של Windows, נווט לתיקייה באמצעות פקודת ה-cd (למשל, cd C:\DockingFiles).
  24. הקלד את הפקודה הבאה ולחץ Enter: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
  25. המתין להשלמת העגינה (משך הזמן משתנה לפי מערכת). יופיעו שני קבצים: log.txt (תוצאות עגינה) ו-output.pdbqt (מבנה הליגנד באנרגיה הנמוכה ביותר). כדי להבטיח שחזוריות, מתבצעות שלוש ריצות עגינה עצמאיות עם זרעים אקראיים שונים. RMSD < 1.0 Å בין התנוחות העליונות מאשר עקביות.
    הערה: כהתייחסות אמפירית, אנרגיות קישור של AutoDock Vina (קאלור/מול) ניתנות לפרש כך: ≤-7 (אפיניות גבוהה, קונפורמציות פעילות פוטנציאליות), -7 עד -5 (אפיניות בינונית), ≥-5 (אפיניות נמוכה). ספים אלו תלויים במערכת ויש לאמת אותם באמצעות נתונים ניסיוניים.
    1. כדי להעריך דיוק עגינה ויכולת הבחנה עבור מטרה מסוימת, מומלץ שתי גישות אימות משלימות. השתמש באימות עגינה מחדש באמצעות ליגנדים קריסטלוגרפיים כדי להעריך האם הפרוטוקול יכול לשחזר מצבי קישור שנצפו ניסיונית, כאשר RMSD < 2.0 Å משמש כקריטריון הקבלה הסטנדרטי.
    2. השתמש בניתוח העשרה באמצעות מאגרי נתונים ציבוריים (למשל, DUD-E) כדי להעריך את יכולת הפרוטוקול להבחין בין תרכובות פעילות אמיתיות לבין פיתיונות תואמים תכונה; זה כולל חישוב עקומות ROC (המספקים מדד גלובלי לביצועי סיווג) וגורמי העשרה כמו EF1% (כימות העשרת החומרים הפעילים בחלק המדורג הגבוה ביותר). יחד, שלבי האימות הללו מסייעים לקבוע חיתוך זיקה מתאימים ולהבטיח ביצועי סינון אמינים עבור מחלקת היעד הרלוונטית.
  26. פתח תוכנת PyMOL. ייבא output.pdbqt ו-receptor.pdbqt על ידי לחיצה על File > Open. שמור את המבנה המשולב כ-result.pdb על ידי לחיצה על File > Save As.
  27. נקה את מרחב העבודה של PyMOL על ידי לחיצה על File > New Session, ואז פתח מחדש את result.pdb כדי להציג את קומפלקס הליגנד-חלבון.

7. עגינה מולקולרית באמצעות YASARA

הערה: שלב זה משמש כעגינה מחדש מדויקת ועיבוד מוקדם לסימולציות דינמיקה מולקולרית (MD) מאוחרת, והוא אימות הדרגתי של תוצאות הסינון הראשוני בקצב גבוה משלב 6. שלב 6 משתמש ב-AutoDock Vina, הכלי הסטנדרטי לסינון וירטואלי בתפוקה גבוהה, כדי לסינון מהיר מולקולות מועמדות עם זיקה מצוינת מספריית התרכובות. שלב זה מאמץ את YASARA לעגינה, שכן מודול העגינה שלו תואם לחלוטין לפלטפורמת הסימולציה MD של YASARA, שיכולה למנוע סטיות מבניות הנגרמות מהמרת פורמט קבצים והחלפת תוכנה, ולספק מבנה מורכב ראשוני סטנדרטי לסימולציות MD הבאות. לכל המולקולות המועמדות שנבדקו על ידי AutoDock Vina בשלב 6, תוצאות העגינה (כולל תנוחת הקישור בכיס הפעיל ואינטראקציות חומצות אמינו מרכזיות) שמתקבלות בשלב זה חייבות להיות תואמות לאלו של AutoDock Vina, והדירוג היחסי של זיקת הקישור חייב לשמור על אותו מגמה לפני המעבר לסימולציית MD. ציוני העגינה האבסולוטיים אינם ניתנים להשוואה ישירה בין שתי התוכנות בשל אלגוריתמים חישוביים שונים. דרישת עקביות זו יכולה לבטל תוצאות חיוביות שגויות הנגרמות מהבדלים בתוכנה, להבטיח את יציבות מאפייני הקישור של מולקולות מועמדות ולהבטיח אמינות והמשכיות לוגית של אימות סימולציה MD לאחר מכן.

  1. השתמש ב-OpenBabel כדי להמיר את קובץ ligand.sdf לקובץ ligand.pdb.
    הערה: OpenBabel משמש כאן רק להמרת פורמט. הפרמטריזציה בפועל של הליגנד לדינמיקה מולקולרית תתבצע אוטומטית על ידי YASARA בשלבים הבאים.
  2. פתח את תוכנת YASARA. לחץ על קובץ > טעינה ובחר ב-ligand.pdb לייבוא הליגנד. לחץ על עריכה > ניקוי > הכל כדי להסיר פגמים מבניים מהליגנד.
    הערה: שלב זה מבצע ניקוי גאומטריה בסיסי. YASARA תקצה אוטומטית פרמטרי שדה כוח לליגנד באמצעות טכנולוגיית AutoSMILES המובנית שלה, אשר מיישמת את מטעני שדה הכוח הכללי (GAFF) ו-AM1-BCC כדי להבטיח תאימות לשדה הכוח AMBER14 המשמש לחלבון. פרמטריזציה זו חיונית לחישובי אנרגיה מדויקים הן בסימולציות עגינה והן בסימולציות MD.
  3. לחץ על אפשרויות > pH ברירת מחדל, בחר את ה-pH המתאים (למשל, 7.4 למצבים פיזיולוגיים), ולחץ על אישור.
  4. לחץ על Dock > Force field כדי להגדיר את שדה העגינה, ולהבטיח עקביות פרמטרים עם סימולציות MD הבאות.
    הערה: AMBER14 הוא שדה הכוח המומלץ לתהליך גילוי תרופות זה ב-YASARA 10.3.16, שכן הוא מספק כיסוי פרמטרים מקיף לחלבונים ותואם לחלוטין לפרוטוקולי סימולציית MD סטנדרטיים. עבור שאריות חלבון סטנדרטיות, הפרמטרים מוקצים אוטומטית מהתבניות המובנות של שדה הכוח. עבור ליגנדים קטנים במולקולות קטנות, YASARA מבצע אוטומטית פרמטריזציה באמצעות טכנולוגיית AutoSMILES המובנית שלו, אשר מקצה סוגי אטומים GAFF (שדה כוח AMBER כללי) ומטעני AM1-BCC. דבר זה מבטיח תאימות בין פרמטרי חלבון וליגנד, ומאפשר חישובי אנרגיה מדויקים הן בסימולציות עגינה והן בסימולציות MD. ניתן לבחור שדה כוח מתאים יותר בהתאם לגרסת YASARA האמיתית והמאפיינים הספציפיים של המערכת.
  5. לחץ על סימולטור > הגדר > תאים סימולציה סביב כל האטומים כדי לקבוע את גבול העבודה. לחץ על סימולטור > גבולות תאים > מחזורי כדי לאפשר תנאי גבול מחזוריים.
  6. לחץ על אפשרויות > בחר ניסוי > מזעור אנרגיה, ואז לחץ על רץ כדי למזער את אנרגיית הליגנד.
  7. לחץ על קובץ > שמור בשם, קרא לקובץ ligand.pdb, ולחץ על OK כדי להחליף את קובץ ה-PDB המקורי של הליגנד. לחץ על קובץ > חדש כדי לנקות את מרחב העבודה, ואז לחץ על קובץ > טעינה ובחר את קובץ receptor.pdb.
  8. חזרו על השלבים 7.2 עד 7.7 עבור קולטני החלבון, ושומרים את הקובץ המעובד כקובץ receptor.pdb חדש.
  9. לחץ על קובץ > חדש, ואז לחץ על File > Load ובחר גם ligand.pdb וגם receptor.pdb. חזור על השלבים 7.3 עד 7.5 כדי לקבוע pH, להגדיר את תא הסימולציה, ולאפשר גבולות מחזוריים לקומפלקס.
  10. לחץ על מעבדים > הגדר את המעבד ובחר את מספר הליבות לשימוש. לחץ על מעבדים > הגדר GPU ובחר את התקן הכרטיס הגרפי כדי להאיץ את החישובים.
  11. לחץ על קובץ > שמור כ-> YASARA Scene, תן לקובץ שם sce\nesult.sce (צור את תיקיית sce אם היא לא קיימת), ולחץ על אישור.
  12. לחץ על אפשרויות > Macro&Movie > Set target, בחר sce\nesult.sce, ולחץ אישור. לחץ על אפשרויות > Macro&Movie > Play macro, בחר את קובץ המאקרו dock_run.mcr , ולחץ אישור.
  13. לחץ על סימולטור > הגדר תא סימולציה > סביב אטומים נבחרים וחזור על 7.5, ואז לחץ על המשך כדי להתחיל את העגינה.
  14. המתינו להשלמת העגינה. ייווצרו קבצים עם הסיומת yob; name.log מכיל את אנרגיית הקישור ושאריות קולטני המגע.
    הערה: כדי להבטיח את הרציונליות של אימות סימולציית דינמיקה מולקולרית, בחר את תוצאת העגינה ב-YASARA התואמת את תוצאת העגינה של AutoDock Vina.

8. סימולציית דינמיקה מולקולרית

  1. לחץ על File > New כדי לנקות את מרחב העבודה. לאחר מכן לחץ על קובץ > Load > YASARA Object ובחר result.yob.
  2. בפאנל תוכן הסצנה (בצד ימין), הרחיב את כל ערכי ה-Mol. לחץ על עריכה > פיצול > אובייקט, בחר את כל תוכן ה-Mol בפאנל הרצף, ולחץ על אישור.
  3. לחץ על עריכה > הצטרף > אובייקט, בחר את כל תוכן ה-Mol למעט הרשומות הראשונות והאחרונות (ליגנד), ולחץ על אישור. בחר את הערך הראשון של Mol ולחץ שוב על OK כדי להצטרף מחדש לחלבון.
  4. המשך למספר מחדש של הרכיבים. בחר ב-ReNumber תחת עריכה ולחץ על אובייקטים. זה יוצר שני חלקים: החלק הראשון הוא קומפלקס חלבון-קולטן, והחלק השני הוא הליגנד של מולקולות קטנות.
  5. לחץ על עריכה > העברה, ואז לחץ על אפשרות האובייקט מהרשימה הנחשפת. בפאנל הרצף, תחילה בחר את תוכן הליגנד המולקולי הקטן על ידי לחיצה על הערך המתאים לו. לאחר מכן בחר את תכולת קולטני החלבון על ידי לחיצה על הערך שלו ולחץ על אישור לאישור זוג הבחירה.
  6. בחלון הקופץ הבא, בדוק את האפשרות שמתחילה בתיקון אטומים על המסך במהלך ההעברה, ולחץ על אישור.
  7. חזור על שלבים 7.2 עד 7.5, ואז לחץ על סימולטור > טמפרטורה ובחר 298K. לחץ על קובץ > שמור > YASARA Scene, קרא לקובץ sce\nesultrun.sce, ולחץ אושר.
  8. לחץ על קובץ > חדש כדי לנקות את מרחב העבודה. לאחר מכן לחץ על אפשרויות > Macro&Movie > Set Target, בחר sce\nesultrun.sce ולחץ אישור.
  9. ודא ששדה הכוח שנבחר בשלב 7.4 משמש גם לסימולציית MD; מאקרו md_run.mcr בדרך כלל יורש את הגדרות שדה הכוח הנוכחיות. לחץ על אפשרויות > מאקרו Macro&Movie > Play, בחר את קובץ המאקרו md_run.mcr , ולחץ על OK כדי להתחיל את סימולציית הדינמיקה המולקולרית.
  10. בצע שלוש סימולציות MD עצמאיות (3 x 100 ננו-שניות) עם מהירויות התחלתיות שונות לקומפלקס חלבון-ליגנד וביצוע ניתוח סטטיסטי של שלושת המסלולים כדי להבטיח את אמינות התוצאות. במהלך הפעולה, ייווצרו קבצים בפורמט הסימולציה. לדוגמה, אם המסלול נשמר כל 100 ps, סימולציה של 100 ננו-שניות תיצור 1000 קבצים עם סיומת הסימולטור.
  11. לאחר סיום שלב 8.10, לחץ על אפשרויות > Macro&Movie > Set target, בחר את קובץ sce\nesultrun.sce ולחץ אישור.
  12. לחץ על אפשרויות > Macro&Movie > Play macro, בחר md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr ו-md_analyzeres.mcr ולחץ OK.
  13. לאחר סיום שלושת הניתוחים, ייווצרו קבצי הנתונים המתאימים result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab ו-result_run_analysisres.tab.
  14. ראשית, נתח את result_run_analysis.tab, שמספק 10 פרמטרים מרכזיים: אנרגיה (אנרגיית מערכת כוללת), קשר (אנרגיית קשר), זווית (אנרגיית זווית קשר), דיהדרל (אנרגיית זווית דיהדרלית), פלנריות (אנרגיית מישור), קולון (אנרגיה אלקטרוסטטית), VdW (אנרגיית ואן דר ואלס), CA (Cα RMSD של החלבון RMSD), עמוד שדרה (RMSD עמוד שדרה חלבון), ו-HeavyAtoms (RMSD אטומים כבדים).
  15. הוצא את עמודת הזמן (ns) ועמודות הפרמטרים המתאימות כדי להעריך האם המערכת מגיעה לשיווי משקל אנרגטי. אשר יציבות המערכת על ידי ייצוב האנרגיה הפוטנציאלית בטווח תנודות צר לאחר 10 - 20 ננו-ננו-צ'אנס הראשונים. הערכת יציבות קונפורמציה על ידי ניטור סטיית השורש-ממוצע-ריבוע (RMSD) של אטומי Cα, שדרת חלבונים ואטומים כבדים. הסימולציה נחשבה ליציבה מבנית כאשר ערכי RMSD אלו הגיעו לפלטו.
  16. כנקודות ייחוס אמפיריות לקומפלקסים חלבונים-ליגנדים בגודל טיפוסי, ערכי Cα וערכי RMSD עמוד שדרה המתיישבים מתחת ל-2.5 Å, יחד עם RMSD אטומים כבדים מתחת ל-3.5 Å, יכולים להיחשב כאינדיקטורים תומכים ליציבות קונפורמציונית. חשוב לציין להשתמש בקריטריון הראשי והחובה ובנוכחות שלב רמה ברור במסלול RMSD, במקום היצמדות קפדנית לערכים מספריים אלה בלבד.
    הערה: ערכי סף אלו הם אמפיריים ויש לפרשם בהקשר של גודל החלבון הספציפי והגמישות. המדד המכריע להתכנסות הוא רמה מתמשכת, המצביעה על כך שהמבנה התייצב סביב אנסמבל קונפורמציונלי עקבי.
  17. לאחר מכן, נתח את result_run_bindenergy.tab, שמספק את אנרגיית הקישור בין הליגנד למטרה לאורך מסלול הסימולציה. חשב את אנרגיית הקישור הממוצעת לאורך כל תקופת הסימולציה. ביישום MM-PBSA של YASARA, ערכים חיוביים יותר מצביעים על קשירה חזקה יותר. אינטראקציה חזקה ויציבה בינוניים מסומנת בדרך כלל על ידי אנרגיית קישור ממוצעת שהיא חיובית וגדולה מספיק (הערך המספרי הסגולי תלוי במערכת אך ניתן לכייל מול קושרים ידועים או נתונים ניסיוניים), יחד עם סטיית תקן קטנה יחסית לממוצע (למשל, מקדם השונות < 50-60%), המשקפת תנודות מוגבלות במהלך הסימולציה.
    הערה: אנרגיית הקישור המדווחת בשלב זה מחושבת באמצעות שיטת MM-PBSA הקפדנית, בניגוד למקרו אנרגיית הקישור של YASARA ברירת המחדל המשתמשת בקירוב מהיר יותר (BoundaryFast). הקירוב ברירת המחדל מתאים לסינון מהיר או השוואות יחסיות, בעוד ששיטת MM-PBSA מומלצת לקבלת אנרגיות חופשיות של קישור מוחלט מדויקות יותר. כפי שציין במפורש על ידי המחבר בכותרת המאקרו של YASARA: אנרגיות חיוביות יותר מצביעות על קישור טוב יותר, אנרגיות שליליות אינן מצביעות על חוסר קשר. לכן, על המשתמשים לפרש ערכים חיוביים כאינדיקציה לקישור חזק יותר, כאשר הגודל המספרי תלוי במערכת החלבון-ליגנד הספציפית.
  18. לבסוף, נתחו את הקובץ result_run_analysisres.tab, המספק נתוני שארית כולל Residue ID, RMSD, Backbone RMSD, HeavyAtoms RMSD ו-RMSF. התמקדו בניתוח בשלב הייצור היציב שזוהה. ראשית, זהו שייריות בתוך האתר הפעיל של המטרה (למשל, אלו בטווח של 5 Å מהליגנד). לאחר מכן, השתמשו בנתונים כדי להעריך את היציבות הקונפורמציה של שאריות האתר הפעיל הבודדות במהלך הסימולציה.
    הערה: כנקודות ייחוס אמפיריות לשאריות אתר פעיל יציבות במתחמי חלבון-ליגנד, ערכי RMSF מתחת ל-1.0 Å ותנודות RMSD בתוך 1 - 1.5 Å במהלך השלב היציב נחשבים בדרך כלל לסימן לקונפורמציה מקומית מתוחזקת היטב. שאירים עם RMSF העולה על 2.0 Å עשויים להעיד על גמישות רבה יותר; יש למפות שאירים אלו על המבנה התלת-ממדי כדי לקבוע אם הם מתאימים לאזורים גמישים רלוונטיים פונקציונלית (למשל, לולאות או שטחי משטח) או מצביעים על חוסר יציבות פוטנציאלית בתוך כיס הקשר. הנחיות מספריות אלו אינן כללים מוחלטים; הקריטריון העיקרי הוא היעדר סטייה קונפורמציה גדולה, שיש להעריך בשילוב עם ההתכנסות הכוללת של המערכת שנקבעה.
  19. לאחר ארגון קבצי הנתונים, ייבא את הנתונים המאורגנים לפריזמה כדי ליצור גרפים מתאימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר ניתוח הפרמקולוגיה הרשתית של לורטדין נגד נזלת אלרגית (AR), נבחרה האינטראקציה בין לורטדין ל-PTGS2 כמחקר מקרה מייצג להמחשת יישום שלב אחר שלב של פרוטוקול העגינה המולקולרית וסימולציה MD. דוגמה זו נועדה להדגים ביצוע זרימת עבודה ופרשנות נתונים, ולא לספק אימות ביולוגי של האינטראקציה הספציפית. להערכה כמותית מול נתונים ניסיוניים, מומלץ למשתמשים ליישם את הפרוטוקול על מערכות מאופיינות היטב עם זיקות קשירות ידועות הזמינות במאגרי מידע ציבוריים.

זיהוי מטרות וניתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חשיבות וצעדים קריטיים
פרוטוקול זה משלב פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית וסימולציית דינמיקה מולקולרית, מה שמציע יתרונות ברורים על פני שיטות עצמאיות או תהליכי עבודה משולבים כפולים, ויכול לסייע בטיפול בחוסר יעילות מרכזי ופערי אמינות בגילוי תרופות כיום. התהליך כולו נשען על שלושה שלבים קריטיים שמבטיחים את אמינותו, כאשר כל אחד מהם מתייחס לאתגר מרכזי בסקר חישובי של תרופות. ראשית, אינטגרציה מרובת מסדי נתונים (למשל, PubChem למבני מולקולות קטנות, 5 מסדי נתונים למטרות מחלה, GO ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין להם ניגוד עניינים.

תודות

תוכנית מחקר ופיתוח מרכזית לאומית של סין (2024YFC3506300, 2024YFC3506301), תחום מרכזי ברמה גבוהה של המינהל הלאומי של הרפואה הסינית המסורתית - רפואה חוקתית סינית מסורתית (No.zyyzdxk-2023251), תוכנית כללית של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204948), תוכנית פריצת דרך של משרד החינוך של סין (JYB2025XDXM612), פרויקטים מיוחדים מרכזיים במדע וטכנולוגיה במחוז חוביי (2023BCA005), פרויקט מחקר מדען ראשי במעבדת שיג'ן בהוביי (HSL2024SX0002)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ADMETlab 3.0מכון שנחאי לחומרים רפואיים (SIMM), האקדמיה הסינית למדעיםלא זמיןפלטפורמה מקוונת לחיזוי תכונות ADMET (ספיגה, הפצה, מטבוליזם, הפרשה, רעילות); משמש להערכת פרופילים פרמקוקינטיים וטוקסיקולוגיים של ליגנדים (URL:  https://admetlab3.scbdd.com/)
כלי אוטודוק (AutoDock 4)מכון המחקר סקריפסאוטודוק 4.2.6חבילת תוכנה לסימולציות עגינה מולקולרית; כולל את AutoDock 4 לעגינה ואת AutoDockTools (ADT) להכנת קבצי קלט חלבון וליגנד (הוספת מימן, הקצאת מטענים, קביעת קשרים מסתובבים), הגדרת רשתות עגינה וניתוח תוצאות עגינה.
אוטודוק וינהמכון המחקר סקריפסAutoDock Vina 1.1.2תוכנת עגינה מולקולרית בקוד פתוח; משמש לחיזוי זיקות ותנוחות קישור בין ליגנדים של מולקולות קטנות לקולטני חלבון
Chem3Dפרקין אלמר אינפורמטיקהChem3D 2024תוכנות למידול מולקולרי; משמש לבניה, אופטימיזציה והדמיית מבנים תלת-ממדיים של ליגנדים קטנים במולקולות קטנות
ציטוסקייףקונסורציום סייטוסקייף (המכון לביולוגיה מערכתית)ציטוסקייפ 3.10.3תוכנה בקוד פתוח להמחשה וניתוח רשתות ביולוגיות; משמש לבניית ועריכת רשתות אינטראקציה בין גנים/חלבונים
DAVID (מסד נתונים להערות, ויזואליזציה וגילוי משולב)המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID), ארה"בלא זמיןכלי מקוון לאנוטציה פונקציונלית וניתוח העשרה; משמש לביצוע ניתוח העשרת מסלולי GO (אונטולוגיית גנים) ו-KEGG (אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים) של גנים יעד (URL:  https://david.ncifcrf.gov/)
מסד הנתונים של DisGeNETמרכז המחשוב העל של ברצלונה (BSC)לא זמיןמאגר מידע של קשרים גנטיים-מחלות; משמש לזיהוי גנים הקשורים למחלות ספציפיות (URL:  https://disgenet.com/)
מאגר GeneCardsמכון ויצמן למדעיםלא זמיןמאגר נתונים אינטגרטיבי של גנים אנושיים; משמש לאיסוף מידע גנטי מקיף (למשל, ביטוי, תפקוד, אסוציאציות מחלות) (URL:  https://www.genecards.org/)
LigPlusהמעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית - המכון האירופי לביואינפורמטיקה (EMBL-EBI)LigPlus 2.3תוכנה ליצירת דיאגרמות אינטראקציה בין חלבון לליגנד דו-ממדיות אוטומטית מקבצי קואורדינטות תלת-ממדיות. היא מתארת סכמטית קשרי מימן, מגעים הידרופוביים, ושאריות אתר הקישור זמין עם הרשמה בדוא"ל אקדמי בכתובת   https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
מאגר OMIMבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (בשיתוף עם NCBI)לא זמיןירושה מנדלית מקוונת באדם; משמש לאיסוף מידע על הפרעות גנטיות והגנים הקשורים אליהן (URL:  https://www.omim.org/)
OpenBabelצוות הפיתוח של OpenBabelלא זמיןארגז כלים כימיים בקוד פתוח; משמש להמרת פורמטים מולקולריים של קבצים (למשל, מ-.mol2 ל-.pdb) בין פלטפורמות תוכנה שונות
מסד הנתונים של PharmGKBאוניברסיטת סטנפורדלא זמיןבסיס הידע של פרמקוגנומיקה; משמש לאיסוף מידע על אינטראקציות גנטיות-תרופות ווריאנטים פרמקוגנומיים (URL:  https://www.pharmgkb.org/)
פריזמהתוכנת GraphPadפריזמה 9משמש לגרפים מדעיים, ניתוח נתונים (למשל, שרטוט עקומות התפלגות אנרגיה מקשרת, ניתוח פסי שגיאה) ויצירת נתונים באיכות פרסום.
פרוטוקס 3.0Charité - Universitä צמדיזין ברלין, גרמניהלא זמיןכלי מקוון לחיזוי נקודות קצה טוקסיקולוגיות של מולקולות קטנות; משמש להערכת רעילות פוטנציאלית של ליגנדים מועמדים (URL:  https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
מאגר הנתונים PubChemהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI), ארה"בלא זמיןמאגר מידע כימי ציבורי; משמש לשחזור מבנים דו-ממדיים/תלת-ממדיים ותכונות פיזיקוכימיות של ליגנדים מולקולריים קטנים (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
PyMOLSchrö דינגר, LLCPyMOL 2.6.1תוכנת ויזואליזציה מולקולרית; משמש לצפייה, עריכה ויצירת תמונות איכותיות של קומפלקסים חלבונים-ליגנדים
סטודיו Rפוזיט, PBCRstudio 2025.09.1+401סביבת פיתוח משולבת (IDE) לתכנות R; משמש לניתוח סטטיסטי של נתונים ביולוגיים וליצירת גרפים של GO/KEGG
מאגר הנתונים של RCSB PDBשיתוף פעולה מחקרי לביואינפורמטיקה מבנית (RCSB)לא זמיןמאגר מבני חלבונים; משמש לשחזור מבנים תלת-ממדיים של קולטני חלבון בפורמט PDB (URL:  https://www.rcsb.org/)
SEA (גישת אנסמבל דמיון)מכון המחקר סקריפסלא זמיןכלי מקוון לחיזוי מטרות על בסיס דמיון כימי; משמש להשלמת SwissTargetPrediction לאישור מטרות הליגנד (URL:  https://sea.bkslab.org/)
מיתרקונסורציום המיתרים (EBI, SIB וכו')לא זמיןמאגר נתונים של אינטראקציות חלבון-חלבון ידועות וחזויות; משמש לבניית רשתות אינטראקציה בין גנים לחלבון (URL:  https://string-db.org/)
SwissTargetPredictionהמכון השווייצרי לביואינפורמטיקה (SIB)לא זמיןשרת מקוון לחיזוי מטרות חלבון פוטנציאליות של מולקולות קטנות; משמש לזיהוי קולטנים מועמדים לליגנדים (URL:  http://swisstargetprediction.ch/)
מסד הנתונים TTDהמכון לגילוי ופיתוח תרופות (IDRBL), אוניברסיטת סון יאט-סןלא זמיןמאגר מטרות טיפוליות; משמש לאיסוף מידע על מטרות סמים מאומתות ופוטנציאליות (URL:  https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF כימרהמשאב למחשוב ביולוגי, ויזואליזציה ואינפורמטיקה (RBVI), אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקוUCSF Chimera 1.19תוכנות לוויזואליזציה וניתוח מולקולרית; משמש להכנת מבנה חלבון כולל שחזור לולאה חסרה (באמצעות ממשק מודלר), אופטימיזציה של שרשרת צדדית (ספריית Dunbrack rotamer), התאמת מצב פרוטונציה, ומזעור אנרגיה עם שדה כוח AMBER ff14SB. גרסה 1.19 (שיצאה במרץ 2025) מתקנת את יכולות הבאת מבנה PDB . זמין ללא תשלום לשימוש לא מסחרי בכתובת   https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ .
מסד הנתונים UniProtקונסורציום UniProt (EBI, SIB, PIR)לא זמיןמאגר נתונים מקיף של רצף ותפקוד החלבונים; משמש לשחזור רצפי חלבונים, מבנים והערות פונקציונליות (URL:  https://www.uniprot.org/)
וני 2.1.0המרכז הלאומי לביוטכנולוגיה; a (CNB-CSIC), ספרדלא זמיןכלי מקוון ליצירת דיאגרמות ון; משמש להמחשת חפיפות בין קבוצות גנים (למשל, גנים מטרה ממאגרי מידע שונים) (URL:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
יסרהYASARA ביוסיינסיאסארה 10.3.16תוכנות למידול מולקולרי וסימולציה; משמש לעגינה מולקולרית (שלב 3.7) ולסימולציות דינמיקה מולקולרית לאחר מכן לאימות תוצאות עגינה

מקורות

  1. Hopkins, A. L. Network pharmacology: The next paradigm in drug discovery. Nat Chem Biol. 4 (11), 682-690 (2008).
  2. An, W., et al. Mechanisms of rhizoma coptidis against type 2 diabetes mellitus explored by network pharmacology combined with molecular docking and experimental validation. Sci Rep. 11 (1), 20849(2021).
  3. Hu, M., et al. Use of network pharmacology and molecular docking to explore the mechanism of action of curcuma in the treatment of osteosarcoma. Sci Rep. 13 (1), 9569(2023).
  4. Oh, K. K., Adnan, M., Cho, D. H. Network pharmacology approach to decipher signaling pathways associated with target proteins of NSAIDs against COVID-19. Sci Rep. 11 (1), 9606(2021).
  5. Kuntz, I. D., Blaney, J. M., Oatley, S. J., Langridge, R., Ferrin, T. E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J Mol Biol. 161 (2), 269-288 (1982).
  6. Sahu, M. K., Nayak, A. K., Hailemeskel, B., Eyupoglu, O. E. Exploring recent updates on molecular docking: Types, method, application, limitation & future prospects. Int J Pharma Res Allied Sci. 13 (2), 24-40 (2024).
  7. Morris, G. M., et al. Autodock4 and autodocktools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  8. Li, C., et al. Characterization of the molecular mechanisms underlying lurasidone-induced acute manic episodes in bipolar depression: A network pharmacology and molecular docking approach. CNS Neurosci Ther. 31 (4), e70383(2025).
  9. Lee, W. Y., et al. Evaluating current status of network pharmacology for herbal medicine focusing on identifying mechanisms and therapeutic effects. J Adv Res. 76, 799-815 (2025).
  10. Shahzadi, Z., et al. Network pharmacology and molecular docking: Combined computational approaches to explore the antihypertensive potential of Fabaceae species. Bioresour Bioprocess. 11 (1), 53(2024).
  11. Che, X., Zhang, L. Blind docking methods have been inappropriately used in most network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 16, 1566772(2025).
  12. Ren, M., Ma, J., Qu, M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of shaoyao gancao tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine .(Baltimore). 103 (50), e40929(2024).
  13. Jorgensen, W. L. The many roles of computation in drug discovery. Science. 303 (5665), 1813-1818 (2004).
  14. Gao, L., et al. Molecular dynamics simulation-driven focused virtual screening and experimental validation of fisetin as an inhibitor of Helicobacter pylori htra protease. Mol Divers. 29 (6), 6243-6258 (2025).
  15. Schaefer, M. H., Serrano, L., Andrade-Navarro, M. A. Correcting for the study bias associated with protein-protein interaction measurements reveals differences between protein degree distributions from different cancer types. Front Genet. 6, 260(2015).
  16. Richter, S., Fetzer, I., Thullner, M., Centler, F., Dittrich, P. Towards rule-based metabolic databases: A requirement analysis based on KEGG. Int J Data Min Bioinform. 13 (3), 289-319 (2015).
  17. Gu, S., et al. Benchmarking ai-powered docking methods from the perspective of virtual screening. Nat Machine Intell. 7 (3), 509-520 (2025).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: Towards the artificial intelligence-based precision traditional chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), 1-12 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ADMETKEGG

מאמרים קשורים